CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS …

CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS (CSIC)

ESTACIÓN EXPERIMENTAL DEL ZAIDÍN

UNIVERSIDAD DE GRANADA

FACULTAD DE CIENCIAS

IMPLICADOS EN EL CONTROL

IDAD DE FRUTOS DE PIMIENTO (Capsicum

annuum L.): PROTEÓMICA FUNCIONAL Y ANTIOXIDANTES

Mª DE LA PAZ ÁLVAREZ DE MORALES DÁVILA PONCE DE LEÓN

TESIS DOCTORAL

Granada 2015

Editorial: Universidad de Granada. Tesis DoctoralesAutora: María de la Paz Álvarez de Morales Dávila Ponce de LeónISBN: 978-84-9125-186-6URI: http://hdl.handle.net/10481/40532

http://hdl.handle.net/10481/40532

IMPLICADOS EN EL CONTROL DE

CALIDAD DE FRUTOS DE PIMIENTO

(Capsicum annuum L.): PROTEÓMICA FUNCIONAL Y

ANTIOXIDANTES

Memoria que presenta la Licenciada en Biología

Mª de la Paz Álvarez de Morales Dávila Ponce de León

para optar al grado de Doctor

Fdo. Mª Paz Álvarez de Morales Dávila Ponce de León

VºBº

LOS DIRECTORES DEL TRABAJO

Dr. José Manuel Palma Martínez Dr. Francisco Javier Corpas Aguire

Profesor de Investigación del CSIC Investigador Científico del CSIC

El trabajo que se presenta en esta memoria de Tesis Doctoral ha sido realizado en el

Departamento de Bioquímica, Biología Celular y Molecular de Plantas, de la Estación

Experimental del Zaidín (CSIC) de Granada, dentro del grupo de investigación (BIO

192) con ayuda de una beca FPI a cargo de los proyectos AGL2008-00834 y AGL2011-

26044.

Parte de los resultados de esta Tesis Doctoral han sido presentados en los siguientes

congresos y reuniones científicas:

+ Reunión GEIRLI. Valencia 2013.

- Título: Protein nitration in pepper fruits and its involvement in ripening. Autores:

Álvarez de Morales P, Chaki M, Barroso JB, Corpas FJ, Palma JM .

+ 11th

International POG Conference. Reactive Oxygen and Nitrogen Species in Plants.

17-19th

July 2013,m Warsaw, Poland.

- Título: Characterization of nitrated proteins from pepper (Capsicum annuum L.)

fruits. Autores: Álvarez de Morales P, Chaki M, Barroso JB, Corpas FJ, Palma

JM.

+ III Jornadas Jóvenes Investigadores en Proteómica, Sociedad Española de Proteómica

(SEPROT) Santiago de Compostela, 9-10 febrero de 2012.

- Título: Proteoma de peroxisomas y mitocondrias de frutos de pimiento

(Capsicum annuum L.) durante la maduración. Autores: Álvarez P, Jiménez A,

Chaki M, del Río LA, Sevilla F, Corpas FJ, Palma JM.

- Título: Nitroproteínas implicadas en la maduración de frutos y en el estrés por

baja temperatura en plantas de pimiento (Capsicum annuum L.). Autores: Chaki

M, Álvarez P, Airaki M, Begara-Morales JC, Sánchez-Calvo B, Barroso JB,

Corpas FJ, Palma JM.

+ XXIV Scandinavian Plant Physiology Society (SPPS) Congress. Stavanger,

Norway. 21-25 August 2011.

- Título: Proteomics of pepper (Capsicum annuum L.) fruits during ripening.

Autores: Álvarez de Morales P, Jiménez A, Chaki

M, Bonilla-Valverde

D,

Campos MJ, del Río

LA, Sevilla

F, Corpas

FJ, Palma

JM.

+ 10th International Conference on Reactive Oxygen and Nitrogen Species in Plants.

July 5-8, 2011, Budapest, Hungary.

- Título: RNS metabolism in pepper fruit ripening. Autores: Chaki M. Airaki M,

Ruiz C, Álvarez P, Carreras A, Begara-Morales JC, Barroso JB, Corpas FJ, del

Río LA, Palma JM.

Parte de los resultados de esta Tesis han dado lugar a las siguientes publicaciones:

- Palma JM, Sevilla

F, Jiménez

A, del Río

LA, Corpas FJ, Álvarez de Morales

P,

Camejo DM (2015). Physiology of pepper fruits and the metabolism of antioxidants:

chloroplasts, mitochondria and peroxisomes. Ann Bot. (En revisión).

- Chaki M, Alvarez de Morales P, Ruiz C, Begara-Morales JC, Barroso JB, Corpas FJ,

Palma JM (2015). Ripening of pepper (Capsicum annuum) fruit is characterized by an

enhancement of protein tyrosine nitration. Ann Bot., en prensa,

doi:10.1093/aob/mcv016.

A mis padres

A Nacho, María y Clara

ÍNDICE

INTRODUCCIÓN GENERAL .................................................................. 3

1.- EL FRUTO DE PIMIENTO (Capsicum annuum L.) ......................... 4

1.1 Historia, importancia económica y producción de pimiento ............................................ 4 1.2 Clasificación taxonómica, características morfológicas y tipos de pimiento ................ 4 1.3 Valor nutricional del fruto de pimiento ................................................................................. 7 1.4 Particularidades del cultivo ...................................................................................................... 8

2.- MADURACIÓN DE LOS FRUTOS DE PIMIENTO........................ 9

2.1 Definición del proceso de maduración. Madurez fisiológica y madurez comercial .... 9 2.2 Cambios que ocurren en los frutos durante la maduración .......................................... 10 2.4 Particularidades en la maduración del fruto de pimiento ¿climatérico o no? .......... 12

3.- METABOLISMO DE LAS ESPECIES DE OXIGENO

REACTIVO Y LOS SISTEMAS ANTIOXIDANTES .......................... 13

3.1 Especies de oxígeno reactivo (Reactive oxygen species; ROS) ....................................... 13 3.1.1 Estrés oxidativo ................................................................................................................................ 15 3.1.2 Producción de ROS en plantas .................................................................................................... 15

3.2 Sistemas antioxidantes de plantas ........................................................................................ 16 3.2.1 Antioxidantes no enzimáticos ..................................................................................................... 16 3.2.2 Antioxidantes enzimáticos............................................................................................................ 18

4.- METABOLISMO DE LAS ESPECIES DE NITRÓGENO

REACTIVO ............................................................................................... 24

4.1 El óxido nítrico (NO), origen e historia............................................................................... 24 4.2 Principales funciones del NO ................................................................................................ 25 4. 3 Producción de NO en plantas ............................................................................................... 26 4. 4 Control y eliminación del NO ............................................................................................... 28 4. 5 Estrés nitrosativo y especies de nitrógeno reactivo (reactive nitrogen species; RNS)

............................................................................................................................................................. 29 4. 6 Modificaciones postraduccionales mediadas por NO y otras RNS ............................. 31

5. PEROXISOMAS VEGETALES ......................................................... 33

5.1 Historia, definición, y tipos de peroxisomas ...................................................................... 33 5.2 Principales funciones de los peroxisomas ........................................................................... 34 5.3 Proteínas peroxisomales ......................................................................................................... 35 5.4 Biogénesis de peroxisomas ..................................................................................................... 36 5.5 Herramientas para la identificación del proteoma de los peroxisomas ...................... 37 5.6 Particularidades de los peroxisomas de frutos de pimiento ........................................... 38

6.- INTRODUCIÓN A LA PROTEÓMICA........................................... 39

OBJETIVOS .............................................................................................. 42

MATERIAL Y MÉTODOS ..................................................................... 45

1.-MATERIAL VEGETAL Y CONDICIONES DE CULTIVO .......... 46

2.- PREPARACIÓN DE EXTRACTOS CRUDOS PARA ENSAYOS

BIOQUÍMICOS ........................................................................................ 46

3.- DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE

PROTEÍNAS .............................................................................................. 46

4.- DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD CATALASA ...................... 47

5.- NITRACIÓN DE CATALASA .......................................................... 47

6.- AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE PEROXISOMAS .......... 48

7.- ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA

(EGPA) Y TINCIÓN DE GELES ............................................................ 49

7.1.- EGPA en condiciones desnaturalizantes. EGPA-SDS .................................................. 49 7.2.- Tinción de geles con azul-Coomassie ................................................................................ 50 7.3.- Tinción de geles con plata .................................................................................................... 50

8.- TRANSFERENCIA E INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS

(Técnica de Western) ................................................................................ 50

8.1.- Transferencia de proteínas .................................................................................................. 50 8.2.- Inmunodetección de proteínas por quimioluminiscencia ............................................ 51

9.- ANÁLISIS PROTEÓMICO ............................................................... 51

9.1.- Limpieza de muestras y solubilización ............................................................................. 51 9.2.- Electroforesis bidimensional (2-D) y tinción de geles ................................................... 52 9.3.- Transferencia a membranas de nitrocelulosa ................................................................. 52 9.4.- Adquisición de imágenes ...................................................................................................... 53 9.5.- Selección y digestión de proteínas ...................................................................................... 53 9.6.- Identificación de proteínas por huella petídica .............................................................. 54

10.- ESTUDIOS BIOINFORMÁTICOS ................................................. 54

CAPÍTULO 1: PROTEÓMICA DE LA MADURACIÓN DE FRUTOS

DE PIMIENTO. ......................................................................................... 56

INTRODUCCIÓN ..................................................................................... 57

RESULTADOS .......................................................................................... 63

1.1 Patrón polipeptídico de frutos de pimiento ................................................................ 64 1.2 Análisis del proteoma de frutos de pimiento mediante electroforesis

bidimensional (2-D) ........................................................................................................................ 64 1.3 Identificación de proteínas y análisis mediante MALDI-TOF/TOF .................... 68

DISCUSIÓN ............................................................................................... 74

CAPÍTULO 2: NITROPROTEOMA Y EFECTO DEL NO EN LA

MADURACIÓN DE LOS FRUTOS. ...................................................... 88

INTRODUCCIÓN ..................................................................................... 89

RESULTADOS .......................................................................................... 93

2.1.- Detección de proteínas nitradas en extractos crudos de pimiento ............................. 94 2.2.- Análisis de las proteínas nitradas mediante electroforesis bidimensional (2-D) e

inmunoblot ........................................................................................................................................ 94 2.3. Identificación de proteínas nitradas y análisis mediante MALDI-TOF/TOF .......... 97 2.4. Nitración de catalasa .............................................................................................................. 99

DISCUSIÓN ............................................................................................. 100

CAPÍTULO 3: FUNCIÓN DE LOS PEROXISOMAS EN LA

MADURACIÓN DE LOS FRUTOS DE PIMIENTO (Capsicum

annuum L.): APROXIMACIONES PROTEÓMICAS Y

BIOINFORMÁTICAS. ........................................................................... 105

INTRODUCCIÓN ................................................................................... 106

RESULTADOS ........................................................................................ 116

3.1 Purificación de peroxisomas de frutos de pimiento verde y rojo tipo California ... 117 3.2 Análisis del proteoma de peroxisomas de frutos de pimiento mediante electroforesis

bidimensional (2-D) ...................................................................................................................... 117 3.3 Identificación de proteínas y análisis mediante MALDI-TOF/TOF ......................... 119 3.4 Análisis in silico del proteoma de peroxisomas ............................................................... 121

DISCUSIÓN ............................................................................................. 125

CONCLUSIONES ................................................................................... 141

BIBLIOGRAFIA ..................................................................................... 143

ANEXO I.1 ............................................................................................... 179

ANEXO I.2 ............................................................................................... 183

ANEXO I.3 ............................................................................................... 187

ANEXO I.4 ............................................................................................... 191

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1: Tipos de pimiento dulce------------------------------------------------------------------------------------6

Figura 2: Frutos climatéricos y no climatéricos de interés nutricional-----------------------------------------12

Figura 3: Formación de especies de oxígeno reactivo (ROS) durante la reducción del O2 a H2O2-------- 13

Figura 4: Formación de radicales ·OH por la reacción de Haber-Weiss---------------------------------------14

Figura 5: Reacción catalizada por la superóxido dismutasa-----------------------------------------------------19

Figura 6: Ciclo ascorbato-glutation---------------------------------------------------------------------------------21

Figura 7: Síntesis y eliminación de NO en las células de las plantas-------------------------------------------28

Figura 8: Regulación de la formación del peroxinitrito por la NOS y la SOD--------------------------------30

Figura 9: Biogénesis de peroxisomas-------------------------------------------------------------------------------37

Figura 10: Estrategias para el estudio del proteoma en muestras vegetales----------------------------------137

Figura 11: Histograma de los grupos funcionales de las proteínas identificadas de frutos verdes y rojos

de pimiento------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----139

Figura 1.1: Estrategia para el análisis proteómico de la maduración de los frutos de pimiento-----60

Figura 1.2: Patrón polipeptídico de extractos crudos de pimiento verde y rojo-------------------------------64

Figura 1.3: Análisis comparativo por electroforesis bi-dimensional (2-D) entre frutos de pimiento verde

y rojo-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

65

Figura 1.4: Imagen correspondiente al gel 2-D de proteoma de fruto de pimiento verde con todos los

spots que se han picado------------------------------------------------------------------------------------------------66

Figura 1.5: Spots identificados en el proteoma de fruto de pimiento verde-----------------------------------67

Figura 1.6: Imagen correspondiente al gel 2-D de proteoma de fruto de pimiento rojo con todos los spots

que se han picado-------------------------------------------------------------------------------------------------------67

Figura 1.7: Spots identificados en proteoma de fruto de pimiento rojo----------------------------------------68

Figura 2. 1: Patrón de proteínas nitradas en extractos crudos de pimiento verde y rojo---------------------94

Figura 2.2: Imagen representativa de electroforesis 2-D correspondiente al extracto crudo de fruto de

pimiento verde----------------------------------------------------------------------------------------------------------95

Figura 2.3: Imagen representativa de electroforesis 2-D correspondiente al extracto de fruto de pimiento

rojo----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 96

Figura 2.4: Inmunoblot representativo correspondiente a proteínas nitradas de frutos de pimiento verde y

rojo----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 97

Figura 2.5: Efecto del SIN-1 en la actividad catalasa de frutos de pimiento---------------------------------99

Figura 3.1: Número de proteínas identificadas en distintas especies de plantas mediante la comparación

de sus proteomas nucleares------------------------------------------------------------------------------------------109

Figura 3.2: Proteínas mitocondriales de Arabidopsis clasificadas en categorías funcionales-------------110

Figura 3.3: Definición de los tripéptidos PTS1 mayoritarios y minoritarios de proteínas peroxisomales de

plantas superiores ----------------------------------------------------------------------------------------------------113

Figura 3.4: Definición de los nonapéptidos PTS2 mayoritarios y minoritarios de proteínas peroxisomales

de plantas superiores -------------------------------------------------------------------------------------------------114

Figura 3.5: Método de aislamiento y purificación de peroxisomas de frutos de pimiento mediante

centrifugaciones diferenciales y en gradientes de densidad de sacarosa--------------------------------------117

Figura 3.6: Imagen de geles correspondientes a matrices concentradas de peroxisomas de fruto de

pimiento verde y rojo-------------------------------------------------------------------------------------------------118

Figura 3.7: Imagen de gel correspondiente a la superposición de los dos anteriores en el que se han

señalado las proteínas que presentaron diferencias de intensidad en peroxisomas de fruto de pimiento

verde y rojo------------------------------------------------------------------------------------------------------------119

Figura 3.8: Enzimas de las fotorrespiración de la b-oxidación de ácidos grasos y del ciclo del glioxilato

identificadas en peroxisomas mediante análisis proteómico----------------------------------------------------130

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1: Filogenia del fruto de pimiento----------------------------------------------------------------------------4

Tabla 2: Composición del fruto de pimiento por cada 100 g de material fresco-------------------------------8

Tabla 3: Producción de ROS en plantas----------------------------------------------------------------------------15

Tabla 4: Tipos de isoenzimas de SOD y localización------------------------------------------------------------19

Tabla 5: Principales funciones descritas en peroxisomas de plantas-------------------------------------------35

Tabla 1.1: Categorías funcionales de las proteínas que se expresan de manera diferencial en los frutos

bajo diferentes condiciones de desarrollo y de maduración -----------------------------------------------------59

Tabla 1.2: Proteínas descritas e identificadas de forma exclusiva en frutos de pimiento verdes o rojos y

su número de identificación en la base de datos Uniprot---------------------------------------------------------69

Tabla 1.3: Proteínas coincidentes entre los dos tipos de fruto de pimiento------------------------------------72

Tabla 1.4: Proteínas identificadas de frutos de pimiento y agrupadas por grupos funcionales-------------76

Tabla 2.1: Proteínas nitradas identificadas en fruto de pimietno verde y rojo--------------------------------98

Tabla 3.1: Comparación de los distintos proteomas nucleares-------------------------------------------------109

Tabla 3.2: Proteínas identificadas en peroxisomas de fruto de pimiento verde y rojo----------------------120

Tabla 3.3: Clasificación de las proteínas identificadas en los peroxisomas de fruto de pimiento verde y

rojo en función del grupo funcional al que pertenecen----------------------------------------------------------121

Tabla 3.4: Funciones principales y localización subcelular descrita hasta el momento de las proteínas

seleccionadas AT1G61680, AT2G38760, AT3G46170 y AT3G14660---------------------------------------122

1

RESUMEN

2

P

frutos de pimiento (Capsicum annuum l.): proteómica funcional y antioxidantes

La maduración de la mayoría de las especies del género Capsicum está caracterizada

por un intenso metabolismo, emisión de compuestos volátiles, destrucción de las

clorofilas y síntesis de nuevos pigmentos, formación de pectinas, síntesis de proteínas,

alteración en el sabor, etc. El proceso de maduración ha sido objeto de interés de

muchos investigadores, no solo por los espectaculares cambios que sufren los frutos,

sino por la complejidad del mecanismo de biosíntesis de capsantina, una sustancia

exclusiva que les da color a los mismos. Muchos de los cambios bioquímicos

observados se corresponden con modificaciones en la célula. De hecho, los cloroplastos,

que son los que contienen clorofila, se convierten en cromoplastos, que contienen

carotenoides como pigmentos mayoritarios. En las mitocondrias, sin embargo, no se han

descrito modificaciones ultraestructurales ni metabólicas destacables durante la

maduración de los frutos. En los peroxisomas, se han descrito importantes cambios

metabólicos; así se ha comprobado que la fotorrespiración es inhibida, mientras que la

actividad de las enzimas del ciclo del glioxilato aumenta a lo largo del proceso de

maduración. Teniendo en cuenta la importancia que tienen los peroxisomas en muchos

procesos intrínsecos de la planta y como respuesta a estímulos externos, nos planteamos

la importancia que puedan tener dichos orgánulos en la homeostasis celular durante el

proceso de maduración de los frutos. Las aproximaciones tradicionales han permitido

descifrar las principales rutas metabólicas y las funciones celulares en las que se

encuentran implicados los distintos orgánulos. No obstante, quedan muchas incógnitas

sobre determinados procesos fisiológicos que subyacen al proceso de maduración. A

diferencia del genoma, que es un elemento estático a lo largo de la vida de un individuo,

el proteoma tiene un carácter dinámico, puesto que la expresión de las proteínas cambia

en las diferentes etapas del ciclo celular, así como en respuesta a acciones externas.

Bajo esta premisa, este trabajo se planteó como la posibilidad de sentar las bases

moleculares que permitieran conocer el desarrollo y la maduración de los frutos a nivel

molecular, y así poder vincularlos con las características nutricionales de los mismos,

haciendo para ello uso de la proteómica. Los resultados obtenidos indican que, en base a

la abundancia relativa de las proteínas, en la maduración de los frutos, interviene de

manera fundamental el metabolismo oxidativo y el relacionado, sobre todo, con la

degradación de proteínas. Los datos obtenidos en el análisis del proteoma de los

peroxisomas corroboran la importante función que desarrollan la catalasa y las

superóxido dismutasas, además de la existencia de enzimas características de rutas que

hasta ahora se creía que se producían de manera alternativa. Por último, el análisis del

nitro-proteoma, revela que esta modificación post-traduccional, propiciada

probablemente por el peroxinitrito, es un evento consustancial a la maduración de los

frutos de pimiento, donde la catalasa vuelve a ejercer un papel crucial.

3

T

Introducción general

4

1.- EL FRUTO DE PIMIENTO (Capsicum annuum L.)

1.1 Historia, importancia económica y producción de pimiento El origen del pimiento (Capsicum annuum L.) es incierto, parece que se sitúa en el

continente americano desde donde se importó a Europa por Cristóbal Colón. La

importancia económica del pimiento se debe a que se trata del segundo fruto hortícola

más consumido en todo el mundo después del tomate. Son varios los usos del pimiento,

el más extendido es su consumo en fresco, no siendo menos importantes la preparación

del pimiento para pimentón, para fabricación de conservas y el consumo de variedades

picantes, usadas como especias (http://faostat3.fao.org/).

El pimiento forma parte de las hortalizas cultivadas en casi todos los lugares del

mundo y en la actualidad una parte importante de la producción mundial se da en la

Cuenca del Mediterráneo entre España, Italia y Turquía. En España, el pimiento es uno

de los cultivos hortícolas bajo invernadero con mayor superficie cultivada,

localizándose casi la mitad de la producción entre Almería y Murcia. Almería se

caracteriza por los cultivos de pimiento de otoño-invierno, mientras que Murcia se

caracteriza por los cultivos de primavera-verano.

1.2 Clasificación taxonómica, características morfológicas y tipos de pimiento

El pimiento es una planta de origen tropical que pertenece a la familia Solanaceae

(Tabla 1) siendo una planta herbácea, perenne, de porte variable, entre 0,5 m (en

determinadas variedades de cultivo al aire libre) y más de 2 m cuando es cultivado en

invernadero.

Tabla 1: Filogenia del fruto de pimiento.

Reino Plantae

Subreino Tracheobionta

División Magnoliophyta

Clase Magnoliopsida

Subclase Asteridae

Orden Solanales

Familia Solanacea

Subfamilia Solanoidea

Tribu Capsiceae

Género Capsicum


5

El sistema radicular del fruto de pimiento se compone de una raíz pivotante

que luego desarrolla un sistema radicular lateral muy ramificado que puede llegar a

cubrir hasta 1,2 m de diámetro en los primeros 0,6 m de suelo en función de la

profundidad y textura del mismo. Además se compone de un tallo principal de

crecimiento limitado y dependiendo de la variedad, presentan un número determinado

de tallos secundarios que a su vez se ramifican de forma dicotómica. La hoja es entera,

lampiña y lanceolada con un pecíolo largo y poco aparente. El haz es glabro (liso y

suave al tacto) y de color verde más o menos intenso (dependiendo de la variedad) y

brillante. Las hojas se insertan en el tallo de forma alterna y su tamaño es variable en

función de la variedad, existiendo cierta correlación entre el tamaño de la hoja adulta y

el peso medio del fruto. Las flores aparecen solitarias en cada nudo del tallo, con

inserción en las axilas de las hojas. Son pequeñas y constan de una corola blanca. La

polinización es autógama, aunque puede presentarse un porcentaje de alogamia que no

supera el 10% (Cochran, 1938; DeWitt and Boslan, 1993).

El pimiento es una hortaliza de carácter anual, cuyo fruto tiene forma de baya

hueca, de diferente coloración y tamaño en función de la variedad. Las semillas se

encuentran insertas en una placenta cónica de disposición central. Son redondeadas,

ligeramente reniformes, de coloración amarillo pálido y longitud variable, entre 3 y 5

mm.

El pimiento se considera una especie no climatérica (Saltveit, 1977; Lurie et al.,

1986), es decir, que su maduración es independiente de la síntesis de etileno y de la

respiración. En el nombre de C. annuum se agrupan muchas variedades que se

diferencian en la forma, el color y el sabor, entre otras características. Generalmente los

pimientos son verdes cuando son inmaduros, desde un punto fisiológico y viran a rojos

en la maduración; sin embargo, con el tiempo, se han obtenido nuevos cultivares con

frutos maduros de otros colores, como el amarillo, naranja, morado o marrón (DeWitt

and Boslan, 1996).

Según su sabor los frutos de pimiento se diferencian en dulces o picantes. Los

frutos picantes suelen ser variedades de fruto largo y delgado. La capsicina es el

componente responsable del sabor amargo o picante de los frutos del género Capsicum

que se concentra en los tabiques divisorios, placenta y semillas (Sharma et al., 2013;

Srinivasan, 2014).


6

Dentro de la variedad de fruto dulce, se distinguen tres tipos de pimiento (Fig. 1;

(Mateos et al., 2013); http://www.infoagro.com/hortalizas/pimiento.htm;

http://es.scribd.com/doc/16619403/Capsicum-Annumm:

California: son frutos cortos, anchos, con tres o cuatro cascos bien marcados, con el

cáliz y la base del pedúnculo por debajo o a nivel de los hombros y un mesocarpio

carnoso más o menos grueso. Son los cultivares más exigentes en temperatura, por lo

que su plantación se realiza temprano (desde mediados de mayo a comienzos de agosto,

dependiendo de la climatología de la zona), para alargar el ciclo productivo y evitar

problemas de cuajado con el descenso excesivo de las temperaturas nocturnas.

Lamuyo: son frutos alargados y cuadrados de carne gruesa. Los cultivares

pertenecientes a este tipo suelen ser más vigorosos (de mayor porte y entrenudos más

largos) y menos sensibles al frío que los de tipo California, por lo que es frecuente

cultivarlos en ciclos más tardíos.

Dulce italiano: frutos alargados, estrechos, acabados en punta, de carne fina, más

tolerantes al frío, que se cultivan normalmente en ciclo único, con plantación tardía en

septiembre y octubre y recolección entre diciembre y mayo.

California Lamuyo Dulce italiano

Figura 1: Tipos de pimiento dulce

.


7

1.3 Valor nutricional del fruto de pimiento

Sobre el valor nutricional del pimiento cabe destacar que, además del agua, que

representa más del 90% del contenido del fruto fresco, contiene fibra, pectinas, glucosa

y fructosa como principales componentes. Esto hace que sea una hortaliza con bajo

aporte calórico y, al igual que el resto de las verduras, su contenido proteico es muy

bajo y apenas aporta grasas. En la Tabla 2 se indican los principales componentes del

fruto de pimiento. Éstos son, además, fuentes naturales de antioxidantes como los

carotenoides o vitamina A, vitamina C o ascorbato y vitamina E o -tocoferol (Howard

et al., 2000; Navarro et al., 2006; Mateos et al., 2013), entre otros. Los carotenoides

(carotenos y xantofilas) son los responsables del color en los frutos maduros de

pimiento, cualidad que deben principalmente a la capsantina. Dentro de las

propiedades de los carotenoides destaca que son precursores de la vitamina A o retinol

(De, 2003). Asimismo, el fruto fresco de pimiento destaca por su alto contenido en

vitamina C, pudiendo ser éste más del doble del que se encuentra en frutas como las

naranjas y las fresas (Davey et al., 2000; Proteggente et al., 2002; Martínez et al., 2005;

Mateos et al., 2013). La vitamina C además de ser un potente antioxidante, interviene en

la formación de colágeno, glóbulos rojos, huesos y dientes, al mismo tiempo que

favorece la absorción del hierro de los alimentos y aumenta la resistencia frente a las

infecciones (Yu and Schellhorn, 2013). La vitamina E retarda o inhibe la oxidación

lipídica, ya que actúa como un secuestrador de radicales lipídicos (Smirnoff, 2000). En

menor cantidad están presentes otras vitaminas del grupo B (B6, B3, B2 y B1). El

contenido de algunos antioxidantes en el pimiento depende además de muchos factores,

como el estado de maduración, las condiciones medioambientales o el almacenamiento

de dichos frutos (Jiménez et al., 2003; Martínez et al. 2005; Navarro et al., 2006). Entre

los minerales cabe destacar la presencia de hierro y potasio y, en menor proporción,

magnesio, fósforo y calcio (De, 2003).


8

Tabla 2: Composición del fruto de pimiento por cada 100 g de material fresco.

(http://www.botanical-online.com)

Pimiento

verde/rojo

Agua 92,1 g

Energía 31 Kcal

Hidratos de carbono 6,43 g

Fibra 1,8-2,0 g

Proteína 0,89 g

Grasa 0,19 g

Potasio 177 mg

Fósforo 19 mg

Magnesio 10 mg

Calcio 9 mg

Hierro 1,2 mg

Vitamina C 89,3 mg

Vitamina B2 0,03 mg

Vitamina B6 0,248 mg

Vitamina A 632 IU

Vitamina E 0,69 mg

1.4 Particularidades del cultivo

Son varios los factores que hay que tener en cuenta en el cultivo de pimiento. En cuanto

a la temperatura, se trata de una planta que no aguanta las heladas y que exige un

clima cálido o templado. De hecho, en temporadas de otoño e invierno sólo es posible

cultivarlos en invernaderos. La temperatura mínima para germinar y crecer es de 15C y

para florecer y fructificar necesitan como mínimo 18C. Las temperaturas óptimas

oscilan entre 20 y 26C. Si se dan bajas temperaturas durante la floración, entre 10 y

15C, se originan anomalías en las flores, dando lugar a frutos pequeños y con

deformaciones (Erickson and Markhart, 2002).

La humedad relativa óptima para el cultivo de esta especie oscila entre el 50 y

el 70%. Si la humedad es más elevada, origina el desarrollo de enfermedades en las

partes aéreas de la planta y dificulta la fecundación. Si la humedad es demasiado baja,

como por ejemplo durante el verano, con temperaturas altas, se produce la caída de


9

flores y frutos recién cuajados. Por otro lado, el pimiento requiere una gran cantidad de

luz, sobre todo durante el primer periodo de crecimiento después de la germinación

(Erickson and Markhart, 2001).

Los suelos más adecuados para el pimiento son los sueltos y arenosos

profundos, ricos en materia orgánica y con un buen drenaje. Los suelos con posibilidad

de encharcamiento favorecen el desarrollo de hongos en raíces y la pudrición de éstas.

En cuanto al riego, debe ser moderado y constante en todas las fases del cultivo, a pesar

de que aguantan bien una falta puntual de agua. El riego por goteo resulta ideal no

siendo apropiada la aspersión, ya que mojando las hojas y los frutos se favorece el

desarrollo de hongos (DeWitt and Boslan, 1993).

Todos estos requerimientos hacen que, los frutos de pimiento, sean cultivados en

invernaderos donde es posible el manejo de las condiciones del medio

(http://www.redpermacultura.org/).

2.- MADURACIÓN DE LOS FRUTOS DE PIMIENTO

2.1 Definición del proceso de maduración. Madurez fisiológica y madurez

comercial

La maduración es un complejo proceso en el desarrollo de los frutos por el cual se

transforman de inmaduros a maduros. Además es específica de cada especie de planta y

depende de las condiciones medioambientales (Palma et al., 2011b).

La maduración es un acontecimiento altamente coordinado, programado

genéticamente e irreversible y conlleva una serie de cambios físiológicos, bioquímicos

y organolépticos que desembocan finalmente en un fruto maduro, comestible y apto

para el consumo humano en aquellos que se destinan a este fin (Prasanna et al., 2007).

La elección del momento para la cosecha de frutas que estén en su justo punto

de maduración es una consideración importante de precosecha que tendrá gran

influencia en la vida postcosecha del producto y en su comercialización.

En el desarrollo del órgano de una planta existen tres fases (crecimiento,

madurez y envejecimiento) y no siempre es posible distinguirlas ya que las transiciones

entre las etapas son a menudo muy lentas y poco diferenciadas. Sin embargo, es

importante distinguir claramente entre madurez fisiológica y comercial. La madurez

fisiológica se refiere a la etapa del desarrollo de la fruta en que se ha producido el

http://www.redpermacultura.org/articulos-categorias/31-ideas-practicas/773-riego-por-goteo-utilizando-botellas-de-plastico-recicladas-biberones.html


10

máximo crecimiento y maduración. Generalmente está asociada con la completa

madurez de la fruta. Esta etapa de madurez fisiológica es seguida por el envejecimiento

o senescencia. La madurez comercial refleja simplemente las condiciones de un

órgano de la planta, requerido por un mercado. Comúnmente la madurez comercial

guarda escasa relación con la madurez fisiológica y puede ocurrir en cualquier fase del

desarrollo o envejecimiento (http://www.fao.org/;

http://www.fao.org/docrep/x5055s/x5055S03.htm).

2.2 Cambios que ocurren en los frutos durante la maduración Las características fundamentales que determinan que la fruta recién recolectada sea

aceptable para su comercio son la apariencia y la textura (Toivonen and Brummell,

2008).

El ablandamiento y los cambios que ocurren en la textura de la fruta durante su

maduración son característicos de cada especie y son debidos a diferencias en el grosor

de la pared celular y a su composición (Brummell et al., 2004).

Los cambios en la apariencia se deben principalmente a variaciones en el color

de los frutos. La diferenciación de cloroplastos en cromoplastos conlleva una serie de

cambios bioquímicos que culminan con la acumulación de carotenoides, tales como

licopenos y capsantina entre otros. Estas modificaciones son aparentes a nivel de

coloración ya que van desde el verde característico de las clorofilas hasta el amarillento

o rojizo de los carotenoides (Bouvier et al., 1998).

Los cambios en el aroma de los frutos maduros se deben a la producción de

compuestos volátiles (aldehídos, ésteres, cetonas, terpenoides, compuestos azufrados)

que se forman al romperse las células (Csoka et al., 2013).

El sabor que se percibe de las frutas se ha descrito como la sensación

procedente de la interacción entre gusto, aroma, tacto en boca, vista y sonido (Luning

et al., 1994). El sabor puede variar en función del contenido de ácidos y azúcares.

Cuando un fruto alcanza la madurez el almidón se transforma en azúcares simples y al

mismo tiempo se van acumulando los ácidos orgánicos. Además se produce un

aumento de los compuestos fenólicos que provocan el amargor o la astringencia de los

http://www.fao.org/


11

frutos. La función de los compuestos fenólicos es contrarrestar la peroxidación de los

lípidos que se produce a medida que maduran los frutos (Namiki, 1990).

A nivel celular, durante la maduración, también se produce un deterioro

oxidativo del metabolismo debido al aumento de las especies de oxígeno reactivo que

causan daños en membranas (peroxidación lipídica), proteínas y mutaciones en el DNA

(Halliwell and Gutteridge, 2000; Jiménez et al., 2002). Terminada la fase de

maduración, el fruto pierde su turgencia, aumenta su sensibilidad a las condiciones del

medio, pierde el control metabólico e inicia su senescencia.

2.3 Tipos de frutos en función de su maduración

El inicio y el progreso de la maduración es un fenómeno sumamente complejo que

depende de muchos factores como el tipo de fruta y la actuación de las fitohormonas,

principalmente el etileno, y de factores externos como luz, temperatura, y elementos

bióticos (Bapat et al., 2010).

El etileno es una fitohormona que juega un papel crucial en el desarrollo y en la

respuesta de las plantas al medio ambiente (Cara and Giovannoni, 2008). En función

de la respuesta de los frutos al etileno se pueden clasificar en climatéricos y en no

climatéricos.

Los frutos climatéricos son aquellos en los que se produce un aumento en la

síntesis de etileno, que controla la tasa respiratoria y hace que ésta aumente. Los frutos

no climatéricos, son independientes de dicha producción de etileno y por tanto la

respiración se mantiene invariable (Palma et al., 2011b).

Los factores medioambientales a los que los frutos están expuestos durante el

transporte, almacenaje y manejo postcosecha influyen fuertemente en la biosíntesis del

etileno. Algunos ejemplos de frutos climatéricos son: manzana, plátano, pera, melón,

melocotón, kiwi, tomate, ciruela, etc y ejemplos de frutos no climatéricos son: naranja,

limón, pepino, cereza, aceituna, uva, fresa y pimiento, entre otros. En la Figura 2 se

muestran algunos ejemplos de frutos climatéricos y no climatéricos.


12

Figura 2: Frutos climatéricos y no climatéricos de interés nutricional (Palma et al., 2011b).

Este comportamiento es independiente de cada especie, y no está asociado con la

clasificación taxonómica. De ahí que especies de la misma familia, como por ejemplo

el pimiento y el tomate (ambos solanáceas), presenten una respuesta distinta al etileno

(Palma et al., 2011b).

No obstante, tanto frutos climatéricos como frutos no climatéricos comparten los

principales aspectos del proceso de maduración, que incluyen cambios de color,

alteración del metabolismo del azúcar, cambios en la textura y síntesis de compuestos

volátiles que los hacen susceptibles a patógenos (Cara and Giovannoni, 2008).

