Cientifica8_2

UNIVERSIDAD CIENTFICA DEL SUR

DIRECTORIOIng. Jos Carlos Dextre Chacn

Presidente del Directorio

RECTORDr. Agustn Iza Stoll

AUTORIDADES

Dr. Jos Amiel PrezVicerrector de Investigacin

MBA. Jaime Tamashiro TamashiroGerente General (e) Director Central de Administracin y Finanzas

MA. Tulio Pita ChvarriGerente Postgrado

Dr. Agustn Iza StollDecano de la Facultad de Medicina Humana

Ing. Jorge Ponce UrquizaDecano de la Facultad de Ingeniera Econmica y de Negocios

Dr. Rodolfo Valdivia MaibachDecano de la Facultad de Estomatologa

Dra. Luzmila Troncoso CorsoDecana de la Facultad de Nutricin y Diettica

Dr. Manuel Rosemberg BarrnDecano de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia

Ing. Jos Carlos Dextre ChacnDecano de la Facultad de Ingeniera de Sistemas Empresariales

Dra. Sonia Valle RubioDecana de la Facultad de Biologa Marina y Econegocios

Mg. Jazmn Dvila Lizrraga Decana de la Facultad de Administracin de Turismo Sostenible y Hotelera

Ing. Juan Guerrero BarrantesDecano de la Facultad de Ingeniera y Gestin Ambiental

Dra. Josefina Takahashi SatoDecana de la Facultad de Negocios Agro-Forestales

Dra. Laurietz Seda RamrezDecana de la Facultad de Artes Escnicas y Literatura

Ing. Zandra Rivera ChvezDirectora de la Facultad de Ingeniera de Sistemas Empresariales

Mg. Larissa Blsamo FasceDirectora de la Carrera de Psicologa

MBA. scar Muro Doig Director de la Carrera de Administracin de Negocios Internacionales

Mg. Jenny Canales PeaDirectora de la Carrera de Comunicacin y Publicidad

Abg. Mariano Castro Snchez-MorenoDirector de la Carrera de Derecho

Dr. Arq. Ignacio Pacheco DazDirector de la Carrera de Arquitectura y Urbanismo Ambiental

MBA. scar Muro Doig Director de la Carrera de Marketing y Administracin

Lic. rika lvarezSecretaria General

Lic. Gustavo Lujn Zumaeta Director de Propuesta Educativa

Dr. Emilio Guija PomaDirector del Instituto de Investigacin

Sr. Percy Encinas CarranzaDirector del Centro Cultural y del Fondo Editorial

Ing. Ricardo de la Piedra AlegraDirector Comercial de Post Grado y Extensin

MBA. Duilio Zolfi FedericiDirector Comercial de Pre Grado

CIENTFICACIENTFICA Vol 8 N 2, mayo-agosto 2011

Asesora de diseo: Erika KohatsuAsistente de prensa: Rodrigo SalazarDiseo y diagramacin: Carlos Amiel

Revista arbitrada

CIENTIFCA, revista de ciencias de la Universidad Cientfica del Sur, publica tres nmeros al ao. La revista est dirigida a investigadores, cientficos, docentes y estudiantes universitarios.

La Universidad Cientfica del Sur no se solidariza necesariamente con las opiniones expresadas en los artculos publicados en esta edicin de CIENTFICA. Se autoriza la reproduccin de los textos siempre que se cite la fuente.

[email protected] Fondo Editorial. Universidad Cientfica del SurCarretera Antigua Panamericana Sur km 19 - Villa El Salvador Tel. 610 6400 anexo 528Tiraje: 600 ejemplares

Hecho el depsito legal en la Biblioteca Nacional del PerN 2008-15522 / ISSN: 1997-100X

DirectorDr. Jos Amiel PrezUniversidad Cientfica del SurVicerrector de [email protected]

Comit EditorialDr. Pedro Mendoza AranaUniversidad Nacional Mayor de San MarcosFacultad de Medicina [email protected]

MSc. Javier Enciso GuterrezUniversidad Cientfica del SurVicerrectorado de [email protected]

Dr. Felipe Antonio San Martn HowardUniversidad Nacional Mayor de San MarcosPresidente del Consejo deGestin de la [email protected]

Dra. Josefina Takahashi Universidad Cientfica del Sur Facultad de Negocios [email protected]

Dr. scar Valiente CastilloUniversidad San Antonio Abad del CuzcoDecano de la facultad de [email protected]

104Vernica Orozco Chvez, Manuel Rosemberg Barrn, Alexei Santiani Acosta, Humberto Rodrguez Landeo

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CIENTFICA

CONTENIDORevista Cientfica Vol 8 N2 mayo - agosto 2011

COMIT CIENTFICO

EdITOrIal

arTCUlOS OrIGINalES Obtencin de extractOs de plantas que estimulan la prOliferacin de una lnea

humana de clulas madre mesenquimales

efectO del aloe vera en la cicatrizacin de lesiOnes gingivales

evaluacin de tres dilutOres para la refrigeracin de semen de caballO peruanO de pasO y sus efectOs sObre la mOtilidad espermtica e integridad funciOnal de la membrana

arTCUlOS dE rEvISIN

evaluacin de la capacidad antimicrObiana del clOrurO de cetilpiridiniO (ccp) sObre la micrOflOra existente en lOs cepillOs dentales en usO en preescOlares cOn denticin decidua cOmpleta

Nathaly Enciso Benavides, Jos Amiel Prez, Emilio Guija Poma, Alejandro Fukusaki Yoshizawa, scar Retegui Arvalo, Javier Enciso Gutirrez

David Prosopio, Jorge Torres, Erick Valdivia, Elmer Salinas P., Margot de los Ros

virus hanta. un antiguO virus emergente

Patricio Berros Etchegaray, Javier Enciso Gutirrez

9

8

Obtaining Of plant extracts that stimulates the prOliferatiOn a human line Of mesenchymal stem cells

effect Of aloe-vera in healing gingival lesiOns

evaluatiOn Of antimicrObial activity Of cetylpyridinium chlOride (cpc) On the existing micrOflOra tOOthbrushes in use in preschOOl children with cOmplete primary dentitiOnSimabukuro VF, Albites AU, Carmen Villarroel, Xavier Contreras, Ramrez YW, Tang SP, Aguilar GD, lvarez-Vidigal E

hantavirus. a fOrmer emerging virus

evaluatiOn Of thre extenders fOr the semem refrigeratiOn prOcess Of peruvian pasO hOrses, and his effects On the mOtility sperm and functiOnal membrane integrity

115

122

89

151Dr. Fernando Cabieses

Luis Wong Espejo

Jos Eduardo Rosales Trabuco 127

ISSN 1997-700X

CarTaS al EdITOr cOnsistencia interna del inventariO de resOlucin de prOblemas sOciales

internal cOnsistency Of the sOcial prOblem sOlving inventOry-revised

Alexandra Delboy Zenteno, Carolina Black Tam, Csar Merino Soto

TESIS factOres asOciadOs a las cOmplicaciOnes pOsOperatOrias en el serviciO de

ciruga OncOlgica

Sala CaBIESES trepanaciOnes, extractO de la Obra la salud y los dioses del

dr. fernandO cabieses (aO 2007)

NOTaS

INSTrUCCIONES para lOS aUTOrES

reflexiOnes en tOrnO a la ciencia

156

152

reflectiOns abOut the science

FE dE ErraTaS 150

134

fragilidad fsica, deteriOrO cOgnitivO y factOres asOciadOs en adultOs mayOres del centrO geritricO naval del callaO, per

144

Dr. Emilio Guija PomaUniversidad Cientfica del SurDirector del Instituto de Investigacin

Dr. Ricardo Caballero Merino Hospiten Rambla - Espaa Jefe de Servicios de Obstetricia y Ginecologa

Dr. James Graham Universidad de Illinois en Chicago EE.UU. Departamento de Farmacognosis. Facultad de Farmacia

Ph.D. Carlos Moslares GarcaUniversidad Ramn Llull - Barcelona, EspaaVice Decano Facultad de Economa IQS

Dra. Amparo ZavaletaUniversidad Nacional Mayor de San MarcosFacultad de Farmacia y Bioqumica

Dr. Manuel Len Nuez VergaraUniversidad Cientfica del SurFacultad de Medicina Humana

Dr. Ricardo Caballero MerinoHospiten Rambla - EspaaJefe de Servicios de Obstetricia y Ginecologa

Psic. Csar Merino Soto Universidad Cientfica del Sur Facultad de Psicologa

Dr. Pedro San Martn Howard Hospital Nacional Dos de Mayo Jefe del Departamento de Pediatra

Ing. scar Paiba Universidad Cientfica del Sur Facultad de Ingeniera de Sistemas Empresariales

Dra. Nancy Lozano Universidad Nacional Mayor de San Marcos Facultad de Farmacia y Bioqumica

Ing. Juan Guerrero Barrantes Universidad Cientfica del Sur Facultad de Ingeniera y Gestin Ambiental

Ing. Domnico Guida Universidad de Salerno - Italia Departamento de Ingeniera Mecnica

Ing. Jos Dvila Universidad Cientfica del Sur Facultad de Ingeniera de Sistemas Empresariales

Mg. Jenny Canales PeaUniversidad Cientfica del SurDirectora de la Carrera de Comunicacin y Publicidad

COMIT CIENTFICO

CIENTFICA SE ENCUENTRA EN ELSISTEMA REGIONAL DE INFORMACIN

EDITORIALAPORTES AL CONOCIMIENTO Y APLICACIN DE LAS CLULAS

MADRE PLURIPOTENTES

Normalmente, las primeras clulas nacidas de la fertilizacin del vulo por el espermatozoide, clulas de embrin temprano, son capaces de convertirse en cualquier tipo de clula adulta, clula diferenciada que ha adquirido un determinado linaje y forma un tejido especfico. Por esta capacidad se las denomina clulas pluripotentes, pueden adoptar las caractersticas de cualquier tipo de clulas del cuerpo humano, siguiendo un programa gentico preestablecido y perfectamente definido en un proceso que comienza en la fertilizacin y, a travs de distintos pasos, termina en una clula adulta, diferenciada y especifca.

Yamanaka y colaboradores, el ao 2006, publicaron en Cell un procedimiento para obtener clulas madre pluripotentes inducidas (iPSCs) a partir de clulas adultas, utilizando cuatro genes: Oct4, Sox2, Kef4 y C-Myc. Observaron que un porcentaje importante de ratones inyectados con iPSCs haba desarrollado cncer, como consecuencia de la actividad residual no silenciada de los retrovirus vectores verdaderas naves transportadoras de genes utilizados para introducirlos en la molcula de ADN. Para superar este inconveniente se desarrollaron tcnicas que utilizan adenovirus en vez de retrovirus, con lo que se prescinde de genes que tienden a estimular el desarrollo de cncer. Tambin disminuyeron el nmero de genes inicialmente empleados con este fin. El mismo Yamanaka, en el 2008, public en Science una tcnica que permite obtener iPSCs sin vectores virales.