2.4 Particularidades en la maduración del fruto de pimiento ¿climatérico o no?

Existe un grupo de compuestos fenólicos que son característicos de los frutos del género

Capsicum, que son la capsaicina y sus productos derivados que se conocen con el

nombre de capsaicinoides (Estrada et al., 2001), siendo fundamentalmente la

capsaicina el compuesto responsable de la acrimonia del fruto de pimiento. Durante la

maduración, las concentraciones de capsaicina alcanzan un máximo hasta llegar a un

punto en el que son degradados en sus productos secundarios mediante la acción de la

peroxidasas (Sung et al., 2005). Tradicionalmente los pimientos han sido considerados


13

como frutos no climatéricos basándose en su comportamiento frente a esta hormona. No

obstante se ha descrito que en determinados cultivares el etileno interno era capaz de

iniciar la maduración de los frutos, lo que traslada la cuestión de climatérico vs no

climatérico a los niveles de etileno que propician la respuesta de maduración (Gross et

al., 1986; Biles et al., 1993; Tan et al., 2012).

3.- METABOLISMO DE LAS ESPECIES DE OXIGENO REACTIVO Y LOS

SISTEMAS ANTIOXIDANTES

3.1 Especies de oxígeno reactivo (Reactive oxygen species; ROS) La aparición del oxígeno en nuestro planeta data de aproximadamente 2.700 millones

de años y aparece como un producto de la fotosíntesis de las cianobacterias. Todos los

organismos aerobios eucariotas necesitan O2 para producir energía en las mitocondrias.

Sin embargo, la necesidad del O2 choca con el hecho de que se trata de un gas que

puede llegar a ser tóxico y mutagénico (Halliwell, 2006). La toxicidad del oxígeno es

debida a la producción de especies de oxígeno reactivo (ROS, en inglés reactive oxygen

species), que se pueden producir durante la actividad metabólica normal de la célula o

como consecuencia de distintas perturbaciones medioambientales y que reaccionan con

todo tipo de biomoléculas (Bartosz, 1997; Scandalios, 2005b).

Figura 3: Formación de especies de

oxígeno reactivo (ROS) durante la

reducción del O2 a H2O2 (Salin,

1988).

Las especies de oxígeno reactivo son tanto los intermediarios de la reducción del

oxígeno molecular a agua, como su forma excitada, el oxígeno singlete (1O2)

(Scandalios, 2005b); Halliwell, 2007. La reducción completa del O2 a agua, requiere

cuatro electrones y en ella los intermediarios son: el radical libre superóxido (O2•−

), el

peróxido de hidrógeno (H2O2) y el radical libre hidroxilo (·OH) (Fig. 3). . Un radical

libre es una molécula que tiene un electrón desapareado en su orbital externo (Halliwell

and Gutteridge, 2000).


14

El radical superóxido se produce por la reducción del oxígeno con un sólo electrón

(Halliwell and Gutteridge, 2000). Es inestable en solución acuosa y más estable en

disolventes orgánicos. Tiene una vida media de milisegundos (Donelly and Robinson,

1995).

El peróxido de hidrógeno es de todas las ROS el más estable en solución y tiene

una vida media relativamente alta. El H2O2 puede comportarse como oxidante o reductor

y tiene baja capacidad para reaccionar con la mayoría de las moléculas orgánicas si no

existen catalizadores metálicos (Karpinski et al., 1997; Dat et al., 2000; Halliwell and

Gutteridge, 2000).

El radical hidroxilo es considerado el oxidante más potente de todas las ROS.

Tiene una vida media muy corta, de nanosegundos (Halliwell and Gutteridge, 2000).

Uno de los efectos más tóxicos del radical O2•−

surge cuando éste reacciona con el H2O2

en presencia de metales como Fe y Cu, llevándose a cabo la reacción de Haber-Weiss

catalizada por metales (Fe3+

/Cu2+

) que conlleva la producción del radical ·OH (Fig. 4).

Figura 4: Formación de radicales ·OH por la reacción de Haber-Weiss.

El oxígeno singlete es la forma excitada del oxígeno no radical y se trata de una

especie muy reactiva. La excitación del oxígeno ocurre en algunos compuestos como las

clorofilas, que son iluminados a una determinada longitud de onda, produciendo

reacciones de fotosensibilización. Esta energía de excitación se transmite al O2,

formándose el 1O2 (Lledías et al., 1998; Halliwell and Gutteridge, 2000).

Las ROS fueron consideradas en principio solamente como elementos tóxicos

del oxígeno; sin embargo a día de hoy se sabe que, en bajas concentraciones, estas

especies reactivas juegan un papel central en procesos de señalización, esenciales en la

célula (Scandalios, 2005b).


15

3.1.1 Estrés oxidativo

En condiciones normales las ROS son eliminadas por las distintas defensas

antioxidantes (Alscher et al., 1997). El equilibrio entre la producción y la eliminación

de ROS puede ser alterado por un gran número de factores adversos medioambientales,

bióticos y abióticos lo que resultaría en un rápido aumento de los niveles celulares de

ROS (Elstner, 1991; Apel and Hirt, 2004). Un exceso de ROS en relación con los

antioxidantes es lo que se conoce como estrés oxidativo (Halliwell, 2006). El daño

oxidativo está relacionado con la elevada reactividad del oxígeno molecular y sus

intermediarios que pueden causar daños en las proteínas, los lípidos y el DNA

(Ludovico and Burhans, 2013).

3.1.2 Producción de ROS en plantas Existen muchas fuentes potenciales de ROS en plantas. En condiciones normales se

producen constantemente como subproductos de las rutas metabólicas localizadas en los

distintos compartimentos subcelulares, principalmente a nivel de cloroplastos,

mitocondrias y peroxisomas (Tabla 3). Pero las ROS también se pueden producir como

respuesta a los distintos tipos de estreses a los que se pueden someter las plantas, tales

como sequía, salinidad, alta y baja temperatura, metales pesados, contaminantes

atmosféricos, ataque de patógenos, etc. (Dat et al., 2000; Mittler, 2002).

Tabla 3: Producción de ROS en plantas.

ROS Localización Producción Referencias

O2•− Mitocondrias Cadena de transporte electrónico

(complejo I y III) (Moller, 2001; Bailly, 2004)

Cloroplastos Fotosistemas I y II (Salin, 1988; Asada, 1999, 2006)

Peroxisomas Matriz peroxisomal

Cadena de transporte electrónico

dependiente de NADH en la membrana

peroxisomal

Xantina oxidasa

(del Río et al., 1992; López-Huertas

et al., 1999; Mittler, 2002; Palma et

al., 2002; Corpas et al., 2008b)

Membrana Plasmática NADPH oxidasa (HammondKosack and Jones, 1996;

Grant and Loake, 2000; Sagi and

Fluhr, 2006)

Pared celular Peroxidasas, Mn2+

, NADH (HammondKosack and Jones, 1996;

Grant and Loake, 2000)

H2O2 Peroxisomas Glicolato oxidasa

-oxidación de ácidos grasos (Palma et al., 1991; Corpas et al.,

2001; Sandalio et al., 2013)

Apoplasto Oxalato oxidasa

Amina oxidasa (Dat et al., 2000)

(Allan and Fluhr, 1997)

Pared celular Peroxidasas, Mn2+

, NADH (HammondKosack and Jones, 1996;

Grant and Loake, 2000) 1O2 Cloroplastos Clorofila excitada (Asada and Takahashi, 1987; Asada,

2006)


16

3.2 Sistemas antioxidantes de plantas Debido a que las ROS causan daños en proteínas, lípidos y DNA, su producción y

eliminación debe estar estrictamente controlada. Todos los compartimentos celulares,

por tanto, han de tener mecanismos para prevenir y reparar los daños causados por

dichas especies (Moller, 2001). Los organismos aerobios sobreviven gracias a que han

desarrollado defensas antioxidantes capaces de eliminar las ROS de manera directa o

indirecta (Halliwell, 2006).

3.2.1 Antioxidantes no enzimáticos

3.2.1.1 El ácido ascórbico es el antioxidante más abundante en las células de las

plantas. El ácido ascórbico se denomina también vitamina C y se trata de un nutriente

esencial en la dieta de los humanos, quienes no pueden sintetizarlo (Ohta and

Nishikimi, 1999; Palma et al., 2009a; Alos et al., 2013). El ácido ascórbico está

presente prácticamente en todos los compartimentos celulares incluida la pared celular

(Noctor and Foyer, 1998; Asada, 1999; Foyer and Noctor, 2011). Participa en una

gran cantidad de procesos celulares como la fotosíntesis, la fotoprotección, el

crecimiento de la pared celular, la expansión celular, la resistencia a estreses

medioambientales y la síntesis de etileno, giberelinas, antocianinas e hidroxiprolina,

entre otras. A pesar de sus múltiples funciones y de que es la principal fuente de

vitamina C en humanos, se sabe muy poco de su metabolismo en plantas (Smirnoff and

Wheeler, 2000).

En animales ya se demostró que el AsA era sintetizado a partir de la D-glucosa y

transformado a L-gulono-1,4-lactona (L-GulL), siendo los intermediarios el ácido D-

glucurónico (GlucA) y el L-gulonato. Finalmente, la L-GulL es oxidada a AsA

mediante la L-gulono-1,4-lactona oxidasa (Burns and Mosbach, 1956; Agius et al.,

2003; Gallie, 2013). Los humanos no podemos sintetizar el AsA debido a una mutación

en el gen de la L-gulono-1,4-lactona oxidasa y tenemos que obtener la vitamina C a

través de la ingestión regular de frutas y vegetales (Nishikimi et al., 1994).

En plantas se han descrito varias posibles vías para la síntesis del AsA. De todas

ellas la principal es la ruta de Smirnoff-Wheeler (Wheeler et al., 1998; Ishikawa et al.,

2008; Linster and Clarke, 2008) que está considerada como la ruta esencial para la


17

síntesis de novo del AsA y que conlleva la conversión de la manosa en AsA mediante

una serie de intermediarios de la L-galactosa (Wheeler et al., 1998). Otras rutas son las

llevadas a cabo a partir de la L-gulosa (Wolucka and Van Montagu, 2003), del D-

galacturónico (D-GalA) (Agius et al., 2003) y a partir de mio-inositol (Lorence et al.,

2004; Ren et al., 2013).

3.2.1.2 El glutatión (GSH) es el compuesto tiólico de bajo peso molecular no proteico

más abundante distribuido principalmente en las células eucarióticas. Se trata de un

tripéptido formado por glutamato (Glu), cisteína (Cys) y glicina (Gly). La presencia de

la cisteína, la reactividad química y la elevada solubilidad en agua del grupo tiol del

GSH es lo que le confiere sus propiedades y hace de él un metabolito crucial para

muchas funciones importantes tales como crecimiento, desarrollo y respuesta frente a

las fluctuaciones medioambientales (Gill et al., 2013). Lo que comúnmente se conoce

como glutatión (GSH o -glutamil-L-cisteínglicina) es el glutatión reducido que

constituye, por lo general, el 90% del glutatión total presente en las células. El GSH

puede oxidarse a disulfuro de glutatión (GSSG) que a su vez se puede reducir por la

glutatión reductasa a expensas de NADPH y formar de nuevo GSH (Li et al., 2004).

El glutatión está implicado en muchos procesos fisiológicos siendo su principal

función la de actuar como antioxidante en la eliminación de ROS. En dicho papel

participa junto al ascorbato en el ciclo ascorbato-glutatión para eliminar el H2O2

intracelular (Creissen et al., 1992; Wingsle and Karpinski, 1996) y además reacciona

con el 1O2 y con los radicales ·OH

protegiendo a los grupos tioles de las proteínas

(Lascano et al., 1998; Gechev et al., 2002). Algunos de los procesos en los que el

glutatión se ve involucrado son la destoxificación de xenobióticos, prevención de la

peroxidación lipídica y la regulación de la expresión de genes relacionados con la

respuesta a estrés medioambiental y al ataque por patógenos (Meister and Anderson,

1983; Alscher, 1989; Creissen et al., 1992). A nivel ultraestructural, el glutatión se

ubica en la mayor parte de los compartimentos celulares (citosol, cloroplasto,

mitocondria, nucleo y peroxisoma) pero también se ha localizado en el apoplasto

(Noctor and Foyer, 1998; Asada, 1999; Muller et al., 2004; Tausz et al., 2004; Foyer

and Noctor, 2005; Zechmann et al., 2008; Fernández-García et al., 2009).


18

3.2.1.3 Los carotenoides, término en el que se agrupan carotenos y xantofilas, son

moléculas liposolubles sintetizadas por plantas y por microrganismos. Los carotenoides

actúan como antioxidantes y además son los precursores de un macronutriente esencial,

el retinol o vitamina A (Collins, 2001). En las plantas, a nivel subcelular se localizan en

las membranas tilacoidales. A medida que los cloroplastos se transforman en

cromoplastos se produce una disminución de la clorofila y un aumento de los

carotenoides, quienes dan un color rojizo o amarillento a hojas, frutos y flores. En

plantas estos pigmentos coloreados atraen a los animales polinizadores y “avisan” de

que las frutas están maduras. Los carotenoides junto con el ascorbato protegen a las

membranas fotosintéticas del estrés oxidativo (Hormaetxe et al., 2004).

3.2.1.4 Los flavonoides, con más de 4.000 componentes, son los polifenoles más

abundantes presentes en la dieta. Debido a su capacidad antioxidante, se trata de

compuestos bioactivos que ayudan a tener una buena salud y que protegen de la

aparición de enfermedades crónicas (Birt and Jeffery, 2013). En plantas desempeñan

importantes funciones no sólo como pigmentos, sino también como bactericidas,

(Yamaguchi et al., 2005). Existen numerosos estudios que demuestran que los

flavonoides ayudan en la eliminación de ROS, protegiendo a las plantas de la acción de

numerosos tipos de estrés. A nivel subcelular se localizan principalmente en vacuolas y

cloroplastos (Yamasaki et al., 1997).

3.2.2 Antioxidantes enzimáticos 3.2.2.1 Las superóxido dismutasas (SOD; EC 1.15.1.1) son una clase de

metaloenzimas cuya naturaleza depende del metal situado en el sitio activo de la

proteína. En plantas se han descrito tres tipos de SODs: cuprozinc, ferro y manganeso

SOD (Fridovich, 1986; Rodríguez-Serrano et al., 2007; Palma et al., 2013). La

función principal de estas enzimas es el desproporcionamiento del radical superóxido

(McCord and Fridovich, 1969; Bannister et al., 1987; Halliwell and Gutteridge,

2007).


19

Figura 5: Reacción catalizada por la superóxido dismutasa.

El número y tipo de isoformas de SODs varían en función de la especie, del

órgano, del crecimiento y de las condiciones medioambientales (Corpas et al., 2006b).

La sobreexpresión de SOD está normalmente relacionada con la defensa de las plantas

frente al estrés oxidativo generado bajo condiciones de estrés biótico y abiótico (Gill

and Tuteja, 2010; Fernández-Ocaña et al., 2011).

Tanto las CuZn- como la Fe-SODs son, por lo general, proteínas

homodiméricas, mientras que la Mn-SOD es una proteína homotetramérica. La

identificación del tipo de las distintas isoenzimas se realiza mediante electroforesis en

geles de poliacrilamida en condiciones nativas y tinción específica de los geles en

presencia y ausencia de inhibidores específicos. De este modo, las CuZn-SODs son

inactivadas por el cianuro y por el H2O2, las Fe-SODs sólo por el H2O2 y las Mn-SODs

no se afectan por ninguno de los dos (del Río et al., 1992; Palma et al., 1997; Asada,

2006; Rodríguez-Serrano et al., 2007). En la Tabla 4 se indican algunas de las

características de las SODs descritas en plantas hasta la fecha.

Tabla 4: Tipos de isoenzimas de SOD y localización (Palma et al., 2013).

Tipo de isoenzima Tamaño (kDa) Localización

subcelular

Inhibidores

CuZn-SOD 32 Cloroplastos (estroma y tilacoides),

citosol, núcleo, apoplasto y peroxisomas

Cianuro y H2O2

Fe-SOD 23-36

Cloroplastos (estroma y tilacoides),

mitocondrias y peroxisomas

H2O2

Mn-SOD 90-100 Mitocondrias y peroxisomas -

3.2.2.2 La catalasa (CAT; EC 1.11.1.6) es una hemoproteína tetramérica cuyas

subunidades tienen un tamaño comprendido entre 55 y 59 kDa y cuya estructura

cuaternaria oscila entre 220 y 240 kDa (Corpas et al., 1999; M. and Gerhardt 2002;

Palma et al., 2013). A nivel subcelular, la catalasa se localiza en los peroxisomas y, de

hecho, es utilizada como marcador de estos orgánulos (M. and Gerhardt 2002; del Río


20

et al., 2006). Los polipéptidos de la catalasa están codificados en el núcleo y son

dirigidos de manera post-traduccional a los peroxisomas (Purdue and Lazarow, 2001;

Baker and Graham, 2002). El principal papel de la catalasa es la eliminación del H2O2

que es generado en dichos orgánulos como consecuencia de su propio metabolismo o el

que se acumula en ellos, derivados de otros orgánulos (Dat et al., 2001; Halliwell and

Gutteridge, 2007). Se ha demostrado que la catalasa tiene una doble función,

principalmente, eliminando los elevados niveles de H2O2 que se producen en

situaciones de estrés (Scandalios, 2005a) y en procesos de señalización controlando los

niveles de H2O2 (Palma et al., 2013).

3.2.2.3 Las enzimas del ciclo ascorbato-glutatión (CAG), también denominado ciclo

de Foyer-Halliwell-Asada, constituyen el principal sistema antioxidante, exclusivo de

plantas, para mantener los niveles de H2O2 controlados, especialmente en los

compartimentos celulares en los que se produce este metabolito y no existe catalasa,

como son los cloroplastos y el citosol (Doulis et al., 1998; Halliwell and Gutteridge,

2000). La primera enzima antioxidante del ciclo ascorbato-glutatión es la ascorbato

peroxidasa (APX), y además existen tres etapas enzimáticas adicionales catalizadas

sucesivamente por la monodeshidroascorbato reductasa (MDAR), la deshidroascorbato

reductasa (DAR) y la glutatión reductasa (GR). En el ciclo participan también el

ascorbato y el glutatión que, cuando se oxidan, se transforman en

monodeshidroascorbato (MDA) y deshidroascorbato (DA), y glutatión oxidado

(GSSG), respectivamente. Para el funcionamiento del ciclo es necesaria la presencia de

NADPH, un coenzima ubicuo de naturaleza nucleotídica que, por su potencial redox,

tiene capacidad reductora (Halliwell and Foyer, 1976; Asada and Badger, 1984; Foyer

et al., 1997). En la Figura 5 se muestra un esquema del CAG.


21

Figura 6: Ciclo ascorbato-glutation (Palma et al., 2011c). APX, ascorbato peroxidasa; MDAR,

monodeshidroascorbato reductasa; DAR, deshidroascorbato reductasa; GR, glutatión reductasa.

La ascorbato peroxidasa (APX; EC 1.11.1.11) es una enzima hemínica que

lleva a cabo la primera reacción del CAG y reduce el H2O2 a H2O empleando el

ascorbato como sustrato reductor, el cual se oxida a monodeshidroascorbato (MDA). La

APX es una familia de isoenzimas cuyo número y distribución varían en función de la

especie vegetal. A nivel subcelular, en plantas superiores, se han descrito en citosol,

cloroplastos (estroma y tilacoides), mitocondria y peroxisomas (Bunkelmann and

Trelease, 1996; Shigeoka et al., 2002; del Río et al., 2003a; Palma et al., 2013).

Aunque esta proteína ha destacado en procesos relacionados con estrés

fotooxidativo o de alta temperatura, también se ha descrito su relevancia frente a

procesos de estrés mediados por metales pesados tales como cadmio, plomo, mercurio,

etc. o metaloides como el arsénico (Karpinski et al., 1997; Yabuta et al., 2002; Ball et

al., 2004; Kangasjarvi et al., 2008; Koussevitzky et al., 2008; Palma et al., 2013).

La monodeshidroascorbato reductasa (MDAR; EC 1.6.5.4) cataliza la

reducción de MDA a ascorbato usando NAD(P)H como donador de electrones (Asada


22

and Takahashi, 1987). La MDAR es una enzima que contiene un grupo tiol en el sitio

catalítico. A nivel subcelular ha sido detectada en distintos compartimentos celulares,

como cloroplastos (Hossain et al., 1984) mitocondrias y peroxisomas (Jiménez et al.,

1997; López-Huertas et al., 1999; Mittova et al., 2003; Leterrier et al., 2005;

Lisenbee et al., 2005; Gest et al., 2013) y citosol (Dalton et al., 1993). Se ha

demostrado que la MDHA se activa bajo condiciones de estrés. En el caso de guisante,

esta enzima aumenta su actividad en respuesta a alta intensidad lumínica y a metales

pesados (Leterrier et al., 2005) así como a radiación UV-B (Kubo et al., 1999; Shin et

al., 2013).

La deshidroascorbato reductasa (DAR; EC 1.8.5.1) es una enzima clave en el

ciclo ASC-GSH ya que mantiene los niveles adecuados de ascorbato y actúa como

antioxidante (Tang and Yang, 2013). Esta enzima cataliza la reducción divalente del

deshidroascorbato (DHA) a ascorbato (ASC) empleando para ello el glutatión reducido

(GSH) (Hossain and Asada, 1984). Se ha descrito la activación de esta enzima en

respuesta a varios tipos de estrés, tales como salinidad, sequía, ozono, etc.(Shin et al.,

2013). A nivel subcelular, además de la localización en cloroplastos, mitocondrias y

peroxisomas (ver referencias anteriores de las enzimas del ciclo), existen evidencias de

la presencia de una isoenzima citoplasmática de DAR en arroz (Kim et al., 2013).

La glutation reductasa (GR; 1.6.4.2) es una flavoproteína que cataliza la

reducción del glutatión oxidado (GSSG) a glutatión reducido (GSH), utilizando

NADPH como donador de electrones (Halliwell and Gutteridge, 2007). A nivel

subcelular, la GR se localiza en cloroplastos, citosol, mitocondrias y peroxisomas

(Jiménez et al., 1997; Ashraf, 2009; Anjum et al., 2010). En la mayoría de las plantas

la GR es un homodímero con un peso molecular que oscila entre los 100 y los 150 kDa

y contienen un FAD por monómero (Romero-Puertas et al., 2006; Gill et al., 2013).

Como componente del ciclo ASC-GSH, la GR juega un importante papel en la

destoxificación de ROS y en la tolerancia frente a determinados tipos de estrés, tales

como, salinidad, sequía y otros (Hasanuzzaman et al., 2012; Gill et al., 2013).

3.2.2.4 Deshidrogenasas dependientes de NADP+

El NADPH, como donador de electrones, es una molécula clave en el estrés oxidativo,

durante el cual es producido por varias deshidrogenasas dependientes de NADP, y


23

normalmente citosólicas, aunque también se han descrito e otros compartimentos

celulares (Corpas and Trelease, 1997; Corpas et al., 1998; Mateos et al., 2009; Li et

al., 2013a). Dentro de este grupo se encuentran las enzimas que forman parte del ciclo

de las pentosas fosfato, la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y la 6-fosfogluconato

deshidrogenasa, así como la isocitrato deshidrogenasa dependiente de NADP (NADP-

ICDH; EC 1.1.1.42) y la enzima málico dependiente de NADP (NADP-EM; 1.1.1.40).

En cloroplastos, existe una potente fuente adicional de NADPH que es la ferredoxina

NADP reductasa del fotosistema I, que suele ser la que contribuye en mayor proporción

al contenido celular de NADPH en tejidos fotosintéticos durante la fase luminosa

(Carrillo et al., 1981).

La glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH; EC 1.1.1.49) es la primera

enzima implicada en la ruta de las pentosas fosfato, que reduciendo NADP a NADPH,

cataliza la oxidación de la glucosa 6-fosfato a 6-fosfogluconato, metabolito que es

oxidado por la 6-fosfogluconato deshidrogenasa (E.C 1.1.1.44) hasta ribulosa-5-

fosfato, utilizando también NADP (Corpas and Trelease, 1997).

La isocitrato deshidrogenasa dependiente de NADP cataliza la conversión

reversible de isocitrato a 2-oxoglutarato y CO2 con la producción del coenzima reducido

NADPH (Gálvez and Gadal, 1995). La NADP-ICDH pertenece a un grupo con

múltiples isoenzimas cuyos miembros se localizan a nivel de citosol, mitocondrias,

plastidios y peroxisomas (Corpas et al., 1998; Gálvez et al., 1999).

La enzima málico dependiente de NADP es una enzima ampliamente

distribuida relacionada con distintas rutas metabólicas tanto en procariotas como en

eucariotas. En la reacción que cataliza esta enzima el malato es oxidado a piruvato y

CO2, mientras que el NADP+ es reducido a NADPH. Dentro de sus funciones hay que

destacar su importante papel en la fotosíntesis de algunas plantas en la que la enzima

málico es la principal enzima que dona CO2 a la Rubisco del ciclo de Calvin (Pengelly

et al., 2012; Saigo et al., 2013). A nivel subcelular se localiza principalmente en

cloroplastos (Drincovich et al., 2001), citosol y mitocondrias (Davies and Patil, 1974).


24

4.- METABOLISMO DE LAS ESPECIES DE NITRÓGENO REACTIVO

4.1 El óxido nítrico (NO), origen e historia La importancia de los óxidos de nitrógeno [óxido nítrico, (NO) y dióxido de nitrógeno

(NO2)] es debida fundamentalmente a su relación con la polución del aire, ya que, junto

con otros factores, son los causantes de la lluvia ácida y de la destrucción de la capa de

ozono, provocando, por tanto, efectos nocivos sobre la salud pública (Corpas et al.,

2011). En 1960, Fewson & Nicholas publicaron un breve artículo sobre cómo los

microorganismos y las plantas podían usar el NO como un intermediario del

metabolismo del nitrógeno (Fewson and Nicholas, 1960). En 1979, Klepper descubrió

que las plantas, bajo determinadas condiciones, podían generar esta molécula y emitirla

a la atmósfera (Klepper, 1979). En 1987, el NO fue identificado de manera separada

por dos grupos de investigadores diferentes y fue identificado en ser el compuesto

previamente designado como factor de relajación endotelial (EDRF) (Ignarro et al.,

1987; Palmer et al., 1987). Fueron dichos descubrimientos por los que estos autores

obtuvieron el Premio Nobel de Fisiología y Medicina en 1998.

En 1992, el NO fue calificado como la molécula del año por la revista Science

(Koshland, 1992), y en 1996, Leshem aportó datos sobre la función del NO en los

sistemas vegetales (Leshem, 1996). En el año 1998 aparecieron dos publicaciones que

describían su participación como señal de defensa en plantas tanto a nivel intra- como

intercelular (Delledonne et al., 1998; Durner et al., 1998), y de ahí hasta al día de hoy

se han publicado miles de artículos sobre la importancia de dicha molécula en la

biología celular (del Río et al., 2004; Corpas et al., 2009d; Wendehenne and Hancock,

2011).

El óxido nítrico o monóxido de nitrógeno (NO) es un gas inorgánico, incoloro,

de pequeño tamaño, considerado como una molécula de tipo radical libre debido a que

presenta en el átomo de nigrógeno un electrón desapareado en su orbital π externo, lo

cual explica su elevada reactividad. Es inestable en medio acuoso y en presencia de

oxígeno se oxida a nitritos y nitratos que son sus metabolitos más estables. El NO

presenta una vida media in vivo relativamente corta, menos de 10 s. Además su

naturaleza lipofílica le permite atravesar las membranas celulares y de esta forma


25

reaccionar con diferentes macromoléculas como proteínas, lípidos o ácidos nucléicos,

entre otras (Corpas et al., 2011).

El NO puede presentarse como tres especies distintas e interconvertibles, ya que

puede adoptar una estructura energéticamente más favorable ganando o perdiendo un

electrón dando como resultado la formación de anión nitroxilo (NO-) o de catión

nitrosonio (NO+), los cuales difieren en sus propiedades físicas y en su reactividad

química (Stamler et al., 1992; Hughes, 1999; Wojtaszek, 2000).

4.2 Principales funciones del NO En los animales, el NO ejerce un importante papel como neurotransmisor y está

relacionado con la regulación de la respuesta inmune, relajación del músculo,

percepción del oxígeno y con la producción de energía mediante respiración (Schmidt

and Walter, 1994; Ignarro, 2000; Hagen et al., 2003; Berchner-Pfannschmidt et al.,

2010). Desde que se descubrió que el NO tenía un importante papel en plantas, a las que

ayudaba frente a la infección por patógenos (Delledonne et al., 1998; Durner et al.,

1998), su función en el desarrollo, metabolismo y respuesta frente a enfermedades ha

sido ampliamente estudiado (Lamattina et al., 2003; Shapiro, 2005; Gupta et al.,

2011). El NO puede ejercer su función de distintas maneras: modulando la expresión de

los genes, mediante la actuación de segundos mensajeros, ó interactuando con proteín

kinasas (Astier and Lindermayr, 2012). Al ser el NO una molécula pequeña, puede

difundir fácilmente a través de las membranas y desencadenar distintos procesos en

cortos periodos de tiempo (Beligni and Lamattina, 2001). Es por esto que se ha

relacionado al NO con múltiples fenómenos en plantas tales como crecimiento y

desarrollo, germinación de semillas, formación de raíces secundarias, floración, cierre

de los estomas, maduración de frutos, senescencia, muerte celular programada (PCD) y

metabolismo de nódulos en leguminosas (Beligni and Lamattina, 2000; Zhang et al.,

2003; Bethke et al., 2004; Corpas et al., 2004; del Río et al., 2004; Shapiro, 2005;

Neill et al., 2008a). Además se ha demostrado la producción de NO en plantas bajo

situaciones de estrés tanto biótico como abiótico (Lamattina et al., 2003; del Río et al.,

2004; Wendehenne et al., 2004; Delledonne, 2005; Shapiro, 2005; Corpas et al.,

2007; Valderrama et al., 2007).


26

La influencia del NO sobre el metabolismo de las plantas ha sido ampliamente

estudiada mediante la incorporación de donadores de NO exógenos en diferentes

concentraciones. El nitroprusiato sódico (SNP) es el donante de NO más usado debido a

que su coste es relativamente bajo (Floryszak-Wieczorek et al., 2006; Ederli et al.,

2009) y a que su aplicación está bien documentada (Zandonadi et al., 2010; Filippou

et al., 2013). Aunque hay otros donadores como los NONOatos o el propio S-

nitrosoglutation (GSNO) que proporcionan la generación de NO de una forma más

controlada.

Dependiendo de su concentración en la célula el NO puede actuar como

antioxidante o como prooxidante. Hay estudios que indican que el NO es una molécula

inductora de estrés (Leshem et al., 1997), mientras que otros describen al NO de una

capacidad protectora (Beligni and Lamattina, 1999b), funcionando como antioxidante

y eliminando las ROS (Filippou et al., 2013). De hecho, se ha descrito cómo la

combinación del NO con las ROS puede ejercer sobre las células un papel tóxico o

protector en función de las circunstancias (Beligni and Lamattina, 1999a). No

obstante, esta función antioxidante es todavía debatida, ya que la reacción del NO con

radicales superóxido genera el ión peroxinitrito (ONOO-), una especie que tiene mucha

mayor reactividad que las moléculas de las que procede (ver más adelante).

4. 3 Producción de NO en plantas En animales se ha identificado la fuente endógena de NO. Se trata de una enzima

designada como óxido nítrico sintasa (NOS) (EC 1.14.13.39) y que genera NO y

citrulina a partir del amino ácido L-arginina (Moncada et al., 1989). Esta formación de

NO requiere NADPH como donador de electrones y O2 como cosustrato (Griffith and

Stuehr, 1995). Los cofactores de esta reacción son FMN, FAD, y tetrahidrobiopterina

(BH4). Existes tres isoformas de NOS, las isoformas de NOS neuronal y endotelial son

constitutivas (nNOSn y eNOS, respectivamente) pues dependen de Ca2+

y calmodulina,

mientras que la isoforma inducible (iNOS) es independiente de calcio (Beligni and

Lamattina, 2001).

Las plantas pueden generar NO por mecanismos enzimáticos y no enzimáticos;

además se han descrito otras dos enzimas necesarias en el control y eliminación del NO

(Gupta et al., 2011; Astier and Lindermayr, 2012) (ver más abajo).


27

En plantas, se ha demostrado la generación enzimática de NO dependiente de

la L-arginina similar a la NOS animal en diferentes especies, aunque no se ha

descubierto el gen que la codifica (Corpas et al., 2009d). Se ha descrito una actividad

tipo NOS en peroxisomas y cloroplastos de plantas (Barroso et al., 1999; Jasid et al.,

2006). En este proceso la L-arginina actúa como substrato y el NADPH actúa como

donador de electrones. Numerosos estudios relacionan la participación de una actividad-

tipo NOS con varios procesos tales como germinación de semillas, la muerte celular

programada, cierre de estomas, desarrollo de raíces y en respuestas a estreses de tipo

bióticos y abióticos (Delledonne et al., 1998; Bright et al., 2006; Besson-Bard et al.,

2009; De Michele et al., 2009; Corpas et al., 2011). También se ha descrito la

producción de NO mediada por poliaminas (Tun et al., 2006) en respuesta a

determinados tipos de estrés y por hidroxilaminas mediada por ROS (Rumer et al.,

2009).

Además se han descrito otros posibles mecanismos enzimáticos de producción de

NO en distintos compartimentos celulares de las células de las plantas (Figura 6). En el

citosol, la nitrato reductasa (NR) reduce el nitrato a nitrito quien posteriormente

producirá NO, en dos reacciones en las que el NADH es el donador de electrones (Lillo

et al., 2004; Gupta et al., 2011). Otra posible fuente enzimática de NO descrita en

plantas es la nitrito-óxido nítrico reductasa (Ni-NOR), que es una enzima unida a la

membrana plasmática de la raíz de tabaco y que cataliza la reducción de nitrito a NO,

usando el citocromo c como donador de electrones (Stohr and Ullrich, 2002; Stohr and

Stremlau, 2006). La reducción del nitrito en la membrana interna de las mitocondrias

da también como resultado la producción de NO (Stoimenova et al., 2007; Gupta et

al., 2011).


28

Figura 7: Síntesis y eliminación de NO en las células de las plantas. (Modificado de Gupta et al., 2011).

Ni-NOR: nitrito-óxido nítrico reductasa. NOS: óxido nítrico sintasa. NR: nitrato reductasa. NiR: nitrito

reductasa. GSNOR: nitrosoglutatión reductasa. Hb: hemoglobinas vegetales

4. 4 Control y eliminación del NO

El NO puede ser eliminado tanto por mecanismos enzimáticos como por mecanismos

no enzimáticos (Baudouin, 2011). En plantas, como en otros organismos, el S-

nitrosoglutatión (GSNO) es considerado como un reservorio de NO y sus niveles son

Membrana plasma tica

Citosol NR

Peroxisomas

Tipo-NOS

Cloroplastos

Tipo-NOS

Ni-NOR

Mitocondria

NiR

Pared celular

NO

NO

GSNOR

Hb


29

controlados por la S-nitrosoglutatión reductasa (GSNOR), también conocida como

alcohol deshidrogenasa de clase III o formaldehido deshidrogenasa dependiente de

glutatión (FALDH) (Dolferus et al., 1997; Liu et al., 2001; Sakamoto et al., 2002).

Esta enzima cataliza la reducción del GSNO a GSSG y NH3.

El NO puede interaccionar también con las hemoglobinas vegetales a través de

hierro presente en su grupo hemo. Por ejemplo, las hemoglobinas no simbióticas

(nsHbs) de cebada, alfalfa y Arabidopsis interaccionan con el NO eliminándolo del

medio (Perazzolli et al., 2006; Neill et al., 2008b).

4. 5 Estrés nitrosativo y especies de nitrógeno reactivo (reactive nitrogen species;

RNS)

Se denomina estrés nitrosativo a la sobreproducción no controlada de NO y a sus

moléculas derivadas, lo que conlleva efectos tóxicos en las células (Klatt and Lamas,

2000; Valderrama et al., 2007). El término especies de nitrógeno reactivo (reactive

nitrogen species, RNS) sirve para englobar tanto al NO como a otras moléculas

derivadas como el peroxinitrito (ONOO-), el dióxido de nitrógeno (NO2), el trióxido de

dinitrógeno (N2O3) y los nitrosotioles (SNOs) (Hausladen and Stamler, 1999;

Gutteridge and Halliwell, 2000; Halliwell and Gutteridge, 2007). Las RNS son

altamente reactivas y pueden reaccionar con diferentes macromolélulas como proteínas,

lípidos y DNA, dando lugar a modificaciones químicas que pueden producir

alteraciones de función y/o estructura e incluso muerte celular.

Peroxinitrito (ONOO-)

El peroxinitrito es un potente oxidante que se genera por la reacción no enzimática entre

el NO y el anión superóxido (O2.-). La formación del peroxinitrito depende de las

concentraciones tanto del NO como de radical superóxido y, por lo tanto, está

directamente relacionado con la actividad de la NOS y de la SOD. Así, una vez que el

NO es producido por la NOS, la fracción de NO que forma peroxinitrito depende de la

concentración de superóxido, que a su vez está controlada la SOD según se indica en la

Figura 7 (Squadrito and Pryor, 1998).


30

Figura 8: Regulación de la formación del peroxinitrito por la NOS y la SOD.

El peroxinitrito es un peróxido reactivo de vida corta (menos de 10 ms) con un pKa de

6,8; es un buen agente oxidante y nitrante que además puede dañar las membranas

biológicas. Estas características son las que determinan sus funciones in vivo (Radi,

2013). El peroxinitrito es capaz de interrumpir el metabolismo normal redox y del NO

actuando, por tanto, como un oxidante biológico importante que media en una gran

cantidad de enfermedades cardiovasculares, neurodegenerativas e inflamatorias

(Ferrer-Sueta and Radi, 2009).

El peroxinitrito puede reaccionar con diferentes biomoléculas como aminoácidos

y proteínas modificando su estructura y su función (Alvárez and Radi, 2003). Se ha

demostrado cómo el peroxinitrito nitra los residuos de tirosina de las proteínas bajo

determinadas condiciones fisiológicas (Goldstein and Merenyi, 2008) dando lugar a

nitroproteínas. Actualmente se considera que un incremento en los niveles de

nitrotirosina libre como de proteínas nitratadas podría ser un buen marcador de estrés

nitrosativo (Corpas et al., 2007), de la misma manera que el aumento en la oxidación

de proteínas o de peroxidación lipídica son considerados marcadores de estrés

oxidativo.

S-Nitrosotioles (SNOs) y S-nitrosoglutatión (GSNO)

Los nitrosotioles son compuestos que se forman por la reacción del NO con el grupo

tiol de un residuo de cisteína de un polipéptido, en presencia de oxígeno (Singh et al.,

1996; Foster et al., 2003). Los SNOs tienen varias funciones dentro de las cuales se

incluyen la liberación del NO, la transnitrosación y la S-tiolación (Liu et al., 1998;

Hogg, 2000). Una vez formados los nitrosotioles son muy sensibles a la luz y a los

cambios redox (Astier et al., 2011).

NO + O2

.- ONOO

-

Activada por la NOS

Reprimida por la SOD


31

Dentro de los nitrosotioles hay que destacar al S-nitrosoglutatión (GSNO). El

GSNO se forma por la reacción de S-nitrosilación del NO con el glutatión (GSH) y

tiene un importante papel en animales y plantas en los que actúa como reservorio móvil

de NO. Asimismo, el GSNO puede mediar en rutas de señalización celular mediante

modificaciones post-traduccionales de proteínas (Barroso et al., 2013). La importancia

de esta molécula además proviene de que el GSH es el mayor antioxidante soluble de

bajo peso molecular en plantas (Durner and Klessig, 1999; Foster et al., 2003; Airaki

et al., 2011; Corpas et al., 2013a).

Los niveles de GSNO y, por tanto, de nitrosotioles están determinados por la

actividad de la enzima GSNOR que cataliza su reducción, dependiente de NADH del

GSNO. Se ha demostrado que la GSNOR es imprescindible en levaduras, plantas y

mamíferos para proteger a las células frente al estrés nitrosativo (Valderrama et al.,

2007; Leterrier et al., 2011; Kubienova et al., 2013).

4. 6 Modificaciones postraduccionales mediadas por NO y otras RNS Además de otros mecanismos de señalización, el NO también puede mediar

modificaciones post-traduccionales a través de la nitración (Corpas et al., 2013c), la S-

nitrosilación y la nitrosilación metálica de las proteínas (Astier et al., 2012; Astier and

Lindermayr, 2012).

La nitración consiste en la reacción de un agente nitrante con un residuo de

tirosina de una proteína, por la que se añade un grupo nitro (NO2) en la posición orto del

anillo de un residuo de tirosina (Y), formando 3-nitrotirosina (Schopfer et al., 2003).

Otros aminoácidos como el triptófano (W), la cisteína (C) y la metionina (M) pueden

ser nitrados, aunque este proceso se da preferentemente en las tirosinas (Corpas et al.,

2009b). La nitración es un proceso selectivo que sólo afecta a unas pocas tirosinas

dentro de las proteínas en función de determinados factores como la estructura de la

proteína o su localización (Bartesaghi et al., 2007). La nitración produce cambios

conformacionales, lo que puede implicar tanto la inhibición como la activación de las

proteínas afectadas o, incluso, no provocar efecto (Ischiropoulos, 2003; Bayden et al.,

2011; Astier and Lindermayr, 2012). En otros casos se ha descrito cómo la nitración

de los residuos de tirosina puede prevenir la fosforilación o, por el contrario, aumentar

la fosforilación en las proteínas (Rayala et al., 2007; Shi et al., 2007; Corpas et al.,


32

2009b). Aunque en principio se pensó que esta modificación post-traduccional era

irreversible, existen algunas evidencias de que la desnitración de las proteínas podría

producirse tanto de manera enzimática como no enzimática (Abello et al., 2009;

Vandelle and Delledonne, 2011).

Debido a sus características químicas, el NO puede interaccionar con metales de

transición como Fe, Zn o Cu de metaloproteínas y formar complejos metal-nitrosilo

(Ford, 2010). Se trata en este caso de una reacción reversible que puede alterar la

actividad de las proteínas afectadas (Astier and Lindermayr, 2012; Toledo and

Augusto, 2012).

La S-nitrosilación se refiere a la unión covalente del NO con el grupo tiol de un

residuo de cisteína de una proteína, con la subsiguiente formación de los S-nitrosotioles

(SNOs) (Hess et al., 2005). A pesar de que los residuos de cisteína aparecen en la

mayoría de las proteínas, la S-nitrosilación sólo se da en residuos específicos. Dicha

especificidad parece que puede ser debida, entre otros factores, a que el medio en el que

se encuentra la proteína sea ácido o básico (Seth and Stamler, 2011; Astier and

Lindermayr, 2012).

La S-nitrosilación de proteínas es un mecanismo específico y reversible que

modula distintas funciones biológicas en las células. Además se trata de un proceso que

es altamente sensible a la luz y al estado redox celular y por lo tanto la acción de

distintos agentes reductores como el GSH, el ascorbato, e incluso determinados iones

metálicos reducidos pueden causar la desnitrosilación de las proteínas (Astier et al.,

2011). La desnitrosilación de las proteínas se produce de manera enzimática y no

enzimática (Astier and Lindermayr, 2012). En los últimos años se han descrito varias

desnitrosilasas, es decir, las enzimas que promueven la desnitrosilación de las proteínas,

de las que dos en particular, la GSNOR y las tiorredoxinas, son especialmente

importantes puesto que regulan diferentes procesos de señalización celular protegiendo,

por tanto, frente al estrés nitrosativo (Benhar et al., 2009).


33

5. PEROXISOMAS VEGETALES

5.1 Historia, definición, y tipos de peroxisomas Los peroxisomas fueron descritos por primera vez en 1954 a partir de imágenes de

microscopía electrónica de células renales de ratón (Rhodin, 1954) y, en un principio,

estos orgánulos se designaron como “microcuerpos”, nombre que no hacía alusión a

ninguna de sus funciones bioquímicas (del Río et al., 2002). Más adelante, en los años

60 se llevó a cabo su aislamiento y su caracterización bioquímica por el equipo del

Profesor Christian de Duve (De Duve and Baudhuin, 1966); fueron entonces

designados como “peroxisomas” debido a que sus constituyentes básicos eran flavín

oxidasas productoras de peróxido de hidrógeno y la catalasa que lo descomponía.

Fueron esos descubrimientos los que le valieron a de Duve para obtener el Premio

Nobel de Fisiología y Medicina, junto a Claude y Palade en 1974 (Tolbert and Essner,

1981).

Los peroxisomas son orgánulos subcelulares de pequeño tamaño (0,1-1,7 m )

constituidos por una membrana simple que rodea a una matriz granular o fibrilar y que

en algunas especies presentan inclusiones amorfas o cuerpos cristalinos (nucleoides)

(Tolbert and Essner, 1981; Huang et al., 1983; del Río et al., 2002; del Río, 2011).

Además el número de peroxisomas por célula suele ser bajo (Palma et al., 2009b). A

diferencia de mitocondrias y de cloroplastos estos orgánulos no poseen ADN, ni

ribosomas y sus proteínas son sintetizadas en el núcleo e importadas post-

traduccionalmente a los peroxisomas desde el citosol (Kaur et al., 2009).

El metabolismo peroxisomal se caracteriza por su elevada plasticidad debido a

que su composición enzimática depende no sólo del tipo celular, sino del estado de

desarrollo y de las condiciones medioambientales (Corpas et al., 2009a). Los

peroxisomas se encuentran en casi todas las células eucarióticas y el número de

orgánulos por célula varía en función del tejido y de la especie vegetal (del Río et al.,

2002).

En plantas, se han descrito distintos tipos de peroxisomas atendiendo a sus

funciones metabólicas específicas. Los principales tipos son: peroxisomas de hojas,

glioxisomas, peroxisomas de nódulos de raíz y peroxisomas no especializados (Huang

et al., 1983; Baker and Graham, 2002; Mateos et al., 2003). Los peroxisomas de


34

hojas son orgánulos especializados presentes en los tejidos fotosintéticos en los que se

llevan a cabo algunas reacciones de la fotorrespiración (Tolbert et al., 1987; Douce

and Heldt, 2000; del Río, 2011). Los glioxisomas son peroxisomas especializados que

aparecen en los tejidos de reserva de las semillas oleaginosas, contienen las enzimas

para la -oxidación de los ácidos grasos y del ciclo del glioxilato y convierten los

lípidos de reserva de las semillas en azúcares que son utilizados para la germinación y

para el crecimiento de la planta (Huang et al., 1983; Baker and Graham, 2002; del

Río, 2011). Los peroxisomas de nódulos de raíz se dan en determinadas leguminosas

tropicales que llevan a cabo la biosíntesis de alantoína, que es el mayor metabolito para

el transporte de nitrógeno en estas plantas (Schubert, 1986; del Río, 2011). Sin

embargo, actualmente se tiende a llamarlos a todos de forma genérica como

peroxisomas (Pracharoenwattana and Smith, 2008).

5.2 Principales funciones de los peroxisomas Los peroxisomas intervienen en multitud de procesos cruciales para el desarrollo de las

plantas. Los peroxisomas son el principal orgánulo en las células vegetales donde se

produce la -oxidación de los ácidos grasos, aunque existe datos de una -oxidación

mitocondrial (Masterson and Wood, 2001). Aparte de los productos normales de la -

oxidación de los ácidos grasos, en peroxisomas estos pueden derivar hacia la generación

de fitohormonas: el ácido indolacético (IAA), el ácido salicílico (SA) y el ácido

jasmónico (JA). Asimismo, estos orgánulos juegan un importante papel en la

fotorrespiración, junto con mitocondrias y cloroplastos.

Intervienen también, en otros procesos metabólicos y de señalización, como en

el ciclo del glioxilato, destoxificación de xenobióticos, generación de moléculas señal

(SA), y metabolismo de ureidos, purinas, poliaminas, sulfitos, así como en el

metabolismo de las especies de oxígeno y nitrógeno reactivo (Corpas et al., 2009a; del

Río et al., 2009; Hu et al., 2012; Corpas et al., 2013b). La capacidad de los

peroxisomas para generar moléculas señal supone cambios en el metabolismo celular de

las plantas, relacionados con la respuesta a estrés tanto biótico como abiótico (Huang et

al., 1983; del Río et al., 1998; Corpas et al., 2001). En la Tabla 5 se muestran las

principales funciones de los peroxisomas vegetales.


35

Tabla 5: Principales funciones descritas en peroxisomas de plantas (del Río, 2011).

Función Referencia

Fotorrespiración (Tolbert et al., 1987; Douce and Heldt, 2000)

-oxidación de los ácidos grasos (Baker and Graham, 2002; Baker et al., 2006)

Ciclo del glioxilato (Baker and Graham, 2002; Pracharoenwattana and

Smith, 2008)

Metabolismo de ureidos (Schubert, 1986; Baker and Graham, 2002)

Catabolismo de purinas (Corpas et al., 1993a)

Catabolismo de poliaminas (Kamada-Nobusada et al., 2008; Moschou et al., 2008)

Metabolismo del azufre (Hansch et al., 2006; Lang et al., 2007; Corpas et al.,

2009a)

Metabolismo de las especies de oxígeno y

nitrógeno reactivo (ROS y RNS)

(Corpas et al., 2001; del Río et al., 2002)

Fotomorfogénesis (Hu et al., 2002; Desai and Hu, 2008)

Biosíntesis de fitohormonas (auxinas,

ácido jasmónico y ácido salicílico)

(Baker et al., 2006; Kaur et al., 2009)

Senescencia de hojas (del Río et al., 1998)

Defensa contra patógenos (Koh et al., 2005; Kuzniak and Sklodowska, 2005; Lipka

et al., 2005; Kaur et al., 2009)

5.3 Proteínas peroxisomales Todas las proteínas peroxisomales están codificadas en el núcleo. Dichas

macromoléculas pueden está localizadas en la matriz o estar integradas en la membrana

y en función del tipo siguen distinta ruta de integración en el orgánulo. Las proteínas de

matriz son sintetizadas en el citoplasma y se dirigen de manera post-traduccional a los

peroxisomas mediante dos señales peptídicas distintas, PTS1 o PTS2 (peroxisomal

targeting signal) (Reumann, 2004; Kessel-Vigelius et al., 2013). La gran mayoría de

proteínas peroxisomales de la matriz conocidas contienen una PTS1 unida al extremo

carboxilo terminal y consiste en un tripéptido que se corresponde con el prototipo

SKL, SRM o variaciones conservadas de esta tripleta (donde “” indica el extremo

C-terminal de la proteína) (Reumann, 2004; Chowdhary et al., 2012). Un pequeño

grupo de proteínas de matriz contienen una PTS2 que es un nonapéptido unido al

extremo amino terminal de las proteínas (Swinkels et al., 1991; Glover et al., 1994;

Reumann, 2004). Las secuencias PTS son reconocidas por dos receptores solubles

distintos situados en el citosol (Pex5 para PTS1 y Pex7 para PTS2); a continuación el

complejo proteína-receptor avanza hasta la membrana del peroxisoma y la atraviesa.

Posteriormente el receptor se libera y vuelve al citosol (Murphy et al., 2003). Mientras

que el tripéptido C-terminal o PTS1 no se escinde de la proteína una vez dentro del

peroxisoma, el nonapéptido N-terminal o PTS2 es degradado proteolíticamente tras

llegar a la matriz peroxisomal (Reumann, 2004). Algunas proteínas de matriz


36

peroxisomales no contienen ninguno de los PTS (Karpichev and Small, 2000) y la

hipótesis es que dichas proteínas son dirigidas al orgánulo por secuencias internas

específicas (Reumann, 2004).

En comparación con las proteínas de matriz peroxisomal, se sabe mucho menos

sobre las proteínas de la membrana peroxisomal (PMP), sobre cuáles son sus señales

peptídicas y cómo son integradas en la membrana del orgánulo. Ello se debe no sólo al

pequeño número de proteínas que aparecen en la membrana, sino también a su carácter

hidrofóbico, que hace que las proteínas de membrana precipiten en medio acuoso

(Corpas et al., 1994; Palma et al., 2009b). Se considera que la mayoría de las PMPs

son sintetizadas en el citosol e insertadas de manera post-traduccional en el peroxisoma

al igual que las proteínas de matriz. Sin embargo no se sabe el papel de las peroxinas, es

decir, de las proteínas relacionadas con el direccionamiento e inserción de las proteínas

en la membrana o de cómo sería la secuencia de dichas señales de las proteínas de

membrana peroxisomal (Murphy et al., 2003).

5.4 Biogénesis de peroxisomas El origen de los peroxisomas ha sido objeto de debate durante muchos años. Los

últimos estudios de visualización de orgánulos en células vivas indican la existencia de

dos mecanismos de biogénesis de peroxisomas. En el primero de ellos, los peroxisomas

se forman de novo a partir de vesículas pre-peroxisomales que nacen del retículo

endoplasmático y que a continuación se unen con otras formando peroxisomas maduros

(Hoepfner et al., 2005; van der Zand et al., 2012). En el segundo mecanismo los

peroxisomas se forman por la división de orgánulos pre-existentes mediante crecimiento

y división (fisión) de los mismos, usando nuevas proteínas y lípidos que serán aportadas

por el retículo endoplasmático en forma de vesículas (Motley and Hettema, 2007). Las

principales diferencias entre estos dos mecanismos de biogénesis de peroxisomas son:

la formación de novo es un proceso más lento que el proceso de fisión; además en la

formación de novo los nuevos peroxisomas contienen todo el material nuevo, mientras

que en la fisión se requiere de la presencia de peroxisomas anteriores (Smith and

Aitchison, 2013). En la Figura 8 se muestra un modelo integrado de los biogénesis de

los peroxisomas por los dos mecanismos descritos anteriormente.


37

Figura 9: Biogénesis de peroxisomas (modificado de Smith and Aitchison, 2013).

5.5 Herramientas para la identificación del proteoma de los peroxisomas

No basta con los estudios genéticos y bioquímicos realizados hasta ahora para conocer

el papel crucial de los peroxisomas. Los primeros estudios sobre el proteoma de los

peroxisomas de las plantas aparecieron poco después de la publicación del genoma de

Arabidopsis (Initiative, 2000; Reumann, 2011b). Una descripción del proteoma total de

los peroxisomas es determinante para identificar nuevas funciones de los mismos.

Asimismo, cuando hablamos de proteoma, hablamos de un elemento cambiante que

varía en función del tejido, del estado de desarrollo y de las condiciones

medioambientales (Hu et al., 2012).

Para abordar el estudio del proteoma peroxisomal son necesarias tres

aproximaciones principales:

1) Predicción de PTSs mediante estudios de bioinformática, los cuales usan

modelos matemáticos para predecir las señales peptídicas a partir de las

secuencias genómicas.


38

2) Identificación de proteínas mediante estudios estrictamente proteómicos, es

decir, electroforesis bidimensional, seguida de digestión tríptica de proteínas y

análisis por espectrometría de masas (MALDI-TOF).

3) Verificación de dichas proteínas putativas peroxisomales mediante localización

subcelular in vivo con proteínas de fusión fluorescentes o mediante

inmunolocalización mediante microscopía electrónica.

Los principales problemas a la hora de identificar una nueva proteína son la falta de

información sobre el genoma de la mayoría de las especies modelo de plantas y la

imposibilidad de intercambio de protocolos de aislamiento de peroxisomas entre

distintas especies, lo que, unido a las posibles contaminaciones en fracciones

peroxisomales de proteínas de mitocondrias y cloroplastos, hace de la descripción de

una proteína anteriormente desconocida una ardua tarea (Reumann 2011).

A pesar de todo, la proteómica se considera como una potente herramienta para

descubrir nuevas funciones de estos orgánulos y así comprender en su totalidad el

metabolismo de los mismos (Hu et al., 2012).

5.6 Particularidades de los peroxisomas de frutos de pimiento La purificación y caracterización de peroxisomas en plantas superiores ha sido

ampliamente descrita. Sin embargo y debido a que los peroxisomas están rodeados por

una membrana simple se trata de orgánulos tremendamente frágiles. En el caso de los

frutos de pimiento y a partir de homogenados de los mismos, el aislamiento de

peroxisomas se hace por centrifugaciones diferenciales seguidas de centrifugaciones en

gradientes de densidad de sacarosa (Mateos et al., 2003) en las que las bandas de

peroxisomas se corresponden a una zona de densidad de aproximadamente 1,24 g ·cm-3

.

A continuación se usan marcadores enzimáticos para verificar la existencia de

peroxisomas y diferenciarlos, así, de las bandas de plastidios, mitrocondrias y de

retículo endoplasmático (Mateos et al., 2003).

La principal particularidad de los peroxisomas de los frutos de pimiento consiste

en la presencia simultánea de las enzimas de la fotorrespiración y del ciclo del

glioxilato, en fruto verde, a diferencia de lo que ocurre en peroxisomas de tejidos verdes

de otras especies vegetales, en los que sólo están presentes las enzimas de la

fotorrespiración. Por el contrario, es en hojas senescentes donde desaparecen dichas


39

enzimas y se detectan las del ciclo del glioxilato estableciéndose una conversión de

peroxisomas de hojas en glioxisomas (Huang et al., 1983; Sandalio and del Río, 1988;

del Río et al., 1998; Hayashi et al., 2000; Baker and Graham, 2002; Mateos et al.,

2003).

6.- INTRODUCIÓN A LA PROTEÓMICA

A día de hoy la proteómica se ha convertido en una poderosa herramienta de

investigación y estudio de los seres vivos ya que proporciona una gran cantidad de

información y, por tanto, un mayor conocimiento de la biología vegetal.

La proteómica es la ciencia que se encarga del estudio del proteoma, es decir,

del conjunto total de las proteínas que se expresan en un momento determinado en un

material biológico de cualquier naturaleza, ya sea célula, órgano, individuo o especie

(Wasinger et al., 1995). A diferencia del genoma, que es un elemento estático a lo

largo de la vida de un individuo, el proteoma tiene un carácter dinámico, puesto que la

expresión de las proteínas cambia en diferentes etapas del ciclo celular así como en

respuesta a acciones externas. La proteómica, sin embargo, va más allá de la mera

catalogación de proteínas, pretendiendo establecer, en último término, su estructura,

actividad biológica, modo de acción, localización celular, modificaciones post-

traduccionales e interacción con otras proteínas o moléculas (Palma et al., 2009b,

2011b).

En general, la biología depende de la lectura selectiva de genes individuales del

genoma. Dichos genes son convertidos en transcritos primarios, posteriormente

procesados en mRNA y por último traducidos en proteínas, las cuales son susceptibles

de modificaciones post-traduccionales e incluso de formación de complejos con otras

proteínas. Todos estos procesos influyen en la función final de las proteínas (Kersten et

al., 2002).

El hecho de trabajar con proteínas implica una serie de problemas debido a que

se trata de elementos físicoquímicamente heterogéneos así como estructuralmente

complejos, lo que hace de su extracción, solubilización, manejo e identificación un

arduo trabajo (Rose et al., 2004).

El dogma central de la biología molecular ADNARNproteína dio lugar a

uno de los paradigmas esenciales de la biología que prevaleció durante la segunda mitad


40

del siglo pasado: Un genuna proteína; sin embargo, esta relación aparentemente

simple, no refleja la realidad (HumpherySmith et al., 1997). Aunque es cierto que un

gen codifica una secuencia de aminoácidos, existen dos eventos que incrementan

considerablemente el número de proteínas que pueden ser originadas por un gen y estar

presentes en una célula en un momento dado y por tanto hace más complejo el

proteoma de una célula. Uno de esos eventos es el fenómeno conocido como

acoplamiento, empalme o ajuste alternativo (alternative splicing). El otro evento, es el

hecho de que una proteína puede ser modificada durante o después de la traducción en

un proceso que se conoce como modificación post-traduccional (PTM). Por ello, una

secuencia única de aminoácidos puede generar muchas especies químicas diferentes

(Castellanos et al., 2004). En el caso del genoma humano que contiene

aproximadamente unos 30.000 genes se calcula que puede codificar unas 200.000 - 2

millones de proteínas. De igual forma se puede concluir que el proteoma de las plantas

alcanzará una magnitud similar (Rose et al., 2004).

La mayoría de estudios proteómicos de plantas se pueden dividir en dos categorías

diferentes:

1) Caracterización del proteoma de un organismo, es decir, identificar el perfil

proteico de una especie en concreto, con el fin de separar, secuenciar y catalogar

el mayor número de proteínas posibles. La identificación del proteoma de

células individuales es altamente complicado, por lo tanto se ha recurrido al

trabajo con orgánulos subcelulares, por lo que no sólo se ha reducido la

complejidad sino que además se obtiene información complementaria sobre la

localización de determinadas proteínas (Rose et al., 2004).

2) Identificación de las diferencias existentes en el proteoma celular entre dos

situaciones distintas lo que se conoce como proteómica de "expresión

diferencial” (Rose et al., 2004).

3) Identificación de las interacciones entre proteínas, así como de las proteínas con

otras moléculas (Castellanos et al., 2004).

Para un completo estudio del proteoma es necesario disponer de técnicas que

permitan a) separar miles de especies proteicas; b) identificar las especies de interés y c)

cuantificar la magnitud de los cambios en la expresión de proteínas. La proteómica

aborda este complejo problema técnico con variadas herramientas. Los elementos clave


41

de un estudio proteómico incluyen la extracción y detección del mayor número de

proteínas posibles a la vez que se minimizan los artefactos post-extracción, la

cuantificación apropiada y comparación de muestras y la identificación de proteínas e

integración de la información proteica obtenida con otros conjuntos de datos. A pesar de

que se incide en el desarrollo de tecnologías que permitan la separación e identificación

de las proteínas de una muestra, el paso más crítico de cualquier estudio de proteómica

es la extracción de proteínas y la preparación de la muestra (Rose et al., 2004; Palma et

al., 2011b).

Las herramientas básicas de la proteómica clásica se asientan en dos técnicas

principales: la electroforesis en gel de poliacrilamida como método de separación y

selección de proteínas diana y la espectrometría de masas como método de

identificación. Estas técnicas se benefician de los conocimientos ya existentes sobre el

genoma y proteoma humano y de otras especies. Dicha información se encuentra

disponible en bases de datos de libre acceso y puede utilizarse mediante programas de

búsqueda específicos que relacionan las secuencias en la base de datos con los datos

espectrométricos obtenidos (Newton et al., 2004).

42

J T V

Objetivos

43

La maduración de la mayoría de las especies del género Capsicum está caracterizada

por un intenso metabolismo, emisión de compuestos volátiles, destrucción de las

clorofilas y síntesis de nuevos pigmentos, formación de pectinas, síntesis de proteínas,

alteración en el sabor, etc. El proceso de maduración ha sido objeto de interés de

muchos investigadores, no solo por los espectaculares cambios que sufren los frutos,

sino por la complejidad del mecanismo de biosíntesis de capsantina, una sustancia

exclusiva que les da color a los mismos. Muchos de los cambios bioquímicos

observados se corresponden con modificaciones en la célula. De hecho, los cloroplastos,

que son los que contienen clorofila, se convierten en cromoplastos, que contienen

carotenoides como pigmentos mayoritarios. En las mitocondrias, sin embargo, no se han

descrito modificaciones ultraestructurales ni metabólicas destacables durante la

maduración de los frutos. En los peroxisomas, se han descrito importantes cambios

metabólicos; así se ha comprobado que la fotorrespiración es inhibida, mientras que la

actividad de las enzimas del ciclo del glioxilato aumenta a lo largo del proceso de

maduración. Teniendo en cuenta la importancia que tienen los peroxisomas en muchos

procesos intrínsecos de la planta y como respuesta a estímulos externos, nos planteamos

la importancia que puedan tener dichos orgánulos en la homeostasis celular durante el

proceso de maduración de los frutos.

Las aproximaciones tradicionales han permitido descifrar las principales rutas

metabólicas y las funciones celulares en las que se encuentran implicados los distintos

orgánulos. No obstante, quedan muchas incógnitas sobre determinados procesos

fisiológicos que subyacen al proceso de maduración. El análisis de la expresión de

varios genes, realizado en diversas variedades de pimiento en distintos estados de

maduración, no ha revelado diferencias notorias que permitieran emplear una

caracterización molecular de los frutos basada en estos parámetros. Por tanto, se

contempla la proteómica como un elemento de estrategia a la hora de abordar la

investigación molecular de las variedades comerciales de pimiento dulce. La

proteómica es una disciplina que va más allá de la mera catalogación de proteínas,

pretendiendo establecer, en último término, su estructura, actividad biológica, modo de

acción, localización celular, modificaciones post-traduccionales e interacción con otras

proteínas o moléculas. La contribución de la proteómica, por tanto, es fundamental no

solo para identificar las proteínas y su relación con los distintos orgánulos, sino cómo

Objetivos

44

en conjunto todas ellas contribuyen a descifrar los factores que intervienen en el

crecimiento de la planta y en su desarrollo.

Es por esto que nuestro grupo en la Estación Experimental del Zaidín inició una

línea de investigación orientada a sentar las bases moleculares que permitieran conocer

el desarrollo y la maduración de los frutos a nivel molecular, y así poder vincularlos con

las características nutricionales de los mismos.

Considerando la importancia que tiene el fruto de pimiento a nivel agronómico,

profundizar en el conocimiento de los cambios moleculares asociados a la fisiología del

mismo aportaría datos relevantes sobre variedades con una calidad superior.

En base a todo ello, en esta Tesis Doctoral nos hemos planteado los siguientes

objetivos:

1. Caracterización del proteoma total de los frutos de pimiento verde y rojo, tipo

California, con el objeto de describir las proteínas que se expresan de manera

diferencial en cada uno de los estados de maduración.

2. Estudio de las modificaciones post-traduccionales de las proteínas mediante

nitroproteómica en extractos de fruto de pimiento verde y rojo, así como el estudio del

efecto del óxido nítrico (NO) sobre la maduración de los mismos.

3. Análisis de la función de los peroxisomas, orgánulos con un metabolismo oxidativo

muy relevante, y de su proteoma en frutos de pimiento durante la maduración.

45

T ÉT

Material y Métodos

46

1.-MATERIAL VEGETAL Y CONDICIONES DE CULTIVO

Se emplearon frutos de pimiento (Capsicum annuum L.) del tipo California, en dos

estados de maduración distintos, verdes y rojos, que fueron proporcionados por la

empresa Syngenta Seeds, S.A. (El Ejido, Almería). Los frutos, recogidos directamente

de las plantas cultivadas en los invernaderos experimentales de la empresa, no

presentaban malformaciones ni síntomas de ningún tipo de daño.

2.- PREPARACIÓN DE EXTRACTOS CRUDOS PARA ENSAYOS

BIOQUÍMICOS

Los frutos de pimiento tanto verdes como rojos fueron procesados de la siguiente

manera: se cortaron tiras longitudinales que a su vez fueron divididas en trozos de 1 cm2

de sección aproximadamente y se homogeneizaron con mortero y pistilo en presencia de

un tampón de homogeneización que contenía Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, EDTA 0,1 mM,

Triton X-100 0,1% (v/v), glicerol 10% (v/v) y DTT 5 mM (relación 1:2, p/v). Tras la

homogeneización los extractos se filtraron y se centrifugaron a 27.000 g, durante 15

min a 4ºC, y los sobrenadantes se usaron para la precipitación de proteínas solubles con

acetona al 70% (v/v, volumen final). Para ello se añadió a los sobrenadantes acetona

pura preservada a -20ºC, con agitación suave durante 30 min, y posteriormente se

centrifugó a 16.000 g durante 15 min. El precipitado, que contenía la mayor parte de las

proteínas fue resuspendido en 5 ml de tampón Tris-HCl, 50 mM e incubado durante 12-

14 h a 4ºC con agitación. La mezcla muestra-acetona se centrifugó a 39.000 g durante

20 min. Los sobrenadantes se clarificaron a través de columnas Sephadex G-25 (NAP-

10, Amersham), previamente equilibradas con el mismo tampón en el que se encontraba

la muestra (Begara-Morales et al., 2013).

3.- DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS

Se empleó el método de Bradford (Bradford, 1976) que permite determinar

espectrofotométricamente el contenido de proteínas mediante la medida del complejo

que éstas forman con el azul Coomassie. Se empleó el reactivo comercial de BioRad

“Protein Assay Dye Reagent” y albúmina de suero bovino (BSA), fracción V, como

proteína estándar para preparar la curva patrón de proteínas (0, 3, 6, 12 y 18 g de

BSA). Se añadieron 200 l de reactivo de BioRad a 800 l de un volumen compuesto

por la muestra o BSA, convenientemente diluidas y agua destilada, y se midió la

Material y Métodos

47

absorbancia a 595 nm, transcurridos 5 min tras la adición del reactivo (periodo de

estabilidad del complejo). Conocidos los valores de absorbancia, se elaboró una recta de

regresión lineal con los datos de la curva patrón de albúmina y se calculó la

concentración de proteínas interpolando los valores de absorbancia de las muestras.

4.- DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD CATALASA

Se siguió el método espectrofotométrico descrito por Aebi (Aebi, 1984), basado en la

medida de disminución de la absorbancia a 240 nm debida a la descomposición del

H2O2 por efecto de la catalasa. En una cubeta de cuarzo se añadieron la muestra,

convenientemente diluida, y la mezcla de reacción, protegida de la luz y formada por

tampón fosfato-K 50 mM, pH 7,0 y H2O2 10,6 mM hasta completar un volumen final

de 1 ml en la cubeta. La reacción se registró durante 2 min a 25ºC en un

espectrofotómetro Beckman Coulter DU 640. La actividad enzimática, expresada en

mol de H2O2 . min

-1 . mg

-1 de proteína, se calculó a partir de la velocidad inicial de la

reacción y de un coeficiente de extinción molar para el H2O2 de 39,58 M-1 .

cm -1

(del

Río et al., 1977).

5.- NITRACIÓN DE CATALASA

La molécula SIN-1 (3- morfolinosidnonimina), es un compuesto que nitra a las

proteínas, puesto que de manera espontánea libera NO y O2.-, lo que conlleva como

resultado la formación de peroxinitrito (ONOO-) (Daiber et al., 2004).

Los extractos de fruto fueron incubados con concentraciones crecientes de SIN-1

(Calbiochem) desde 0,5 a 5 mM, durante 1 hora a 37C, preparado justo antes de su

utilización. Las muestras fueron entonces filtradas a través de columnas NAP-10

(Amersham) para evitar interferencias entre la molécula SIN-1 y la actividad

enzimática. Una vez transcurrido el tiempo se determinó la actividad de la enzima

catalasa para cada una de las muestras. Además se añadió urato 2 mM, ya que se ha

demostrado que es una agente protector de la nitración y se observó el comportamiento

del mismo frente a SIN-1 en nuestras muestras (Alamillo and García-Olmedo, 2001).

Material y Métodos

48

6.- AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE PEROXISOMAS

Todas las operaciones se llevaron a cabo a 4ºC, con el objeto de preservar en todo

momento la integridad de los orgánulos. El método utilizado para el aislamiento de los

orgánulos fue el descrito anteriormente para frutos de pimiento (Mateos et al., 2003). El

método consiste en varias centrifugaciones diferenciales seguidas de una centrifugación

en gradiente de densidad de sacarosa. Los frutos se lavaron con agua desionizada y se

partieron manualmente en trozos de 5-10 cm2 de sección, e inmediatamente después se

incubaron durante 30 min a 4ºC con el tampón de homogeneización en una relación 1:4

(p/v). Transcurrido ese tiempo, los frutos se homogeneizaron en pulsos suaves en una

batidora de vaso separados por unos segundos. La composición del tampón de

homogeneización fue de Tricina-KOH 170 mM, pH 7,5, KCl 10 mM, MgCl2 1 mM,

EDTA 1 mM, sacarosa 1,5 M, BSA 0,3% (p/v) para pimiento verde y 0,4% (p/v) BSA

para pimiento rojo, y DTT 5 mM. El homogenado se filtró a través de dos capas de

entretela y se centrifugó a 4.600 g durante 20 min para eliminar la mayor parte de

plastidios, núcleos y residuos celulares. El sobrenadante se centrifugó de nuevo a

12.000 g durante 15 min y el precipitado obtenido se resuspendió con un pincel suave

en un medio similar al de extracción pero con un pH de 7,0, sacarosa 1 M y sin DTT. La

suspensión de orgánulos se depositó con ayuda de una jeringa, en la parte superior de un

gradiente discontinuo de sacarosa compuesto por 3 ml del 60%, 6 ml del 57%, 9 ml del

51%, 9 ml del 47%, 6ml del 42% y 3 ml del 35% de sacarosa (p/v). Las soluciones de

sacarosa se prepararon a partir de una solución madre de sacarosa del 66% (p/v)

preparada en Na2-EDTA, 1 mM, pH 7,5. Los gradientes de sacarosa se prepararon en

tubos Quick Seal (Beckman) y se centrifugaron a 80.000 g durante 1 h y 30 min en una

ultracentrífuga Beckman con un rotor vertical Vti50. Finalizada la centrifugación, los

peroxisomas se situaban en la parte inferior del gradiente en la interfase entre las capas

de 57% y 51% (p/v) de sacarosa (López-Huertas et al., 1995), en una densidad media

de 1,24 g.cm

-3. La banda correspondiente a la fracción de los peroxisomas se extrajo

mediante perforación de los tubos con una jeringa.

Las matrices peroxisomales (fracción soluble) se separaron de las membranas

mediante choque osmótico por dilución 1:4 con tampón fosfato-K pH 7,8 Na2-EDTA 1

mM con agitación suave a 4ºC durante 1 h y posterior centrifugación a 120.000 g

durante 30 min en un rotor Beckman 70Ti.

Material y Métodos

49

El sobrenadante que contiene las proteínas solubles del orgánulo se concentró

por ultrafiltración usando una membrana PM-10 (Amicon), según se indica en la

siguiente figura:

En las matrices concentradas se analizaron los parámetros bioquímicos inmediatamente

o bien se congelaron a -20ºC hasta su uso.