Quedaron siempre dudas respecto de la identidad de las clulas pluripotentes inducidas, de su calidad y su capacidad para producir todo tipo de clulas del organismo, tal como lo exige la definicin del trmino.En ocasiones, algunos genes del ADN de las clulas originales pueden no haber sido activados y transferir solo parcialmente sus diversas caractersticas; en consecuencia, estas no califican para adjudicrseles su identidad primigenia de clulas madre, y puede incluso alterarse su correcta derivacin en clulas diferenciadas.

Se investiga para establecer de manera inequvoca pruebas de su pluripotencia empleando marcadores, tcnicas in vitro para obtener gran variedad de clulas de diferentes Iinajes, producir teratomas o los tres tipos de clulas fundamentales (ectodermo, mesodermo y endodermo), y comprobar su capacidad de incorporacin al crecimiento embrionario en animales de experimentacin. Todas son pruebas que cumplen

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las clulas embrionarias y deben hacerlo tambin las clulas madre pluripotentes.

En el Per se vienen realizando ensayos clnicos con clulas madre autlogas, para evitar el rechazo, las cuales, felizmente y por las tcnicas breves utilizadas, no ofrecen la posibidad de modificacin gentica como podra ocurrir con las clulas pluripotentes inducidas; pero probablemente tampoco se las identifica como clulas madre y, por tanto, no pueden cuantificarse. Es imprescindible realizar esta tarea determinando la dosis teraputica. De no hacerlo, estaramos obviando la etapa experimental que es la que confiere a esta nueva tecnologa que con justa razn se ha denominado la promesa teraputica un mayor valor cientfico, ms seguridad y precisin.

En la Universidad Cientfica del Sur estamos desarrollando trabajos experimentales para contribuir a la aplicacin correcta de estos mtodos y, precisamente, en el artculo Extractos de plantas que estimulan la proliferacin de una lnea humana de clulas madre mesenquimales, Nathaly Enciso y colaboradores, continuando con publicaciones anteriores, tratan el tema de la identificacin de clulas madre con miras a una cuantificacin que permita administrar la cantidad apropiada de estas clulas en cada intervencin mdica. Para ello es necesario innovar tcnicas actuales y proveer de otras, rigurosas y de aplicacin prctica, simples y rpidas. Tambin en este trabajo se busca delinear procedimientos de incremento celular para aquellos casos en los que se encuentre un nmero muy reducido de clulas madre pluripotentes, ya que estas podran multiplicarse convenientemente en cantidad, tiempo y calidad, sin modificacin de su genoma, y as garantizar el resultado favorable esperado.

Dr. Jos Amiel Prez Director

88 Cientfica 8 (2), 2011 89Cientfica 8 (2), 2011

Obtencin de extractos de plantas que estimulan la proliferacin de una lnea humana de clulas madre mesenquimales

arTCUlOS OrIGINalES

OBTENCIN DE EXTRACTOS DE PLANTAS QUE ESTIMULAN LA PROLIFERACIN DE UNA LNEA HUMANA DE CLULAS MADRE

MESENQUIMALES OBTAINING OF PLANT EXTRACTS THAT STIMULATES THE PROLIFERATION A HUMAN LINE OF

MESENCHYMAL STEM CELLS

Nathaly Enciso Benavides1, Jos Amiel Prez1, Emilio Guija Poma1, Alejandro Fukusaki Yoshizawa2, scar Retegui Arvalo2, Javier Enciso Gutirrez1

1 universidad cientfica del sur. labOratOriO de cultivO celular. 2 universidad cientfica del sur. labOratOriO de biOqumica y qumica de prOductOs naturales.

rESUMEN

El tejido adiposo es la fuente ms rica y accesible de clulas madre mesenquimales con alta capacidad para regenerar diversos tejidos lesionados y tratar enfermedades inmunitarias, previa expansin de poblaciones celulares. Esta expansin de clulas madre in vitro es influenciada por diferentes factores, que intervienen sobre la formacin de la colonia, como las citoquinas, factores de crecimiento, aminocidos y otras molculas esenciales para la vida de las clulas madre. El suero fetal bovino (SFB) es muy usado para estimular el crecimiento celular; sin embargo, por su origen animal, no puede ser usado con este propsito en clulas madre de origen animal y humano. Sera de mucha utilidad para este fin, obtener molculas o sustancias inocuas que cumplan el mismo estmulo que el SFB, pero que no sean de origen animal. En este trabajo de investigacin se plante como objetivo determinar, mediante bioensayos, si los extractos metanlicos de Equisetum arvense, Bixa orellana y Buddleja incana tienen efecto estimulador en la proliferacin in vitro de clulas madre humanas STEMPRO Human Adipose-Derived Stem Cell (ADSC), adquirido de INVITROGEN Inc. EE.UU. y comparar ese efecto con la mezcla de SFB + extracto metanlico de las plantas estudiadas. Se obtuvieron extractos

de E. arvense (5,61%), B. orellana (13,5%) y B. incana (7,5%), que en pruebas bioqumicas evidenciaron una capacidad antioxidante de 5,6 (E. arvense), 28,11 (B. orellana) y 16,25 mmoles/100 g/m.s. (B. incana); el contenido de flavonoides fue de 3 200 (E. arvense), 1 616 (B. orellana) y 773 mg (B. incana) de catequina/100 g de m.s.; mientras que el contenido de polifenoles fue de 407 (E. arvense), 2 241 (B. orellana) y 1 595 mg (B.incana) de cido glico/100 g de m.s. En los ensayos las clulas recibieron solamente medio de cultivo DMEM-High Glucosa con glutamina. Las dosis de los extractos fueron 40, 80, 160, 320, 640 y 1 280 g/ml; como control se us el solvente metanol y el SFB. Las clulas se sembraron por triplicado, para cada dosis. El efecto sobre la proliferacin celular se evalu a las 24, 48 y 72 horas, mediante la tcnica XTT, y se midi la densidad ptica en un lector de ELISA a 560 nm, expresndose los resultados en porcentaje como Tasa de Estimulacin Celular (TEC). Estos resultados evidenciaron que el extracto de E. arvense, a las 48 horas y a dosis de 1280 g/ml, tiene el mayor valor TEC sin SFB (173%) y con SFB (366%), seguido por B. orellana sin SFB (106%) y con SFB (329%), finalmente por B. incana sin SFB (80%) y con SFB (170%). El valor mximo TEC utilizando solo SFB fue del 83% a

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las 72 horas. Se concluye que los extractos metanlicos de E. arvense y B. orellana producen una TEC mayor que la de B. incana con o sin el SFB, por lo que pueden ser buenos candidatos para ser usados como estimuladores de la expansin poblacional de clulas madre humanas.

Palabras clave: clulas madre humanas, proliferacin celular, extractos metanlicos de plantas.

aBSTraCT

Adipose tissue is the available and richest source of mesenchymal stem cells, with high capacity to regenerate various injured tissues and treatment of immune diseases previous expansion of cell populations. This expansion of stem cells in vitro is influenced by different factors affecting the formation of the colony, such as, cytokines, growth factors, amino acids and other molecules essential for stem cells proliferation and differentiation. Fetal bovine serum (FBS) is used to stimulate cell growth, but being from animals, cannot be used for animal and human stem cells proliferation. Molecules or harmless substances of non animal origin, with similar stimulatory effect that FBS can be very useful for this purpose. The aim of this research work was to determine, through bioassays, if the methanolic extract of Equisetum arvense, Buddleja incana and Bixa orellana have stimulatory effect on in vitro human stem cells proliferation and compare this effect with the combination of FBS + methanolic extract. For this purpose, a human stem cell line originating from adipose tissue (Stemprocell, Invitrogen, USA) was purchased and, cultured in vitro using culture medium DMEM supplied by the same laboratory until the start of the trials. After the extraction process the extracts of E. arvense (5.61%) of B. orellana (13.5%) and B. incana (7.5%), biochemical tests showed that antioxidant capacity expressed in mmoles/100 g of ms were of 5.6 (E. arvense) and 11.28 (B. orellana) and 16.25 (B. incana), the flavonoid content expressed as catequina/100 g

m.s. was 3200 (E. arvense), 1616 (B. orellana) and 773 (B. incana), while the polyphenol content expressed as acid galic/100 g de m.s was 407 (E. arvense), 2241 (B. orellana) and 1595 (B.incana). For trials stem cells received culture medium DMEM-High Glucose with glutamine. Stem cell were seeded in triplicate at following extract doses 40, 80, 160, 320, 640 and 1280 mg / ml, same as the solvent control and FBS. The effect on cell proliferation was assessed at 24, 48 and 72 hours by XTT technique, measuring the optical density in an ELISA reader at 560 nm, expressed in percentage and rate of cellular stimulation (TEC). The results showed that E. arvense methanolic extract has the highest TEC, either without FBS (173%) and with FBS (366%) at 48 hours, with a dose of 1 280 mg / ml, followed by B. orellana without FBS (106%) and with FBS (329%) and finally B. incana without FBS (80%) and with FBS (170%). We conclude that methanolic extracts of E. arvense and B. orellana TEC have more proliferation effect on stem cells than the FBS alone. Therefore, could be good candidates for their use as stimulants of the population expansion of human stem cells.

Keywords: human stem cells, cell proliferation, plant extracts.

INTrOdUCCIN

Las clulas madre mesenquimales (MSCs) descubiertas por Friedenstein y colaboradores (1) son una poblacin de clulas madre/progenitoras con capacidad pluripotente para diferenciarse en linajes mesodrmicos y no mesodrmicos que incluyen osteocitos, adipocitos, condrocitos, miocitos, cardiomiocitos, fibroblastos, miofibroblastos, clulas epiteliales y neuronas. Residen primariamente en la mdula sea, pero tambin existen en tejido adiposo, sangre perifrica, sangre de cordn umbilical, placenta, tero, hgado y tejidos fetales (2). El tejido adiposo es la fuente ms rica y accesible de clulas madre mesenquimales con alta capacidad para regenerar piel lesionada (3), tendn (4), cartlago,



hueso, con efectos inmunomoduladores en enfermedades inmunitarias (5) y potencial de diferenciacin miognica (6).

Una vez obtenidas las clulas madre de tejidos adultos (mesenquimales), deben cultivarse en medios especiales, ser expandidas para luego someterse a induccin de diferenciacin en clulas de diferentes tejidos o para realizar trasplantes celulares. Esta expansin de poblaciones de clulas madre in vitro, es influenciada por diferentes factores que intervienen sobre la formacin de la colonia, como son: tiempo de duplicacin de la poblacin, ciclo celular, expresin de marcadores (7) y estabilidad genmica (8) y por molculas como citoquinas, factores de crecimiento, aminocidos y otras, esenciales para la vida de las clulas madre (9,10,11,12).

Por otro lado, la expansin de poblaciones de clulas madre mesenquimales in vitro no debe modificar la expresin de factores de transcripcin involucrados en la autorenovacin y multipotencia (13,14), por lo que se buscan factores estimulantes de la proliferacin celular in vitro sin potenciales efectos mutagnicos ni inductores de diferenciacin en las clulas madre. El objetivo de este trabajo es preparar extractos metanlicos de las plantas Equisetum arvense, Bixa orellana y Buddleja incana que estimulen la proliferacin de una lnea de clulas madre humanas obtenida de tejido adiposo.