7.- ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA (EGPA) Y

TINCIÓN DE GELES

7.1.- EGPA en condiciones desnaturalizantes. EGPA-SDS

El método seguido fue el descrito por Laemmli (Laemmli, 1970) utilizando un equipo

Mini Protean III de Bio-Rad. El método se basa en someter el extracto que contiene las

proteínas a electroforesis sobre geles discontinuos de poliacrilamida constituidos por

dos zonas distintas: el gel concentrador y el gel separador. El gel se dispone como una

lámina delgada situada verticalmente que al aplicarse un campo eléctrico permite al

complejo SDS-proteína migrar hacia el ánodo debido a su carga negativa. Los geles de

poliacrilamida son soportes químicamente inertes formados mediante la polimerización

de acrilamida y N,N´metilén-bis-acrilamida, con la participación de persulfato amónico

y TEMED. La polimerización se inicia al adicionar el TEMED que cataliza la

formación de radicales libres a partir del persulfato amónico.

Barra magnética

ULTRAFILTRACIÓN (Cámara fría)

Inyección de N2

Solución Membrana de ultrafiltración

Vaso para deshecho

Tapón para agregar solución y mecanismo para purgar

(Presión 60Psi)

Material y Métodos

50

Se prepararon geles de poliacrilamida a distintas concentraciones (10-15% p/v), con

un gel concentrador de poliacrilamina al 4% (p/v). Las muestras para electroforesis se

prepararon en un tampón de Tris-HCl 125 mM pH 6,8, SDS 4% (p/v), glicerol 20%

(v/v), azul de bromofenol 0,006% (p/v) y DTT 10 mM, y se calentaron a 95 durante 10

min para desnaturalizar las muestras. Después se cargaron en los geles, a los cuales se

les aplicó un voltaje de 200 V durante unos 45-60 min. El tampón de electrodos usado

para el cátodo fue Tris-HCl 25 mM pH 8,3, glicina 192 mM y SDS 0,1% (p/v), y el

tampón del ánodo de igual composición pero sin SDS.

7.2.- Tinción de geles con azul-Coomassie

Los geles se tiñeron con “Coomassie Brillant Blue” R-250 al 0,1% (p/v), preparado en

metanol al 50% (v/v) y ácido acético al 10% (v/v) durante 30 min. Después se

destiñeron con metanol al 40% (v/v) y ácido acético al 10% (v/v), hasta que quedaron

bandas azules sobre un fondo transparente.

7.3.- Tinción de geles con plata

Se utilizó la técnica descrita por Heukeshoven y Dernick (Heukeshoven and Dernick,

1985). Después de la electroforesis los geles se incubaron con etanol al 30% (v/v) y

ácido acético al 10% (v/v) durante 1-3 h para fijar las proteínas. A continuación los

geles se lavaron con agua desionizada 3 veces durante 5 min cada vez, y se incubaron

con una solución reductora de ferricianuro potásico 1% (p/v) y tiosulfato de sodio al

1.6% (p/v) durante 15 min. Posteriormente, los geles se lavaron abundantemente hasta

que desapareciese el color amarillento de los mismos y se incubaron en una solución de

nitrato de plata 0,1% (p/v) en oscuridad, durante 30 min. El revelado se efectuó en una

solución de carbonato sódico 0,3 M y formaldehido 0,02% (v/v), hasta que aparecieron

las bandas de proteínas. La reacción se detuvo añadiendo ácido acético al 3% (v/v).

8.- TRANSFERENCIA E INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS (Técnica de

Western)

8.1.- Transferencia de proteínas

Las proteínas separadas por EGPA-SDS se transfirieron a una membrana de difluoruro

de polivinilo (PVDF), utilizando el sistema de transferencia Trans-Blot Turbo de

BioRad. El tampón utilizado en la transferencia fue CAPS 10 mM, pH 11,0 con metanol

al 10% (v/v). Debido a la naturaleza hidrofóbica de las membranas, primero se

Material y Métodos

51

activaron durante 15 s con metanol puro y a continuación se lavaron 2 min con agua

milliQ para posteriormente equilibrarse con el tampón de transferencia. Se prepararon

papeles “extra thick blot paper” (BioRad) de las mismas medidas del gel, y estos

papeles y los geles se equilibraron igualmente en el mismo tampón. La transferencia se

llevó a cabo utilizando una intensidad de 2,5 mA/cm2 de gel, 25 V, durante 7 min.

8.2.- Inmunodetección de proteínas por quimioluminiscencia Una vez concluida la transferencia de proteínas, las membranas se lavaron con agua

destilada. Para bloquear los sitios inespecíficos de unión de las inmunoglubulinas, las

membranas se incubaron con leche en polvo desnatada al 1,5% (p/v), preparada en

tampón TBS (Tris-HCl 20 mM, pH 7,8, NaCl 0,18 M) durante 1,5-2 h a temperatura

ambiente. Después de lavar las membranas, se incubaron con el anticuerpo primario

correspondiente, en una dilución óptima, durante toda la noche a 4C, o bien durante 2 h

a temperatura ambiente. Posteriormente, las membranas se lavaron con TBS durante 40

min, cambiando el tampón cada 10 min, tras lo cual se incubaron durante 1 h a

temperatura ambiente con el anticuerpo secundario, anti-IgG unida a peroxidasa de

rábano. Las membranas se lavaron finalmente con TBS y se procedió a la detección de

las proteínas por quimioluminiscencia.

Como sustrato quimiloluminiscente para la detección, se añade sobre la

membrana una mezcla de los reactivos A y B (ECL plus Amersham Biosciences)

basado en la generación enzimática de un éster de acridina que produce una luz más

intensa y durante un periodo de tiempo más largo, en proporción 1:40 y se incuba en

oscuridad a temperatura ambiente durante 5 min sin agitación, siguiendo las

instrucciones del fabricante.

Las membranas se expusieron a una película autorradiográfica “Hyperfilm”, de

Amersham Biosciences, en un accesorio para autorradiografía (Kodak). El tiempo de

exposición variaba desde unos segundos hasta 20 min, según la intensidad luminosa

obtenida en cada caso.

9.- ANÁLISIS PROTEÓMICO

9.1.- Limpieza de muestras y solubilización

Las muestras fueron limpiadas mediante el método de metanol-cloroformo (Wessel and

Flugge, 1984) y posteriormente solubilizadas en un tampón conteniendo urea 7 M,

Material y Métodos

52

tiourea 2 M y CHAPS 4% (p/v). A continuación se cuantificaron por el método de

Bradford (BioRad) indicado anteriormente.

9.2.- Electroforesis bidimensional (2-D) y tinción de geles

Para la electroforesis bidimensional a cada muestra cuantificada se le realizó la primera

dimensión y se utilizaron tiras (strips) IPG (geles de isoelectroenfoque de gradiente

inmovilizado) de 17 cm, pH 3-10, de gradiente no lineal (BioRad). Se aplicó 60 µg de

proteína por cada muestra para geles preparativos. La electroforesis tuvo lugar con un

incremento lineal de voltaje como sigue:

- rehidratación pasiva (sin voltaje), 2 h

- rehidratación activa 50 V, 10 h, rápido

- 1000 V, 1 h, rápido

- 4000 V, 2 h, lineal

- 8000 V, 30 min, lineal

- 8000V, hasta alcanzar 50000 V, rápido

Transcurrida la primera dimensión, las tiras fueron equilibradas por agitación,

primero durante 15 min en una solución Tris-HCl 375 mM, pH 8,8, urea 6 M, SDS 2%

(p/v), glicerol 20% (v/v)) y DTT 2% (p/v), y segundo, durante otros 15 min en la

misma solución conteniendo iodoacetamida 2.5% (p/v) en lugar de DTT.

Los geles de IPG fueron transferidos a un sistema vertical de geles al 12% de

poliacrilamidaProtean II xi Cell System de BioRad, y la electroforesis se llevó a cabo a

30 mA durante 15 min y 60 mA hasta que el frente alcanzaba el final del gel.

Una vez terminada la electroforesis en SDS-PAGE se tiñeron los geles con

Imidazol (Hardy et al., 1996). Primero se incubó en H2O destilada durante 30-60 s.

Segundo se incubó en Imidazol 0,2 M conteniendo 0,1 % SDS (p/v) durante 10 min.

Posteriormente se pasaron a 0,2 M de sulfato de zinc 30-40 s hasta que el gel adquirió

coloración blanca, dejándose ver las proteínas transparentes. La tinción se detuvo con

H2O destilada y se analizó mediante un escáner GS-800 Calibrated Densitometer

(BioRad).

9.3.- Transferencia a membranas de nitrocelulosa

Antes de realizar la transferencia se lavaron los geles con EDTA 100 mM durante 10

minutos. El tampón de transferencia (Buffer Towbin) estaba compuesto por Tris-HCl 25

mM, pH 8,3, glicina 192 mM, metanol 20 % (v/v) y SDS 0.02 % (p/v). Las membranas

Material y Métodos

53

se equilibraron durante 15 min en el “Buffer Towbin” antes de ser transferidas. El

sistema utilizado fue Trans-Blot Plus Electrophoretic Transfer Cell (BioRad). Las

condiciones de recorrido fueron: 30 V a 1 ºC durante 20 h.

9.4.- Adquisición de imágenes En las imágenes de la electroforesis 2-D deben marcarse aquellas proteínas que han de

ser analizadas mediante espectrometría de masas. Para ello, en nuestras condiciones de

trabajo, se realizaron nuevos geles 2-D con idénticas condiciones a las anteriores

(electroforesis bidimensional). Esta vez los geles fueron teñidos con el compuesto

fluorescente Sypro Ruby (BioRad) según instrucciones del manual. Las proteínas se

fijaron con una solución al 7% (v/v) de ácido acético y 10% (v/v) de metanol durante

30 min; posteriormente se incubaron en Sypro Ruby©

durante toda la noche y, por

último, se lavaron con la solución anterior de ácido acético y metanol durante 30 min

para eliminar la fluorescencia del fondo. Las imágenes fueron adquiridas a 535 nm con

el equipo Molecular Imagen FX ProPlus (BioRad), con una resolución de 100 µm.

9.5.- Selección y digestión de proteínas

Las proteínas de interés fueron recuperadas de los geles mediante la estación automática

ProPic Investigator™ (Genomic Solution), y digeridas según el protocolo de

Schevchenko (1996) con pequeñas modificaciones, mediante el digestor automático

ProGest Investigator™ (Genomic Solutions). Las proteínas recuperadas fueron lavadas

con bicarbonato amónico 25 mM y acetonitrilo (100%) antes de la reducción con DTT

10 mM en bicarbonato amónico 25 mM y posterior alquilación con iodoacetamida 100

mM, preparada en bicarbonato amónico 50 mM. Los restos de gel fueron así eliminados

con 50 mM de bicarbonato amónico y acetonitrilo, y secados bajo nitrógeno gaseoso. Se

añadió tripsina porcina (Promega, Madison WI) a una concentración final de 12,5 ng/l,

preparada en bicarbonato amónico 25 mM, y la digestión se llevó a cabo a 37 ºC

durante 12 h. Los péptidos resultantes fueron eluídos con bicarbonato amónico 25 mM

y ácido trifluoroacético 0.1% (v/v) para un volumen de extracción final de 50 l. Una

alícuota de 1 l de mezcla de la solución de extracción final junto con la solución de

matriz (ácido 2,5-dihidroxibenzoico en 33% (v/v) de acetonitrilo y 0,1% (p/v) de ácido

trifluoroacético (TFA) fue depositada en la placa MALDI seguido del secado a

temperatura ambiente.

Material y Métodos

54

9.6.- Identificación de proteínas por huella petídica Los péptidos resultantes de la digestión con tripsina se purificaron de manera

automática en una estación ProMS (Genomic Solutions), mediante una microcolumna

de resina C18 (ZipTip, Millipore), eluyéndose directamente con una solución de matriz

(3 mg/ml de ácido α-ciano-4-hidoxicinámico en 70% acetonitrilo/0,1% TFA) sobre la

placa MALDI en un volumen de 1 ml. Tras la co-cristalización sobre la placa, las

muestras se analizaron en el rango de masa/carga (m/z) de 800 a 4000 Da mediante

espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF para obtener la huella peptídica (MS) en un

espectrómetro 4700 Proteomics Analyzer (Applied Biosystems) en modo automático.

Se realizó calibración interna de los espectros utilizando las relaciones m/z de los

péptidos resultantes de la autolisis de la tripsina porcina (M+H+

= 842,509, M+H+

=

2211,104), obteniéndose de esta manera una precisión en la medida de las m/z de ± 20

ppm. De cada muestra se obtuvieron espectros de fragmentación (MS/MS) de las tres

m/z más intensas.

La identificación de proteínas se realizó combinando los espectros MS y sus

correspondientes MS/MS usando MASCOT (MatrixScience, UK) como motor de

búsqueda sobre la base de datos MSDB, limitando la categoría taxonómica a

Viridiplantae, con carbamidometilación completa de los residuos de cisteína y

oxidación parcial de los residuos de metionina. El error máximo permitido en la

búsqueda fue de 100 ppm y el número máximo de errores en el corte de la proteasa fue

uno.

10.- ESTUDIOS BIOINFORMÁTICOS

El análisis bioinformático para proteínas peroxisomales de pimiento se realizó de la

siguiente manera: a partir de una lista de proteínas de Arabidopsis con PTS1 conocido

se identificaron los ortólogos de Capsicum para lo cual se hizo uso del programa

“tblastn” en el que se compara una secuencia proteica con una base de datos de

nucléotidos, en nuestro caso EST. Antes de continuar las secuencias EST de Capsicum

fueron traducidas de nucleótidos a aminoácidos mediante “ExPASy”

(http://web.expasy.org/translate/) y de esta manera se realizó un alineamiento múltiple

con “MulTalin” (http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html) con el que se

comprobó si en esas secuencias existía un tripéptido en el extremo C-terminal, y si

Material y Métodos

55

además coincidía con aquel de Arabidopsis, lo que, por tanto, significaba que podría

tratarse de un PTS1.

Asimismo, mediante el uso de “TAIR” (http://www.arabidopsis.org/), “SUBA

II” (http://suba2.plantenergy.uwa.edu.au/flatfile.php?id=AT1G77750.1) y

“Genevestigator” (https://www.genevestigator.com/gv/) se estudiaron las funciones en

las que la proteína en cuestión podría estar implicada, su posible localización

subcelular, así como la expresión de esos genes o si se trataba de proteínas inducibles

bajo un determinado tipo de estrés.

56

ÍT 1: T

F T T .

57

T

Capítulo 1

58

OBJETIVO: Caracterización del proteoma total de los frutos de pimiento verde y rojo

con el objeto de describir las proteínas que se expresan de manera diferencial en cada

uno de los estadios.

La maduración de los frutos es un proceso altamente coordinado que, a su vez,

coincide con la maduración de las semillas. Este proceso está regulado por un elevado

número de genes que controlan el ablandamiento progresivo de la pared celular, la

acumulación de azúcares, ácidos y pigmentos así como la liberación de compuestos

volátiles. Es clave para la mejora de los cultivos un profundo conocimiento de los

procesos que subyacen al fenómeno de la maduración (Osorio et al., 2013).

Sin embargo y debido a la gran cantidad de cambios metabólicos que se

producen durante la maduración de los frutos, son necesarias una gran cantidad de

metodologías para poder evaluar la evolución natural de este proceso. La importancia de

la maduración proviene de la repercusión económica que ésta tiene, como resultado del

procesamiento de los frutos una vez que se han recolectado. Tradicionalmente el estudio

del proceso de maduración se ha abordado desde un punto de vista genético (Seymour

et al., 2008). Hasta hace pocos años existía poca información disponible sobre las

proteínas involucradas en el desarrollo de los frutos pero debido a la gran cantidad de

datos que pueden proporcionan las nuevas tecnologías de análisis, los estudios

proteómicos se han incrementado notablemente, sobre todo en especies vegetales de

gran importancia agronómica (Jansen et al., 2002; Sarry et al., 2004; Rocco et al.,

2006; Palma et al., 2011a).

La mayoría de las especies comparten perfiles de maduración comunes en el que

las proteínas están relacionadas con el metabolismo oxidativo, el metabolismo de los

azúcares, proteínas relacionadas con estrés y otras cuya expresión se ve modificada por

el proceso de maduración. La siguiente tabla muestra distintas categorías funcionales

entre las que se incluyen las proteínas que se han determinado para algunos de los

principales cultivos frutales como tomate, uva, naranja, manzana, melocotón, pera, o

albaricoque (Palma et al., 2011b).

Capítulo 1

59

Tabla 1.1: Categorías funcionales de las proteínas que se expresan de manera diferencial en los frutos

bajo diferentes condiciones de desarrollo y de maduración (Palma et al., 2011).

Categoria Funcional Proceso Especie Referencias Metabolismo de lípidos, de aminoácidos, carbono y carbohidratos

Maduración Tomate (Rocco et al., 2006; Faurobert et al., 2007)

Uva (Deytieux et al., 2007; Negri et al., 2008)

Naranja (Katz et al., 2007; Muccilli et al., 2009; Pan et al., 2009)

Senescencia Manzana (Qin et al., 2009a) Frío Tomate (Vega-García et al., 2010)

Respuesta a estrés/ Estrés oxidativo

Maduración Tomate (Rocco et al., 2006; Faurobert et al., 2007; Kok et al., 2008)

Uva (Deytieux et al., 2007; Negri et al., 2008; Giribaldi et al., 2010)

Naranja (Katz et al., 2007; Muccilli et al., 2009; Pan et al., 2009)

Albaricoque (Grimplet et al., 2005) Senescencia Manzana (Qin et al., 2009a; Qin et al., 2009b) Frío Tomate (Stevens, 1972; Vega-García et al., 2010)

Melocotón (Nilo et al., 2010) Transporte/ Transportadores de membrana

Maduración Tomate (Faurobert et al., 2007) Uva (Zhang et al., 2008)

Senescencia Manzana (Qin et al., 2009a) Frío Melocotón (Nilo et al., 2010)

Energía Maduración Tomate (Rocco et al., 2006) Uva (Zhang et al., 2008) Naranja (Katz et al., 2007; Pan et al., 2009; Katz et al., 2010)

Frío Melocotón (Nilo et al., 2010; Zhang et al., 2010) Metabolismo Maduración Uva (Zhang et al., 2008)

Naranja (Katz et al., 2007) Senescencia Manzana (Qin et al., 2009a) Almacenamiento Pera (Bantscheff et al., 2007; Schulze and Usadel, 2010) Frío Melocotón (Nilo et al., 2010)

Síntesis/ Destrucción de proteínas

Maduración Tomate (Faurobert et al., 2007; Kok et al., 2008) Uva (Zhang et al., 2008)

Almacenamiento Pera (Bantscheff et al., 2007; Schulze and Usadel, 2010) Frío Melocotón (Nilo et al., 2010; Zhang et al., 2010)

Fotosíntesis Maduración Tomate (Faurobert et al., 2007; Kok et al., 2008; Barsan et al., 2010)

Uva (Deytieux et al., 2007) Frío Tomate (Vega-García et al., 2010)

Metabolismo secundario Maduración Tomate (Faurobert et al., 2007) Uva (Giribaldi et al., 2010) Naranja (Muccilli et al., 2009)

Frío Melocotón (Nilo et al., 2010; Zhang et al., 2010) Estructura celular/Crecimiento

Frío Melocotón (Nilo et al., 2010; Zhang et al., 2010)

Transcripción Maduración Uva (Zhang et al., 2008) Frío Melocotón (Zhang et al., 2010)

Defensa Maduración Tomate (Rocco et al., 2006; Faurobert et al., 2007) Uva (Deytieux et al., 2007)

Almacenamiento Pera (Bantscheff et al., 2007; Schulze and Usadel, 2010) Frío Tomate (Stevens, 1972)

Melocotón (Zhang et al., 2010) Transducción de señales/Señalización celular

Maduración Tomate (Rocco et al., 2006) Uva (Giribaldi et al., 2010)

Frío Melocotón (Nilo et al., 2010) Metabolismo de lípidos Maduración Tomate (Faurobert et al., 2007; Barsan et al., 2010) Movimiento/Biosíntesis de orgánulos

Maduración Tomate (Faurobert et al., 2007; Barsan et al., 2010) Naranja (Katz et al., 2007)

Estado redox Maduración Tomate (Rocco et al., 2006) Destoxificación Maduración Tomate (Faurobert et al., 2007) Biosíntesis de vitaminas Maduración Tomate (Faurobert et al., 2007) Procesamiento de DNA Maduración Tomate (Faurobert et al., 2007)

Capítulo 1

60

Proteómica y fruto de pimiento

El fruto de pimiento (Capsicum annuum L.) es el segundo vegetal más consumido a

nivel mundial y destaca por su elevado contenido en vitamina C (ácido ascórbico), pro-

vitamina A (caroteno) y calcio. De hecho, la ingesta de 50-100 gr de fruto en fresco

aportarían el 100% y el 60% de las cantidades diarias recomendadas de vitamina C y A,

respectivamente (Howard et al., 2000; Palma et al., 2011c; Mateos et al., 2013).

Los trabajos clásicos de construcción de proteomas descriptivos de orígenes

complejos tal como el proteoma del tallo del arroz (Komatsu et al., 1999) han ido

derivando hacia proteomas ligados a la función, analizando subproteomas de orgánulos

subcelulares propios de plantas, como el cloroplasto, así como en estudios comparativos

de proteomas de una misma especie bajo distintas condiciones fisiológicas o

medioambientales.

En el caso del pimiento, los métodos usados para la descripción del proteoma

total comienzan por la extracción de proteínas a partir de frutos completos en los dos

estadios de maduración, inmaduro y maduro, o lo que es lo mismo en nuestro caso,

verde y rojo, respectivamente. Una vez extraídas las proteínas éstas serán sometidas a

estudios proteómicos. Los resultados finales serán analizados con la ayuda de bases de

datos con motores de búsqueda apropiados, lo que permitirá identificar el mayor

número de proteínas posibles (Palma et al., 2011b). En la Figura 1.1 Se muestra un

modelo de análisis al proteoma de los frutos de pimiento.

Figura 1.1: Estrategia para el análisis proteómico de la maduración de los frutos de pimiento.

Capítulo 1

61

No son muchos los trabajos realizados hasta el día de hoy sobre proteómica de

frutos de pimiento. Ello se debe, en primer lugar, a que el genoma de esta planta no ha

sido secuenciado hasta hace pocos meses (Kim et al., 2013), lo cual dificultaba el

trabajo a lo hora de describir nuevas proteínas.

De hecho aunque se conocían trabajos pioneros en proteómica de solanáceas

(tomate y pimiento) anteriores (Rose et al., 2004), no fue hasta 2006 en que se

publicaron los primeros datos sobre un estudio comparativo de proteínas que se

expresaban de manera diferencial en los tejidos de pimientos en estados de maduración

diferente (Lee et al., 2006b).

El sabor picante de los frutos de pimiento es una característica peculiar de esos

frutos que se debe a la presencia en sus tejidos de la capsaicina y a sus derivados que

son un tipo de alcaloides fenólicos que aparecen de manera exclusiva en los miembros

de este género. Dichos alcaloides, se acumulan en la placenta de los frutos de pimiento

maduros. El contenido en capsaicinoides varía entre las distintas variedades de pimiento

y destacan por ser agentes antimicrobianos, antioxidantes y antiinflamatorios, , así como

porque ejercen un papel protector frente a determinados procesos patológicos como

cáncer, aterosclerosis y obesidad (Surh, 2002; Basu and De, 2003; Lee et al., 2006b).

Este estudio analizaba tejidos de placenta de pimientos dulces y de pimientos picantes y

se obtuvieron un total de 2600 proteínas, de los cuales 37 eran exclusivas de las

especies picantes, y de todos ellos sólo 22 proteínas fueron identificadas (Lee et al.,

2006b).

En otro estudio se comparó el daño que ocasionaba el frío en los frutos de

pimiento a nivel proteómico y se compararon por tanto, frutos sometidos a temperaturas

distintas (10ºC y 1ºC). Para mantener la calidad de los frutos y retrasar la pudrición de

los mismos, justo después de su recolección, los pimientos son refrigerados a una

temperatura de alrededor de 7,5ºC y no inferior, ya que son muy sensibles a las bajas

temperaturas. Entre las consecuencias de las bajas temperaturas en los frutos de

pimiento, destacan manchas y decoloración de tejidos, oscurecimiento de semillas,

pérdida de humedad y ablandamiento del pericarpo, entre otros. A nivel ultraestructural,

se altera la composición de las membranas y se dan cambios en cloroplastos y

peroxisomas. Y a nivel fisiológico, aumenta la producción de etileno, se producen

cambios en el contenido de azúcares y ácidos y se observa un aumento en la producción

Capítulo 1

62

de ROS. El análisis proteómico comparativo entre frutos control y sometidos a frío

mostró que las principales alteraciones provocadas por el frío afectaban a proteínas

relacionadas con la homeostasis redox celular y con el metabolismo de los

carbohidratos (Sánchez-Bel et al., 2012).

A medida que los frutos van madurando, los cloroplastos sufren una

transformación absoluta de sus estructuras hasta el punto en que se convierten en

cromoplastos. Los cromoplastos son los plastidios de acumulación masiva de

carotenoides en los frutos, a diferencia de los cloroplastos que acumulan principalmente

clorofilas. En un análisis de proteómica comparativa de cromoplastos entre 6 tipos de

cultivos diferentes (pimiento, sandía, coliflor, zanahoria, papaya y tomate) se

describieron un total de entre 953 y 2262 proteínas para los 6 cultivos, de las cuales casi

el 60% se localizaban en los plastidios. De todas ellas, tan solo 17 eran enzimas

metabólicas de carotenoides (Wang et al., 2013b).

La proteómica ha contribuido a revelar los cambios que ocurren en el

metabolismo de los frutos a medida que estos maduran, sin embargo y debido a las

características peculiares de cada una de las especies se necesitan más datos sobre el

trascurso de este proceso natural, de manera que se puedan controlar algunos de los

aspectos de la fisiología de los mismos y finalmente ofrecérselos a los consumidores en

el mejor momento de su ciclo de vida. Una vez que se han descrito las principales

categorías funcionales de las proteínas que se expresan en cada uno de los estadios

madurativos, es posible avanzar en el estudio de las más importantes proteínas

específicas, así como en los genes que las codifican y, de esta manera, describir su papel

característico en la fisiología de los frutos (Palma et al., 2011b).

Capítulo 1

63

T

Capítulo 1

64

1.1 Patrón polipeptídico de frutos de pimiento

Mediante electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes

(EGPA-SDS) y posterior tinción de los mismos con azul-Coomassie se estudió el

patrón polipeptídico de extractos crudos de fruto de pimiento verde y rojo. La

maduración de los frutos modifica claramente el patrón polipeptídico con la aparición

de nuevas bandas en los pimientos rojos. Concretamente, se detectan tres bandas

polipeptídicas exclusivas de frutos rojos de un tamaño aproximado de 97, 50 y 32

kDa, mientras que en frutos verdes una banda de un tamaño aproximado de 34 kDa es

más abundante que en frutos rojos (Figura 1.2).

Figura 1.2: Patrón polipeptídico de extractos crudos de

pimiento verde y rojo. Tras ser desnaturalizados a 95ºC

durante 5 min. los extractos (20 g) fueron sometidos a

electroforesis en geles discontinuos de poliacrilamida (10%).

Los valores que se muestran a la izquierda corresponden a los

patrones de peso molecular (SDS-PAGE standards Bio-Rad

low range), mientras que a la derecha de indican las bandas

diferenciales entre ambos tipos de fruto.

1.2 Análisis del proteoma de frutos de pimiento mediante electroforesis

bidimensional (2-D)

Mediante electroforesis bidimensional (2-D), se ha estudiado el patrón de las proteínas

de fruto de pimiento verde y rojo (Figuras 2-6). Previo al análisis proteómico y con la

finalidad de partir de la cantidad óptima de proteínas para la electroforesis 2-D, las

muestras se concentraron con acetona al 70% (v/v, volumen final). Los geles fueron

teñidos con el compuesto fluorescente Sypro-Ruby (Figura 1.3) y el análisis de los spots

Capítulo 1

65

se realizó mediante el programa bioinformático PDQuest. Debido a la envergadura del

trabajo los geles fueron sometidos a dos picados consecutivos, con el fin de no superar

el número máximo de spots a analizar aconsejado por el programa. Es por ésto que en el

caso del fruto de pimiento verde el análisis de los geles se dividió en dos partes: una de

102 spots, correspondiente a la zona superior del gel y otra de 103, correspondiente a la

inferior (Figura 1.4). En el caso del pimiento rojo, en la zona superior del gel se picaron

88 spots, mientras que en la inferior fueron 84 los puntos analizados (Figura 1.6). A

continuación cada uno de los spots fue extraído de los geles para ser sometidos a una

digestión con tripsina e identificación por MALDI-TOF/TOF.

Figura 1.3: Análisis comparativo por electroforesis bi-dimensional (2-D) entre frutos de pimiento

verde (A) y rojo (B) (Capsicum annuum L.). Se cargaron 60 μg de proteína por cada tipo de fruto.

Posteriormente los geles se tiñeron con el agente fluorescente Sypro Ruby ( Bio-Rad). A la izquierda

de cada gel se indican los marcadores de peso molecular y en la parte superior el pH correspondiente

a la primera dimensión. IEE: isoelectroenfoque.

En las Figuras 1.5 y 1.7 aparecen indicados los polipéptidos que se identificaron en los

frutos verdes y rojos, respectivamente, una vez aplicado el análisis por MALDI-

TOF/TOF y que se enfrentaran los resultados a las bases de datos. En dichos geles se

destacan en negro los polipéptidos que se detectaron exclusivamente en los frutos

verdes (Figura 1.5) y en los frutos rojos (Figura 1.7). En azul se muestran los

Capítulo 1

66

polipéptidos que eran coincidentes en frutos verdes y rojos cuando se analizó de manera

independiente el proteoma de frutos verdes (Figura 1.5) o el proteoma de frutos rojos

(Figura 1.7). Se podrá comprobar que los polipéptidos coincidentes en ambos tipos de

frutos tienen numeración diferente en las Figuras 1.5 y 1.7, al haberse asignado dicha

numeración de manera automática por el programa, dependiendo de si el proteoma

mostrado corresponde al pimiento verde o al rojo. No obstante, la identificación final en

ambos casos corresponde a la misma proteína. Así por ejemplo, el spot 3 del proteoma

del fruto verde corresponde en movilidad con el spot 6 del proteoma de fruto rojo, y en

ambos frutos se corresponde la transcetolasa (ver más adelante). Esta misma regla se

empleó para el resto de polipéptidos compartidos por los dos tipos de frutos.

Figura 1.4: Imagen correspondiente al gel 2-D de proteoma de fruto de pimiento verde con todos los

spots que se han picado. En la parte superior del gel se analizaron 102 polipéptidos y 103 en la parte

inferior.

Capítulo 1

67

Figura 1.5: Spots identificados en el proteoma de fruto de pimiento verde. En negro se muestran los

polipéptidos específicos de fruto de pimiento verde y en azul aquellos que coinciden con los del fruto

rojo.

Figura 1.6: Imagen correspondiente al gel 2-D de proteoma de fruto de pimiento rojo con todos los spots

que se han picado. En la parte superior del gel se analizaron 88 polipéptidos y 84 en la parte inferior.

Capítulo 1

68

Figura 1.7: Spots identificados en proteoma de fruto de pimiento rojo. En negro los específicos de fruto

de pimiento rojo y en azul aquellos que coinciden con los del verde.

1.3 Identificación de proteínas y análisis mediante MALDI-TOF/TOF

Las proteínas identificadas fueron analizadas por espectrometría de masas (MALDI-

TOF) tras su digestión con tripsina. MASCOT fue el motor de búsqueda elegido para

identificar las proteínas desde secuencias primarias lanzadas en bases de datos. Un valor

mayor de 99% en el intervalo de confianza de la puntuación asignada por MASCOT

(protein score C.I %) indica una elevada probabilidad de que la proteína haya sido

identificada correctamente. En la Tabla 1.2 aparecen las proteínas que han presentado

un protein score 99% presentes de forma exclusiva bien en frutos verdes o en rojos y

que ya habían sido descritas con anterioridad en Capsicum annuum u otras especies.

Capítulo 1

69

Tabla 1.2: Proteínas descritas e identificadas de forma exclusiva en frutos de pimiento (Capsicum

annuum L.) verdes o rojos y su número de identificación en la base de datos Uniprot (número de acceso).

Se indica también el spot con el que se corresponde en los respectivos geles (Figura 4 para pimientos

verdes y 6 para rojos), los tamaños moleculares (MW) y puntos isoeléctricos (PI), así como las especies

donde se han descrito anteriormente.

Proteína

identificada

Tipo

de

fruto

Spot

(Figs.

4 y 6)

Nº acceso MW/PI Especie

Subtilisina Verde 4 E9LUF1 86563.7/6.41 Phaseolus

vulgaris

Proteína de choque

térmico (Heat

Shock Protein,

HSP)

Verde 15 Q08276 73317.1/ 6.37 Solanum

tuberosum

59 Q67BD0 71341.2/ 5.14 Nicotiana

tabacum

80 B9RBP6 65385.7/ 5.6 Ricinus communis

Dihidroxiácido

deshidratasa

Verde 23 Q9LIR4 65555.9/5.85 Arabidopsis

thaliana

Calreticulina Verde 27 G7I9H2 48595.4 /4.41 Medicago

truncatula

Inositol-3-fosfato

sintasa

Verde 28 Q9SSV4 56520.9/ 5.44 Nicotiana

paniculata

Leucina

aminopeptidasa 2

Verde 32 Q42876 60081.9/ 8.18 Solanum

lycopersicum

Adenosil-

homocisteinasa

Verde 33 P35007 53769.2 /5.6 Catharanthus

roseus

Xylosa isomerasa Verde 43 K4CBD6 44750.3/ 5.53 Solanum

lycopersicum

Anexina Verde 45 B9N394 35865.3 /8.75 Populus

trichocarpa

S-

adenosilmetionina

sintasa 1

Verde 47 Q9M7K8 43144.6 /5.66 Nicotiana

tabacum

49 B5LAW6 43055.6 /5.66 Capsicum

annuum

Delta ácido

aminolevulínico

deshidratasa

Verde 50 K4CMC3 47261.9 /6.36 Solanum

lycopersicum

Anquirina Verde 61 D2Y4N3 37572.5 /4.47 Nicotiana

tabacum

Succinil-CoA

ligasa, subunidad

beta

Verde 66 Q2PYW7 45624.8 /5.69 Solanum

tuberosum

Piruvato

deshidrogenasa E1,

subunidad alfa

Verde 71 B5LAW2 48025 /6.29 Capsicum

annuum

Alfa-galactosidasa Verde 88 Q5DUH7 41545.2 /5.65 Coffea canephora

Capítulo 1

70

Succinil-CoA

sintetasa

Verde 97 K4FZR6 34581.9/ 8.99 Capsicum

annuum

Enoil-acil reductasa Verde 14 B5LAU4 41955.7/ 8.85 Capsicum

annuum

Coatómero,

subunidad gamma

Verde 24 K4B3G7 98962/ 5.05 Solanum

lycopersicum

Harpina Verde 54 E0X584 98962/ 5.05 Solanum

lycopersicum

Proteína de

biosíntesis de

arginina ArgJ

Verde 71 K4CR69 49638.2 /5.79 Solanum

lycopersicum

Glutatión-S-

transferasa

Verde 77 Q5DUH0 23840.3/ 6.38 Capsicum

chinense

Taumatina Verde 85 Q5DJS5 25562.7/ 5.39 Nicotiana

tabacum

Proteína 4b

relacionada con

patogénesis

Verde 90 Q75QH1 22507.6/ 7.91 Capsicum

chinense

Proteína de

respuesta al etileno

Verde 101 Q4LAW5 19850.8/ 5.53 Capsicum

chinense

Proteína del lumen

tilacoidal

Verde 103 B9SL97 26292.3/ 6.53 Ricinus communis

RNA polimerasa,

subunidad beta

Rojo 5 J7K6T9 234051.1/10.09 Trebouxiophyceae

sp.

Alfa manosidasa

lisosomal

Rojo 11 G7J3A3 115123.2/6.48 Medicago

truncatula

Proteína asociada a

la BON1

Rojo 19 Q941L2 22149.2/9.42 Arabidopsis

thaliana

Cetol-ácido

reductoisomerasa

Rojo 25 B5LAT1 63652.3/6.49 Capsicum

annuum

Leucina

aminopeptidasa

Rojo 28 B3TL99 32084.7/5.4 Solanum nigrum

Adenosil-

homocisteinasa

Rojo 32 B9S9Y6 53905.2/5.81 Ricinus communis

Glutatión reductasa Rojo 39 B8PWQ9 60499.9/7.62 Solanum

lycopersicum

Retrotransposón

subclase Ty3 gypsy

Rojo 35 Q2QMY4 198390.2/8.81 Oryza sativa

subsp. japonica

Progesterona 5 beta

reductasa

Rojo 50 D9ILU8 44125/5.53 Nierembergia

aristata

Factor de

transcripción

homebox

Rojo 51 D6PAP4 15383.2/9.3 Jatropha curcas

Succinil-CoA

ligasa, subunidad

beta

Rojo 63 Q84LB6 45153.6/5.86 Solanum

lycopersicum

Fenilalanina Rojo 66 Q9XGR3 72456/6.21 Vigna

http://www.uniprot.org/taxonomy/4072



Capítulo 1

71

amonio liasa unguiculata

Proteína SlUPTG1:

UDP glucosa

transglucosilasa

Rojo 69 Q6IV07 41735.8/5.85 Solanum

lycopersicum

Proteína de

cloroplasto RF2

Rojo 70 G0YD10 269728.3/8.49 Ixerba brexioides

Nucleasa de

inducción por alta

luminosidad

Rojo 75 A8HN65 29594.8/9.03 Chlamydomonas

reinhardtii

1,4-glucano sintasa Rojo 76 G7JWW6 41683.8/5.71 Medicago

truncatula

Proteína

poligalacturonasa

de inhibición

Rojo 2 D7RJV7 38246.8/8.99 Capsicum

annuum

Fructosa bisfosfato

aldolasa

Rojo 5 K4D3E4 38829/8.33 Solanum

lycopersicum

Gliceraldehído 3-

fosfato

deshidrogenasa

Rojo 27 F1AF05 12404.5/8.16 Rosa chinensis

var. spontanea

Glucano endo 1,3-

beta glucosidasa

Rojo 30 P15797 40541.4/7.1 Nicotiana

tabacum

Proteína de

biosíntesis de

piridoxina,

isoforma A

Rojo 36 Q6QND3 33353.1/5.93 Nicotiana

tabacum

Osmotina Rojo 68

70

Q9ARG0

Q84U69

27253.6/7.84

18627.6/8.3

Capsicum

annuum

Solanum

tuberosum

Lipocalina Rojo 78 Q5J0W3 21432.8/6.62 Capsicum

annuum

83 Q38JB9 21392.9/6.33 Populus

tremuloides

En la Tabla 1.3 se muestran las proteínas compartidas entre los dos tipos de frutos,

donde vienen anotados para cada una de ellas los spots identificados a partir de los

frutos verdes (Figura 1.5) o de los rojos (Figura 1.7).

Capítulo 1

72

Tabla 1.3: Proteínas coincidentes entre los dos tipos de fruto de pimiento (Capsicum annuum L.). Se

indica también el spot con el que se corresponde en los respectivos geles (Figura 4 para pimientos verdes

y 6 para rojos), los tamaños moleculares (MW) y puntos isoeléctricos (PI), así como las especies donde se

han descrito anteriormente.

Proteína identificada Tipo

de

fruto

Spot

(Figs. 4

y 6)

Nº acceso MW/PI Especie

Transcetolasa 1 Verde 3 O78327 80397.7/

6.16

Capsicum

annuum Rojo 6

Alfa manosidasa Verde 6 E7BYE5 117029.1/

6.28

Capsicum

annuum Rojo 30

Beta hexosaminidasa Verde 7 E7BYE4 64319.6/

5.47

Capsicum

annuum Rojo 8

Poligalacturonasa Verde 14 Q2XTD7 52412.2/

5.66

Solanum

tuberosum Rojo 12

Adenilosuccinato

sintetasa 1

Verde 46 A9XLE1 56188.9

/8.35

Capsicum

frutescens Rojo 46

Citocromo c oxidasa,

subunidad II PS17

Verde 55 P84733 1707 /9.63 Pinus strobus

Rojo 32

3 isopropilmalato

deshidrogenasa

Verde 70 B5LAV1 43683.4/ 5.9 Capsicum

annuum

Rojo 64

Fosforribuloquinasa Verde 84 K4CMY9 44792.6

/5.96

Solanum

lycopersicum Rojo 78

N carbamoíl-

putrescina amidasa

Verde 9 Q3HVN1 33555/ 5.87 Solanum

tuberosum Rojo 11

Ferredoxina NADP+

oxidorreductasa

Verde 17 Q9M4D2 40666.7

/8.54

Capsicum

annuum Rojo 54

Ascorbato peroxidasa Verde 55 Q84UH3 27754.9

/5.43

Capsicum

annuum Rojo 42

Deshidroascorbato

reductasa

Verde 81 Q84UH4 23817.5/ 7.7 Nicotiana

tabacum Rojo 63

Metionina sulfóxido

reductasa A4

Verde 91 G3K2M4 29252.5

/8.65

Solanum


Peptidil prolil cis-

trans isomerasa

Verde 102 K4ATJ4 26689.6 /9.2 Solanum

lycopersicum

Rojo 84 B9RMA5 27656.2/9.58 Ricinus

communis

Enolasa Verde 36 P26300 48053.5/

5.68

Solanum

lycopersicum

Rojo 37 Q6WB92 47872.7/6.16 Gossypium

barbadense

Glutamato

deshidrogenasa

Verde 57 B9I5Y2 44699/ 6.28 Populus

trichocarpa

Rojo 59 G3G8J6 44944.1/6.23 Vitis vinifera

Capítulo 1

73

Fructosa bifosfato

aldolasa

Verde 78 G9MA91 37689.5/

5.97

Linum

grandiflorum

Verde 81 K4CQV5 39109.1

/7.51

Solanum

lycopersicum Rojo 3

Malato

deshidrogenasa

Verde 87 Q2PYY8 35805.4/

5.74

Solanum

tuberosum

Verde 91 K4DCV3 35860 /8.9 Solanum


Rojo 82 Q8L5C8 36429.1/8.48 Solanum

tuberosum

Subunidad alfa

proteasomal

Verde 59 K4D245 27443.9/

6.11

Solanum


Verde 31 K4B407 27196.2/

6.98

Solanum

lycopersicum

Verde 68 K4BA40 27368.7/

5.63

Solanum

lycopersicum

Rojo 48 K4BVD8 32648.3/5.67 Solanum

lycopersicum

Subunidad beta

proteasomal

Verde 69 K4C2U0 29566.7

/6.66

Solanum

lycopersicum

Verde 78 K4BB06 24930.3/

5.93

Solanum

lycopersicum

Verde 88 K4CCD7 25382.7

/5.51

Solanum


Rojo 56 K4DA71 27637.9/7.02 Solanum

lycopersicum

Triosofosfato

isomerasa

Verde 72 K4FXE7 27305.2/

5.72

Capsicum

annuum Rojo 51

Verde 75 K4B3X5 35042.7/

6.45

Solanum


Catalasa Verde 29 Q9M5L6 56957.4/

7.31

Capsicum

annuum

Rojo 43

Rojo 55 A8QID6 56960.4/7.05 Capsicum

annuum

Cisteína sintasa Verde 15 Q3LAG5 34331.1/

5.71

Nicotiana

tabacum

Verde 13 K4CVI4 34335.1/

5.93

Solanum

lycopersicum

Rojo 87 P31300 40465.9/5.22 Capsicum

annuum

Superóxido dismutasa Verde 92 C0JPM8 14732.4/

5.36

Solanum

nigrum Rojo 72

Verde 93 Q7YK44 27893/ 6.6 Solanum




Capítulo 1

74

Capítulo 1

75

En los últimos años ha aumentado la información disponible sobre el proceso de

maduración de los frutos, principalmente de aquellas especies que están destinadas al

consumo humano. Por consiguiente, la investigación en producción de frutos, desde un

punto de vista nutricional, fisiológico y genético ha adquirido una especial atención,

para de esta forma poder satisfacer las demandas de los diferentes sectores como la

agricultura, la economía e incluso la política.

El pimiento es una especie agrícola dominante a nivel mundial, puesto que se consume

prácticamente en todos los países y de distintas maneras. A día de hoy existe poca

información sobre algunos de los aspectos del cultivo de este fruto, tales como mejores

prácticas para el sembrado y germinación de semillas, patologías, control de

maduración y estrategias post-cosecha y, por último, calidad de frutos como valor

añadido, entre otros. La maduración de los frutos es un proceso complejo en el

desarrollo de los mismos que conlleva una gran cantidad de cambios tanto a nivel

fisiológico como bioquímico (Palma et al., 2011b). En este estudio se ha comparado el

proteoma general de frutos de pimiento verdes y rojos y se han identificado las

proteínas diferenciales de cada tipo de fruto, así como las coincidentes entre ellos para

así intentar descubrir los eventos que subyacen a este importante proceso del desarrollo

en esta especie.

En la Tabla 1.4 se distribuyen las proteínas identificadas de acuerdo al grupo funcional

en el que se encuadran. Como se puede apreciar, muchas proteínas tienen un cierto

papel en los mecanismos de defensa, fundamentalmente relacionados con el

metabolismo antioxidante. Por otro lado, son de destacar también por su número las

proteínas relacionadas con el propio metabolismo proteico, tanto proteinasas como

aquellas implicadas en la síntesis de aminoácidos. Asimismos, se dará una visión

general de aquellas proteínas, de acuerdo a sus implicaciones nutricionales o de cierta

singularidad, habida cuenta de que hasta el momento se desconoce buena parte del

metabolismo de frutos de pimiento y, sobre todo, de cómo evoluciona éste durante la

maduración.

Capítulo 1

76

Tabla 1.4: Proteínas identificadas de frutos de pimiento y agrupadas por grupos funcionales.

Proteína Tipo de

pimiento

Grupo funcional

Catalasa Verde y rojo Metabolismo oxidativo

Superóxido dismutasa (SOD) Verde y rojo Metabolismo oxidativo

Ascorbato peroxidasa (APX) Verde y rojo Metabolismo oxidativo

Deshidroascorbato reductasa (DAR) Verde y rojo Metabolismo oxidativo

Glutatión reductasa (GR) Rojo Metabolismo oxidativo

Glutatión S-transferasa (GST) Verde Metabolismo oxidativo

Metionina sulfóxido reductasa A4

(MSR)

Verde y rojo Metabolismo oxidativo

Malato deshidrogenasa (MDH) Verde y rojo Metabolismo del malato

Ferredoxina NADP+ oxidorreductasa Verde y rojo Fotosíntesis

Fosforribuloquinasa Verde y rojo Fotosíntesis

Taumatina Verde Defensa frente a patógenos

Proteína 4b relacionada con

patogénesis

Verde Defensa frente a patógenos

Proteínas de choque térmico Verde Defensa

Harpina Verde Defensa

Proteína asociada BON1 Rojo Defensa

Osmotina Verde y rojo Defensa

Subtilisina Verde Enzimas proteolíticas

Leucina aminopeptidasa Verde y rojo Enzimas proteolíticas

Subunidad alfa proteasomal Verde y rojo Enzimas proteolíticas

Subunidad beta proteasomal Verde y rojo Enzimas proteolíticas

S-adenosilmetionina sintasa Verde Biosíntesis de Aminoácidos

Adenosil-homocisteinasa Verde Biosíntesis de Aminoácidos

Cisteína sintasa Verde y rojo Biosíntesis de Aminoácidos

Proteína de biosíntesis de arginina Verde Biosíntesis de aminoácidos

Anexina Verde Metabolismo secundario

Fenilalanina amonio liasa Rojo Metabolismo secundario

Progesterona 5 beta reductasa Rojo Metabolismo secundario

Proteína Ycf2 Rojo Síntesis de ATP

Citocromo C oxidasa subunidad II Verde y rojo Respiración mitocondrial

Calreticulina Verde Síntesis de proteínas

Anquirina Verde Transporte intracelular

Coatómero subunidad γ Verde Transporte intracelular

Lipocalina Rojo Transporte intracelular

Alfa manosidasa lisosomal Rojo Metabolismo de carbohidratos

Triosofosfato isomerasa Verde y rojo Metabolismo de carbohidratos

Factor de transcripción homeobox Rojo Transcripción de ADN

Proteína de biosíntesis de piridoxina Rojo Biosíntesis de vitaminas

La catalasa (EC 1.11.1.6) es una de las principales proteínas peroxisomales

relacionadas con la eliminación del peróxido de hidrógeno en células eucarióticas bajo

situaciones celulares normales y que además actúa como antioxidante en situaciones en

que se produce un estrés oxidativo (Palma et al., 2013). En estudios realizados en

nuestro laboratorio sobre el perfil de la catalasa en peroxisomas aislados tanto de frutos

Capítulo 1

77

de pimiento verde como rojo, se observó una actividad inferior en frutos maduros

(Mateos et al., 2003). Sin embargo, a nivel global la catalasa es una enzima que se

expresa tanto en condiciones de inmadurez de fruto como en éste ya maduro indicando

que en situaciones de estrés es también una defensa antioxidante primordial.

Las superóxido dismutasas (SODs; EC 1.15.1.1) son las enzimas encargadas

de eliminar el radical superóxido (O2.-) y se les considera las primera barrera de defensa

antioxidante (Halliwell and Gutteridge, 2007). Existen tres tipos distintos de SODs en

función del metal pesado que posean en el centro activo de la proteína (CuZn-SOD, Fe-

SOD y Mn-SOD) (Rodríguez-Serrano et al., 2007). El número y tipo de isoformas de

SOD varía en función de la especie de planta, del órgano, del estadio de desarrollo y de

las condiciones medioambientales. La sobreexpresión de las SODs está relacionada

normalmente con la defensa de plantas frente a estrés oxidativo generado tanto por

estrés biótico como abiótico, y juega un papel crucial en la supervivencia de la célula

bajo esas condiciones (Gill and Tuteja, 2010). En plantas, las SODs han sido

localizadas en distintos compartimentos subcelulares. Las CuZn-SOD se localizan a

nivel de cloroplastos citosol, peroxisomas y apoplasto. Las MnSOD a nivel de

mitocondrias y de peroxisomas. Y por último las Fe-SOD se localizan a nivel de

cloroplastos aunque también se han descrito en peroxisomas (Palma; Del Rio et al.,

1983; Salin, 1988; Ogawa, 1995; Corpas et al., 1998; Corpas et al., 2006b). Debido a

que las SODs tienen diferentes átomos presentes en el sitio activo, han sido

ampliamente estudiadas en la investigación frente a estrés en plantas causado por

metales pesados. En cultivares de pimiento con diferente sensibilidad al cadmio (Cd2+

),

se observó cómo este metal a concentraciones de 0,5 mM provocaba una leve

disminución de la actividad SOD. El crecimiento de las plantas de pimiento con 0,5 mM

de cadmio inhibió la actividad CuZn-SOD en todos los cultivares, a diferencia de la Fe-

SOD y de la Mn-SOD que aumentaron (León et al., 2002). A nivel subcelular también

se han estudiado los efectos del exceso de cobre (Cu2+

)usando cloroplastos y

peroxisomas aislados de plantas de guisante de dos cultivares con diferente sensibilidad

a este metal. En estos análisis se observó una elevada actividad Mn-SOD en

peroxisomas del cultivar tolerante, mientras que en el caso de las CuZn-SOD de los

cloroplastos de los dos cultivares no hubo diferencias (Palma et al., 1987).

Capítulo 1

78

La ascorbato peroxidasa (APX; EC 1.11.1.11 ), junto con la

deshidroascorbato reductasa (DAR; EC 1.8.5.1), la glutatión reductasa (GR; EC

1.8.1.7) y la monodeshidroascorbato reductasa (MDAR; EC 1.6.5.4) – no detectada en

este estudio – forman una unidad funcional denominada ciclo ascorbato-glutatión,

también llamado ciclo Foyer-Halliwell-Asada, en el que están implicadas las moléculas

citadas anteriormente que son de gran importancia en el metabolismo celular: ascorbato,

glutatión y NADPH. Así, este ciclo está encargado de la eliminación de peróxido de

hidrógeno con consumo de ascorbato y siendo estrictamente dependiente, como ciclo,

del aporte contínuo de NADPH (Asada, 2006).

La APX es una peroxidasa hemínica que lleva a cabo la primera reacción del

ciclo ascorbato-glutatión, al reducir el H2O2 a H2O empleando para ello, el ascorbato

como sustrato reductor, el cual se oxida a monodeshidroascorbato (MDA). Su

localización subcelular en plantas superiores es a nivel de citosol, cloroplastos,

mitocondrias y peroxisomas (Shigeoka et al., 2002). La DAR es otra enzima que, al

igual que las demás, ayuda a defender a la planta frente a los efectos nocivos de las

especies de oxígeno reactivo (ROS). La deshidroascorbato reductasa cataliza la

reducción del deshidroascorbato (DHA) a ascorbato (ASC), empleando para ello el

glutatión reducido (GSH) (Trumper et al., 1994). La (GR) es una flavoproteína que

cataliza la reducción del glutatión oxidado (GSSG) a glutatión reducido (GSH),

utilizando el NADPH como donador de electrones. Forma parte del ciclo ascorbato-

glutatión y por lo tanto es muy importante en la defensa de la planta frente al estrés

oxidativo. La GR se ha identificado en numerosas especies y tejidos vegetales, siendo

las más estudiadas las de guisante. A nivel de orgánulos se localizan en cloroplastos,

mitocondrias, citosol y peroxisomas (Romero-Puertas et al., 2006). En pimiento se ha

comprobado que, en general, tanto la catalasa, las superóxido dismutasas, así como las

enzimas del ciclo ascorbato-glutatión están implicadas en la respuesta de las plantas

frente a estrés por Cd (León et al., 2002) y por bajas temperaturas (Airaki et al., 2012)

en la germinación y etapas post-germinativas (Airaki et al., 2015), en la maduración de

los frutos (Jiménez et al., 2003; Mateos et al., 2003; Martí et al., 2009) y en la

respuesta de éstos frente a estrés por bajas temperaturas (Mateos et al., 2013).

Las glutation S-transferasas (GST; EC 2.5.1.13) son enzimas que ayudan a la

destoxificación celular ya que tienen actividad peroxidasa y se localizan principalmente

Capítulo 1

79

a nivel de citosol. Se ha sugerido que las GST actúan formando complejo con el

glutatión existente en el citosol para transformarlo en tiolato (GS-). Este tipo de enzimas

han sido bien caracterizadas en mamíferos (Sheehan et al., 2001). En plantas de

pimiento, la GST está implicada en la respuesta de la planta al herbicida 2,4-D (Mateos,

2006) y en la especie Amelanchier alnifolia (fresa de junio o sascatun) participa en la

maduración de los frutos (Rogiers et al., 1998).

Los residuos de metionina (Met) son especialmente sensibles a la oxidación por las

ROS, lo que produce sulfóxido de metionina (MetSO). Las metionina sulfóxido

reductasas (MSR) reparan los residuos oxidados de metionina y protegen a la planta

frente al estrés oxidativo (Liu and Wang, 2013). La modificación de las metioninas

origina cambios en la función y estructura de las proteínas. Por eso es tan importante la

existencia de estas proteínas que se expresan en casi todos los organismos y se han

relacionado con el retraso del envejecimiento celular y la progresión de enfermedades

neurodegenerativas (Kim and Gladyshev, 2007). Resultados en experimentos

realizados en arroz transfectado con el gen de pimiento CaMSRB2 indicaron que dicho

gen debía jugar un importante papel en los cloroplastos pues conferían tolerancia frente

a estrés por sequía (Kim et al., 2014). Recientemente, mediante análisis de

secuenciación masiva de plantas de Arabidopsis expuestas a GSH o S-nitrosoglutatión

(GSNO), se ha observado que la mayoría de los genes de MSR de hoja se inducían por

GSH, a excepción de MSRB7 (At4g21830) que se inducía por GSNO pero por GSH

(Begara et al., 2014), sugiriendo una clara relación entre metabolismo oxidativo y

nitrosativo de esta proteína.

La malato deshidrogenasa cataliza la reacción de oxidación del (S)-malato a

oxaloacetato utilizando NAD+ como aceptor de electrones. Esta enzima juega un papel

esencial en el transporte malato/aspartato a través de la membrana mitocondrial y en el

ciclo de los ácidos tricarboxílicos dentro de la matriz mitocondrial. Además aparece en

muchos compartimentos celulares y posee varias isoformas en función de su

localización (Minarik et al., 2002). Esta enzima al igual que la 3 cetoacil coA thiolasa

es procesada proteolíticamente antes de entrar en los peroxisomas por su extremo C-

terminal (Corpas et al., 1993b).

Capítulo 1

80

La ferredoxina NADP+ oxidorreductasa (FNR; EC 1.18.1.2) es una enzima

perteneciente a las flavoproteínas que emplea FAD como cofactor y está codificada por

una pequeña familia de genes nucleares de plantas superiores. Las isoformas

cloroplastídicas de FNR son las responsables del último paso del transporte de

electrones desde la ferredoxina al NADP+ para generar NADPH, el distribuidor del

poder reductor. Las FNRs se han encontrado en tres compartimentos dentro del

cloroplasto, en la membrana tilacoidal, en el estroma y en la pared interna

cloroplastídica (Mulo, 2011). La presencia de la FNR en frutos rojos de pimiento

sugiere que, esta enzima podría tener otra función adicional a la propia transferencia de

electrones provenientes del PSI, aunque tampoco se podría descartar la posibilidad de

que esta proteína fuera parte de los remanentes que quedan en la célula sin degradar (o

de degradación lenta), una vez que se desmantelan los cloroplastos.

Las proteínas relacionadas con la patogénesis (PRs) están relacionadas con una

gran cantidad de alérgenos y se inducen de manera específica en respuesta a infecciones

causadas por patógenos o por situaciones medioambientales desfavorables. Las PRs no

constituyen una superfamilia de proteínas sino que representan un grupo de familias de

proteínas no relacionasdas entre sí que funcionan como parte del sistema de defensa de

las plantas. Debido a la homología en las secuencias de una de las familias de PRs con

la taumatina, se ha denominado al conjunto de estas proteínas tipo taumatina o TLPs

(thaumatin-like proteins). Las TLPs pueden producirse como respuesta al ataque de

patógenos, en respuesta a estrés osmótico (en este caso se llaman osmotinas), o un

tercer grupo que son las TLPs antifúngicas que están presentes en semillas de cereales.

Las TLPs son resistentes a las proteasas, pH o calor y esto se debe a que poseen 16

cisteínas conservadas en su estructura que formas 8 puentes disulfuro (Breiteneder,

2004). Además, la taumatina es la proteína considerada como el edulcorante natural más

potente conocido. Es denominado en la legislación alimenticia con el código de

identificación E 957 (Kant, 2005). La taumatina en pimiento picante donde actúa como

alérgeno (Lee et al., 2009). También se ha propuesto que el gen PepTLP que codifica

una proteína de tipo taumatina en pimiento se puede usar como marcador molecular en

la resistencia a enfermedades, de maduración y en los casos de acumulación de azúcares

en los frutos (Kim et al., 2002).

Capítulo 1

81

Las proteínas de choque térmico o HSP (Heat shock proteins), son un conjunto

de proteínas que producen tanto los organismos unicelulares como los pluricelulares

cuando se encuentran en un medio ambiente que le provoca cualquier tipo de estrés.

Hay un tipo de HSPs conocidas como chaperonas, y dentro de estas últimas las

chaperoninas, que son vitales en procesos tales como síntesis de proteínas, unión de

complejos multiproteicos, transporte de proteínas a compartimentos celulares,

señalización celular, y reacción frente a estrés. Además, las HSPs pueden desencadenar

la respuesta inmune. Las HSP se clasifican en función de su peso molecular (hsp10,

hsp40, hsp60, hsp70, hsp90, etc.) (Li and Srivastava, 2004). La distribución subcelular

de estas proteínas en plantas superiores es amplia, citosol, cloroplastos, mitocondria,

retículo endoplasmatico, peroxisomas y núcleo (Haslbeck and Vierling, 2015). Se ha

descrito que el tratamiento de pimientos dulces con ácido jasmónico induce la síntesis

de HSPs, así como de otras proteínas PR o la oxidasa alternativa, lo que conlleva a una

mayor tolerancia a las bajas temperaturas (Wang et al., 2005).

La subtilisina es una endopeptidasa del tipo serín-proteinasa que está

relacionada con una gran variedad de procesos fisiológicos en plantas, como

senescencia, muerte celular programada, diferenciación de tejidos, germinación, etc

(Palma et al., 2002). En plantas, al igual que en animales, la muerte celular

programada (PCD) se produce en una gran variedad de situaciones incluidos el

desarrollo, así como la respuestas de defensa frente a estrés. En el reino animal son las

caspasas las que tienen un papel muy importante en la PCD, y en plantas se ha

establecido un paralelismo con las subtilisinas, ya que a pesar de que estructuralmente

no están relacionadas unas con las otras sí comparten la misma especificidad y función.

Se han descubierto alrededor de 50 genes que codifican subtilisinas en Arabidopsis

thaliana así como unos 60 en Oryza sativa (Vartapetian et al., 2011).

Las aminopeptidasas son un tipo de peptidasas que degradan el extremo amino

de las proteínas (exopeptidasas), liberando el aminoácido terminal. Las enzimas

proteolíticas juegan un papel esencial en procesos de maduración intracelular y reciclaje

de proteínas y, a nivel subcelular, se localizan en distintos compartimentos (Matsui et

al., 2006). Este tipo de enzimas se han descrito en peroxisomas de guisante (Corpas et

al., 1993b).

http://es.wikipedia.org/wiki/Prote%C3%ADna

http://es.wikipedia.org/wiki/Ser_vivo

http://es.wikipedia.org/wiki/Medio_ambiente

http://es.wikipedia.org/wiki/Estr%C3%A9s

Capítulo 1

82

Las subunidades alfa y beta proteasomales forman parte del proteasoma que

es un complejo proteico de gran tamaño ubicado en el citosol que se encarga de realizar

la degradación de proteínas no necesarias o ya dañadas. Las proteínas que van a ser

degradadas por este complejo son marcadas por una pequeña proteína

llamada ubiquitina. Una vez que una de estas moléculas de ubiquitina se han unido a la

proteína a eliminar, se empiezan a agregar más proteínas de ubiquitina dando como

resultado la formación de una cadena poliubiquitínica (poliubiquitinación) que le

permite al proteasoma identificar y degradar la proteína. Hay tres tipos de proteosomas

funcionales: el proteosoma 26S, el proteosoma 30S, y el inmunoproteosoma. La forma

más común de proteasoma es el 26S que está compuesto por un núcleo de 20S y dos

subunidades reguladoras 19S. El complejo 20S está formado por 4 anillos, 2 alfa y 2

beta. El complejo 20S está formado por 4 anillos, 2 alfa y 2 beta, que dejan tres espacios

o cámaras internas entre ellos (precámara, cámara de reacción y postcámara). Los

anillos alfa y beta están, a su vez, formados por 7 subunidades cada uno de ellos. En la

cámara de reacción, cada subunidad beta deja su extremo amino con una treonina muy

reactiva hacia el interior de la cámara, que es el residuo que lleva a cabo la degradación

de proteínas (Palma et al., 2002). La actividad 26S y la 20S del proteasoma se regulan

para controlar el desarrollo de la planta y las respuestas a estrés (Kurepa et al., 2009;

Jung et al., 2013).

A nivel proteómico se han identificado estas enzimas tanto en extractos de fruto

verde como de fruto rojo puesto que la degradación de las proteínas oxidadas forma

parte de la protección del normal funcionamiento celular. Pero además, el hecho de que

este grupo de proteínas con actividad proteolítica (subtilisina, leucina

aminopeptidasasea y proteasoma) sea de los más abundantes en los frutos de pimiento

indica el gran dinamismo metabólico que se desarrolla durante la maduración.

La S-adenosilmetionina sintasa (también llamada ATP:L-metionina S-

adenosil-transferasa, y metionina adenosiltransferasa, entre otros términos)

cataliza la formación de S-adenosilmetionina desde la metionina y ATP y es el principal

donador de grupos metilo (Murray et al., 2014). En base a la importante función que

tienen estas proteínas (reacciones de transmetilación) se puede esperar que jueguen un

papel clave en la tolerancia de las plantas a estrés (Gong et al., 2014). A nivel

Capítulo 1

83

subcelular se han descrito en citoplasma y núcleo en células de epidermis de cebolla

(Quan et al., 2014).

La S-adenosilhomocisteinasa (SAHH) es la enzima que cataliza el catabolismo

de S-adenosilhomocisteína (SAH) a adenosina y L-homocisteína. Juega un importante

papel en la regulación de las reacciones de metilación en las células (la SAH se forma

por una reacción de transmetilación de la S-adenosil metionina y por lo tanto en la

concentración de adenosilhomocisteína intracelular (Chaki et al., 2009a). Se ha

encontrado actividad SAHH en mamíferos, aves, plantas y levaduras (Mull et al.,

2006). Las reacciones de transmetilación son esenciales para el desarrollo normal de las

plantas. A nivel subcelular se ha descrito en citoplasma y núcleo de Arabidopsis

thaliana (Lee et al., 2012). A la luz de nuestros resultados sobre la S-adenosilmetionina

sintasa y la SAHH, se podría afirmar que, posiblemente, la reacciones de

transmetilación y los procesos asociados tienen mayor repercusión en las etapas previas

a la maduración de los frutos.

La cisteína sintasa es la enzima encargada de generar cisteína a partir de serina.

La cisteína no sólo es un aminoácido proteinogénico, sino también un metabolito

regulador esencial en plantas. La asimilación de nutrientes es fundamental para el

crecimiento y el desarrollo vegetal, y también determina la respuesta de la planta a las

señales ambientales. La cisteína juega un importante papel en el metabolismo de las

plantas debido a que es una molécula que dona azufre reducido, lo que sirve para la

síntesis de biomoléculas esenciales y elementos de defensa. Además la cisteína es

esencial en el estado del mantenimiento redox celular. El azufre es un macronutriente

esencial para el crecimiento y el desarrollo de las plantas y la forma más abundante en

que éste se presenta en la naturaleza es en forma de sulfatos, el cual es tomado por las

plantas y asimilado en forma de cisteína. Además el grupo tiol de la cisteína es

susceptible de oxidación por lo que puede afectar a la estructura de las proteínas y como

consecuencia a su función (Romero et al., 2014). En plantas, las enzimas implicadas en

la síntesis de cisteína están presentes en el citosol, los plastidios y las mitocondrias

(Romero et al., 2014) habiéndose descrito también en los plastidios de fruto de

pimiento (Romer et al., 1992).

Capítulo 1

84

Las anexinas son proteínas multifuncionales de unión a lípidos dependientes de

Ca2+.

En plantas se expresan durante todo el ciclo de vida así como bajo control

medioambiental. Dentro de las funciones de estas proteínas se incluyen, la exocitosis,

unión a actina, actividad peroxidasa, regulación de la síntesis de calosa y transporte de

iones. Al ser proteínas capaces de unirse a Ca2+

actúan en el desarrollo y como

respuesta a condiciones bióticas y abióticas regulando el estado redox celular. Ha

habido estudios en los que se ha relacionado a la anexina con la maduración de frutos de

pimiento. El pimiento al ser un fruto no climatérico presenta un comportamiento

especial en respuesta a factores hormonales durante la maduración, en el que las

anexinas podrían jugar un papel clave (Proust et al., 1996; Delmer and Potikha, 1997;

Laohavisit and Davies, 2011). De hecho, se ha aislado y caracterizado la anexina p35 a

partir de frutos verdes de pimiento (Hoshino et al., 1995). Nuestro estudio corrobora

estos datos ya que sólo pudimos detectar esta proteína en los frutos verdes.

Posiblemente los procesos asociados al calcio sean más proclives en los frutos

inmaduros, pero es un tema que conviene estudiar con más profundidad. A nivel

subcelular se ha descrito en membrana plasmática de Gossypium hirsutum L. y de

Arabidopsis thaliana (Zhang et al., 2015).

La fenilalanina amonio liasa (PAL) es la principal enzima implicada en la

biosíntesis de compuestos fenólicos tales como los flavonoides. La PAL se encuentra

ampliamente distribuida en plantas, así como algunas levaduras y hongos. La actividad

de esta proteína se induce como respuesta ante las distintas situaciones de estrés

soportadas por la planta. La PAL está implicada en 5 vías metabólicas: metabolismo de

la tirosina, el metabolismo de la fenilalanina, el metabolismo del nitrógeno, la

biosíntesis de fenilpropanoides y biosíntesis de alcaloides. A nivel subcelular se ha

localizado en pared celular en uvas (Chen et al., 2006). La PAL se ha estudiado

recientemente para posibles beneficios terapéuticos en los seres humanos que sufren de

fenilcetonuria y además se ha utilizado en la generación de la L-fenilalanina en forma

de precursor del edulcorante aspartamo (Strisciuglio and Concolino, 2014; Valcárcel

et al., 2015). Dado que la capsicina, compuesto exclusivo que se encuentra en

determinadas variedades de pimientos picantes, es un derivado fenilpropanoide, es

lógico pensar que la PAL desempeñe un papel importante en las rutas metabólicas

ligadas a esta molécula. De hecho, se ha comprobado que la PAL, además de participar

Capítulo 1

85

en la biosíntesis de capsicina en condiciones normales (Pandhair and Sharma, 2008;

Phimchan et al., 2014), lo hace en situaciones de estrés por sequía (Phimchan et al.,

2014). En nuestro caso, la PAL sólo fue detectada en frutos rojos. Al ser una variedad

dulce, hay que descartar la implicación de esta enzima en metabolismo de

capsaicinoides.

Existen dos grandes genes en el genoma del cloroplasto ycf1 y ycf2 (Proteína

hipotética del cloroplasto RF2) de los cuales se desconoce su función, aunque hasta el

momento se han sugerido la síntesis de ATP, proteínas chaperonas, actividad en la

división celular, función estructural, detoxificación y respuesta a estrés (Wicke et al.,

2011). Es interesante destacar que esta proteína está fundamentalmente al cloroplasto,

pero, en nuestro caso, fue detectada en los frutos rojos y no en los verdes. Convendría

estudiar más profundamente este aspecto.

La cadena de transporte de electrones mitocondrial utiliza electrones desde un

donador ya sea NADH o FADH2 y los pasa a un aceptor de electrones final, como el O2,

mediante una serie de reacciones redox. Estas reacciones están acopladas a la creación

de un gradiente de protones generado por los complejos I, III y IV ubicados en la

membrana interna de la mitocondria. Dicho gradiente es utilizado para generar ATP

mediante la ATP sintasa, que se localiza en las proximidades de los complejos redox (I-

IV). El complejo IV o de la citocromo c oxidasa (CCO; EC 1.9.3.1) capta 4 electrones

de las cuatro moléculas de citocromo c y las transfiere al O2 para producir dos

moléculas de agua sin intermediarios reactivos de oxígeno (Dudkina et al., 2010). La

subunidad II de la CCO se detectó tanto en frutos verdes como rojos, lo que denota la

funcionalidad de la respiración mitocondrial, un hecho que está asociado a la evolución

de los frutos durante la maduración.

La calreticulina juega un importante papel en procesos celulares como

señalización por Ca2+

y plegamiento de proteínas. Estas proteínas se expresan en

situaciones de crecimiento de la planta y desarrollo así como en respuesta a estreses

tanto bióticos como bióticos. A nivel subcelular se localizan principalmente en retículo

endoplasmático (Jia et al., 2009). En pimiento se ha descrito una calreticulin peroxidasa

que tiene una regulación positiva por el factor de transcripción SREBP (Sterol

Regulatory Element-Binding Proteins) (Hwang et al., 2004).

Capítulo 1

86

Las anquirinas son una familia de proteínas adaptadoras (en realidad una

secuencia polipeptídica repetitiva de unos 30-34 aminoácidos) que median la unión

de las proteínas integrales de membrana al citoesqueleto, en un proceso dependiente de

Ca2+

y que, en algunos casos está directamente implicada en el desarrollo del cáncer y

otras enfermedades (Li et al., 2006). A nivel subcelular se localizan en membrana

plasmática y citoplasma (Ueki et al., 2010). Se ha demostrado que 3-4 repeticiones de

la anquirina están presentes en el extremo amino terminal del receptor de la capsaicina

TRP. Los TRPs (transient receptor potential) son una subfamilia de receptores de la

capsaicina que poseen seis dominios transmembrana, con un canal para iones, de 3-4

anquirinas y un dominio TRP propiamente dicho formado por 25 aminoácidos en el

extremo carboxílico (Nakagawa and Hiura, 2006). La presencia de esta proteína en los

frutos verdes de pimiento es un fenómeno extraño, ya que sería el primer caso descrito

sobre la existencia de este polipéptido en plantas.

El coatómero, γ, pertenece a un grupo de proteínas denominadas

“coatómero” que es un complejo citosólico formado por 7 proteínas “coat” (α-COP, β-

COP, β′-COP ,γ-COP, δ-COP ε-COP, and δ-COP). Su función está relacionada con el

transporte de proteínas desde el retículo endoplasmático hasta el aparato de Golgi

(Kimata et al., 2000). Al igual que como ocurría con la anquirina, la presencia de la

subunidad γ del coatómero en frutos de pimiento sería algo excepciona ya que, aunque

este polipéptido se ha descrito en determinadas situaciones y tejidos en plantas

(Langhans et al., 2008; Ostertag et al., 2013) no es un evento común, y su descripción

en frutos es, hasta ahora, inexistente.