MaTErIal Y MTOdOS

prEparaCIN dEl ExTraCTO METaNlICO

Se trabaj con hojas de Equisetum arvense y Bixa orellana compradas en un mercado de Lima y de Buddleja incana colectada en el poblado de San Luis de Llincag, Hunuco, ubicado a 3,600 m.s.n.m. Las hojas de las plantas previamente se lavaron con agua destilada y colocaron en una estufa con corriente de aire a 40 C hasta obtener peso constante, luego se

pulverizaron utilizando una licuadora y se separaron en porciones de 100 g del polvo seco de Equisetum arvense y Bixa orellana y 20 g de B. incana, que fueron tratadas con 350 ml y 200 ml de alcohol metlico respectivamente, dejndolas en reposo durante 24 horas. Transcurrido este tiempo se procedi a filtrar utilizando papel filtro Whatman N 2. Al producto residual se le adicion 250 ml de alcohol metlico y se repiti el proceso de la misma manera que en la etapa anterior por 3 veces para E. arvense y B. orellana y 4 veces para B. incana.

Para realizar las determinaciones analticas bioqumicas se pes 50,0 mg del extracto metanlico de E. arvense, 50,6 mg de B. orellana y 26 mg de B. incana que se disolvieron en 10 ml de alcohol metlico.

dETErMINaCIONES BIOqUMICaS

Capacidad antioxidante

La capacidad antioxidante de los extractos metanlicos de las plantas motivo del presente estudio se determin utilizando la tcnica propuesta por Benzie y Strain (15). En forma breve, esta se realiz midiendo 1,0 ml del reactivo 2,4,6-tri-piridil-triazina, 0,020 ml del extracto metanlico de la planta y 0,9 ml de agua destilada. Paralelamente se prepar el blanco respectivo, solvente sin muestra, y todos los tubos se colocaron en bao mara a 37 C durante 15 minutos a cuyo trmino se determin la densidad ptica a 593 nm en un espectrofotmetro Spectronic modelo Genesys 6. Todas las determinaciones se realizaron por triplicado. Se elabor una curva patrn, utilizando diversas concentraciones de sulfato ferroso para realizar los clculos.

Polifenoles totales

El contenido de polifenoles en los extractos metanlicos de las plantas medicinales se determin utilizando el mtodo de Singleton (16), para cuyo propsito a 0,020 ml de las muestras, se adicion 1,0 ml del reactivo de Folin

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Ciocalteu 1:1 con agua destilada y, finalmente, 1,5 ml de una solucin de carbonato de sodio al 7,5%. Los tubos se colocaron en bao mara a 45 C durante 15 minutos, a cuyo trmino se leyeron en el espectrofotmetro a 765 nm. Paralelamente, se prepar el blanco respectivo sin muestra. Para realizar los clculos se prepar una curva patrn utilizando diferentes concentraciones de cido glico.

Flavonoides

La determinacin de flavonoides se realiz utilizando la tcnica propuesta por Jia (17), para lo cual se midieron 0,200 ml del extracto metanlico, se adicion 1,30 ml de agua destilada y aadi 0,075 ml de una solucin de nitrito de sodio al 5%, se dej en reposo durante 5 minutos, a cuyo trmino se aadi 0,15 ml de una solucin de cloruro de aluminio al 10%. Despus de 6 minutos en reposo se adicionaron 0,5 ml de NaOH 1 N y 0,275 ml de agua destilada. La densidad ptica de la muestra y el blanco respectivo se midi a 510 nm. Para realizar los clculos se utiliz una curva patrn preparada con concentraciones variables de catequina.

EvalUaCIN dE la prOlIFEraCIN CElUlar

Cultivo de clulas madre humanas

Se compr una lnea de clulas madre humanas originaria de tejido adiposo STEMPRO Human Adipose-Derived Stem Cell (ADSC), adquirido de INVITROGEN, Inc. EE.UU. con la que se realizaron todos los ensayos. En el laboratorio se dividieron en 10 alcuotas de 100 L, conteniendo 100 000 clulas por alcuota, y se mantuvieron en congelacin a -80 C hasta el da del ensayo. Los ensayos in vitro se realizaron en condiciones de asepsia en microplacas de cultivo de 96 pocitos con un volumen final de 0,2 ml. El efecto sobre la proliferacin celular del extracto a ensayar se evalu a diferentes tiempos de cultivo (24, 48 y 72 horas), diferentes dosis y en ausencia (control) de los extractos

a fin de determinar la cintica de accin del producto. La metodologa seguir los protocolos descritos previamente (18,19).

Tasa de estimulacin celular (TEC)

Se realiz mediante la tcnica XTT (20) que se basa en la capacidad de las clulas metablicamente activas para reducir las sales de tetrazolium a compuestos de formazn. La lectura se realiz en un lector de ELISA a 560 nm. El modelo biolgico en el cual se realiz el experimento fueron cultivos de lneas de clulas madre mesenquimales originarias de mdula sea humana. Se cultivaron 5 x 103 clulas en dos microplacas de 96 pocitos, en medio de cultivo celular Dulbecco High Glucosa (DMEM-HG), una placa sin y otra placa con SFB al 10%, mantenidos en incubador a 37 C, con 5% de CO2 y 95% de humedad que fueron tratadas con diferentes dosis de los extractos, para conocer el efecto de los extractos metanlicos sobre la proliferacin de estas clulas. Como controles se tuvo: clulas cultivadas (C.C) en medio DMEM con SFB al 10% (Control positivo), y clulas en DMEM con solvente METANOL (Prueba en blanco).

rESUlTadOS Y dISCUSIN

Los extractos filtrados se juntaron y evaporaron utilizando un rotavapor a 40 C, con lo que se obtuvieron 5,61 g de extracto metanlico seco (5,61%) de E. arvense, 13,5 g de B. orellana (13,5%) y 1,5 g de B. incana (7,5%).

Las pruebas bioqumicas de los extractos estudiados utilizando como solvente el metanol, permitieron determinar que E. arvense tena la ms alta cantidad de flavonoides y la menor cantidad de polifenoles y, a la vez, una menor capacidad antioxidante; mientras que Bixa orellana tena la mayor cantidad de polifenoles y mayor capacidad antioxidante, en tanto que B. incana tuvo regular cantidad de polifenoles, baja cantidad de flavonoides y moderada capacidad antioxidante (Tabla 1).



El efecto estimulante de la proliferacin de clulas madre humanas cultivadas sin SFB, pero s con el extracto, fue medido mediante tcnica XTT y expresado como Tasa de Estimulacin Celular (TEC). Se encontr que E. arvense fue el extracto que produjo la mayor TEC 173,89% a dosis de 1 280

incubacin; a las 24 horas produjo un 56,7%, a las 24 horas 70,76% y a las 72 horas, un 83,52% (Tabla 2).

El efecto estimulante de la proliferacin de clulas madre in vitro demostrado en este trabajo empleando extractos vegetales, es innovatorio y de

figura 1. clulas madre humanas Originarias de tejidO adipOsO. muestran diferente mOrfOlOga en las primeras hOras de cultivO.

tabla 1. cOntenidO de pOlifenOles, flavOnOides y capacidad antiOxidante del extractO metanlicO de plantas medicinales.

Nombre de la planta Polifenoles (mg de cido glico/100 de m. s.)

Flavonoides (mg de catequina /100 g de m.s.)

FRAP (mmoles/100 g m.s.) Capacidad an-tioxidante

Equisetum arvense 407.30 3 200.53 5.60Bixa orellana 2 241.00 1 616.96 28.11Buddleja incana 1 595.18 773.89 16.25

g/ml y a las 48 horas (Figura 2), seguido por B. orellana 106,92% a las 48 horas (Figura 3), mientras que B. incana (Figura 4) tuvo menor TEC (80,81%) que el control SFB (83,52%) (Tabla 2). Por otro lado, en las clulas cultivadas con extracto de E. arvense a dosis de 1 280 g/ml y SFB se produjo la mas alta TEC 367,34%, superior a la experiencia sin SFB. El extracto metanlico de Bixa orellana produjo una TEC de 337,82% a dosis de 1 280 g/ml, mientras que B. incana produjo una TEC de 226,04%, a dosis de 1 280 g/ml (Figuras 5, 6 y 7).

La tasa de estimulacin de la proliferacin de clulas madre humanas producida por los extractos metanlico de E. arvense, B. orellana y B. incana, en este trabajo, estara relacionada con el contenido de flavonoides, mas no con la capacidad antioxidante ni el contenido de polifenoles totales, puesto que en E. arvense son significativamente menores.

El SFB al 10% produjo una TEC mxima dependiente del tiempo de

importancia para trabajos de expansin de poblaciones de clulas madre con fines de terapia regenerativa; pero tambin es importante por la factibilidad de su utilizacin in vivo, debiendo evaluarse experiencias como estimulantes de clulas progenitoras, como se ha demostrado con el extracto de Uncaria tormentosa sobre clulas de cordn umbilical (21); mientras que un extracto, el polifenol epigallectin y la catequina del t verde han demostrado efectos de promocin de la osteognesis e inhibicin de

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la adipognesis, en clulas madre de mdula sea (22), similares a los efectos del flavonoide poncirin de la fruta Poncirus trifoliata (23).

FINaNCIaMIENTO

Este trabajo fue financiado por el CONCYTEC mediante contrato No. 017-2010-CONCYTEC-OAJ

tabla 2. tasa de estimulacin celular expresada en pOrcentaje del suerO fetal bOvinO sObre clulas madre humanas segn tiempO.

Tipo de clulas Tasa de estimulacin celular (TEC) %24 horas 48 horas 72 horas

Suero fetal bovino Humanas 56,70 70,76 83,52

aGradECIMIENTOS

Al CONCYTEC por el apoyo brindado para lograr los objetivos de este proyecto. A Fredy Fabin estudiante de la Universidad Hermilio Valdizn de Hunuco, quien recolect la planta Buddleja incana.

figura 2. tasa de estimulacin celular del extractO metanlicO de e. arvense sObre clulas madre humanas segn dOsis y tiempO, cultivadas sin sfb.

figura 3. tasa de estimulacin celular del extractO metanlicO de B. orellana sObre clulas madre humanas segn dOsis y tiempO, cultivadas sin sfb.



figura 4. tasa de estimulacin celular del extractO metanlicO de B. incana sObre clulas madre humanas segn dOsis y tiempO, cultivadas sin sfb.

figura 5. tasa de estimulacin celular del extractO metanlicO de e. arvense sObre clulas madre humanas cultivadas cOn sfb.

figura 6. tasa de estimulacin celular del extractO metanlicO de B. orellana sObre clulas madre humanas cultivadas cOn sfb.

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figura 7. tasa de estimulacin celular del extractO metanlicO de B. incana sObre clulas madre humanas cultivadas cOn sfb.

REFERENCIaS

1. Friedenstein AJ, Piatetzky S II, Petrakova KV. Osteogenesis in transplants of bone marrow cells. J Embryol Exp Morphol. 1966; 16: 381- 90.

2. Liu ZJ, Zhuge Y, Velsquez OC. Trafficking and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells. Journal of Cellular Biochemistry 2009; 106: 984-91.

3. Yang JA, Chung HM, Won CH, Sung JH. Potential application of adipose-derived stem cells and their secretory factors to skin: discussion from both clinical and industrial viewpoints. Expert Opin Biol Ther. 2010;10(4): 495-503.