La harpina es una proteína rica en glicina estable frente a calor secretada por

bacterias patógenas de plantas. Muchos estudios han descrito cómo estas proteínas se

dirigen al espacio extracellular de los tejidos de las plantas a diferencia de las proteínas

efectoras de bacterias que van al interior de las células desencadenando la respuesta

hipersesitiva. Cuando las harpinas se han aplicado a las plantas directamente o se han

expresado en células vegetales han aportado muchas respuestas beneficiosas de defensa

frente a determinados patógenos, así como estimulado el crecimiento de la planta (Choi

et al., 2013). En pimiento se ha comprobado que el tratamiento con harpina aumenta la

vida media de los frutos afectados por Botrytis cinérea (Akbudak et al., 2009; Tezcan

et al., 2013b) o Verticillium dahliae (Tezcan et al., 2013a) o Phytophthora capsicii

http://gl.wikipedia.org/wiki/Prote%C3%ADna_integral_de_membrana

http://gl.wikipedia.org/wiki/Citoesqueleto

Capítulo 1

87

(Roberts et al., 2010) entre otros. En algunos casos se ha empleado el gen de una

proteína tipo ferredoxina vegetal (PFLP, plant ferredoxin-like protein), característica de

pimiento dulce para mimetizar los efectos de la harpina en plantas transfectadas con

dicho gen e inoculadas con diversos patógenos (Lin et al., 2010; Tripathi et al., 2013;

Ger et al., 2014).

La α-manosidasa lisosomal es una proteína encargada de las síntesis de la

manosa que en humanos es la responsable de una enfermedad autosómica dominante

que causa deficiencia en el almacenamiento en los lisosomas cuando existe una

deficiencia en la misma. La enzima de frutos de pimiento fue la primera que se purificó

y se caracterizó a partir de estos órganos vegetales (Sethu and Prabha, 1997). En

pimiento se ha descrito que esta enzima muestra baja actividad durante la maduración

(Tan et al., 2012) aunque también se ha comprobado que esta enzima incrementa la

vida media de los frutos (Ghosh et al., 2011).

Los cardenólidos son un tipo de esteroides (alcaloides indol monoterpernoides,

entre ellos) que poseen las plantas y que a menudo actúan como toxinas. La

progesterona-5.- reductasa (PR) es una familia de proteínas que forman parte de la

ruta biosintética de estos compuestos y que podría actuar en el metabolismo secundario

de la planta (Gartner et al., 1990). Recientemente se ha detectado también esta proteína

en fibra de algodón mediante análisis proteómico, y se le ha atribuido una función

relacionada con la pigmentación de dicha fibra (Li et al., 2013b). No hay datos sobre

esta enzima en pimiento, pero el hecho de que la capsicina sea un alcaloide hace pensar

que la PR pueda ser un elemento fundamental en el metabolismo de esta especie, sobre

todo en las variedades picantes.

88

ÍT 2: T T F T

F T .

89

T

Capítulo 2

90

OBJETIVO: Estudio de las modificaciones post-traduccionales de las proteínas

mediante nitroproteómica en extractos de fruto de pimiento verde y rojo, así como el

estudio del efecto del NO sobre la maduración de los frutos.

El óxido nítrico (NO) es un gas radical a partir del cual se forman algunas

moléculas derivadas como el S-nitrosoglutatión (GSNO) y el peroxinitrito (ONOO-),

dióxido de nitrógeno (NO2) entre otras. Todas ellas son las denominadas especies de

nitrógeno reactivo (RNS). El metabolismo de las RNS y sus implicaciones fisiológicas

han sido estudiadas ampliamente en células animales. Sin embargo, poco se sabe sobre

su papel en la células de las plantas. Se ha descrito cómo el NO produce modificaciones

post-traduccionales (PTMs) en las proteínas. La importancia de este fenómeno radica en

que dichas modificaciones intervienen en diferentes procesos fisiológicos a través de

mecanismos de señalización celular (Radi, 2004; Ischiropoulos and Gow, 2005;

Corpas et al., 2007; Corpas et al., 2009b; Corpas and Barroso, 2014). Dentro de las

PTMs mediadas por las RNS se incluyen procesos de nitración de tirosinas,

nitrosilación de grupos tioles y nitrosilación metálica de proteínas (Gow et al., 2004).

Nitración de proteínas

La nitración de proteínas es el proceso por el cual se añade un grupo NO2 a uno de los

dos carbonos en posición orto de un residuo de tirosina. Esto convierte a la tirosina en

una nitrotirosina hidrofílica cargada negativamente lo que causa un cambio pronunciado

en el pKa local del grupo hidroxilo variando de 10.07 en la tirosina a 7.50 en la

nitrotirosina (Turko and Murad, 2002). Esta modificación post-traduccional de las

proteínas es considerada un proceso selectivo, puesto que depende de diversos factores

como la estructura de la proteína, y además afecta a un número reducido de proteínas,

así como a unas pocas tirosinas dentro de cada proteína (Corpas et al., 2009b).

La nitración se ha usado tradicionalmente como un marcador de enfermedad y

estrés oxidativo en células animales (Ischiropoulos, 2003), mientras que en plantas se

ha estudiado bajo condiciones de estrés biótico (Chaki et al., 2009a) y abiótico, tal

como salinidad (Valderrama et al., 2007; Corpas et al., 2009c; Tanou et al., 2012),

temperatura (Chaki et al., 2011; Airaki et al., 2012), y concentraciones controladas de

Capítulo 2

91

arsénico (Leterrier et al., 2012). Sin embargo, a día de hoy existe poca información

disponible sobre la nitración de las proteínas durante los procesos de desarrollo y

senescencia en plantas superiores (Begara-Morales et al., 2013).

Óxido nítrico y desarrollo en plantas

En mamíferos, el NO juega un papel fundamental en gran cantidad de procesos

fisiológicos (Hirst and Robson, 2011). Sin embargo, el papel de esta molécula en

procesos de desarrollo no es tan conocido. Experimentos llevados a cabo mediante la

eliminación de los genes NOS no han provocado graves alteraciones en el desarrollo en

tejidos animales de diverso origen (Huang et al., 1993; Lee et al., 2000). No obstante,

se ha descubierto el papel del NO en el desarrollo del corazón en el que una deficiencia

de la eNOS causa defectos congénitos como hipertrofia cardíaca y fallos cardíacos post-

natales. Asimismo, se sabe que la eNOS es crucial en las principales arterias coronarias

y en el desarrollo de los capilares del miocardio (Liu and Feng, 2012; Yu et al., 2014).

En plantas se está considerando el papel del NO en los últimos años, como

regulador del crecimiento, del desarrollo, de la inmunidad y de las interacciones

medioambientales de las plantas (Yu et al., 2014). El NO interviene en los procesos de

desarrollo de las plantas tales como germinación (Beligni et al., 2002), desarrollo de las

flores (Lee et al., 2008; Kwon et al., 2012), momento de floración (He et al., 2004;

Kwon et al., 2012), crecimiento de raíces y su desarrollo, etc. (Corpas et al., 2006a;

Fernández-Marcos et al., 2011; Kwon et al., 2012; Yu et al., 2014).

El desarrollo de la planta consta de diferentes fases que son: crecimiento

vegetativo, fase reproductiva y senescencia.

Durante la senescencia se produce un incremento de las ROS que desbordan los

sistemas antioxidantes de la planta causando un desequilibrio en el estado redox celular

lo que provoca un daño oxidativo que deviene, por tanto, en muerte celular (Thompson

et al., 1987; Procházková, 2007).

Por el contrario, los cambios que se producen en la senescencia en los niveles

de NO y en las RNS son menos conocidos (Procházková and Wilhelmova, 2011). El

NO afecta a la biosíntesis de etileno, que es un factor promotor de la senescencia, y por

tanto se ha descrito que ambos gases actúan de modo antagónico (Procházková and

Wilhelmova, 2011). En investigaciones llevadas a cabo sobre el efecto del NO en el

Capítulo 2

92

metabolismo de las plantas se ha observado que un aporte de NO exógeno puede

retrasar la senescencia de flores y de vegetales así como la maduración de los frutos

(Leshem and Pinchasov, 2000), a diferencia de lo que ocurría con la producción de

etileno. De hecho, Leshem and Haramaty (1996) mostraron cómo la aplicación de un

donante de NO sobre hojas senescentes de guisante (Pisum sativum) reducían la

producción de etileno (Leshem and Haramaty, 1996). En hojas de arroz (Oryza sativa),

la aplicación de NO exógeno contrarresta la senescencia inducida por ácido abcísico

(Hung and Kao, 2003) y puede retrasar la muerte celular programada en las capas de

aleurona de cebada (Hordeum vulgare) (Beligni et al., 2002). Sin embargo, elevados

niveles de NO exógeno son tóxicos. Selçukcam y Cevahir describieron que el efecto del

NO sobre la senescencia de las hojas de girasol (Helianthus annuus L.) es dependiente

de concentración. Así, el SNP (nitroprusiato sódico) a una concentración del 0,1 M

retrasa la senescencia mientras que a 400 M la induce (Selçukcan and Cevahir,

2008).

Recientemente se ha descrito cómo el uso de una mezcla sólida formada por

dietilentriamina-óxido nítrico (DETANO), que libera NO, aumenta la vida post-cosecha

de determinadas hortalizas (Wills et al., 2007).

A día de hoy existe un consenso sobre cómo el NO interviene en gran cantidad

de funciones biológicas durante el crecimiento, desarrollo, respuesta a señales

medioambientales e incluso en la respuesta inmune en plantas (Delledonne et al., 2001;

Neill et al., 2008a; Airaki et al., 2012; Begara-Morales et al., 2013). Los cambios

locales en el estado redox celular o subcelular afectan a varios aspectos de la fisiología

de las plantas, al igual que ocurre en mamíferos. A pesar de que en los últimos 15 años

se han llevado a cabo numerosos e importantes descubrimientos en la biología del NO,

aún quedan importantes cuestiones referentes a dicha molécula. No sólo el

descubrimiento del gen que codifica la NOS en plantas superiores, sino cuáles son las

rutas de señalización completas en las que esta molécula y sus derivados intervienen y

por tanto, cual es su papel global durante el desarrollo de las plantas (Yu et al., 2014).

Capítulo 2

93

RESULTADOS

Capítulo 2

94

2.1.- Detección de proteínas nitradas en extractos crudos de pimiento

Mediante western blotting se ha estudiado el patrón de las proteínas nitradas en

extractos crudos de pimiento verde y rojo, observándose un total de 10 bandas

immunoreactivas predominantes, con un tamaño molecular aparente comprendido entre

89 y 25 kDa. Dicho análisis mostró cómo la intensidad de las bandas polipeptídicas de

tamaño 79, 63, 44 y 25 kDa aumentaba en los frutos rojos con respecto a los verdes.

Además las bandas de tamaño 89, 50, 32 y 28 Kda eran exclusivas de frutos rojos,

mientras que las bandas corespondientes a los tamaños 70, 72 y > 90 kDa aparecen sólo

en los frutos verdes (Figura 2.1).

Figura 2. 1: Patrón de proteínas nitradas en extractos

crudos de pimiento verde y rojo. Se cargaron 30 g de

proteínas que fueron sometidas a EGPA-SDS en geles

preparados al 12% de poliacrilamida. A continuación las

proteínas nitradas fueron detectadas mediante western

blotting, en membrana de PVDF, usando un anticuerpo

policlonal frente a la 3-nitrotirosina de conejo en

dilución 1:8.000. Se usó BSA nitrada (NO2-BSA) como

control positivo. Los valores que se muestran a la

derecha corresponden a los tamaños estimados de las

principales bandas inmunoreactivas detectadas. PV:

pimiento verde, PR: pimiento rojo.

2.2.- Análisis de las proteínas nitradas mediante electroforesis bidimensional (2-D)

e inmunoblot

Mediante electroforesis bidimensional (2-D), se ha estudiado el patrón de las proteínas

nitradas en extractos de fruto de pimiento verde y rojo en muestras previamente

concentradas con acetona al 70% (v/v, volumen final), usando un anticuerpo frente a la

3-nitrotirosina. Para ello se realizaron dos réplicas de cada muestra. El primer gel fue

teñido con el compuesto fluorescente Sypro Ruby y analizado posteriormente con el

programa bioinformático PDQuest, mientras que el segundo gel fue transferido a una

membrana de nitrocelulosa e incubado con el anticuerpo anteriormente indicado. Los

resultados de ambos geles se compararon y los puntos coincidentes entre uno y otro

fueron los seleccionados para estudios proteómicos posteriores. En fruto de pimiento

Capítulo 2

95

verde fueron reconocidos 15 polipéptidos por el anticuerpo frente a la nitrotirosina y

en fruto de pimiento rojo fueron reconocidos 14 polipéptidos (Figuras 2.2, 2.3 y 2.4).

Figura 2.2: Imagen representativa de electroforesis 2-D correspondiente al extracto crudo de fruto de

pimiento verde. 60 g de proteínas fueron sometidas a electroforesis bidimensional y a continuación el

gel fue teñido con el compuesto fluorescente Sypro Ruby (BioRad). A la izquierda se indican los

marcadores de peso molecular y en la parte superior el pH correspondiente a la primera dimensión. Sobre

el gel se indican los polipéptidos que reconocían el anticuerpo frente a la 3-nitrotirosina (ver Figura 4)

Capítulo 2

96

Figura 2.3: Imagen representativa de electroforesis 2-D correspondiente al extracto de fruto de pimiento

rojo. 60 g de proteínas fueron sometidas a electroforesis bidimensional y a continuación el gel fue teñido

con el compuesto fluorescente Sypro Ruby (BioRad). A la izquierda se indican los marcadores de peso

molecular y en la parte superior el pH correspondiente a la primera dimensión. Sobre el gel se indican los

polipéptidos que reconocían el anticuerpo frente a la 3-nitrotirosina (ver Figura 4)

Capítulo 2

97

Figura 2.4: Inmunoblot representativo correspondiente a proteínas nitradas de frutos de pimiento verde y

rojo. 60 g de proteínas fueron sometidas a electroforesis bidimensional y posteriormente transferidas a

una membrana de nitrocelulosa, la cual fue incubada con un anticuerpo frente a la 3-nitrotirosina diluido

1:8.000. A) Fruto de pimiento verde; B) Fruto de pimiento rojo.

2.3. Identificación de proteínas nitradas y análisis mediante MALDI-TOF/TOF

Mediante análisis por espectrometría de masas a partir de los polipéptidos seleccionados

se identificaron un total de 9 proteínas nitradas entre los frutos de pimiento verde y rojo,

aunque cuatro de ellas se corresponden con variantes de catalasa. En la Tabla 2.1 se

indican algunas características moleculares de dichas proteínas, además del número de

acceso de cada una de ellas en la base de datos Uniprot y su integración en grupos

funcionales.

Capítulo 2

98

Tabla 2.1: Los extractos de proteínas concentradas de fruto de pimiento verde y rojo (Capsicum annuum

L.) fueron sometidos a electroforesis bidimensional y posterior inmunoblot con anticuerpo frente a la 3-

nitrotirosina. Las proteínas identificadas fueron analizadas por espectrometría de masas (MALDI-TOF)

tras su digestión con tripsina. MASCOT fue el motor de búsqueda elegido para identificar las proteínas

desde secuencias primarias lanzadas en bases de datos. Un valor mayor del 99% en el intervalo de

confianza de la puntuación asignada por MASCOT (protein score C.I %) indica una elevada probabilidad

de que la proteína haya sido correctamente identificada. Pep.count: número de péptidos identificados;

MW: peso molecular; pI: punto isoeléctrico. Acc.no/Uniprot: identificación de la proteína en la base de

datos Uniprot.

Proteína

identificada

Tipo de

fruto

Acc.no/

Uniprot

Protein Score

CI%/pep.count

MW/pI Grupo

funcional

Gliceraldehido 3-

fosfato

deshidrogenasa

dependiente de

NADP (putativa)

Verde D7U1A1 100/7 53824,7/6,76 Metabolismo

redox

Transcetolasa 1 Verde O78327

100/18 80397,7/6,16 Metabolismo

de

carbohidratos

Subunidad tipo alfa

proteasomal

Verde Q8H1Y2

100/8 30142,9/5,07 Metabolismo

de proteínas

Catalasa, isoenzima

1

Verde P49319

100/14 57301,4/6,6 Metabolismo

redox

Catalasa, isoenzima

2

Verde P49316

100/9 57317,6/6,75 Metabolismo

redox

Catalasa Verde y

rojo

Q9M5L6

100/8 56957,4/7,31 Metabolismo

redox

Catalasa Rojo P55311

100/26 57097,5/6,86 Metabolismo

redox

Glutamato sintasa 1

dependiente de

ferredoxina

(putativa)

Rojo B5LAU8

99.9/17 179205,1/6,1

1 Biosíntesis de

glutamato

Proteína portadora

en la enfermedad de

Graves (putativa)

Rojo B9RQR8

99.9/11 37639,8/9,84 Transporte a

través de

membrana

(metabolismo

oxidativo)

Capítulo 2

99

2.4. Nitración de catalasa

Teniendo en cuenta que la catalasa y algunas de sus variantes aparecen como la

principal proteína nitrada tanto en frutos verdes como en rojos, se llevó a cabo un

análisis in vitro del efecto de la nitración de esta proteína mediante el empleo de SIN-1

(3-morpholinosydnonimine). El efecto de este compuesto sobre la actividad enzimática

de la catalasa se muestra en la figura 2.5. El tratamiento con SIN-1, a una concentración

2 mM, produjo un descenso pronunciado de la actividad enzimática, tanto en frutos

verdes como en rojos. Los resultados presentados en esta figura coinciden, por otro

lado, con los obtenidos anteriormente que mostraban que la actividad catalasa es mayor

en frutos verdes que en rojos (Mateos et al., 2003). Esto se correspondía, además, con

nuestros datos de inmunoblot que revelaban un mayor reconocimiento en los

peroxisomas verdes con el anticuerpo policlonal frente a catalasa (Figura 2.5).

Figura 2.5: Efecto del SIN-1 en la actividad catalasa de frutos de pimiento. Los extractos crudos de

frutos verdes y rojos se incubaron en ausencia y en presencia de SIN-1 2 mM, determinándose

posteriormente la actividad catalasa (gráfico). Se llevaron también a cabo ensayos de inmunoblotting en

frutos verdes y rojos, usando un anticuerpo frente a una secuencia consenso interna de la catalasa de

pimiento (foto superior).

Capítulo 2

100

DISCUSIÓN

Capítulo 2

101

El NO es un gas radical que se genera de manera natural en las células. El óxido nítrico

no sólo actúa como importante molécula señal en animales sino que en plantas

interviene en ciertos momentos del crecimiento y del desarrollo, e incluso en respuestas

a estrés (Beligni et al., 2002; Zafra et al., 2010). Así, se ha descrito que el NO es

considerado como una molécula señal clave relacionada con las respuestas de defensa

frente a estrés tanto biótico como abiótico (Delledonne et al., 2001; Neill et al., 2008a;

Corpas et al., 2011; Airaki et al., 2012) y por su papel como regulador del crecimiento,

del desarrollo, la inmunidad y de las interacciones con el medioambiente (Yu et al.,

2014). El NO participa en procesos tales como la germinación de semillas (Beligni et

al., 2002) y desarrollo de las flores (He et al., 2004; Lee et al., 2008; Kwon et al.,

2012), crecimiento y desarrollo de raíces (Corpas et al., 2007; Fernández-Marcos et

al., 2011; Kwon et al., 2012; Yu et al., 2014) y senescencia (Corpas et al., 2004;

Corpas et al., 2006a; Procházková and Wilhelmova, 2011; Begara-Morales et al.,

2013; Khan, 2014). En este trabajo se ha descrito el efecto que tiene el NO sobre la

maduración de los frutos de pimiento para así ampliar el conocimiento y utilizarlo como

estrategia de cultivo y/o post-cosecha en el futuro. De hecho, en trabajos realizados

recientemente en nuestro laboratorio se ha demostrado que el NO retrasa la maduración

de los frutos de pimiento y se ha propuesto un modelo sobre cómo están relacionados

ambos eventos (Chaki et al., 2015).

Se sabe cómo el NO afecta a la biosíntesis de etileno y se ha descrito el papel

antagónico de ambos gases (Procházková and Wilhelmova, 2011). De hecho, el NO

afecta la producción de etileno en Arabidopsis thaliana como consecuencia de la S-

nitrosilación de la metionina adenosíltransferasa, una enzima implicada en la síntesis de

la S-adenosílmetionina, precursos del etileno (Lindermayr et al., 2006). Algunos

trabajos pioneros en este campo revelaron que la adición exógena de NO en forma

líquida (como SNP, NONOato o como nitrosoglutation, GSNO), y no como gas,

producían un retraso en la senescencia de flores y hojas, así como en maduración de

frutos de plátano (Leshem and Pinchasov, 2000). La maduración de los frutos es un

proceso controlado genéticamente, que está asociado a la senescencia de las plantas en

el que normalmente se produce un aumento en la generación de especies de oxígeno

reactivo (ROS). De hecho, los pimientos maduros presentan una tasa de peroxidación

lipídica superior al de pimientos verdes (Martí et al., 2011). Sin embargo, en esta

Capítulo 2

102

Memoria Doctoral se demuestra la correlación existente entre la maduración de frutos

de pimiento con un aumento en el número de proteínas nitradas.

La nitración de las tirosinas de las proteínas es una modificación post-traduccional

mediada por el NO que puede causar alteraciones en las funciones de las mismas

(Corpas et al., 2013c). Tradicionalmente se ha usado la nitración como marcador de

estrés nitrosativo en células animales y de plantas (Ischiropoulos, 2003; Chaki et al.,

2009b; Corpas et al., 2009c; Airaki et al., 2012). Teniendo en cuenta que la

maduración de los frutos es un complejo proceso en el desarrollo de los mismos que

conlleva una gran cantidad de cambios tanto a nivel fisiológico como bioquímico

(Palma et al., 2011b), se ha pretendido establecer la relación existente entre dicho

proceso y el posible nivel de estrés al que quedan sometidas las células durante la

maduración, usando para ello como parámetro la nitración de las proteínas. Mediante un

anticuerpo frente a la nitrotirosina se detectaron las proteínas nitradas en extractos de

frutos de pimiento verde y rojo. El estudio mostró cómo aparece un mayor número de

proteínas nitradas en pimiento rojo (maduro) que en pimiento verde. Las proteínas

nitradas se identificaron mediante análisis proteómicos y se vio que la mayoría de ellas

estaban relacionadas con el metabolismo oxidativo y, en menor medida, con el

metabolismo de carbohidratos y del glutamato. La poca información disponible sobre el

genoma del pimiento dulce y las limitaciones en la ejecución de los análisis es lo que

hace que el número de proteínas identificadas sea considerablemente bajo.

En muestras de fruto verde se identificó la gliceraldehido-3-fosfato

deshidrogenasa dependiente de NADP (EC 1.2.1.9), que es una enzima perteneciente

a la familia de las aldehído deshidrogenasas, las cuales poseen una importante función

generadoras de NADPH en las rutas biosintéticas

(http://www.uniprot.org/uniprot/Q1WIQ6 y referencias incluidas en este portal). En el

caso de frutos de pimiento esta enzima debe jugar un papel crucial, ya que se ha

demostrado que el NADPH y otras deshidrogenasas están relacionadas con procesos de

maduración (Mateos et al., 2009). Se ha descrito también cómo esta enzima es

susceptible de nitración en plántulas de Arabidopsis thaliana (Lozano-Juste et al.,

2011).

La transcetolasa (EC 2.2.1.1) cataliza dos reacciones opuestas, en el ciclo de

Calvin, y en el de las pentosas fosfato, pero además produce 4fosfo-eritrosa que es el

Capítulo 2

103

precursor de la ruta del siquimato lo que inicia el metabolismo de los fenilpropanoides

(Flechner et al., 1996; Henkes et al., 2001). Los fenilpropanoides son una importante

clase de metabolitos secundarios que participan en la estructura celular de las plantas,

defensa y mecanismos de señalización (Dixon and Paiva, 1995). Estos compuestos

derivan de aminoácidos aromáticos que son sintetizados mediante la ruta del siquimato

en los plastidios (Henkes et al., 2001). Teniendo en cuenta el papel de la transcetolasa

en la fotosíntesis, nuestros resultados indican que ésta podría ser un punto de regulación

en la transición de cloroplastos a cromoplastos que acompañe a la pérdida del aparato

fotosintético durante la maduración de los frutos. También se ha descrito cómo la

transcetolasa es potencialmente nitrada en plántulas de Arabidopsis thaliana (Lozano-

Juste et al., 2011).

Recientemente, se ha demostrado que la oxidación de las proteínas es una

consecuencia de la maduración de los frutos de pimiento (Martí et al., 2011). La

glutamato sintasa 1 dependiente de ferredoxina, (EC 1.4.7.1; también denominada

Fd-GOGAT; http://www.uniprot.org/uniprot/Q9ZNZ7), que se encontró en frutos de

pimiento rojo, es una enzima cloroplastídica responsable de la biosíntesis del glutamato

en hojas y que se necesita para la reasimilación del ión amonio generado durante la

fotorrespiración, así como para la asimilación del nitrógeno primario (Coschigano et

al., 1998; Jamai et al., 2009; Potel et al., 2009). La fotorrespiración ocurre en tres

orgánulos distintos, cloroplastos, peroxisomas y mitocondrias. A pesar de que la

fotorrespiración está asociada a los tejidos verdes en plantas, esta ruta metabólica

funciona también en frutos de pimiento rojos como ya se demostró en estudios de las

enzimas fotorrespiratorias glicolato oxidasa e hidroxipiruvato reductasa realizados en

peroxisomas purificados a partir de frutos de pimiento (Mateos et al., 2003). Por tanto,

los resultados mostrados en este trabajo aportan evidencias sobre la modulación de la

provisión de metabolitos desde la fotorrespiración en frutos de pimiento rojo maduro a

nivel de la Fd-GOGAT.

La proteína transportadora de la enfermedad de Graves es una proteína que

se localiza a nivel de la membrana mitocondrial interna y que pertenece a la familia de

proteínas transportadoras de metabolitos (incluidos traslocadores de ADP/ATP, un

transportador fosfato y una proteína desacopladora del ión hidrógeno) y que se

requieren para la acumulación del coenzima A en la matriz mitocondrial (Prohl et al.,

Capítulo 2

104

2001). Esta proteína es reconocida por la IgG en pacientes que padecen la enfermedad

de Graves, que es una trastorno autoinmune en humanos y que su homología en plantas

no se había descrito hasta ahora.

La catalasa aparece como la proteína nitrada más abundante. En estudios

pioneros sobre el perfil de la catalasa en peroxisomas aislados tanto de frutos de

pimiento verde como rojo, se observó una actividad de esta enzima que era inferior en

los frutos maduros (Mateos et al., 2003). Los resultados aquí aportados evidencian que

esta reducción no sólo se debe a un contenido menor en catalasa en frutos de pimiento

rojo, sino a la nitración potencial que ocurre durante el proceso de maduración en estas

especies. La disminución de catalasa en frutos rojos implica una menor capacidad para

eliminar H2O2, lo que conlleva el aumento de peroxidación lipídica ya descrito en frutos

de pimiento maduros (Martí et al., 2011).

Otro polipéptido cuya nitración se ha detectado en frutos verdes es la subunidad

alfa del proteasoma 20S. La nitración de la esta subuindad proteasomal que ocurre en

frutos de pimiento verde indica el papel de este sistema en la maduración de los frutos

de pimiento, como ya se discutió en el capítulo anterior.

Por tanto, los resultados presentados en esta memoria constituye un hito importante en

el metabolismo de las RNS en frutos de plantas superiores durante el proceso de

maduración. Sin embargo, serían necesarios estudios complementarios para profundizar

el cómo el metabolismo del NO influye en el conjunto de procesos que transforman de

verde a rojo los frutos, en plantas de pimiento.

105

ÍT 3: F

X

F T T (Capsicum

annuum .): X

T F ÁT .

Capítulo 3

106

T

Capítulo 3

107

OBJETIVO: Estudio de la implicación del metabolismo de los peroxisomas en la

maduración del fruto de pimiento mediante aproximaciones novedosas, concretamente

proteómica y bioinformática.

Uno de los principales acontecimientos que tuvo lugar durante la evolución fue la

subdivisión de las células eucarióticas en compartimentos subcelulares limitados por

membranas para optimizar las funciones fisiológicas. Cada compartimento celular

desempeña unas funciones propias y, por lo tanto, las células deben ser capaces de

dirigir cada proteína a su orgánulo correspondiente (Gould et al., 1988). Para

comprender la compartimentalizacion de las rutas metabólicas y de transducción de

señales, los proteomas de los orgánulos celulares deben ser definidos en toda su

complejidad (Lingner et al., 2012). De manera general los estudios de proteómica no

solo generan listas completas de proteínas sino que también manifiestan la abundancia

de éstas y su actividad. Nuevos avances en bioquímica, en espectrometría de masas y

sobre todo en bioinformática han aumentado considerablemente el número de proteínas

identificadas, sus modificaciones post-traduccionales y su ubicación dentro de la célula.

En este capítulo nos centraremos en el impacto que ha tenido el progreso en estas

técnicas sobre la composición proteica subcelular y más concretamente a nivel de los

peroxisomas (Saleem et al., 2006).

Hace años se acordó el concepto de “atlas proteico” en particular para la

descripción del proteoma humano (http://www.proteinatlas.org/). Este concepto

relaciona la creación de listas de proteínas para cada órgano y localización subcelular,

además proporciona información adicional sobre las modificaciones post-

traduccionales, empalme alternativo de proteínas (alternarive splicing), etc.

Actualmente dichas listas se están ampliando para generar el proteoma de las distintas

especies de plantas en las que exista información sobre los diferentes órganos y

estructuras subcelulares (van Wijk and Baginsky, 2011).

Proteoma de orgánulos subcelulares

Los plastidios son los orgánulos de la célula vegetal que llevan a cabo las funciones

más esenciales en el metabolismo de la planta. Dentro de estas se incluyen la

Capítulo 3

108

fotosíntesis, la biosíntesis de aminoácidos y ácidos grasos, así como la síntesis de

numerosos metabolitos secundarios (van Wijk and Baginsky, 2011). Es por ello que el

proteoma de los plastidios y en particular de los cloroplastos ha sido objeto de atención

en los últimos años y de hecho son los orgánulos celulares mejor caracterizados a nivel

proteico. Se calcula que el tamaño del proteoma de los plastidios oscila entre las 2.000 y

3.500 proteínas en Arabidopsis. Sin embargo, sólo se han descrito como proteínas

plastidiales alrededor de 1.200. Las razones por las que se ha subestimado este número

es: a) que se trate de proteínas poco abundantes o que su detección se vea “ocultada”

por otras proteínas fotosintéticas; b) que se expresen de manera diferencial en algunos

tipos de plastidios y no en cloroplastos; c) que sólo se expresen bajo determinadas

condiciones; o d) que sean altamente ionizables, es decir, que se dividan en sus péptidos

con facilidad. Existen distintas bases de datos tales como AtProteome (http://gator.

mascproteomics.org/), PPDB (http://ppdb.tc.cornell.edu), AT_CHLORO (http://www.

grenoble.prabi.fr/at_chloro/), etc. que aportan información sobre proteínas plastidiales

de Arabidopsis y de otras especies de plantas, además de información peptídica y

modificaciones post-traduccionales entre otras (Armbruster et al., 2011; van Wijk and

Baginsky, 2011).

El núcleo es el centro de regulación de las células eucarióticas. Es un sistema

dinámico que actúa como almacén de varias macromoléculas y que sirve como

modulador de señales de vital importancia para la célula. Las proteínas nucleares

constituyen del 10 al 20% del total de las proteínas celulares y forman una red compleja

que juega un importante papel durante el desarrollo y otros procesos fisiológicos. En

plantas, poco se sabe sobre la naturaleza de los componentes moleculares y sobre los

mecanismos implicados en la coordinación de la síntesis de proteínas nucleares así

como sobre su acción y función; por lo tanto los estudios de proteómica son necesarios

para ayudarnos a comprender las bases moleculares de la función nuclear (Narula et al.,

2013). Hasta la fecha el número de proteínas del núcleo descritas varía en función de las

especies (Tabla 3.1), y hay que destacar que la descripción del proteoma nuclear de

animales está bastante avanzado con respecto al de levaduras y plantas.

Capítulo 3

109

Tabla 3.1: Comparación de los distintos proteomas nucleares.

Especie Proteínas descritas Referencias

Hombre 1.868 (Salzano et al., 2006; Henrich et al., 2007)

Ratón 1.548 (Buhr et al., 2008)

Drosophila 282 (Varma and Mishra, 2011)

Levaduras 328 (Gauci et al., 2009)

En plantas se ha abordado el estudio del proteoma nuclear en Arabidopsis (Bae

et al., 2003), Medicago (Repetto et al., 2008; Repetto et al., 2012), soja (Cooper et al.,

2011), garbanzo (Pandey et al., 2006; Pandey et al., 2008), Xerophyta viscosa

(Abdalla and Rafudeen, 2012), y pimiento (Lee et al., 2006a) (Fig. 3.1). Dentro de las

monocotiledóneas el arroz es la especie con un mayor número de proteínas nucleares

descritas (Choudhary et al., 2009).

Figura 3.1: Número de proteínas identificadas en distintas especies de plantas mediante la

comparación de sus proteomas nucleares.

Las mitocondrias son los orgánulos responsables de procesos bioquímicos

esenciales para las células de plantas como son la fosforilación oxidativa y la

fotorrespiración. Tradicionalmente su principal papel fue la oxidación de ácidos

orgánicos mediante el ciclo de los ácidos tricarboxílicos y la síntesis de ATP unida a la

transferencia de electrones al O2 que se produce en la membrana, proceso denominado

respiración. Más recientemente se ha descrito su papel en la síntesis de muchos

metabolitos como aminoácidos, lípidos y vitaminas. Además contienen un gran número

de transportadores por lo que pueden intercambiar metabolitos con el citosol y con otros

orgánulos. Asimismo las mitocondrias poseen un genoma propio que de manera activa

Capítulo 3

110

transcribe y traduce proteínas que están coordinadas con las proteínas codificadas en el

núcleo para producir grandes enzimas funcionales en el orgánulo. Para poder descifrar

los distintos tipos de metabolismo en los que están implicadas las mitocondrias, se ha

empleado mucho esfuerzo en describir el perfil proteico de las mismas tanto de plantas

de cultivo como de plantas modelo. Para poder obtener unos resultados satisfactorios

sobre el proteoma de las mitocondrias, es necesario partir de muestras de orgánulos

aislados de alta calidad, además de contar con técnicas de proteómica de alta resolución

para así poder identificar, cuantificar y diferenciar el grado de contaminación con otros

orgánulos y compartimentos celulares (Huang et al., 2014). Hasta la fecha menos del

30% del total de proteínas existentes que se suponen como mitocondriales han sido

verificadas experimentalmente mediante proteómica y/o estudios de localización con

proteínas de fusión que portan GFP (green fluorescent protein) (Lee et al., 2013).

Arabidopsis thaliana se convirtió en el primer sistema modelo de plantas una

vez que su genoma fue completamente secuenciado en 2000 (The Arabidopsis Genome

Initiative, 2000). En los últimos años se ha avanzado tremendamente mediante el uso de

aproximaciones experimentales y bioinformáticas en la descripción del proteoma total

de esta planta modelo. Una gran parte de las proteínas mitocondriales descritas se han

basado en estudios con secuencias diana en el extremo N-terminal de las mismas. A

continuación se muestra un esquema de las 726 proteínas mitocondriales identificadas

hasta el momento clasificadas en las distintas categorías funcionales en Arabidopsis

(Lee et al., 2013).

Figura 3.2: Proteínas mitocondriales de Arabidopsis clasificadas en las distintas categorías funcionales.

Capítulo 3

111

Proteoma de peroxisomas

Desde que se descubrieron los peroxisomas hace más de 50 años, numerosos estudios

han reflejado la implicación de estos orgánulos en distintas rutas metabólicas. Los

peroxisomas están involucrados en diferentes reacciones oxidativas estrictamente

controladas, de manera que la célula pueda adaptarse a las condiciones cambiantes del

medio en el que se encuentra y, como respuesta a distintas señales, pueden variar de

manera drástica en número, forma, tamaño y metabolismo (Smith and Aitchison,

2013). La mayor parte de la información disponible a día de hoy sobre las enzimas

peroxisomales ha sido obtenida mediante aproximaciones tradicionales, como ensayos

de cinética y uso de anticuerpos específicos, los cuales se llevaban a cabo en

peroxisomas purificados o en fracciones enriquecidas en peroxisomas (Palma et al.,

2009b). Dichas aproximaciones tradicionales han permitido aclarar las principales rutas

metabólicas y las funciones celulares en las que los peroxisomas se encuentran

implicados; sin embargo existen limitaciones en estos estudios y por lo tanto son

necesarias otras técnicas que las complementen, técnicas proteómicas por ejemplo, que

permitan la identificación del total de proteínas de los peroxisomas, así como para la

caracterización de las modificaciones post-traduccionales de las mismas (Saleem et al.,

2006; Palma et al., 2009b).

En plantas existe mucha menos información proteómica disponible comparada

con la de animales y levaduras, esto se debe, principalmente, a las dificultades que

existen a la hora de purificar los peroxisomas a partir del material vegetal. En plantas el

número de peroxisomas por células es considerablemente menor que en animales, y

además se produce una elevada contaminación por otras estructuras celulares como

cloroplastos, mitocondrias y vacuolas en los protocolos de purificación de los

orgánulos. Todo ello, por tanto, hace que el número total de peroxisomas purificados

disminuya considerablemente por los métodos tradicionales de biología celular (Palma

et al., 2009b).

La proteómica experimental se enfrenta a obstáculos a la hora de detectar

proteínas peroxisomales que aparecen solamente de manera transitoria en estos

orgánulos, y para ello es necesario complementar dichas aproximaciones con los

estudios bioinformáticos de predicción de proteínas, basados en la aparición de los PTS

Capítulo 3

112

(peroxisomal targeting signals) que a su vez serán complementados con estudios de

localizacion subcelular (Kaur and Hu, 2011). Todas estas herramientas son esenciales

para definir el proteoma de los orgánulos y comprender así los sistemas metabólicos y

reguladores que rigen los mismos (Nair and Rost, 2008; Xu et al., 2009; Chowdhary

et al., 2012). La proteómica experimental además, nos permite investigar los cambios

que ocurren en las células durante el desarrollo, durante la diferenciación celular o

durante las condiciones desfavorables del medio, entre otros (Palma et al., 2009b).

Teniendo en cuenta la importancia médica y biológica de los peroxisomas, la

bioinformática ha asumido el importante reto de identificar proteínas peroxisomales a

partir de la secuencia aminoacídicas en una estrategia de tipo in silico (Emanuelsson et

al., 2003).

Como los peroxisomas no poseen un sistema propio de síntesis de proteínas,

éstas son importadas desde el citoplasma, desde donde son dirigidas mediante señales

peptídicas (PTSs; peroxisomal targerting signals) que determinan su liberación en los

peroxisomas (Lazarow and Fujiki, 1985; Hayashi et al., 1997; Reumann, 2004). Las

PTSs, así como las rutas de señalización, se mantienen conservadas en gran medida en

los eucariotas, de manera que los estudios bioinformáticos pueden ayudar a describir las

PTSs de tipo 1 y 2 mediante comparación con los ya descritos en otras especies. No se

conoce ninguna proteína que a la vez contenga PTS1 en una especie y un PTS2 en otra;

sin embargo, si una determinada proteína es dirigida al peroxisoma por una PTS1 (o

PTS2), todos los ortólogos de esa proteína poseerán también una PTS1 (o PTS2)

(Reumann, 2004).

En plantas, la determinación de la secuencia de las PTS1 se empezó a elucidar

en los años 90 (Banjoko and Trelease, 1995) por ejemplo el grupo de Dr. Nishimura

estableció que dicha secuencia en las proteínas peroxisomales de la matriz estaba en el

extremo C-terminal y correspondía a un tripéptido de la forma SACPKRLMI, lo

que generaba 24 posibles tripéptidos para las PTS1 en plantas superiores (Hayashi et

al., 1997). Basado en estos trabajos previos Reumann y colaboradores (Reumann,

2004), mediante estudios bioinformáticos, elaboraron un algoritmo para definir la

secuencia consenso responsable de dirigir las proteínas a los peroxisomas (Figura 3.3).

En primer lugar, obtuvieron de las bases de datos 391 secuencias con PTS1 conocidos

en las distintas especies de plantas. De todas ellas estudiaron cuáles se correspondían

Capítulo 3

113

con las secuencias establecidas por Hayashi et al., 1998, a las que denominaron con el

término general de “tripéptidos PTS1 canónicos” y en función de eso, las caracterizaron

como: PTS1 mayoritarios (SRL, SRM, SRI, SKL, SKM, ARL, ARM,

AKL, PRL) que eran aquellos que estaban presentes en al menos 10 secuencias y en

3 grupos ortólogos distintos y PTS1 minoritarios (SKI, PRM, PKL, CRL, CKL)

que eran los que aparecían con una frecuencia menor a 10 secuencias y 3 grupos

ortólogos. Además existían tripéptidos que sólo aparecían en una secuencia (AKI,

CRM, CRI) y otros que no se detectaban (AKM, ARI, PKM, PRI, PKI,

CKM, CKI) y, por lo tanto, no indicaban señalización a peroxisomas. De todos estos,

Reumann estableció que la secuencia de los PTS1 mayoritarios SARKLM (sin

AKM, pero con SRI y PRL) representaban las secuencias de localización

peroxisomal más fiables y se correspondían con el 84% de los PTS1 existentes. Además

existen otras secuencias de “tripéptidos PTS1 no canónicos” que no estaban incluidos

en las secuencias de Hayashi et al., 1998 y que se definían como minoritarios en

función a su frecuencia (SRV, SNL, SNM, ANL, SML, SSM) (Reumann,

2004).

Figura 3.3: Definición de los tripéptidos PTS1 mayoritarios y minoritarios de proteínas

peroxisomales de plantas superiores (Reumann, 2004).

Capítulo 3

114

Por otro lado, alrededor de un tercio del total de proteínas peroxisomales

contienen un PTS2 en el extremo N-terminal que se corresponden con el tipo

RKLVI-x5-HQLA y se trata de un nonapéptido que es degradado

proteolíticamente una vez que entra en el orgánulo (Brown and Baker, 2003;

Reumann et al., 2007; Palma et al., 2009b). Al igual que para los PTS1, en primer

lugar se procedió a la recuperación de secuencias de PTS2 conocidos de plantas en las

bases de datos y, como con los PTS1 y en función a su frecuencia se clasificaron en

mayoritarios (RLx5HL y RIx5HL) y minoritarios (RQx5HL, RTx5HL, RMx5HL,

RAx5HL, RVx5HL, RLx5HI, RIx5HI, RAx5HI, RLx5HF) e incluso un único

nonapéptido (RLx5HV) (Figura 3.4).

Figura 3.4: Definición de los nonapéptidos PTS2 mayoritarios y minoritarios de proteínas

peroxisomales de plantas superiores (Reumann, 2004).

A partir del conocimiento de las secuencias generales de los PTS1 y PTS2 se

pueden investigar los ortólogos de cualquier especie de planta, identificando para ello el

máximo número de cDNAs homólogos, o el máximo número de secuencia EST

(expressed sequence tag) que contengan el extremo C- o N- terminal, y de ahí analizar

la existencia de las secuencias peptídicas de direccionamiento peroxisomal.

Sin embargo, cabe destacar que existe otro grupo de proteínas peroxisomales

que han sido menos estudiadas que no poseen ni PTS1 ni PTS2 y que son las proteínas

Capítulo 3

115

integrales de la membrana de peroxisomas, de las cuales la información disponible es

muy escasa (Mullen et al., 1999; Hu et al., 2012).

Como conclusión se puede decir que el uso de la proteómica, además de otras

herramientas como la bioinformática, permitirán en un futuro próximo caracterizar a los

peroxisomas, últimos orgánulos descubiertos en biología celular, como elementos

dinámicos, funcionales y polivalentes en las células (Palma et al., 2009b).

Capítulo 3

116

RESULTADOS

Capítulo 3

117

3.1 Purificación de peroxisomas de frutos de pimiento verde y rojo tipo California

Los peroxisomas fueron purificados a partir de frutos de pimiento verde y rojo,

mediante centrifugaciones diferenciales y en gradientes de densidad de sacarosa (Figura

3.5)

Figura 3.5: Método de aislamiento y purificación de peroxisomas de frutos de pimiento mediante

centrifugaciones diferenciales y en gradientes de densidad de sacarosa. Las matrices peroxisomales

fueron separadas de las membranas (PMP) por choque osmótico y se concentraron por ultrafiltración.

3.2 Análisis del proteoma de peroxisomas de frutos de pimiento mediante

electroforesis bidimensional (2-D)

Mediante electroforesis bidimensional (2-D) se ha estudiado el patrón de proteínas de

los peroxisomas de fruto de pimiento verde y rojo (Figura 3.2). Los geles fueron teñidos

con el compuesto fluorescente Sypro-Ruby y el análisis de los spots se realizó con el

programa bioinformático PDQuest. Mediante este sistema se marcaron los spots

diferenciales de cada tipo de fruto así como la diferencia de intensidad de los

coincidentes (Figura 3.6).

Capítulo 3

118

Figura 3.6: Imagen de geles correspondientes a matrices concentradas de peroxisomas de fruto de

pimiento verde (A) y rojo (B). Las proteínas (100 g) se separaron por electroforesis bidimensional y,

posteriormente, los geles fueron teñidos con el compuesto fluorescente Sypro Ruby (BioRad). A la

izquierda se indican los marcadores de peso molecular y en la parte superior el pH correspondiente a la

primera dimensión. IEE muestra la dirección del isoelectroenfoque.

Capítulo 3

119

Figura 3.7: Imagen de gel correspondiente a la superposición de los dos anteriores en el que se han

señalado las proteínas que presentaron diferencias de intensidad en peroxisomas de fruto de pimiento

verde y rojo.

3.3 Identificación de proteínas y análisis mediante MALDI-TOF/TOF

Las proteínas seleccionadas fueron analizadas por espectrometría de masas (MALDI-

TOF) tras su digestión con tripsina. MASCOT fue el motor de búsqueda elegido para

identificar las proteínas desde secuencias primarias lanzadas en bases de datos. Un valor

mayor de 99% en el intervalo de confianza de la puntuación asignada por MASCOT

(protein score C.I %) indica una elevada probabilidad de que la proteína haya sido

identificada correctamente (Tabla 3.2). Además, las proteínas se han clasificado en

función de los grupos funcionales a los que pertenecen y se han señalado otras posibles

localizaciones subcelulares, según consta en la literatura (Tabla 3.3).

Capítulo 3

120

Tabla 3.2: Proteínas identificadas en peroxisomas de fruto de pimiento verde y rojo. Los peroxisomas de

fruto de pimiento verde y rojo (Capsicum annuum L.) fueron sometidos a electroforesis bidimensional.

Las proteínas fueron analizadas por espectrometría de masas (MALDI-TOF) tras su digestión con

tripsina. MASCOT fue el motor de búsqueda elegido para identificar las proteínas desde secuencias

primarias lanzadas en bases de datos. Un valor mayor del 99% en el intervalo de confianza de la

puntuación asignada por MASCOT (protein score C.I %) indica una elevada probabilidad de que la

proteína haya sido correctamente identificada. Pep.ident., número de péptidos identificados; PM, peso

molecular; pI, punto isoeléctrico. Nº acceso/Uniprot: identificación de la proteína en la base de datos

Uniprot.

Proteína Identificada Nº

acceso/Uniprot

Protein Score

CI%/pep.ident.

PM/pI

Malato

deshidrogenasa

O81279

100/6 27545,4/5,56

Superóxido dismutasa

(Fe)

Q6X1D0

100/4 27919/6,53


(Fe)

Q7YK44

100/6 27893/6,6


(Mn)

O49066

100/8 25610,2/8,39

Catalasa Q9M5L6

100/25 56957,4/7,31

Fosfoglicerato quinasa O81394

99.994/9 50594/7.68

Aminometiltransferasa O23936

99.916/11 44655,9/8,87

Formato

deshidrogenasa

Q07511

100/16 42094,6/6,64

Aconitasa Q84TR4

99.993/14 98635/6,07

Proteína de tipo

quinesina de cadena

pesada

Q9FKP4

99.986/19 140880,3/5,91

Esterasa/lipasa

tioesterasa

Q2HUX9

99.723/10 42088,5/9,18

Aldehído

deshidrogenasa

Q8LST4

100/9 59520.9/6.65

3-cetoacil-CoA

tiolasa1

Q8LF48

99.483/5 49067,2/8,78

6-4 fotoliasa Q52Z99

99.899/13 67551,4/9,51

Aspartato

aminotransferasa

Q2XTE6

99.512/11 50998,1/8,64

Capítulo 3

121

Tabla 3.3: Clasificación de las proteínas identificadas en los peroxisomas de fruto de pimiento verde y

rojo en función del grupo funcional al que pertenecen. Además se indican otras posibles localizaciones

subcelulares de las mismas.

Proteína identificada Otras

localizaciones

subcelulares

posibles

Grupo funcional

Malato deshidrogenasa Mitocondria Metabolismo de carbohidratos y malato

Ciclo de los ácidos tricarboxílicos

Superóxido dismutasa (Fe) Cloroplasto Metabolismo oxidativo

Superóxido dismutasa (Mn) Mitocondria Metabolismo oxidativo

Catalasa - Metabolismo oxidativo

Fosfoglicerato kinasa Citoplasma Glicólisis

Aminometiltransferasa Mitocondria Catabolismo de glicina

Formato deshidrogenasa Mitocondria Metabolismo redox

Aconitasa - Ciclo del glioxilato y

del ácido cítrico

Proteína de tipo quinesina

de cadena pesada

Microtúbulos

Citosol

Acumulación en

cloroplastos

Esterasa/lipasa

tioesterasa

- Metabolismo lipídico

Aldehído deshidrogenasa Mitocondria Metabolismo lipídico

3-cetoacil-CoA tiolasa 1 - Biosíntesis y metabolismo de ácidos

grasos

Metabolismo lipídico

Síntesis de lípidos

Biosíntesis de oxilipinas

6-4 fotoliasa - Reparación de ADN

Aspartato aminotransferasa - Procesos de biosíntesis

Metabolismo de aminoácidos

3.4 Análisis in silico del proteoma de peroxisomas

Este trabajo se realizó durante una estancia en el laboratorio de la Dra. Sigrun Reumann

de la Univesidad de Stavanger, Noruega. Para este estudio se tuvieron en cuenta 100

proteínas de Arabidopsis que portaban el tripéptido PTS1 (peroxisomal targeting signal

de tipo 1). En base a ello se estableció la existencia de posibles ortólogos de dichas

proteínas en Capsicum annuum con sus PTS1 correspondientes, basándonos en dos

algoritmos distintos (PWM, pulse-width modulation, y RIR, room impulse response).

De todas las proteínas analizadas, seleccionamos las más interesantes, bien porque se

tenía poca información sobre su función e integración dentro del metabolismo

peroxisomal o porque eran inducidas por estrés, para posteriormente desarrollar el

análisis experimental. Las proteínas seleccionadas, junto con su PTS1 respectivo fueron

las siguientes:

Capítulo 3

122

Proteínas Tripéptido C-terminal

Arabidopsis thaliana

Tripéptido C-terminal

Capsicum annum

AT1G61680 SLM> SML>

AT2G38760 SKI> AKV>

AT3G14660 HKL> RKL>

AT3G46170 SSL> SSL>

Las principales características de estas proteínas en Arabidopsis se detallan a

continuación en la Tabla 3.4.

Tabla 3.4: Funciones principales y localización subcelular descrita hasta el momento de las proteínas

seleccionadas AT1G61680, AT2G38760, AT3G46170 y AT3G14660.

Para cada proteína candidata, y haciendo uso del programa BLAST del NCBI

(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), se realizaron dos aproximaciones

bioinformáticas para corroborar el resultado de las analogías:

1. Usando la proteína de Arabidopsis thaliana, como secuencia problema se hizo

un alineamiento frente proteínas de Capsicum annuum para determinar posibles

ortólogos.

2. A continuación se realizó un alineamiento entre la secuencia EST (expressed

sequence tag) traducida (cortada en el extremo C-terminal) de Capsicum

annuum, frente a proteínas de pimiento en general, para así poder confirmar las

proteínas candidatas.

Proteína Proceso biológico Función molecular Localización subcelular

AT1G61680 Procesos metabólicos

Biosíntesis de mono-

terpenos y

terpenoides

- Actividad S-linalool sintasa

- Unión de iones de magnesio

- Actividad terpeno sintasa

Citosol, mitocondrias,

plastidios

AT2G38760

Respuesta al frío, al

calor, al estrés salino

y a sequía

Unión de iones calcio y de

fosfolípidos dependientes de

calcio

Citosol, mitocondrias,

núcleo

AT3G46170

Respuesta a cadmio Actividad oxidorreductasa Citosol, plastidios, núcleo,

peroxisomas, mitocondrias,

membrana plasmática

AT3G14660

Procesos de

oxidación-reducción

Unión de oxígeno Citosol. retículo

endoplasmático, aparato de

Golgi, plastidios,

mitocondrias, membrana

plasmática

Capítulo 3

123

Haciendo un rastreo por las bases de datos, NCBI, TAIR-The Arabidopsis Information

Resource (https://www.arabidopsis.org) y el programa de localización subcelular

SUBA3 (http://suba3.plantenergy.uwa.edu.au/), podemos establecer la siguientes

consideraciones generales de las proteínas seleccionadas.

3.4.1. At1g61680 (Terpeno sintasa 14, TPS14 o S-lynalool sintasa). Es una proteína de

Arabidopsis thaliana, con una secuencia de 569 aminoácidos. Esta proteína está

relacionada con procesos de biosíntesis de terpenoides, que son algunos de los

compuestos volátiles que emiten las flores en los casos en los que los insectos son los

vectores para la polinización (aunque las flores de Arabidopsis poseen en la mayor parte

de los casos fecundación autógama). No existen evidencias de la localización de esta

proteína en peroxisomas, pero sí en citosol, mitocondrias y en plastidios.

3.4.2. At2g38760 (ANN3, ANNAT3, ATANN3 o anexina 3). Es una proteína que en

Arabidopsis thaliana tiene una secuencia de 321 aminoácidos. Las anexinas son

proteínas que se unen al calcio citosólico y que actúan en respuesta a distintos tipos de

estrés medioambiental, frío, calor, salinidad y sequía. A nivel subcelular se localizan a

nivel de citosol, mitocondria y núcleo.

3.4.3. At3g14660 (Citocromo P450, familia 72, subfamilia A, polipéptido 13,

CYP72A13 o citocromo P450 putativo). Es una proteína de Arabidopsis thaliana, con

una secuencia de 512 aminoácidos. Esta proteína está relacionada con procesos de

oxidación-reducción y tiene varias localizaciones subcelulares a nivel de citosol,

retículo endoplasmático, aparato de Golgi, plastidios, mitocondria y membrana

plasmática.

3.4.4. At3g46170. Es una proteína de Arabidopsis thaliana, con una secuencia de 512

aminoácidos. Esta proteína actúa en respuesta a iones de cadmio y tiene actividad

óxido-reductasa. A nivel subcelular se localiza en citosol, plastidios, núcleo,

peroxisomas, mitocondrias y membrana plasmática.

Capítulo 3

124

En el anexo I se incluye una explicación detallada de las distintas aproximaciones

bioinformáticas, para cada proteína. En base al análisis de los algoritmos

bioinformáticos, que en todos los casos generaban resultados similares siguiendo las dos

aproximaciones empleadas, se obtuvieron las siguientes conclusiones:

1. Para la proteína AT1G61680, se corrobora que existe una proteína ortóloga en

Capsicum annuum que probablemente tendrá una localización peroxisomal

determinada por un PTS1 del tipo SML>, y que se correspondería con una

epiaristoloqueno sintasa o una sesquiterpeno ciclasa.

2. Asimismo, en Capsicum annuum existe una proteína ortóloga a la proteína

AT2G38760 que es muy probable que tenga una localización peroxisomal

determinada por un PTS1 del tipo AKV> y que se corresponda con una anexina.

3. Para la proteína AT3G14660, efectivamente existe una proteína ortóloga en

Capsicum annuum que con alta probabilidad tendrá una localización

peroxisomal determinada por un PTS1 del tipo RKL> y que posiblemente sea

del tipo citocromo P450 y, en menor medida, una p-cumarato hidroxilasa.

4. Por último, para la proteína AT3G46170, existe igualmente una proteína

ortóloga en Capsicum annuum que probablemente tenga una localización

peroxisomal determinada por un PTS1 del tipo RKL>., pudiendo atribuirse a

una proteína portadora de acilo 3-oxoacil reductasa.

Capítulo 3

125

Capítulo 3

126

Los frutos son exclusivos de las plantas fanerógamas y juegan un papel central en la

maduración de las semillas y en su dispersión. El estudio exhaustivo del proceso de

maduración ha despertado gran interés debido, sobre todo, a la importancia que tienen

los frutos en nuestra dieta (Wang et al., 2014). Para ampliar el conocimiento sobre los

mecanismos reguladores que subyacen al proceso de maduración, se ha llevado a cabo

la identificación del proteoma total de los peroxisomas de los frutos de pimiento, para,

de esta forma, comprender las funciones fisiológicas de estos orgánulos subcelulares.

La comparación entre el proteoma de peroxisomas de frutos de pimiento verdes

y rojos no demostró diferencias significativas, lo que indica que las mismas rutas

metabólicas operarían en los dos momentos del proceso de maduración. Por tanto a

continuación, se hará una discusión sobre las proteínas identificadas de forma común

en estos orgánulos y que pudieran ejercer una función en los peroxisomas.

La malato deshidrogenasa es una enzima propia de los peroxisomas (Reumann,

2002), cuya presencia en los frutos de pimiento quedó manifiesta en el análisis del

proteoma completo de los mismos que se mostró en el capítulo 1. La catalasa es el

marcador enzimático por excelencia de los peroxisomas (del Río, 2013) y ha sido

efectivamente identificado por MALDI-TOF/TOF en los orgánulos aislados de

pimiento verde y rojo, lo que confirma el importante papel de esta proteína en el

metabolismo celular a lo largo del proceso de maduración, como ya había sido

propuesto anteriormente (Mateos et al., 2003).

Con respecto a las superóxido dismutasas, en peroxisomas se ha identificado

la presencia de la Mn-SOD tanto en frutos verdes y rojos mediante nuestro análisis

proteómico, lo cual coincide con estudios anteriores de actividad de la enzima y de

transferencia de western en peroxisomas purificados a partir de los frutos (Mateos et

al., 2003). Recientemente mediante técnicas bioquímicas, se ha descrito también la

presencia de una Mn-SOD en los cromoplastos en una variedad de pimiento cuyos

frutos maduros viran a amarillo (Martí et al., 2009). Este evento, aunque también se ha

corroborado por estudios proteómicos (Barsan et al., 2012; Wang et al., 2013a) no es

un hecho común en estos orgánulos. Mateos y colaboradores (2003) no encontraron

actividad Fe-SOD en peroxisomas de fruto de pimiento, lo que contrasta con nuestros

resultados sobre el proteoma de los peroxisomas en ambos tipos de frutos. La Fe-SOD

generalmente se localiza en cloroplastos aunque la presencia de esta isoenzima en

Capítulo 3

127

peroxisomas ya había sido descrita en pétalos de clavel (Droillard and Paulin, 1990).

No obstante, esta es la única referencia hasta la fecha que haya asignado también una

localización de una Fe-SOD en peroxisomas vegetales. Estos datos, junto con los que

apuntan a la presencia de la CuZn-SOD en peroxisomas de plantas (Bueno et al., 1995;

del Río et al., 2003b; Sandalio et al., 2013) refuerzan la plasticidad metabólica del

metabolismo peroxisomal en plantas que es capaz de albergar todos los tipos de SODs

eucarióticas tanto en la matriz o bien ligada a la membrana peroxisomal, a diferencia de

lo observado en el resto de orgánulos celulares vegetales o en peroxisomas animales o

de levaduras. Como se muestra en el capítulo 1 (tabla 1.2) tanto la catalasa como la

SOD ya habían sido detectadas en el proteoma global de los frutos, lo que nos da una

idea de la abundancia relativa de estas enzimas.

La fosfoglicerato quinasa (PGK; EC 2.7.2.3) cataliza la primera reacción de

fosforilación a nivel de sustrato de la glucólisis, sintetizando ATP a partir del 1,3

bifosfoglicertato y ADP. Además también está implicada en el último paso de la

fijación de CO2 en plantas (Joao and Williams, 1993; Bowler, 2013). En plantas, se

han identificado diversas isoformas de PGK que se han localizado en el citosol y el

cloroplastos (Bayer et al., 2011; Troncoso-Ponce et al., 2013). No se puede descartar,

por tanto, la posible contaminación por plastos en las muestras de peroxisomas, aunque

la identificación de esta proteína en estos orgánulos, tanto en frutos verdes como en

rojos, que muestran un perfil plastídico tan diferente, podría ser un elemento de valor a

tener en cuenta a la hora de asignar la localización de la PGK. Por otro lado, se ha

descrito la presencia de una PGK en glicosomas de Trypanosoma brucei (Peterson et

al., 1997; Blattner et al., 1998), un orgánulo enmarcado comúnmente en el grupo de

los microcuerpos, donde también se encuadra a los peroxisomas (Parsons et al., 2001).

La enzima aminometiltransferasa o subunidad T (EC 2.1.2.10) es una de las

cuatro proteínas que forman parte del complejo glicina descarboxilasa (GDC). Las otras

proteínas constituyentes de este complejo son: la proteína L (dihidrolipoamida

deshidrogenasa), la proteína P (glicina deshidrogenasa) y la proteína H que es la

responsable de la interacción de las otras 3 proteínas. Este sistema es esencial en células

animales para la degradación de glicina, ya que se activa cuando las concentraciones de

este aminoácido son elevadas (Okamura-Ikeda et al., 2010). En plantas, la GDC es un

componente indispensable en la ruta de la fotorrespiración encargada de la

Capítulo 3

128

transformación de glicina en serina (Reumann, 2002). En la fotorrespiración toman

parte los cloroplastos, los peroxisomas y la mitocondrias en una serie de etapas

enzimáticas que comparten metabolitos de una forma muy activa, ya que van

transfiriéndose de unos orgánulos a otros (Reumann and Weber, 2006) (Heldt et al.,

1998; Hagemann et al., 2013). La GDC se localiza en mitocondrias, usando la glicina

que se genera en los peroxisomas con producción de serina vuelve al peroxisoma para

continuar el ciclo de la fotorrespiración. La unión funcional de peroxisomas y

mitocondrias en la fotorrespiración podría ser la responsable de esta falsa identificación

poisitiva.

La aconitasa (EC 4.2.1.3) es una enzima que cataliza la isomerización del

citrato a isocitrato, como parte de metabolismo de la célula implicado en el ciclo de

Krebs. Se ha descrito cómo la inhibición de la actividad de la aconitasa mitocondrial, en

un momento temprano del desarrollo de los frutos, conlleva un aumento de la acidez

mientras que un aumento de la actividad de la aconitasa citosólica provoca una

disminución de la misma (Degu et al., 2011). La acidez de la fruta es un índice de

maduración de la misma que aumenta con el proceso de desarrollo y que comienza a

disminuir una vez que el fruto ha madurado y comienza a envejecer (Etienne et al.,

2013). La aconitasa ha sido identificada en mitocondrias de fruto de pimiento rojo

(Camejo et al., 2015). No obstante, en plántulas se Arabidopsis se ha comprobado que

la isoforma ACO3 está más asociada al catabolismo del citrato a través del ciclo del

glioxilato peroxisomal que al catabolismo mitocondrial de este ácido (Hooks et al.,

2014). De alguna forma, esta unión funcional podría ser también la responsable la

presencia de la aconitasa en nuestras muestras de peroxisomas.

Las quinesinas (EC 3.6.4.4) son una familia de proteínas motoras que median el

transporte intracelular sobre los microtúbulos, que son componentes del citoesqueleto

(Ganguly and Dixit, 2013). Además juegan un importante papel durante la mitosis,

morfogénesis y transducción de señales. Este tipo de proteínas se encuentra distribuidas

en todas las organismos eucarióticos (Li et al., 2012). Las quinesinas han sido descritas

en peroxisomas (Hamada et al., 2013) donde podrían participar en los movimientos de

estos orgánulos (Kural et al., 2005; Rodríguez-Serrano et al., 2014)

Las aldehído deshidrogenasas (ALDH; EC 1.2.1.3) son un grupo de enzimas

que catalizan la oxidación de los aldehídos a ácidos carboxílicos usando NAD/NADH

http://es.wikipedia.org/wiki/Prote%C3%ADna

http://es.wikipedia.org/wiki/Microt%C3%BAbulo

Capítulo 3

129

como coenzimas. Estas proteínas modulan varias funciones celulares, tales como la

proliferación y la diferenciación celular o respuestas frente a estrés oxidativo, entre

otras. Existen muchas isoformas de las aldehído deshidrogenasas en prácticamente

todos los organismos y su localización subcelular es variada (Muzio et al., 2012). Se ha

identificado distintas isoformas a nivel de peroxisomas en Arabidopsis thaliana

(Missihoun et al., 2011) así como en cebada (Fujiwara et al., 2008).

Una esterasa es una enzima hidrolasa que rompe los enlaces éster en los

correspondientes alcoholes y ácidos por medio de una hidrólisis. También hay que tener

en cuenta que algunas enzimas que catalizan la hidrólisis de ésteres pueden catalizar

reacciones de transesterificación. Tras la hidrolización de ésteres, los ácidos grasos

comienzan a degradarse. Debido a la relación existente entre ácidos grasos y procesos

de desarrollo y senescencia celular, se han identificado alrededor de 60 lipasas que

aumentan con la senescencia (Troncoso-Ponce et al., 2013). La asociación de las

lipasas con los peroxisomas es un evento común dado que en tejidos que presentan

cuerpos lipídicos se necesita la acción de una lipasa que genere los ácidos grasos que

son procesados por la -oxidación peroxisomal. Recientemente se ha demostrado la

localización de una triacilglicerol lipasa (SPD1) en las membranas de peroxisomas de

plántulas jóvenes de A. thaliana (Thazar-Poulot et al., 2015).

Capítulo 3

130

Figura 3.8: Enzimas de las fotorrespiración de la b-oxidación de ácidos grasos y del ciclo del glioxilato

identificadas en peroxisomas mediante análisis proteómico. En color azul se indican las enzimas que se

han detectado y son propias del peroxisoma y en rojo, las que, aún habiéndose descrito en otros

orgánulos, nuestros resultados indican que también se podrían localizar en estos orgánulos. Previo a la b-

oxidación, la lipasa (LIP), localizada en los cuerpos lipídicos libera los ácidos grasos contenidos que se

activan por una acil-CoA sintetasa ubicada en la membrana de este orgánulo de almacén. Posteriormente

el acil-CoA entra en la espiral de la b-oxidación donde actúa la tiolasa (TIO) generando acetil-CoA, que

se incorporará al ciclo del glioxilato. El ciclo del glioxilato implica la conversión de citrato en isocitrato

por la acción de una aconitasa (ACO), si bien la localización de esta enzima sólo se ha descrito

fehacientemente en el citosol y en mitocondrias. El glicolato producido en el cloroplasto como

consecuencia de la actividad oxigenasa de la RuBisCo inicia la ruta fotorrespiratoria viajando al

peroxisoma, donde es oxidado a glioxilato y H2O2 por la glicolato oxidasa. El glioxilato se convierte en

glicina y la glicina, en la mitocondria, y ésta se transforma en serina, por acción del complejo glicina

descarboxilasa (GDC). La serina, a su vez, entra en el peroxisoma donde sufre las transformaciones

necesarias para integrarse de nuevo en el ciclo de la fotorrespiración. El H2O2 producido en los

peroxisomas por acción de diversas oxidasas es degradado por la catalasa (CAT). Por otro lado, el radical

superóxido, que es un metabolito común de los peroxisomas, es dismutado hasta H2O2 por la superóxido

dismutasa (SOD).

La β-oxidación es un proceso metabólico esencial en las células eucarióticas.

Tradicionalmente, esta ruta catabólica ha sido considerada en plantas como la vía

principal de degradación de ácidos grasos en las células. Sin embargo, en los últimos

años, la β-oxidación de plantas está siendo objeto de un gran interés científico por su

implicación en funciones relacionadas con el desarrollo y la defensa. En plantas, la β-

oxidación ocurre específicamente en peroxisomas a diferencia de los animales en los

que se desarrolla en mitocondrias. La familia de las 3-cetoacil-CoA tiolasas (EC 2. 3.

1. 16) son las enzimas que actúan en el paso final de la β-oxidación liberando el acetil-

Capítulo 3

131

CoA como producto final de la ruta. Dicho acetil-CoA es metabolizado a través del

ciclo del glioxilato y de la gluconeogénesis para dar lugar a sacarosa que proporciona la

energía ncesaria para el crecimiento de la planta y su desarrollo (Baker et al., 2006).

Esta enzima se ha comprobado que posee un PTS2 en el extremo N-terminal para su

entrada en peroxisomas (Johnson and Olsen, 2003). Mediante la técnica de

transferencia de western, empleando un anticuerpo frente a la tiolas, se detectó en

nuestro laboratorio la presencia de esta enzima en peroxisomas purificados a partir de

frutos de pimiento verdes y rojos (Mateos et al., 2003).

La biosíntesis de aspartato está propiciada por la aspartato aminotransferasa

(AST; EC 2.6.1.1) que cataliza la transaminación reversible entre el glutamato y el

oxalacetato para generar aspartato y 2-oxoglutarato, principalmente en el proceso de

fotorrespiración de plantas C4. La importancia del aspartato radica en que actúa como

precursor de otros aminoácidos esenciales como lisina, treonina, metionina e isoleucina

en plantas superiores (de la Torre et al., 2014). Se ha descrito que esta enzima está

localizada tanto en el citosol como en la mitocondria (Offermann et al., 2011). Las

aminotransferasas fotorrespiratorias que se han descrito en peroxisomas son del tipo

glioxilato aminotransferasa (Liepman and Olsen, 2001).

Las formato deshidrogenasas (FDH; EC 1.2.1.2/1.2.2.1) son un conjunto de

enzimas que llevan a cabo la oxidación de formato hasta CO2, empleando NAD (EC

1.2.1.2) o citocromo c3+

como aceptores de electrones. Esta enzima se ha detectado en

cloroplastos y mitocondrias de hojas de A. Thaliana (Herman et al., 2002), y en

pimiento se ha caracterizado la isoforma FDH 1 en las mitocondrias. Dicha enzima está

implicada en la regulación de la muerte celular y la respuesta de defensa frente a

patógenos bacterianos (Choi du et al., 2014). La detección de esta enzima en los

peroxisomas es anómalo, aunque es un hecho nada extraño en levaduras donde existen

una asociación entre el metabolismo del formato y estos orgánulos (Yurimoto et al.,

2004; van Zutphen et al., 2010).

Como se ha podido comprobar, la mayoría de las proteínas detectadas en los

peroxisomas de frutos de pimiento son o tienen vinculación funcional con estos

orgánulos, según se desprende de los datos bibliográficos. Sin embargo, nuestros datos

aportan discrepancias sobre la localización descrita hasta el momento para algunas

enzimas. Está claro que durante el proceso de purificación de los orgánulos se pueden

Capítulo 3

132

arrastrar algunas contaminaciones, aunque está descrito que en el procedimiento llevado

a cabo en este trabajo tiene contaminaciones cruzadas con otros orgánulos muy bajas

(Mateos et al., 2003). Por tanto, es recomendable confirmar la presencia de dichas

proteínas en los peroxisomas mediante diversas estrategias como la inmunolocación con

oro coloidal y el empleo de anticuerpos específicos, o técnicas de microscopía de

fluorescencia usando proteínas recombinantes, entre otras alternativas.

Como se ha podido comprobar, la mayoría de las proteínas detectadas en los

peroxisomas de frutos de pimiento son o tienen vinculación funcional con estos

orgánulos, según se desprende de los datos bibliográficos. Sin embargo, nuestros datos

aportan discrepancias sobre la localización descrita hasta el momento para algunas

enzimas. En la Figura 3.8 se muestra un esquema con algunas de las proteínas que se

han detectado tras el análisis proteómico de los peroxisomas, pero que anteriormente

habían sido descritas en otros orgánulos. Está claro que durante el proceso de

purificación de los orgánulos se pueden arrastrar algunas contaminaciones, aunque está

descrito que el procedimiento llevado a cabo en este trabajo tiene contaminaciones

cruzadas con otros orgánulos muy bajas (Mateos et al., 2003). Por tanto, es

recomendable confirmar la presencia de dichas proteínas en los peroxisomas mediante

diversas estrategias como la inmunolocación con oro coloidal y el empleo de

anticuerpos específicos, o técnicas de microscopía de fluorescencia usando proteínas

recombinantes, entre otras alternativas. En última instancia, es reseñable destacar que

las proteínas que anteriormente no habían sido descritas en peroxisomas y sí en otros

orgánulos llevan a cabo una función en rutas metabólicas en las que participan los

peroxisomas: así ocurre con la LIP de los cuerpos proteicos, la GDC de la

fotorrespiración y la ACO que transforma el citrato en isocitrato.

Validación de modelos de predicción

Para estudiar las funciones de los peroxisomas en el proceso de maduración, como

momento de “crisis celular” debido al aumentos de ROS y RNS, se hizo un estudio

previo de las posibles proteínas que portaban una PTS1 y que, además, contaran con

funciones descritas relacionadas con la defensa de plantas frente a patógenos y a otro

tipo de estreses.