4. Uysal AC, Mizuno H. Tendon regeneration and repair with adipose derived stem cells. Curr Stem Cell Res Ther. 2010; 5(2): 161-7.

5. Kuhbier JW, Weyand B, Sorg H, Radtke C, Vogt PM, Reimers K. Stem cells from fatty tissue: A new resource for regenerative medicine? Chirurg. 2010;81(9):826-32.

6. Martinello T, Bronzini I, Maccatrozzo L, Mollo A, Sampaolesi M, Mascarello F, Decaminada M, Patruno M. Canine adipose-derived-mesenchymal stem cells do not lose stem features after a long-term cryopreservation. Res. Vet. Sci. 2010; 21.

7. Turnovcova K, Ruzickova K, Vanecek V, Sykova E, Jendelova P. Properties and growth of human bone marrow mesenchymal stromal cells cultivated in different media. Cytotherapy 2009; 25: 1-12.

8. Kenyon J, Gerson S.L. The role of DNA damage repair in aging of adult stem cells. Nucleic Acids Research 2007; 35(22): 7557-65.



9. McNiece I, et al. Ex vivo expansion of cord blood mononuclear cells on mesenchymal stem cells. Cytotherapy, 2003; 6: 311-17.

10. Wulf-Goldenberg A, et al. Cytokine pre-treatment of CD34+ cord blood stem cells in vitro reduces long-term cell engraftment in NOD/SCID mice. Eur J of Cell Biology 2007; 87: 69-80

11. Levay K, et al. Tescalcin is an essential factor in megakaryocytic differentiation associated with Ets family gene expression. Journal of Clinical Investigations 2007; 117: 2672-83.

12. Sigma Aldrich. Growth Factors and Cytokines for Stem Cell Biology. Brochure. 2009. www. sigma.com/stemcellgf

13. Vicente MA, Vzquez MN, Entrena A, Olmedillas S, Garca-Arranz M, Garca-Olmo D, Zapata AG. Low doses of BMP4 increases the survival of human adipose-derived stem cells maintaining their stemness and multipotency. Stem Cells Dev. 2010; Sep 16.

14. Baer PC, Griesche N, Luttmann W, Schubert R, Luttmann A, Geiger H. Human adipose-derived mesenchymal stem cells in vitro: evaluation of an optimal expansion medium preserving stemness. Cytotherapy 2010; 12(1): 96-106.

15. Benzie IFF, Strain JJ. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of antioxidant power: the FRAP assay. Anal Biochem, 1996; 239: 70-76.

16. Singleton VL, Rossi JA. Colorimetry of total phenolics with phosphomolibdic phosphotungstic acid reagents. Am. J. Enol. Vitic. 1965; 16: 144-58.

17. Jia Z, Tang M, Wu J. The determination of flavonoid contents in mulberry and their scavenging effects on superoxide radicals. Food Chem, 1999; 64: 555-99.

18. Freshney I. Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique. 3rd edition. 1994; Alan R. Liss, Inc., New York.

19. Mather J, Barnes D. Eds. Methods in Cell Biology, Academic Press, San Diego. Animal Cell Culture Methods, 1998; 57.

20. Lam HW, Lin H CH, Lao S CH, Gao JL, Hong SJ, Leong CH W, Yue PYK, Kwan YW, Leung AYH, Wang YT, Lee SM. The angiogenic effects of Angelica sinensis extract on HUVEC in vitro and zebrafish in vivo. J. Cell. Biochem, 2008; 103: 195-211.

21. Farias I, do Carmo Arajo M, Zimmermann ES, Dalmora SL, Benedetti AL, Alvarez-Silva M, Asbahr AC, Bertol G, Farias J, Schetinger MR. Uncaria tomentosa stimulates the proliferation of myeloid progenitor cells. J Ethnopharmacol. 2011; 137(1): 856-63.

22. Ko CH, Siu WS, Wong HL, Shum WT, Fung KP, Lau CB, Leung PC. Pro- bone and Antifat Effects of Green Tea and Its Polyphenol, Epigallocatechin, in Rat Mesenchymal Stem Cells in Vitro. J Agric Food Chem. 2011; 59(18): 9870-6.

23. Yoon HY, Yun SI, Kim BY, Jin Q, Woo ER, Jeong SY, Chung YS. Poncirin promotes osteoblast differentiation but inhibits adipocyte differentiation in mesenchymal stem cells. Eur J Pharmacol. 2011; 664(1-3): 54-9.

recepcin: 27/05/2011 aceptacin: 22/07/2011

javier encisOcOrrespOndencia: [email protected]

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LES David Prosopio, Jorge Torres, Erick Valdivia, Elmer Salinas P., Margot De los Ros

rESUMEN

La enfermedad periodontal, en todas sus formas, es una de las afecciones que ms afecta al ser humano. Por ello, dentro del tratamiento para esta patologa se consideran terapias no quirrgicas y terapias quirrgicas que implican incisin de los tejidos blandos, los cuales, luego del procedimiento en s, se reparan mediante el proceso de cicatrizacin. El objetivo de este trabajo fue comparar la cicatrizacin en incisiones a nivel gingival en cobayos con la aplicacin de Aloe vera y sin este, en el periodo de una semana.

Palabras clave: Aloe vera, cobayos, cicatrizacin

aBSTraCT

Periodontal disease is in all its forms one of the most senious affections that affect humans. Therefore within the treatment for this disease is considered: not surgically therapy and surgical therapy, which involves soft tissue incision, that after the procedure itself is carried out the tissue repair through the healing process. The aim of this study was to compare the healing of gingival incisions in guinea pigs at the application of Aloe vera and without the aloe in the period of one week.

Keywords: Aloe vera, guinea pig, healing

David Prosopio1, Jorge Torres1, Erick Valdivia1, Elmer Salinas P.1, Margot de los Ros1

EFECTO DEL ALOE VERA EN LA CICATRIZACIN DE LESIONES GINGIVALES

EFFECT OF Aloe-verA IN HEALING GINGIVAL LESIONS

1universidad cientfica del sur. facultad de estOmatOlOga

INTrOdUCCIN

La capacidad de respuesta a una agresin de un tejido es determinada por una serie de eventos que, de manera progresiva, se activan para restablecer las condiciones de integridad que este haya tenido antes de ser afectado. Previamente a considerar los procesos de reparacin tisular, es importante tener presente que la cicatrizacin es el resultado de la regeneracin de los tejidos y del cierre de una herida; no se trata de un fenmeno aislado y su evolucin est condicionada por una serie de factores bioqumicos a nivel de la solucin de continuidad que representa la lesin, por unos cambios en las estructuras tisulares y por una serie de procesos que determinan la formacin de la cicatriz. Este proceso puede ser dividido en tres etapas bsicas: de inflamacin, fibroblstica y de remodelacin. Dentro de este complicado proceso en la cavidad bucal, juega un papel importante la funcin de diversas clulas como el fibroblasto gingival, el queratinocito y el colgeno (1). En situaciones de heridas abiertas y quemaduras (2), es importante la rpida reparacin de las lesiones, las cuales podran mejorar a travs de la aplicacin de sustancias que favorezcan su crecimiento. La aplicacin simultnea de Aloe vera sera una opcin eficaz para lograr este objetivo en heridas abiertas (3).

El Aloe vera es una planta de la familia Xanthorrhoeaceae, de hojas gruesas,


Efecto del aloe vera en la cicatrizacin de lesiones gingivales

lanceoladas, espinosas y carnosas. Tiene efectos antimicrobianos debido a las sustancias que contiene, como la aloetina, que neutraliza el efecto de las toxinas microbianas, y la saponina, que acta como antisptico. Adems, tiene componentes antiinflamatorios como la emolina, la emodina y la barbaloina, que generan cido saliclico, y los fitosteroles, que tambin tienen efectos antiinflamatorios. Podemos mencionar, asimismo, efectos cicatrizantes por su contenido de fosfato de manosa, carricina (2), que refuerza el sistema inmune, y hormonas vegetales, que ayudan a la reparacin de tejidos y el crecimiento celular.

Desde hace mucho tiempo se viene utilizando el Aloe vera en la medicina tradicional debido a su efecto cicatrizante. Adems, estudios en ratas han demostrado que un polisacrido extrado del Aloe vera estimula factores de crecimiento y proliferacin tisular como el factor de crecimiento queratinoctico (KGF-1), el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y la produccin de colgeno tipo I (1).

El Aloe vera presenta una amplia variedad de especies, calculada en hasta 360 variedades (2), de las cuales la ms utilizada en la medicina tradicional es Aloe barbadensis (1,2), por sus beneficios cicatrizantes y antiinflamatorios, adems de otros beneficios, como se sugiere en estudios realizados. La administracin oral de Aloe vera podra ser un complemento til para reducir la glucosa en la sangre de pacientes diabticos, as como reducir los niveles de lpidos en sangre de pacientes con hiperlipidemia, con resultados prometedores de su actividad oral y tpica (2).

OBJETIvO

Determinar el efecto antiinflamatorio y cicatrizante de Aloe vera (sbila) sobre lesiones gingivales en animales de laboratorio (cobayos).

JUSTIFICaCIN dEl ESTUdIO

La justificacin se basa en hallazgos clnicos en los que se aplic la sbila a diferentes niveles y se obtuvo efectos positivos en los procesos antiinflamatorios y reparadores de los tejidos como piel, mucosa gstrica entre otros. Asimismo, existen estudios que han demostrado su eficacia en enfermedades sistmicas y en heridas abiertas. Estos resultados son prometedores y llevan a continuar investigando para descubrir otros beneficios de la planta.

Determinar el efecto de la sbila sobre las lesiones gingivales podra ser de mucho aporte para el periodoncista y odontlogo de prctica general, ya que sus componentes podran utilizarse en apsitos posquirrgicos o sobre lesiones ya establecidas, con lo que ayudaran a disminuir los procesos inflamatorios y mejoraran la actividad reparadora de las clulas de la gngiva.

MaTErIalES Y MTOdOS

Estudio doble ciego en 14 animales de laboratorios (cobayos). Se utilizaron savia de Aloe vera, bistur, gasa estril, recipientes de vidrio con formol al 10% y microscopio Leica.

Figura 1. cOrte de 3 a 4 mm en la enca adherida.

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rESUlTadOS

OBSERVaCIONES CLNICaS

El primer da no se observaron diferencias significativas; ambos grupos mostraron la herida con inflamacin circundante. El da 2, el grupo experimental present mejores caractersticas reparadoras y menor inflamacin en relacin con el grupo control.

Al cuarto da, las caractersticas clnicas son evidentes al presentarse un mejor avance en el grupo experimental (con aplicacin de Aloe vera). Al octavo da, las cicatrices del grupo experimental tienen menor volumen en relacin con las del grupo control 1, y en comparacin con el tercer grupo (grupo control 2) las caractersticas de la enca han reparado de manera eficaz. Luego se sacrific a los especmenes para el estudio histolgico de la zona analizada.

HISTOLOGa

En el grupo experimental (con aplicacin de Aloe vera) se observ un mayor nmero de clulas epiteliales, moderada queratinizacin, cantidad moderada de vasos sanguneos, fibroblastos organizados y poco o nada infiltrado inflamatorio (figuras 4, 5, 8 y 9).