Capítulo 3

133

La bioinformática es una disciplina cuyos objetivos son la comprensión de los

procesos biológicos y el análisis de grupos complejos de datos y de bases de datos

usadas en biología molecular, manejando archivos que proceden de distintas áreas en

las que están almacenados de modo eficaz y uniforme y que son de uso público para la

comunidad científica.

En esta Tesis y mediante dos algoritmos distintos (PMW y RI) se identificaron

varias proteínas peroxisomales de fruto de pimiento que portaban un tripéptido PTS1

en el extremo carboxílico. Además dichos modelos de predicción tienen en cuenta a

proteínas poco abundantes de manera que el número de posibles candidatas aumenta.

Nuestras proteínas seleccionadas, AT1G61680, AT2G38760, AT3G14660 Y

AT3G46170, eran ortólogas de aquellas de Arabidopsis ya descritas. A pesar de que

aparentemente las secuencias proteicas contienen la secuencia correspondiente a un

PTS1 en el extremo C-terminal, el siguiente paso en su estudio sería la localización

subcelular de las mismas en las células de la planta y para ello sería necesaria la

clonación de los genes en vectores con extremos fluorescentes y la transformación

posterior en células de epidermis de cebolla. Con ello, se comprobaría si efectivamente

las proteínas selecionadas poseen localización peroxisomal, determinada por la

presencia en su secuencia de un PTS1. Estos modelos de predicción han sido ya

corroborados con resultados positivos por el (Lingner et al., 2012)grupo de la Profesora

Sigrun Reumann (Reumann, 2011a; Reumann et al., 2012), en cuyo laboratorio se

desarrolló esta parte de esta Tesis Doctoral.

134

DISCUSIÓN GENERAL

Discusión general

135

El objetivo principal del trabajo que se presenta en esta Memoria Doctoral se ha

centrado en el estudio de la maduración de los frutos de pimiento (Capsicum

annuum L.), así como en los procesos biológicos que están implicados en el control de

esta compleja fase de su ciclo de vida y, por consiguiente, de la calidad de los frutos

maduros que llegan a los mercados. Todo ello deriva de la importancia que este fruto

posee tanto a nivel económico, como a nivel nutricional. Dicho objetivo general se ha

abordado mediante una aproximación proteómica, con el propósito de conocer las

proteínas y, por tanto, los genes que se expresan de manera diferencial durante el

proceso de maduración. Se han empleado diversos abordajes proteómicos, lo que

confiere a este trabajo una riqueza, una singularidad y un carácter innovador apenas

aplicados en la fruticultura actual. Además del proteoma global de los frutos, se han

estudiado las proteínas modificadas post-traduccionalmente mediante proteómica

funcional, en concreto nitro-proteómica, para así desvelar las rutas metabólicas que

tienen una regulación positiva y/o negativa mediada por especies de nitrógeno reactivo

(RNS) durante el proceso de maduración. Existen otras formas de analizar el proteoma

funcional de muestras biológicas como puede ser el estudio de las proteínas oxidadas

(oxi-proteoma), proteínas fosforiladas (fosfo-proteoma) o proteínas glicosiladas (glico-

proteoma). En nuestro caso, como ya se ha indicado, y por cuestiones meramente

logísticas sólo hemos podido acometer la investigación del nitro-proteoma de los frutos.

El óxido nítrico es un gas radical que se produce de manera endógena en las células de

las plantas, con efectos diversos sobre los procesos fisiológicos de las mismas, incluida

la germinación, la respuesta frente a patógenos y a estrés abiótico, entre otros. La

adición de donantes externos de NO permite valorar el comportamiento de las proteínas

frente a este agente, así como su interacción con el metabolismo de las especies de

oxígeno reactivo (ROS, reactive oxygen species).

Para llevar a cabo este proyecto se han analizado no sólo los frutos enteros, sino

fracciones celulares de los mismos, en este caso, peroxisomas, por ser estos orgánulos

fuentes importantes de antioxidantes implicados en la respuesta frente al estrés

oxidativo y nitrosativo. La investigación del sub-proteoma de los peroxisomas es un

complemento más que nos permite profundizar en más detalle en los cambios

metabólicos que se suceden en la maduración. En conexión con nuestro objetivo se ha

Discusión general

136

desarrollado en paralelo el perfil del proteoma de las mitocondrias durante la

maduración de los frutos de pimiento. Se ha abordado proteoma completo de la

mitocondria (Álvarez de Morales et al., 2011) así como el oxi-proteoma de dichos

orgánulos durante la maduración de los frutos (Camejo et al., 2015). Todo ello deriva

de la necesidad fundamental de conocer las características nutricionales y beneficiosas

que esta materia prima puede aportar a la dieta humana, para, de esta forma, poder

desarrollar herramientas biotecnológicas que permitan su mejora, y además poder

ofrecérselos a los consumidores en el momento más saludable delciclo de vida del

producto.

En la Figura 10 se muestran algunas de las estrategias más importantes para el

análisis del proteoma en muestras vegetales. En la investigación realizada en esta Tesis

Doctoral se han analizado los frutos completos, así como los peroxisomas purificados a

partir de los mismos mediante la combinación de electroforesis bi-dimensional y

MALDI/TOF. En el caso del nitro-proteoma se siguió la estrategia de combinar la

electroforesis 2-D con la técnica de detección de proteínas específicas (nitradas) con

anticuerpos frente a la nitro-tirosina (transferencia de western) y el análisis por MALDI-

TOF de las proteínas inmunoreactivas. En esta Tesis, además, se ha desarrollado una

aproximación bio-informática que permite predecir la localización de algunas proteínas

en los peroxisomas de los frutos, basándonos en otras que portan un PTS1 depositadas

en las bases de datos.

Discusión general

137

Figura 10: Estrategias para el estudio del proteoma en muestras vegetales (basado en (Palma et al.,

2009b)).

Como se observa en la Figura 11, que representa la clasificación de las proteínas

identificadas en frutos verdes y rojos de pimiento, en base a la clasificación de Bevan

(Bevan et al., 1998). A nivel de fruto completo podemos destacar cómo el mayor

número de proteínas identificadas (alrededor del 25%) tanto en fruto verde como en

fruto rojo están ralacionadas con el metabolismo oxidativo de las células., Esto nos

indica que la maduración está asociada a importantes cambios redox en los que

participan enzimas antioxidantes fundamentalmente para contrarrestar las alteraciones

metabólicas que ocurren durante este proceso. Otros grupos importantes de proteínas

que se afectan son aquellas relacionadas con el metabolismo de las proteínas, sobre todo

las que poseen actividad proteolítica. En realidad durante la maduración de los frutos, el

recambio proteico es muy considerable ya que se produce el desmantelamiento de

estructuras pre-existentes y síntesis de nuevas (Palma et al., 2011b). Por tanto, es

lógico pensar que el metabolismo de las proteínas tendrá un marcado papel en la

maduración. En el caso de los frutos verdes también destaca el grupo de proteínas

Discusión general

138

implicadas en el metabolismo de aminoácidos. Éste es un aspecto relevante para el fruto

y, por consiguiente, para la nutrición, por el papel que desempeñan éstos, no sólo como

elementos constituyentes de nuevas proteínas que se van a sintetizar, sino también como

fuente para otros metabolismos como es la síntesis de glutatión u otros péptidos

pequeños que puedan tener funciones importantes en la estabilidad de los frutos, etc.

Discusión general

139

Figura 11: Histograma de los grupos funcionales, según clasificación de Bevan (Bevan et al., 1998) en

los que se encuadran las proteínas identificadas por 2-D y MALDI/TOF-TOF de frutos verdes (A) y rojos

(B) de pimiento.

Esta estrategia de estudiar el proteoma de los frutos para avanzar en el

conocimiento de la maduración de los mismos ha sido empleada en los últimos años en

un buen número de especies, entre las que se incluyen la vid, el tomate, kiwi, mango,

naranja, melocotón, etc. (Palma et al., 2011b)y referencias incluidas; (Kambiranda et

al., 2014; Pan et al., 2014; Wu et al., 2014; Fraige et al., 2015; Jiang et al., 2015).

El estudio del nitro-proteoma se ha acometido por la relevancia que tiene el NO

y las especies derivadas (RNS) en la transducción de señales que regulan la mayoría de

los procesos metabólicos (Corpas et al., 2008a; Corpas and Barroso, 2014). Según

nuestros resultados la nitración de proteínas es un evento relevante en la maduración de

los frutos de pimiento, pero sería también de interés acometer las MPT originadas por

S-nitrosilación, una modificación de las proteínas que es reversible y en la que participa

el S-nitrosoglutatión (Corpas et al., 2013a). El análisis in vitro del efecto que tanto la

nitración como la S-nitrosilación ejercen sobre algunas proteínas permite conocer

exactamente las modificaciones estructurales que sufren y que son las responsables, en

última instancia, de la mayor o menor actividad enzimática que muestran en cada

situación (Begara-Morales et al., 2014). Igualmente sería de gran interés estudiar el

oxi-proteoma completo, ya que nos proporcionaría una imagen más global de los

eventos que se suceden durante la maduración. Como ya es reconocido, las proteínas

oxidadas son destruidas normalmente por sistemas proteolíticos. El relevante papel que

juegan las proteasas durante la maduración, como se indicó anteriormente, hace que esta

ruta sea un objetivo a tener en cuenta en los próximos estudios.

Aplicado a la biología celular, el análisis de los proteomas de los orgánulos

proporciona un conocimiento profundo de la dinámica del metabolismo celular,

incluyéndose las interacciones entre orgánulos, el tránsito de moléculas, los procesos de

señalización intracelulares, etc. Permite, además, amplificar los datos obtenidos en el

proteoma global de las muestras y que, por cuestiones de concentración o de abundancia

relativa de las proteínas, podría hacer indetectables a algunas de ellas. A nivel de

plastidios, la conversión de cloroplastos en cromoplastos está asociada al

desmantelamiento de las rutas fotosintéticas y la aparición de rutas implicadas en el

Discusión general

140

metabolismo de carotenoides. La investigación del proteoma plastídico se ha

documentado ampliamente en los último años, así como su evolución durante los

cambios en distintas etapas del desarrollo y maduración de los frutos (Egea et al., 2011;

Barsan et al., 2012; Nogueira et al., 2012; Wang et al., 2013b; Renato et al., 2014).

En este contexto hay que destacar los studios realizados sobre el proteoma de

cromoplastos de frutos de pimiento (Ytterberg et al., 2006; Wang et al., 2013a).

Por el contrario, los proteomas de mitocondrias y peroxisomas están menos

estudiados. En esta Tesis se documenta por primera vez el proteoma de los peroxisomas

de frutos de pimiento durante la maduración. Se siguió desde una estrategia estándar de

separación de proteínas por electroforesis 2-D seguida de análisis de espectrometría de

masa, a una nueva fórmula que detecta proteínas candidatas en base a análisis de

secuencia in silico, pero que ha de corroborarse con ensayos in vitro con proteínas

recombinantes o métodos alternativos. En cualquier caso, nuestros resultados aportan

evidencias de la presencia en los peroxisomas de proteínas hasta ahora no asociadas a

estos orgánulos. Por tanto, estas aproximaciones resultan ser de gran calado ya que nos

proporciona nuevos elementos a tener en cuenta en la biología celular y en la fisiología

molecular de la maduración.

141

Conclusiones

142

- En esta Tesis Doctoral se constata que los estudios proteómicos son una gran

herramienta para analizar los cambios metabólicos que se producen durante la

maduración de los frutos de variedades comerciales de pimiento dulce. Así, los datos de

proteómica obtenidos son consistentes, e indican que, en base a la abundancia relativa

de las proteínas, en la maduración de los frutos intervienen de manera fundamental el

metabolismo oxidativo y el relacionado, sobre todo, con la degradación proteica,

fenómenos que son fundamentales, si tenemos en cuenta las grandes transformaciones

metabólicas que sufre el fruto de pimiento.

2.- Los datos obtenidos en el análisis del proteoma de los peroxisomas complementan y

afinan aún más los observados en el estudio del proteoma global de los frutos. Así, se

corrobora la función preeminente que desarrollan la catalasa y las superóxido

dismutasas, enzimas propias del metabolismo del orgánulo, pero además nuestros datos

enfatizan la relevancia de las rutas metabólicas del peroxisoma durante la maduración,

habida cuenta de que parecen coexistir la fotorrespiración, la β-oxidación de ácidos

grasos y el ciclo del glioxilato a largo de todo el proceso, algo que no se había

observado hasta la fecha en otros órganos vegetales.

3.- Por otro lado, la detección de ciertas proteínas en el proteoma de los peroxisomas,

que hasta la fecha estaban asimiladas a otros orgánulos, abre de nuevo el debate sobre la

verdadera localización subcelular de algunas proteínas, sobre todo aquéllas que

participan en rutas metabólicas compartidas entre varios compartimentos celulares.

4.- El análisis del nitro-proteoma, que permite detectar las proteínas que han sufrido la

nitración de algunas de sus tirosinas, revela que esta modificación post-traduccional,

propiciada probablemente por el peroxinitrito, es un evento consustancial a la

maduración de los frutos de pimiento, donde la catalasa parece jugar un papel central.

143

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Anexo I.1

179

ANEXO I.1

Análisis bioinformático para la proteína de Arabdopsis thaliana At1g61680

El número de acceso en la base de datos UNIPROT para A. thaliana corresponde a

Q84UV0. A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos de esta proteína y su

PTS1 marcado en rojo, obtenido del NCBI.

1 MALIATKISS RSCFVSAYPN NSPTFLISKF PNTVDSLSPA NTAKRSILRN VHASVSNPSK

61 QFHNKTSLEY LHELNIKKIK NILSANVDVP SENLEMIDVI QSLGIDLHFR QEIEQTLHMI

121 YKEGLQFNGD LHEIALRFRL LRQEGHYVQE IIFKNILDKK GGFKDVVKND VKGLTELFEA

181 SELRVEGEET LDGAREFTYS RLNELCSGRE SHQKQEIMKS LAQPRHKTVR GLTSKRFTSM

241 IKIAGQEDPE WLQSLLRVAE IDSIRLKSLT QGEMSQTFKW WTELGLEKDV EKARSQPLKW

301 HTWSMKILQD PTLTEQRLDL TKPISLVYVI DDIFDVYGEL EELTIFTRVV ERWDHKGLKT

361 LPKYMRVCFE ALDMITTEIS MKIYKSHGWN PTYALRQSWA SLCKAFLVEA KWFNSGYLPT

421 TEEYMKNGVV SSGVHLVMLH AYILLGEELT KEKVELIESN PGIVSSAATI LRLWDDLGSA

481 KDENQDGTDG SYVECYLNEY KGSTVDEART HVAQKISRAW KRLNRECLNP CPFSRSFSKA

541 CLNIARTVPL MYSYDDDQRL PDEYLKSLM //

Los algoritmos aportan una posible candidata en Capsicum annuum (gb|GD135281.1),

cuyos últimos 14 aminoácidos en el extremo C-terminal son los siguientes:

QSLPVLQEYIKSML.

Con el número de acceso GD135281.1 en el NCBI, nos aparece la siguiente secuencia

EST (KS26061G10 ) de C. annuum de 593 bp.

GCACGAGGGCAGTCTTAGTTCACTTGTTCTATCTCTTAGGTCTTGGTGTAAGCTCTATAAGTTTGGAGGA

TATATCAGCCATATCTGCTTCTGCGGCTATGATTCTACGCCTTTGGGATGATCTTGGAACTGCAAAGGAT

GAAAATCAAGAAGGAACTGATGGTTCATACATAGAATGTTACATCAAGGAAAACAAAGATGCTTCTCTTG

AATTGGCAAGAGAACATGTGATCAAGCTAATAGAAGATGAATGGAAGCAACTCAACAAAGAACATCTTCG

TCTGATGAGTCGATCTTCAAGATCATTTTCAAAAGCTTCGCTTAATTTTGCAAGGATGGTTCCTCTTATG

TACAATTACGATGATAATCAGTCCCTCCCTGTCCTCCAAGAATACATTAAGTCTATGTTGTAAGCGGAGG

CAGGTAGAATTGAGGAGTCCATTCA

AGCTTCCTTTGATAGAAAGTTACACTATTTATACATAGTTGAAAT

TAATTTTTATTTATATAGTAGCTATTGAACCTCCTACGACTTCTTTGTATGTTTACTTATTTATATTTTG

AAATCCTTAGTGAATATCTTGGCTCTGCCAATT

La traducción de esta secuencia de nucleótidos, en aminoácidos corresponde con el

marco de lectura (+3) siguiente:

5’3’f 3 T R A V L V H L F Y L L G L G V S S I S L E D I S A I S A S A A M I L

R L W D D L G T A K D E N Q E G T D G S Y I E C Y I K E N K D A S L E

L A R E H V I K L I E D E W K Q L N K E H L R L M S R S S R S F S K A

S L N F A R M V P L M Y N Y D D N Q S L P V L Q E Y I K S M L Stop A E

A G R I E E S I Q A S F D R K L H Y L Y I V E I N F Y L Y S S Y Stop T

S Y D F F V C L L I Y I L K S L V N I L A L P I

Anexo I.1

180

En azul se indica la correlación de la secuencia con los 14 aminoácidos del extremo C-

terminal indicado por el algoritmo.

1) Para llevar a cabo nuestro análisis, en primer lugar se hace un alineamiento entre la

secuencia de la proteína de Arabidopsis y las posibles proteínas ortólogas de C. annuum

(blastp) y se obtienen los siguientes resultados:

Figura I.1: Resultados de blastp de la proteína de Arabidopsis frente proteínas de Capsicum annuum.

Las “barras rojas” del alineamiento se corresponden con las secuencias cuya similitud

con la secuencia problema es mayor. Dichas “barras rojas”, a su vez, se corresponden

con las proteínas de Capsicum annuum indicadas en la siguiente tabla.

Tabla I.1: Secuencias que tienen alineamientos significativos. El parámetro “e-value” es el valor de

corte que nos permite definir qué alineamientos queremos obtener de acuerdo a su significación

estadística. Cuanto menor sea el “e-value”, más significativo es un alineamient. “Query cover” indica el

porcentaje de homología de nuestra secuencia problema.

Proteína Número de acceso e-value Query cover

5-epiaristoloqueno sintasa,

secuencia completa

O65323.1 1e-80 86%

5-epiaristoloqueno sintasa CAA06614.1 6e-80 86%

sesquiterpeno ciclasa AAK15641.1 3e-73 81%

UV-induced sesquiterpeno cyclasa

inducida por UV

AAF21053.1 4e-71 81%

sesquiterpeno cyclasa AAK15642.1 4e-58 81%

Con estos resultados se construye el siguiente árbol de distancia entre secuencias,

referidas al molde de A. thaliana At1g61680.

Anexo I.1

181

Figura I.2: Árbol de distancia entre las secuencias, teniendo como referencia la proteína At1g61680 de

A. thaliana.

2) En segundo lugar se hace un alineamiento entre la secuencia EST traducida (cortada

en en C-terminal) frente a proteínas de Capsicum annuum.

T R A V L V H L F Y L L G L G V S S I S L E D I S A I S A S A A M I L

R L W D D L G T A K D E N Q E G T D G S Y I E C Y I K E N K D A S L E

L A R E H V I K L I E D E W K Q L N K E H L R L M S R S S R S F S K A

S L N F A R M V P L M Y N Y D D N Q S L P V L Q E Y I K S M L

Y ello nos proporciona las siguientes correspondencias



estadística. Cuanto menor sea el “e-value”, más significativo es un alineamiento. “Query cover” indica el



sesquiterpeno ciclasa AAK15641.1 3e-08 89%

sesquiterpeno cyclasa inducida por

UV

AAF21053.1 2e-06 80%

epiaristoloqueno sintasa, secuencia O65323.1 6e-06 80%

Anexo I.1

182

completa

5-epiaristoloqueno sintasa CAA06614.1 6e-06 80%

Observamos que por ambas aproximaciones bioinformáticas, los resultados coinciden,

lo que significa que, efectivamente, existe una proteína ortóloga en Capsicum annuum

que probablemente tendrá una localización peroxisomal determinada por un PTS1 del

tipo SML>.

Anexo I.2

183

ANEXO I.2



AAP21228. A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos de esta proteína y

su PTS1 marcado en rojo, obtenido del NCBI.

1 MATIRVPNEV PSPAQDSETL KQAIRGWGTD EKAIIRVLGQ RDQSQRRKIR ESFREIYGKD

61 LIDVLSSELS GDFMKAVVSW TYDPAERDAR LVNKILNKEK KKKSLENLKV IVEISCTTSP

121 NHLIAVRKAY CSLFDSSLEE HIASSLPFPL AKLLVTLAST FRYDKDRTDA EVATIEAAML

181 REAIEKKQLD HDHVLYILGT RSIYQLRETF VAYKKNYGVT IDKDVDGCPG DADLRSLLKV

241 AIFCIDTPEK HFAKVVRDSI EGFGTDEDSL TRAIVTRAEI DLMKVRGEYF NMYNTSMDNA

301 ITGDISGDYK DFIITLLGSK I //


cuyos últimos 14 aa en el extremo C-terminal son los siguientes:

DYRKFLMTLLGAKV.

Con el número de acceso GD107205.1en el NCBI, nos aparece la siguiente secuencia

EST (KS22024A04 ) de C. annuum de 442 bp.

GCACGAGGAGCAACTTTTGAGTGCTACAAGCAAAATTACGGATTCTCCATTGACCAGGAC

ATTAAGAGCTGTGGAAAGGGTCTGCTGGAGTCTATTCTGAAGGTCGTTATCTGGTGCATT

GATTCGCCGGAGAAACATTTTGCTGAGGTTGTCAGAGCCTCTGTTGTCGGGTTAGGGACT

GATGAGGATTCACTAACTAGAGCCATTGTAACGCGAGCTGAAGTTGATATGATGAAAGTG

AGGGGAGAGTATTTCATCGCGAACAAGACTAGTCTTGATAATGCAGTTATTGATGACACA

TCAGGTGATTACAGAAAGTTCCTCATGACACTACTTGGTGCCAAAGTCTAGATCTTTGGA

CATGATACATTGTGTTGCGTAGTGTTTCAATAGTATAATTCTACTTTGTATGGTTTCATT

TAACGATGCTACATGATATGAG

La traducción de la secuencia de nucleótidos de EST en aminoácidos corresponde con el


5’3’f 3 A R G A T F E C Y K Q N Y G F S I D Q D I K S C G K G L L E S I L K V

V I W C I D S P E K H F A E V V R A S V V G L G T D E D S L T R A I V

T R A E V D M M K V R G E Y F I A N K T S L D N A V I D D T S G D Y R

K F L M T L L G A K V Stop I F G H D T L C C V V F Q Stop Y N S T L Y

G F I Stop R C Y Met I Stop



Anexo I.2

184


secuencia de la proteína de Arabidopsis y las posibles proteínas ortólogas de Capsicum

annuum (blastp) y se obtienen los siguientes resultados:


Las “barras rojas” del alineamiento se corresponden con las secuencias cuya similitud

con la secuencia problema es mayor. Dichas “barras rojas” a su vez se corresponden

con las proteínas de Capsicum annuum indicadas en la siguiente tabla.






anexina P38 CAA10261.1 3e-84 99%

anexina CAA63710.1 3e-75 99%

Estructura cristalina de la anexina,

cadena 24

1DK5_A 4e-75 99%

annexina cap32 CAA10210.1 1e-74 99%



Anexo I.2

185


A. thaliana.



A R G A T F E C Y K Q N Y G F S I D Q D I K S C G K G L L E S I L K V

V I W C I D S P E K H F A E V V R A S V V G L G T D E D S L T R A I V

T R A E V D M M K V R G E Y F I A N K T S L D N A V I D D T S G D Y R

K F L M T L L G A K V







anexina P38 CAA10261.1 1e-27 96%

anexina cap32 CAA10210.1 9e-18 96%

anexina CAA63710.1 1e-17 96%

Anexo I.2

186




tipo AKV>.

Anexo I.3

187

ANEXO I.3



Q9LUC8. A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos de esta proteína y su

PTS1 marcado en rojo, obtenido del NCBI.

1 MEISVASVTV SVAVVVVSWW VWRTLQRVWL KPKMLESYLR RQGLAGTPYT PLVGDLKRNF

61 SMLAEARSKP INLTDDITPR IVPYPLQMLK THGRTFFTWF GPIPTITIMD PEQIKEVFNK

121 VYDFQKAHTF PLGRLIAAGL VSYDGDKWTK HRRIINPAFH LEKIKNMVPA FHQSCSEIVG

181 EWDKLVTDKQ SSCEVDIWPW LVSMTADVIS RTAFGSSYKE GQRIFELQAE LAQLIIQAFR

241 KAIIPGYRYF PTKGNRRMKA AAREIKFILR GIVNKRLRAR EAGEAPSDDL LGILLESNLG

301 QTKGNGMSTE ELMEECKLFY FAGQETTTVL LVWTMVLLSQ HQDWQARARE EVKQVFGDKE

361 PDAEGLNQLK VMTMILYEVL RLYPPVVQLT RAIHKEMQLG DLTLPGGVQI SLPILLIQRD

421 RELWGNDAGE FKPDRFKDGL SKATKNQVSF FPFAWGPRIC IGQNFALLEA KMAMTLILRK

481 FSFELSPSYV HAPYTVLTTH PQFGAPLILH KL //


cuyos últimos 14 aa en el extremo C-terminal son los siguientes:

IHPQYGAPLLMRKL.

Con el número de acceso GD129978.1en el NCBI, nos aparece la siguiente secuencia

EST (KS26002F09 ) de C. annuum de 717 bp.

GCACGAGGAGAGGTTTTGCAGGTCTTTGGAAATGATAAACCCGATTTGGAAGGACTAGGT

CGCTTGAAAATTGTGAACATGATCTTGTACGAGACGCTAAGGTTATTCCCCCCATTACCA

ACATTTGGTAGAAGGAATAAACAAGAAGGGAAATTGGGGGAGCTAGATCTACCTGATGGA

GTGATACTCATTATACCCGCAATCTTGGTACATTATGATAAGGAAATATGGGGTGAAGAC

GCAAAGGAATTCAAACCAGAAAGATTTAGTGAAGGAGTGTCAAAGGCAACCAAAGGACAA

TTCTCATATATTCCATTTGGCGGGGGACCTCGAATTTGCATTGGACAAAACTTTGCAATG

ATGGAAGCAAAAATGGCAATGGCAATGATACTAAGAAAATTCTCCTTCGAACTCTCTCCA

TCTTATACACATGCTCCATTTGCAGTAGTGACTATTCATCCTCAGTATGGTGCTCCTCTG

CTTATGCGCAAACTTTAAAACGGAATATCCAGAAGAATACTTGTATTCATAGGTTTTCTC

AATTGAACTTCATATAGGATGCTTGGTCGAGAAAAAGATAAGTTTTGCACCATAGTATTA

ATGCATCTCTATATTCATTTTGGTTTGTCCATATACCGGGAATCAACCAAAACAACTACT

GCTATTTTTCTCAAGTGCTATGTACTTTCTTGTTTTCTTTGGCCTGTATATATTTCT



5’3’f 3 A R G E V L Q V F G N D K P D L E G L G R L K I V N M I L Y E T L R L

F P P L P T F G R R N K Q E G K L G E L D L P D G V I L I I P A I L V

H Y D K E I W G E D A K E F K P E R F S E G V S K A T K G Q F S Y I P

Anexo I.3

188

F G G G P R I C I G Q N F A M M E A K M A M A M I L R K F S F E L S P

S Y T H A P F A V V T I H P Q Y G A P L L M R K L Stop N G I S R R I L

V F I G F L N Stop T S Y R M L G R E K D K F C T I V L M H L Y I H F G

L S I Y R E S T K T T T A I F L K C Y V L S C F L W P V Y I S





annuum (blastp) y se obtienen los siguientes resultados:


Las “barras moradas” del alineamiento se corresponden con las secuencias cuya

similitud con la secuencia problema es mayor.

Dichas “barras moradas” a su vez se corresponden con las proteínas de Capsicum

annuum indicadas en la siguiente tabla.






citoromo P450 A ADO24345.1 2e-27 78%

citocromo P450 AAF27282.1 4e-27 79%

citocromo P450 ACD10924.1 8e-24 75%

p-cumarato 3-hidroxilasa putativa ACF17644.1 5e-17 78%

Anexo I.3

189




A. thaliana.



A R G E V L Q V F G N D K P D L E G L G R L K I V N M I L Y E T L R L

F P P L P T F G R R N K Q E G K L G E L D L P D G V I L I I P A I L V

H Y D K E I W G E D A K E F K P E R F S E G V S K A T K G Q F S Y I P

F G G G P R I C I G Q N F A M M E A K M A M A M I L R K F S F E L S P

S Y T H A P F A V V T I H P Q Y G A P L L M R K L




Anexo I.3

190



Proteína Número de

acceso

e-value Query cover

citocromo P450 A ADO24345.1 2e-27 78%

citocromo P450 ACD10924.1 8e-24 75%




tipo RKL>.

Anexo I.4

191

ANEXO I.4



AEE78124. A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos de esta proteína y

su PTS1 marcado en rojo, obtenido del NCBI.

1 MSNHQTLTFV FGEKEVLKQL EPWCELKDKV VLVTGASSGI GREICLDLGK AGCKIIAVAR

61 RVDRLNSLCS EINSSSSTGI QAAALKLDVT SDAATIQKVV QGAWGIFGKI DALINNAGIR

121 GNVKSSLDLS KEEWDNVFKT NLTGPWLVSK YVCVLMRDAK LGGSVINISS IAGIRGILPG

181 ALAYACSKIG VDTMSKMMAV ELGVHKIRVN SIAPGIFKSE ITQGLMQKEW FKNVTERTVP

241 LKLQQTVDPG ITSLVRYLIH DSSQYISGNT YIVDSGATLP GVPIFSSL //

Los algoritmos aportan dos posibles candidatas en Capsicum annuum (GD126785.1 y

GD058877.1), cuyos últimos 14 aa en el extremo C-terminal son los siguientes:

GGGTLPGVPIFSSL en ambos casos.

Con el número de acceso GD126785.1 en el NCBI, nos aparece la siguiente secuencia

EST (KS25033E17 ) de C. annuum de 717 bp.

GCACGAGGGCCGATGGCGCTACTATTGAGGCTTCCGTACAAAGAGCTTGGGATGCCTTTG

GACGTATCGATGCCTTGATTAACAATGCTGGCGTTAGAGGTAGTATGAACTCTTCACTGG

AATTGTCAGAGGAGGAATGGGAAAATACTTATAAGACGAATCTAAGAGGGGCATGGTTGG

TTTCAAAATATGTTTGTAAACGTATGCGCGATGCTAAACAGGGCGGAGGATCTGTTATTA

ATATAACTTCGATAGCTGGTCTGAATCGAGTTATATTAGCAGGGTCTATTGCTTACGGTT

CTTCGAAGATGGCTCTTGACATGGTCACTAAGACAATGGCACTTGAATTGGGAGTTCACA

ACATCAGAGTGAACTCTATAGCACCAGGAATATTCAAATCCGAGATAACAGAGAGCCTTT

TTAAACAGAAATGGTTCCATGAATTTTTTTATAAAACCCTTCCTCAGAGATATCTTGGAG

CAACGGATCCGGCTTTAACATCAGTAGTTCGATATTTGATCCATGATTGTTCTGAATATG

TAACTGGCAATGTCTTCGTTGTTGATGGTGGAGGTACTTTACCCGGTGTTCCCATTTTCT

CATCGTTGTAGAAGATGGAGTGATAATTTAGTATTGTGCAACCTGCACTAATAATGCAAT

AGTTAATTAATATTGTTGCTTTTGTCTCATTGTATTAATCATATTGGTCAATTCGT



5’3’f 3 T R A D G A T I E A S V Q R A W D A F G R I D A L I N N A G V R G

S M N S S L E L S E E E W E N T Y K T N L R G A W L V S K Y V C K

Anexo I.4

192

R M R D A K Q G G G S V I N I T S I A G L N R V I L A G S I A Y G S S

K M A L D M V T K T M A L E L G V H N I R V N S I A P G I F K S E I T

E S L F K Q K W F H E F F Y K T L P Q R Y L G A T D P A L T S V V R Y

L I H D C S E Y V T G N V F V V D G G G T L P G V P I F S S

L Stop K M E Stop Stop F S I V Q P A L I M Q Stop L I N I V A F V S L

Y StopS Y W S I R



Con el número de acceso GD058877.1en NCBI, nos aparece la siguiente secuencia EST

(KS14016A04 ) de C. annuum de 685 bp.

GCACGAGGCCTTGAGCTTGATGTCACTGCTGATGGTGCTACTATTGAGGCTGCTGTACAA

ATAGCTTGGGACGCCTTTGGACGTATTGATTCCTTGGTTAACAATGCTGGAGTTCGAGGT

AGTACAAGTTCTTCACTGAATTTGTCAGAGGAGGAGTGGGAACATACTTATAAGACGAAT

CTAAGAGGGGCATGGCTGGTCTCAAAATATGTTTGTAAACGTATGCGCGATGCTAAACAA

GGCGGAGGATCTGTTATTAATATAACCTCAATAGCTGCTCTGAATAGAGTACTAGTAGGA

GGGACTCTTGCTTACGCTTCTTCAAAGATGGCTCTCGACATGGTCACTAAGATAATGGCA

CTTGAATTAGGAGCAGACAATATTCGAGTGAACTCAATATCGCCAGGAATATTCAAATCT

GAGATAACAGAGAGCCTTCTTCAACAGGAATGGTTCCATAAGTTTCTTTATAAAACTCAT

CCTCAGAGATTTATTGGAAAGACAGATCCGGCTTTAACAACACTGCTCCGGTATTTGATC

CATGATTCTTCTGAATATGTAACAGGCAATATCTTCATTGTTGATGGTGGAGGTACCTTA

CCAGGCGTTCCCATTTTCTCATCGTTGTAGAAGATGGAGTAATAGTTTAGTACTGGTGAA

TGTTCAGATAGTCAGTCGACTGAAC


marco de lectura (+1) y es la siguiente:

5’3’f 3

A R G L E L D V T A D G A T I E A A V Q I A W D A F G R I D S L V N N

A G V R G S T S S S L N L S E E E W E H T Y K T N L R G A W L V S K Y

V C K R M R D A K Q G G G S V I N I T S I A A L N R V L V G G T L A Y

A S S K M A L D M V T K I M A L E L G A D N I R V N S I S P G I F K S

E I T E S L L Q Q E W F H K F L Y K T H P Q R F I G K T D P A L T T L

L R Y L I H D S S E Y V T G N I F I V D G G G T L P G V P I F S S

L Stop K M E Stop Stop F S T G E C S D S Q S T E



http://web.expasy.org/cgi-bin/translate/dna_sequences?/work/expasy/tmp/http/seqdna.465,1,1







Anexo I.4

193



annuum (blastp) y sólo se obtiene un resultado significativo:


La “barra morada” del alineamiento se corresponden con las secuencias cuya similitud

con la secuencia problema es mayor.

Dichas “barra morada” , a su vez, se corresponden con las proteínas de Capsicum

annuum indicada en la siguiente tabla.






proteína portadora de acilo 3-oxoacil-

reductasa putativa

ACF17653.1 6e-30 90%

En este caso al ser una única secuencia no se pudo hacer ningún árbol de distancias de

secuencias.


en en C-terminal) frente a proteínas de Capsicum annuum, siendo para KS25033E17

T R A D G A T I E A S V Q R A W D A F G R I D A L I N N A G V R G

S M N S S L E L S E E E W E N T Y K T N L R G A W L V S K Y V C K

R M R D A K Q G G G S V I N I T S I A G L N R V I L A G S I A Y G S S

K M A L D M V T K T M A L E L G V H N I R V N S I A P G I F K S E I T

E S L F K Q K W F H E F F Y K T L P Q R Y L G A T D P A L T S V V R Y

L I H D C S E Y V T G N V F V V D G G G T L P G V P I F S S L

y para KS14016A04

Anexo I.4

194

A R G L E L D V T A D G A T I E A A V Q I A W D A F G R I D S L V N N

A G V R G S T S S S L N L S E E E W E H T Y K T N L R G A W L V S K Y

V C K R M R D A K Q G G G S V I N I T S I A A L N R V L V G G T L A Y

A S S K M A L D M V T K I M A L E L G A D N I R V N S I S P G I F K S

E I T E S L L Q Q E W F H K F L Y K T H P Q R F I G K T D P A L T T L

L R Y L I H D S S E Y V T G N I F I V D G G G T L P G V P I F S S L

La única secuencia que produce resultados signifcativos es:

Tabla I.8: : Secuencia que tiene un alineamiento significativo. El parámetro “e-value” es el valor de




Proteína Número de

acceso

e-value Query cover

proteína portadora de acilo 3-oxoacil-

reductasa putativa

ACF17653.1 6e-30 90%




tipo RKL>.






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