Se separ a los especmenes en tres grupos: dos de 6 individuos y uno de 2 individuos (grupo control). El Aloe vera se prepar haciendo un corte en la base de la penca y se puso en agua para que sus componentes qumicos que podran ser irritantes, como el Cu, P, Mg, I, fluyan hacia afuera de la hoja y poder as trabajar con los componentes antiinflamatorios y cicatrizantes (figura 3).

Al primer grupo de 6 individuos (grupo experimental) se le realiz un corte de 3 a 4 mm en la enca adherida a nivel del incisivo central derecho, y se les aplic inmediatamente el Aloe vera preparado previamente. A estos especmenes se les aplic el Aloe vera 2 veces cada 24 horas durante 4 das (figuras 1 y 2).

Al segundo grupo de 6 unidades tambin se le realiz un corte con las mismas caractersticas que al primer grupo, pero no se les aplic el Aloe vera; este fue el primer grupo control. Al tercer grupo, de 2 individuos, no se le realiz ninguna incisin ni aplicacin de Aloe vera (segundo grupo control).

Figura 4. micrOfOtOgrafa a 10x, cOlOracin he, cOn tratamientO de aloe vera.

Figura 3. recOleccin del gel de aloe vera.

Figura 2. aplicacin del aloe vera luegO del cOrte.



Figura 5. micrOfOtOgrafa a 40x, cOlOracin he, cOn tratamientO de aloe vera. se Observan vasOs sanguneOs, fibrOblastOs OrganizadOs y cOlgenO,

nO se Observa infiltradO inflamatOriO.

Figura. 7. micrOfOtOgrafa a 40x, cOlOracin he de enca, sin tratamientO cOn aloe vera. se

Observan mltiples vasOs sanguneOs, fibrOblastOs desOrganizadOs infiltradO inflamatOriO.

Figura 6. mmicrOfOtOgrafa a 10x, cOlOracin he, sin tratamientO de aloe vera.

Figura 8. anlisis cOmparativO de las caractersticas histOlgicas cOn y sin la aplicacin de aloe vera.

tabla 1. infOrme de lectura histOlgica.

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dISCUSIN

Los efectos antiinflamatorios y reparadores del Aloe vera actan de manera positiva sobre los tejidos gingivales, al mejorar la respuesta celular y tisular frente a una agresin. Se debera continuar analizando y hacer el estudio en un grupo experimental ms grande detallando las caractersticas clnicas e histolgicas de las lesiones. En estudios anteriores se muestran similares resultados, como en el realizado por Suwimon Jettanacheawchankit y col.,

n nn n

tabla 2. resultadOs

tabla 3. resultadOs cualitativOs y cuantitativOs

donde se observa la estimulacin de los factores de crecimiento para fibroblastos y clulas epiteliales con la aplicacin de gel de Aloe vera, lo que mejora la cicatrizacin de heridas abiertas.

CONClUSIN

El gel de Aloe vera tiene efectos antiinflamatorios, cicatrizantes y reparadores sobre las lesiones gingivales en animales de laboratorio.



rEFErENCIaS BIBlIOGrFICaS

1. Jettanacheawchankit S. Sasithanasate S, Sangvanich P, Banlunara W, Thunyakitpisal P. Stimulates Gingival Fibroblast Proliferation; Expressions of Keratinocyte Growth Factor-1, Vascular Endothelial Growth Factor, and Type I Collagen; and Wound Healing. Journal Pharmacol Sci 2009; 109: 525-31.

2. Vogler BK, Ernst E. Aloe vera: a systematic review of its clinical effectiveness. British Journal of General Practice 1999; 49: 823-8.

3. Sampaio FA, Passarini JR, Marretto M, Mendona J, Franchini C, Tech dos Santos G. Effects of the application of Aloe vera and microcurrent on the healing of woundssurgically induced in Wistar rats. Acta Quirrgica Brasileira 2009; 24 (2).

4. Calixto Cotos M. Plantas medicinales utilizadas en odontologa. Disponible en: http://cpu.usmp.edu.pe/odonto/servicio/2006rv2/Kiru3.pdf

5. Meja K y Rengifo E. Plantas medicinales de uso popular en la Amazona peruana. Lima: AECI, 2000.

6. Segura L. Aplicaciones farmacodinmicas y farmacocinticas del Aloe vera. Rev. Acofar, 1994


david prOsOpiOcOrrespOndencia: [email protected]

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rESUMEN

La utilizacin de la inseminacin artificial en el mejoramiento gentico del caballo peruano de paso es cada vez ms frecuente. Existen diversas tcnicas de inseminacin en equinos, las cuales utilizan semen fresco, refrigerado o congelado. Para realizar un adecuado manejo del semen, es necesario diluir los espermatozoides en medios que provean las condiciones adecuadas para su supervivencia. Existen diversos dilutores comerciales o caseros formulados en base a leche descremada; sin embargo, son pocos los estudios que indiquen el efecto de dichos dilutores en la conservacin del semen equino. El objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto de diferentes dilutores desarrollados para semen equino refrigerado en la funcionalidad de espermatozoides de caballo peruano de paso. Se refrigeraron siete muestras de semen equino, provenientes de dos potros. Cada muestra fue dividida en tres partes y diluida con los dilutores E-Z Mixin - ARS (EZ), EquiPRO - Minitb (EP) y leche descremada (LD). Las muestras fueron almacenadas a 5 C y la evaluacin se realiz a las 0, 24 y 48 horas. Se evaluaron la motilidad progresiva y la integridad funcional de membrana espermtica, mediante el test hiposmtico (HOST). Los resultados de la evaluacin de motilidad espermtica a las 24 y

48 horas luego de la refrigeracin, indican que el dilutor EP (43 y 12%) brinda mejores resultados (P 0,05) en comparacin con los dilutores EZ (32 y 7%) y LD (23 y 2%). Los porcentajes de espermatozoides con adecuada integridad de membrana fueron similares entre los tres tipos de dilutores. Estos resultados nos permiten concluir que el dilutor ms adecuado para conservar espermatozoides refrigerados de semen de caballo peruano de paso sera el EquiPRO - Minitb. Por otro lado, la utilizacin de leche descremada no brindara ventajas respecto de los dilutores comerciales para la refrigeracin de semen equino.

Palabras clave: caballo peruano de paso, biotecnologa, dilutor, refrigeracin, semen

SUMMarYThe use of artificial insemination in the breeding of the Peruvian Paso Horse is becoming increasingly common. There are several equine insemination techniques using fresh semen, chilled or frozen. For proper handling of semen, sperm must be diluted in media provide the right conditions for their survival. There are several commercial or homemade diluter formulated based on skim milk, however few studies showing the effect of these diluter in the preservation of

EVALUACIN DE TRES DILUTORES PARA LA REFRIGERACIN DE SEMEN DE CABALLO PERUANO DE PASO Y SUS EFECTOS SOBRE LA MOTILIDAD ESPERMTICA E INTEGRIDAD FUNCIONAL DE LA

MEMBRANAEVALUATION OF THRE EXTENDERS FOR THE SEMEM REFRIGERATION PROCESS OF PERUVIAN PASO HORSES, AND HIS EFFECTS ON THE MOTILITY SPERM AND FUNCTIONAL MEMBRANE INTEGRITY

Vernica Orozco Chvez1, Manuel Rosemberg Barrn2, Alexei Santiani Acosta2, Humberto Rodrguez Landeo2

1universidad cientfica del sur. facultad medicina veterinaria y zOOtecnia. unidad de zOOtcnica y tecnOlgica. lima2universidad cientfica del sur. facultad medicina veterinaria y zOOtecnia. lima


Evaluacin de tres dilutores para la refrigeracin de semen de caballo peruano de paso y sus efectos sobre la motilidad espermtica e integridad funcional de la membrana

stallion semen. The aim of this study was to evaluate the effect of different sperm diluter developed for equine sperm functionality Peruvian Paso Horse under refrigeration processes. 7 samples were refrigerated for stallion semen, from 2 foals. Each sample was divided into 3 parts and diluted with EZ-Mixin diluter-ARS (EZ)-Minitb Equipro (EP) and skim milk (LD). The samples were stored at 5 C and the evaluation was performed at 0, 24 and 48 hours. Progressive motility was evaluated and the sperm membrane functional integrity by the hypo-osmotic test (HOST). The results of the evaluation of sperm motility at 24 and 48 hours after cooling, indicating that the EP diluter (43 and 12%) provides better results (P 0.05) compared with the diluter EZ (32 and 7%) and LD (23 and 2%). The percentages of spermatozoa with membrane integrity proper were similar among the 3 types of diluter. These results demonstrate that the most appropriate diluter to keep chilled semen sperm Peruvian Paso Horse-Minitb would Equipro. The use of skim milk would provide no advantages over commercial diluter for cooling stallion semen.Keywords: Peruvian Paso Horse, biotechnology, diluter, cooling, semen

INTrOdUCCINLos dilutores son medios apropiados capaces de mantener la viabilidad espermtica del semen fresco, refrigerado o congelado, a corto o largo plazo. Se caracterizan por disminuir la contaminacin bacteriana, mantener la viabilidad espermtica (1) y obtener mayor volumen del semen (2), con lo que aumentan la tasa reproductiva del macho al inseminar artificialmente a un mayor nmero de yeguas. Existen dilutores comerciales como el E-Z Mixin (CST) - Animal Reproduction Systems, Equipro - Minitb y caseros como la leche fresca descremada UHT Gloria Sper Light (ultra pasteurizada, 0% grasas). El EZ Mixin (CST) - ARS (EZ) est formulado en base a leche descremada en polvo y glucosa (3). Generalmente, es empleado para conservar el semen

equino refrigerado (5 C) (4), ya que a temperatura ambiente desciende la motilidad espermtica (5). Tambin contiene slidos no grasos y sulfato de amikacina. No se especifican ms compuestos en su frmula. El Equipro - Minitb (EP) est formulado en base a caseinatos especficos, protenas de suero de leche y un amplio rango de azcares. No contiene antibiticos ni leche descremada (6). No se especifican ms compuestos en su frmula. Pagl y col. (2006) (7) indican que dilutores (como el EquiPRO - Minitub) formulados en base a estos compuestos son superiores a la leche descremada (3). Pese a esto, los dilutores usados generalmente estn formulados en base a leche descremada y yema de huevo, y ofrecen variados resultados en relacin a la motilidad espermtica (8, 9).

Son pocas las investigaciones dirigidas a la evaluacin de diferentes dilutores de semen de caballo peruano de paso para su conservacin. Por ejemplo, Donayre (1987) (10) y Ruiz (2001) (11) no encontraron diferencias significativas entre dilutores empleados en semen equino, y obtuvieron pobres resultados (27.50% de motilidad a las 19,5 horas de refrigeracin). Por tal motivo, es de suma importancia seguir evaluando los dilutores existentes en el mercado, a fin de poder optimizar las tcnicas de preservacin de semen de caballo peruano de paso.

MaTErIalES Y MTOdOS1.1 Perodo de estudio

El trabajo se realiz durante el mes de septiembre del 2009. Tuvo una duracin de cuatro semanas, y se destinaron dos das de la semana (martes y jueves en horas de la maana) para realizar las colecciones seminales de los potros seleccionados.

1.2 Lugar de estudio

Esta etapa se realiz en un criadero ubicado en el km 40 de la Antigua Panamericana Sur. Luego de haber colectado a los potros, las muestras de semen fueron transportadas

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LES Vernica Orozco Chvez, Manuel Rosemberg Barrn, Alexei Santiani Acosta, Humberto Rodrguez Landeo

al laboratorio CIRE. (Centro de Investigacin y Reproduccin Equina), ubicado en Mamacona (Lurn), para realizar los respectivos anlisis.

1.3 Potros

Se seleccionaron dos potros de la raza caballo peruano de paso (CPP), los cuales tenan 8 aos (potro 1) y 10 aos (potro 2) de edad, con 280 y 290 kg de peso, respectivamente.

1.4 Coleccin de semen

Para realizar las colecciones seminales, se seleccionaron potros segn su comportamiento y aceptacin de la vagina artificial, tal como se muestra a continuacin:

ventocraneal (figura 2). Con la vagina artificial armada y lista para su uso, se aproximaba el potro a la yegua. El potro se estimulaba y, una vez que el pene estaba totalmente protruido, se le alejaba de la yegua para poderle lavar y secar el pene. Esto permiti eliminar esmegma u otros detritus presentes en la superficie peneana. Finalmente, se volva a acercar al potro a la yegua, y una vez que el pene estaba totalmente protruido y erecto, se dejaba que monte a la yegua y el pene era desviado hacia la vagina artificial (figura 3). Al trmino de la eyaculacin, se llevaba el semen al laboratorio.

1.5 Manejo, dilucin y refrigeracin de semen

Las muestras de semen obtenidas fueron filtradas para separar la

Para realizar las colecciones seminales, se utiliz una vagina artificial tipo Missouri (figura 1). Dado que se utilizaba una sola vagina artificial para los dos potros, previamente a su armado, se proceda a colocarle y retirarle (antes y despus de cada coleccin) un guante de palpacin en el interior (entre las fundas de ltex). Se llenaba la vagina artificial con agua a una temperatura inicial, que oscilaba entre 48 C y 49 C, hasta obtener una temperatura final de 41 C-42 C. En el extremo de la vagina artificial se coloc un whire pack (bolsa de coleccin), el cual fue protegido por una membrana oscura y aseguradas ambas con un cinta. Finalmente, se lubric la vagina artificial en la porcin distal con gel no espermicida.

Momentos antes de la coleccin, se identificaba una yegua en celo a fin de que el potro se estimulara con mayor rapidez. A la yegua se le colocaba una traba a nivel de la cuartilla de uno de los miembros posteriores y se le vendaba y amarraba la cola en direccin

fraccin gel del eyaculado. Para ello, se verti el eyaculado obtenido en otra bolsa colectora que contena el filtro de nailon (malla con poros de 37 m), que permita el pasaje de la porcin menos

densa del eyaculado. La primera evaluacin seminal se realiz con el semen fresco inmediatamente despus de la coleccin. Solo las muestras con motilidad > 50% fueron consideradas aptas para el presente estudio. Las muestras seleccionadas fueron diluidas 1:1 con el dilutor respectivo, a fin de transportar las muestras refrigeradas (caja de tecnopor con packs de hielo) al laboratorio (duracin del viaje: 20 min). Los grupos formados fueron:

1) Grupo EZ-24: 5 ml de semen + 5 ml de dilutor EZ para ser evaluado a las 24 horas;2) Grupo EP-24: 5 ml de semen + 5 ml de dilutor EP para ser evaluado a las 24 horas;3) Grupo LD-24: 5 ml de semen + 5 ml de dilutor LD para ser evaluado a las 24 horas;4) Grupo EZ-48: 5 ml de semen + 5 ml de dilutor EZ para ser evaluado a las 48 horas;5) Grupo EP-48: 5 ml de semen + 5 ml de dilutor EP para ser evaluado a las 48 horas;6) Grupo LD-48: 5 ml de semen + 5 ml de dilutor LD para ser evaluado a las 48 horas.



Una vez en el laboratorio, se procedi a evaluar la motilidad, concentracin e integridad funcional de membrana. Tras determinar la concentracin espermtica, se realiz la segunda dilucin en cada uno de los grupos, hasta llegar a 25 50 x 106 espermatozoides/ml correspondiente a la dosis espermtica para inseminacin artificial en equinos con semen refrigerado (12). Para refrigerar las muestras seminales diluidas, se emple el Equitainer, el cual es un contenedor que permite el enfriamiento inicial lento (a 0,3 C/min) hasta llegar a una temperatura final de 4 C a 6 C durante 48 horas (13).

1.6 Dilutores

Los dilutores utilizados fueron: 1) EZ (E-Z Mixin - Animal Reproduction System), formulado en base a leche descremada en polvo, glucosa, slidos no grasos y sulfato de amikacina; 2) EP (Equipro - Minitb), formulado en base a caseinatos especficos, protenas de suero de leche, amplio rango de azcares, sin antibiticos ni leche descremada; y 3) LD (Leche descremada Gloria), leche fresca UHT, descremada, sper light, 0% grasas, con vitaminas A, C, D y E. El efecto de dilutores sobre la motilidad espermtica y la integridad funcional de membrana fue evaluado a las 0, 24 y 48 horas de refrigeracin.

1.7 Evaluacin del semen

1.7.1 Motilidad espermtica

Se utiliz el mtodo subjetivo para determinar el porcentaje de espermatozoides motiles. Con una pipeta pasteur, se tom una pequea muestra de semen y se la coloc en una lmina portaobjetos temperada en una platina a una temperatura aprox. de 37 C. Sobre esta muestra se coloc una lmina cubreobjetos (tambin temperada) y se observ al microscopio a 100X. Los resultados fueron expresados en porcentaje de espermatozoides motiles con respecto al total de espermatozoides observados en diversos campos.

1.7.2 Integridad funcional de membrana

Para evaluar la integridad funcional de membrana se realiz el test hiposmtico (HOST). Se prepar un medio de sacarosa diluido en agua bidestilada (18 g/l) (14). En un tubo Eppendorf, se colocaron 1 ml de la solucin preparada y 100 l de semen, para ser incubados en una estufa durante 30 minutos a 37 C. Posteriormente, se contaron en promedio 100 espermatozoides, los cuales fueron clasificados como HOS+ (membrana citoplasmtica funcional, con la cola espermtica hinchada y/o doblada) o HOS- (membrana citoplasmtica daada, con la cola espermtica recta) (figura 4). Los resultados se expresan en porcentaje de espermatozoides HOS+, es decir, con la membrana espermtica funcional.

Tabla 1. Porcentaje de motilidad espermtica posrefrigeracin con diferentes dilutores a las 0, 24 y 48 horas

Horas

Muestras seminales

Sin dilutorCon dilutor

E-Z Mixin - ARS (CST) EquiPRO - MinitbLeche descremada

GloriaX DS X DS X DS X DS

0 74.29 1.82 - - -24 - 32.71 20.29 (ab) 43.29 20.84 (a) 23.36 19.00 (b)48 - 7.93 6.78 (ab) 12.50 12.05 (a) 2.71 3.20 (b)

** En las comparaciones horizontales, letras diferentes implican diferencias significativas (P 0,05).

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rESUlTadOS Y dISCUSINEl objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto de tres tipos de dilutores sobre la calidad seminal, luego de ser sometidas las muestras a un proceso de refrigeracin por 48 horas. Los parmetros evaluados fueron la motilidad espermtica y la integridad funcional de la membrana celular, medida mediante el test hiposmtico.

Inicialmente, tras colectar el semen de los potros seleccionados, se evalu la calidad del semen momentos antes de realizar las primeras diluciones. Los principales parmetros evaluados fueron la motilidad espermtica, la concentracin espermtica y el volumen seminal libre de gel, en los cuales se obtuvieron valores de 72%, 130 x 106 espermatozoides/ml y 56 ml, respectivamente. Estas caractersticas son similares a las descritas anteriormente para muestras seminales de caballo peruano de paso obtenidas por Donayre (1987) (10), Borgesa (2004) (15), Vsquez (2005) (16) y Ruiz (2001) (11).

Todas las muestras de motilidad espermtica obtenidas en el presente estudio, al inicio, tuvieron un porcentaje adecuado de alrededor del 75%. Se observ una notoria disminucin de motilidad a las 24 y 48 horas.

En la evaluacin a las 24 horas, la motilidad del grupo EP fue significativamente mayor (P < 0.01) en comparacin con el grupo LD. Esta misma tendencia se observ a las 48 horas. El grupo EZ fue similar (P > 0.05) al grupo EP y LD, tanto a las 24 como a las 48 horas. Esta semejanza entre los dilutores EP y EZ, a partir de las 24 horas de refrigeracin, pudo ser consecuencia de la similitud de los compuestos con los cuales han sido formulados. El EZ est formulado en base a leche descremada en polvo y glucosa (3), slidos no grasos y sulfato de amikacina. El dilutor EP, por su parte, est formulado en base a caseinatos especficos, protenas de bajo peso molecular y un amplio rango de azcares. No contiene antibiticos ni leche descremada (6). El dilutor LD, en cambio, solo contena leche

descremada (0% grasas) y vitaminas A, C, D y E; no se le aadi ningn otro compuesto extra. Los resultados obtenidos coinciden con los de Pagl y col. (2006) (7), quienes observaron que el dilutor EP fue superior a dilutores formulados en base a leche descremada en los procesos de refrigeracin de semen de caballos (3), como consecuencia de sus compuestos. Cabe destacar que las protenas presentes en la leche otorgan proteccin a los espermatozoides frente a las bajas temperaturas (17, 18). Por tal motivo, es un compuesto comn en la formulacin de dilutores de semen. Pese a esto, la disminucin de la motilidad espermtica a partir de las 24 horas de refrigeracin pudo ser consecuencia de la ausencia de otros compuestos tales como antibiticos, glucosa, bicarbonato de sodio u otros, los cuales permitiran cumplir la funcin de un dilutor eficiente (3, 19, 20, 21) al crear un medio capaz de conservar la motilidad progresiva, as como de ofrecer mejores ndices de concepcin frente a la leche descremada sin otro compuesto (22).

Existen diversos estudios en los que se indica la eficiencia del dilutor EZ. Frand y col. (1987) (23) almacenaron una muestra de semen diluido con el dilutor E-Z Mixin a 20 C por 24 horas, y obtuvieron una motilidad del 19%. Pickett y Amann (1987) (24) evaluaron dos tratamientos de semen diluido con E-Z Mixin a 20 C, los cuales fueron almacenados durante 34 y 48 horas, y obtuvieron una motilidad del 23% y el 15%, respectivamente. En ambos estudios, los autores sealaron que las diferencias obtenidas entre experimentos pueden deberse a la edad de los animales y/o a la inherente variacin que puede haber en las metodologas experimentales. En relacin con los resultados obtenidos en el presente estudio, a las 24 horas, fue mayor la motilidad espermtica obtenida por Frand y col (1987) (23); sin embargo, existe una ligera disminucin a las 48 horas de refrigeracin si se compara con los resultados obtenidos por Pickett y Amann (1987) (24). Esto pudo ser consecuencia de la temperatura de refrigeracin, ya que



el rango de temperatura ptima para mantener la motilidad espermtica (25, 26, 27) y fertilidad (19, 28) del semen equino refrigerado vara entre 4 y 6 C.

Province y col. (1985) (29), en un estudio, indicaron que la temperatura de 15-20 C es superior a los 5 C para mantener la motilidad y viabilidad espermtica del semen equino; sin embargo, esta evaluacin se realiz solo entre 4 y 12 horas de refrigeracin. Estudios franceses indican que, para mantener una buena motilidad espermtica, el semen debe ser refrigerado a 15 C en vez de 10 C o 4 C cuando el dilutor no contiene leche (30). Tambin indicaron que la motilidad espermtica se conserva mejor a 4 C en vez de a 15 C cuando el dilutor est formulado en base a leche. Se debe considerar que la fertilidad del semen refrigerado a 20 C por ms de 24 horas puede ser favorable para algunos sementales (31, 27); pero para otros sementales puede verse afectado negativamente a partir de las 12 horas de almacenamiento. Asimismo, se ha reportado que el almacenamiento a 5 C, es ms viable en comparacin con los 20 C para semen que ser almacenado por perodos mayores a 12-24 horas (28). En los tres grupos de dilutores evaluados, la disminucin de la motilidad espermtica a partir de las 24 horas de refrigeracin pudo haber sido consecuencia de la presencia y cantidad del plasma seminal, la generacin de radicales libres a partir de espermatozoides daados, muertos o defectuosos, entre otras causas.

El plasma seminal contiene ciertos sustratos capaces de activar el

movimiento espermtico e iniciar el proceso de maduracin espermtica (32), lo que desfavorece su conservacin vital (33). Pickett y col. (1975) (34) sealan que existe un compuesto en el plasma seminal con efecto detrimente sobre los espermatozoides, el cual podra causar la disminucin de la motilidad, y la muerte espermtica durante su conservacin.

La composicin del plasma seminal vara considerablemente entre potros; por tal motivo, los efectos del plasma seminal en combinacin con diferentes dilutores no sern iguales para todos los potros. Por ejemplo, una elevada concentracin de cloruro de sodio puede ser responsable de la variacin y de la tolerancia del semen de los potros, tras provocar un cambio en la presin osmtica en los procesos de refrigeracin y/o criopreservacin (congelacin) (35).

Diversos autores sealan la importancia de mantener un determinado porcentaje del plasma seminal en el momento de conservar el semen. Tal es el caso de Palmer (1984) (19) y de Braun y col. (1994) (36), quienes indicaron que la presencia del 0% al 10% de plasma seminal en el semen permite alcanzar resultados superiores a los alcanzados del 20% al 50%. En cambio, Jasko y col. (1992) (37) sealaron que la eliminacin total del plasma seminal provoca una disminucin de la motilidad despus de dos horas de refrigeracin, por lo que recomendaron mantener entre un 5% y un 20% del plasma seminal. Otros indicaron que niveles superiores al 20%, durante

tabla 3. evaluacin de la integridad funciOnal de la membrana plasmtica pOsrefrigeracin (%)

HORASCon dilutor (HOS+)

E-Z Mixin - ARS (CST) - EZ EquiPRO - Minitb - EP Leche descremada - LDX DS X DS X DS

0 65.71 4.12 66.64 3.67 70.00 6.8424 41.29 10.66 45.07 13.39 37.14 9.1648 28.21 7.55 30.71 11.27 24.21 7.76

** En las comparaciones horizontales, letras diferentes implican diferencias significativas (P 0,05).

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un prolongado periodo, causan una notable disminucin de la motilidad espermtica (38, 37, 39). Mina y Morel (1999) (40) sealan que la remocin del plasma seminal y su reemplazo con un dilutor apropiado podra proporcionar a los espermatozoides los requerimientos necesarios para prolongar su supervivencia durante el almacenamiento. Respecto a esto, trabajos realizados por Palmer (1984) (19) hallaron tasas de supervivencia espermtica del 27,3%, 44,2%, 50,8% y 55,9%, para semen diluido que inclua un 50%, 20%, 10% y 0% de plasma seminal, respectivamente.

En el trabajo realizado, en las muestras refrigeradas se mantuvo el 100% del plasma seminal, con lo que se obtuvo, a las 24 horas, promedios del 32,71%, 43,29% y 23,36%; y a las 48 horas, promedios del 7,93%, 12,50% y 2,71% para los dilutores EZ, EP y LD, respectivamente.

En el equino, el uso de semen refrigerado es limitado debido a la baja capacidad de fecundacin. Francl y col. (1987) (31) sealaron que el semen almacenado por 24 horas es capaz de mantener una fertilidad similar al semen fresco; sin embargo, cuando es refrigerado a 5 C por 48 horas, la motilidad espermtica (37) y los rangos de fertilidad generalmente se ven disminuidos (41). Esto se debi a la presencia de espermatozoides muertos, daados por un rpido proceso de enfriamiento o morfolgicamente anormales, los cuales generaron una mayor cantidad de especies reactivas de oxgeno (ROS, por sus siglas en ingls) que los espermatozoides morfolgicamente normales (42), lo que caus diversos daos.

El otro parmetro evaluado fue la integridad de membrana mediante la prueba hiposmtica. Este test es un buen indicador de la eficiencia de los dilutores, pues se espera obtener buenos ndices de fertilidad al inseminar artificialmente yeguas. Existen dilutores que causan la

disminucin de la fertilidad (43, 44, 45), probablemente por los daos producidos a nivel de la membrana plasmtica de los espermatozoides (46). Tras realizar el test hiposmtico (HOS), los espermatozoides que posean una membrana plasmtica funcional sern aquellos que tengan la cola engrosada y enrollada (HOS+). Estos espermatozoides an mantienen la capacidad de incorporar agua para equilibrar el medio en el que estn presentes, sin que suceda una lisis celular.

Los resultados obtenidos del HOST indican que no hubo diferencia significativa (P < 0,05) entre dilutores a las 0, 24 y 48 horas de refrigeracin espermtica.

Asimismo, se observ que, conforme aumentan las horas de refrigeracin, disminuye el porcentaje de HOS obtenido. Esto puede ser consecuencia del enfriamiento, ya que los espermatozoides estn expuestos a los efectos negativos del choque trmico (47), lo que ocasiona daos en la membrana plasmtica y en su capacidad fecundante. Los resultados obtenidos son superiores a los de Ruiz (2001) (11), quien obtuvo promedios del 30,36% a las 0 horas y del 16,15% a las 20 horas, al emplear un dilutor denominado Next Generation, el cual tiene como compuesto principal la leche descremada.

Los espermatozoides siempre estn expuestos al efecto negativo del choque trmico; por ello, se considera un factor desencadenante la velocidad con la que se desciende hasta la temperatura deseada. Existe choque trmico cuando son enfriados de 37 C a 8 C a una velocidad mayor a 0,38 C/min (48). Los signos de choque trmico en los espermatozoides son una rpida disminucin de la motilidad, movimientos retrgrados y/o circulares, reduccin del metabolismo, daos a nivel acrosomal y en membrana plasmtica, siendo estos ltimos lesiones irreversibles (24, 26). La



rEFrENCIaS BIBlIOGrFICaS

1. Yates DJ, Witacre MD. Equine artificial insemination. Vet Clin North Am Equine Pract 1988; 4: 291-304.

2. Pickett B, Burwash L, Voss J, Back D. Effect of seminal extenders on equine fertility. J Anim Sci 1975; 40:1135-43.

3. Kenney RM, Bergman RV, Cooper WL, Morse GW. Minimal contamination techniques for breeding mares: techniques and preliminary finding. Proc Am Assoc Equine Pract 1975; 21: 327-36.

4. Palma G. Biotecnologa de la reproduccin. 2. ed. Mar del Plata: Produccin grfica integral, 2008.

5. Samper JC. Equine breeding management and artificial insemination. Filadelfia: WB Saunder, 2000.

6. Aurich C, Seeber P, Mller-Schlosser F. Comparison of different extenders with defined protein composition for storage of stallion spermatozoa at 5C. Reprod Domest Anim 2007; 42: 445-8.

7. Pagl R, Aurich JE, Mller-Schloser F, Kankofer M, Aurich C. Comparison of an extender containing defined milk protein fractions with a skin milk-based extender for storage of equine semen at 5 C. Theriogenology 2006; 66: 1115-22.

8. Melo MIV, Henry M, Beker ARCL. Hypoosmotic test to predict viability of equine chilled semen in different extenders. Arq Bras Med Vet Zootec 2005; 57: 757-63.

9. Price S, Aurich J, Davies-Morel M, Aurich C. Effects of oxygen exposure and gentamicin on stallion semen stored at 5 and 15 C. Reprod Domest Anim 2008; 43: 261-6.

severidad del efecto del choque trmico depende del grado de enfriamiento, intervalo entre temperaturas y variacin de la misma, por lo que pueden ser reducidos controlando el enfriamiento en las temperaturas crticas (entre 19 C y 8 C) (26) y por medio de la adicin de lpidos (yema de huevo) o protenas (leche) en el dilutor.

El contenedor empleado para refrigerar las muestras a partir de las 0 horas fue el Equitainer (Minitb) (figura 4), el cual es el contenedor ms apto para este proceso ya que realiza un enfriamiento lento (0.3C/min) hasta llegar a una temperatura final de 4 C a 6 C desde 36 horas (49, 25, 50, 51) hasta 48 horas (13). Se ha demostrado que este rango de temperatura para el proceso de refrigeracin es ptimo para mantener la motilidad (26, 25, 27) y fertilidad espermtica (19, 28, 52) del semen equino.

Si bien en el trabajo se emple el Equitainer, se debe considerar que el efecto de un rpido enfriamiento del semen tambin depende de la composicin del dilutor empleado (53).FINaNCIaMIENTO

Este trabajo se realiz con el financiamiento del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa (CONCYTEC), segn expediente N 256-2008-CONCYTEC-OAJ.

aGradECIMIENTONuestro ms profundo agradecimiento al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa (CONCYTEC) y a los directivos de la Universidad Cientfica del Sur, sin cuyo apoyo no hubiera sido posible ejecutar y culminar el presente estudio.

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10. Donayre J. Comparativo de diferentes mtodos para el congelamiento de semen equino en nitrgeno lquido. Tesis de Ingeniero Zootecnista. Lima: Univ. Nac. Agraria La Molina, 1987.

11. Ruiz C. Influencia del tiempo de refrigeracin en la motilidad espermtica e integridad de membrana citoplasmtica de semen diluido de caballo peruano de paso. Tesis de Ingeniero Zootecnista. Lima: Univ. Nac. Agraria La Molina, 2001.

12. Kareskoski AM, Reilas T, Andersson M, Katila T. Motility and plasma membrane integrity of spermatozoa in fractionated stallion ejaculates after storage. Reprod Domest Anim 2006; 41: 33-8.

13. Da Silva Filho JM, Alozio F, Silveira M, Ribeiro do Valle V, Nunes H, Capuano H. Effect of extender on the fertility of mares from different farms inseminated with diluted, cooled semen transported in a newly designed container. R. Bras. Zootec 1998; 27: 75-86.

14. Neild D. Test hipoosmtico en espermatozoides equinos. En I Congreso Argentino de Reproduccin Equina. Argentina: Laboratorio de reproduccin equina-UNRC, 2009: 143-5.

15. Borgesa G. Evaluacin de dos dilutores en dos mtodos de congelamiento de semen de caballo peruano de paso. Tesis de Ingeniero Zootecnista. Lima: Univ. Nac. Agraria La Molina, 2004.

16. Vsquez, F. Motilidad espermtica post congelamiento en semen de caballo peruano de paso, usando tres dilutores comerciales. Tesis de Ingeniero Zootecnista. Lima: Univ. Nac. Agraria La Molina, 2005.

17. Watson PF. Artificial insemination and the preservation of semen. En Lamming GE (ed.). Marshalls Physiology of Reproduction. Londres: Churchill, 1990: p 747-869.

18. Batellier F, Vidament M, Noue P, Clment F, Magistrini M, Palmer. Las tcnicas de inseminacin artificial. El punto veterinario 1998; 29: 53-9.

19. Palmer E. Factors affecting stallion semen survival and fertility. En X International Congress on Animal Reproduction and Artificial Insemination. Estados Unidos, 1984.

20. Katila T. Procedures for handling fresh stallion semen. Theriogenology 1997; 48, 1217-27.

21. Rota A, Furzi C, Panzani D, Camillo F. Studies on motility and fertility of cooled stallion spermatozoa. Reprod Domest Anim 2004; 39: 103-9.

22. Morel MCG. Equine artificial insemination. Reino Unido: CAB International, 1999.

23. Frand A, Amann R, Squires E, Pickett B. Motility and fertility of equine spermatozoa in a milk extender after 12 or 24 hours at 20 C. Theriogenology 1987; 27: 517-25.

24. Pickett B, Amann R, Extension and storage of stallion spermatozoa. Review equine veterinary science 1987; 7: 289-302

25. Varner DD, Blanchard TL, Love CL, Garcia MC, Kenney RM. Effects of cooling rate and storage temperature on equine spermatozoa motility parameters. Theriogenology 1988; 29: 1043-53.

26. Moran DM, Jasko DJ, Squires EL, Amann RP. Determination of temperatura and cooling rate which induce cold shock in stallion spermatozoa. Theriogenology 1992; 38: 999-1012.



27. Varner DD, Scanlas CM, Thompson JA, Brumbaugh GW, Blanchard TL, Carlton CM, Johnson L. Bacteriology of preserved stallion semen and antibiotics in semen extender. Theriogenology 1998; 50: 559-73.

28. Squires E, Amann RP, McKinnon AO, Pickett BW. Fertility of equine spermatozoa cooled to 5 or 20 C. Proc. Int. Cong. Anim. Reprod. 1988; 11: 297-9.

29. Province C, Squires E, Pickett BW, et al. Cooling rates, storage temperatures and fertility of extended equine spermatozoa. Theriogenology 1985; 23: 925.

30. Magistrini M, Couty I, Palmer E. Interactions between sperm packaging, gas environment, temperature and diluent on fresh stallion sperm survival. Acta Vet Scandinavica 1992; 88: 97-110.

31. Francl AT, Amann RP, Squires EL, Pickett W. Motility and fertility of equine spermatozoa in a milk extender after 12 or 24 hours at 20 C. Theriogenology 1987; 23: 925-34.

32. Katila T. Sperm-uterine interactions: a review. An Reprod Scie 2001; 68: 267-72.

33. Hafez ESE. Reproduccin e inseminacin artificial en animales. Mxico: Interamericana Mc Graw-Hill, 1996.

34. Pickett B, Burwash L, Voss J, Back D. Effect of seminal extenders on equine fertility. J Anim Sci 1975; 40:1135-43.

35. Nishikawa Y. Studies on the preservation of raw and frozen horses semen. Journal of reproduction and fertility. Supplement 1975; 23: 99-104.

36. Braun J, Sakai M, Hoch S, Oguri N. Preservation eyaculated and epididymal stallion spermatozoa by cooling and freezing. Therigenology 1994; 41: 809-18.

37. Jasko DJ, Hathaway JA, Schaltenbrand VL, Simper WD, Squires EL. Effect of seminal plasma and egg yolk on motion characteristics of cooled stallion spermatozoa. Theriogenology 1992; 37: 1241-52.

38. Varner D, Blanchard T, Love C, Garcia M, Kenney R. Effects of sperm fractionation and dilution ratio on equine spermatozoa motility parameters. Theriogenology 1987; 28: 709-23.

39. Pruitt JA, Arns MJ, Pool KC. Seminal plasma influences recovery of equine spermatozoa following in vitro culture (37 C) and cold storage (5 C). Theriogenology 1993; 39: 291.

40. Mina CG, Davies Morel. Equine artificial insemination. Reino Unido: Welsh Institute - University of Wales Aberystwyth, 1999.

41. Pickett BW, Squires EL, McKinnon RO, Shideler RK, Voss JL. Management of the mare for maximum reproductive efficiency. Colorado State University Animal Reproduction Laboratory Bulletin 1989; 6: 80.

42. Ball BA, Medina V, Gravance CG, Baumber J. Effect of antioxidants on preservation of motility, viability and acrosomal integrity of equine spermatozoa during storage at 5 C. Theriogenology, 2001: 577-89.

43. Demick DS, Voss JL, Pickett BW. Effect of cooling storage, glycerolization and spermatozoa numbers on equine fertility. J. Anim Sci 1976; 43: 633-7.

44. Wolfe CA, James PS, Mackie AR, Ladha S, Jones R. Regionalized lipid diffusion in the plasma membrane of mammalian spermatozoa. Biol Reprod 1998; 59: 1506-14.

45. Mller K, Pomorski T, Mller P, Herrmann A. Stability of transbilayer phospholipid asymmetry in viable ram sperm cells after cryotreatment. J Cell Sci 1999; 112: 11-20.

114 Cientfica 8 (2), 2011

ARTC

ULOS

ORI

GINA


46. Clarkson PM, Thompson SH. Antioxidants: what role do they play in physical activity and health? Am. J. Clin. Nutr 2000; 72: 637-46.

47. Mattos R, Castilho LFF, Keller A, Malschitzky E, Neves AP, Htt AK, Silva JFS, Garbade P, Gregory RM, RC Mattos. Influencia de la agitacin y del vaco en la motilidad y fertilidad del semen equino diluido y conservado a 4 C. Arq Fac Vet UFRGS 1997; 25: 44-53.

48. Devireddy RV, Swanlund DJ, Alghamdi AS, Duoos LA, Troedsson MH, Bischof JC, Roberts KP. Measured effect of collection and cooling condition on the motility and the water transport parameters at subzero temperatures of equine spermatozoa. Reproduction 2002; 124: 643-8.

49. Douglas-Hamilton DH, Osol R, Osol G, Driscoll D, Noble H. A field study of the fertility of transported equine semen. Theriogenology 1984; 22: 291-304.

50. Kayser JP, Amann RP, Sheideler RK, Squires EL, Jasko DJ, Pickett BW. Effects of linear cooling rates on motion characteristics of stallion spermatozoa. Theriogenology 1992; 38: 601-14.

51. Palma G. Biotecnologa de la reproduccin. 2. ed. Mar del Plata: Produccin Grfica Integral, 2008.

52. Varner DD. Consideraciones tcnicas del semen refrigerado. En XIV Congreso Anual Europeo de Veterinaria Equina. Venecia, 2003.

53. Bedford S, Jasko D, Graham J, Amann R, Squires E, Pickett B. Effects of seminal extenders containing egg yolk and glycerol on motion characteristics and fertility of stallion spermatozoa. Theriogenology 1995; 43: 955-67.


vernica OrOzcO cOrrespOndencia: [email protected]


rESUMENObjetivo: Determinar la capacidad antimicrobiana del cloruro de cetilpiridinio (CCP) sobre los cepillos dentales despus del uso diario de preescolares con denticin decidua completa.

Materiales y mtodos: Es un estudio de ciego, cruzado. La muestra estuvo constituida por 67 nios con edades que oscilaban entre 2 y 5 aos, pertenecientes a un centro educativo preescolar localizado en la ciudad de Huaral (Lima), que fueron divididos en dos grupos: Grupo 1 y Grupo 2. El estudio fue realizado en dos fases, en cada una de ellas se intercal la aplicacin de la solucin seleccionada para la descontaminacin del cepillo dental para ambos grupos; Sustancia B: enguaje bucal para nios, que contiene cloruro de cetilpiridinio (CCP) con flor; y Sustancia A: agua destilada (contr.ol). Posteriormente, los cepillos fueron rotulados para el anlisis microbiolgico respectivo. Los datos obtenidos fueron analizados mediante la prueba de Friedman.

Resultados: Los cepillos dentales a los que se les aplic en forma de spray el enjuague bucal para su descontaminacin, presentaron un menor porcentaje de colonizacin bacteriana de S. mutans (28,6%),

EVALUACIN DE LA CAPACIDAD ANTIMICROBIANA DEL CLORURO DE CETILPIRIDINIO (CCP) SOBRE LA MICROFLORA EXISTENTE EN LOS CEPILLOS DENTALES EN USO EN PREESCOLARES CON

DENTICIN DECIDUA COMPLETA

mientras que con el agua destilada (control) existi un alto porcentaje (93,6%).

Conclusiones: Los cepillos dentales presentan un grado de contaminacin bacteriana posterior a su uso. El cloruro de cetilpiridinio (CCP) al 0,05%, presente en el enjuague bucal peditrico, utilizado demostr disminuir la presencia de colonias de S. mutans presentes en los cepillos dentales.

Palabras clave: cepillos, desinfeccin, enjuague bucal

aBSTraCTThere are a few studies that analyze the use of desinfectant substances in toothbrushes to reduce the microbial contamination in children; nor on the effectiveness of the Cetilpiridinium Chloride (component commonly found in the mouthwashes) in the decontamination of these brushes. For that reason, the present study was made in order to determine the antimicrobial capacity of the Cetilpiridinium Chloride (CCP) on the dental brushes after the daily use in an infantile population.

The sample was constituted by 67 students with a rank of age between 2 and 5 years, belonging to a located preschool in Huarals city, Department of Lima, which on the basis of the

Simabukuro VF1, Albites AU1, Carmen Villarroel1, Xavier Contreras1, Ramrez YW1, Tang SP1, Aguilar GD2, lvarez-Vidigal E2

EVALUATION OF ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF CETYLPYRIDINIUM CHLORIDE (CPC) ON THE EXISTING MICROFLORA TOOTHBRUSHES IN USE IN PRESCHOOL CHILDREN wITH COMPLETE

PRIMARY DENTITION

1universidad cientfica del sur. facultad de estOmatOlOga. estudiante2universidad cientfica del sur. facultad de estOmatOlOga. dOcente

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LES Simabukuro VF, Albites AU, Carmen Villarroel VC, Xavier Contreras CX, Ramrez YW, Tang SP, Aguilar GD,

lvarez-Vidigal E

inclusion criteria and exclusion was selected, soon to be divided in two groups. Two phases were made putting in for each one of them the solution selected for the disinfection of the dental brush (CPP or distilled Water).

The results were translated through scales, finding a higher number of Streptoccocus mutans in scale 3 and none in 0. There was observed a higher percentage of cases with high bacterina formation when using distilled Water (90,3% and 96,9%) that in the cases when

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