2015 I

CUANTIFICACION DE ADN EN

MUESTRAS BIOLOGICAS

CUANTIFICACIN DE ADN EN MUESTRAS BIOLOGICAS

Tras el proceso de extraccin y purificacin, suelerealizarse la cuantificacin del ADN para determinar lacantidad de cido nucleico de la que disponemos.

Generalmente no es necesaria una determinacin muyexacta y basta con realizar una estimacin de laconcentracin de ADN.

En el caso de muestras poco habituales o muestraslmite, es conveniente realizar una cuantificacin de lacantidad de ADN antes de realizar la PCR.

CUANTIFICACIN DE ADN EN MUESTRAS BIOLOGICAS

Las tcnicas de cuantificacin ms utilizadasson:Geles de agarosa teidos con bromuro de

etidioEspectrofotometraFluorimetraHibridacin con sondas especficas

CANTIDAD DE ADN EN UNA CLULA

Peso molecular de cada una de las bases nitrogenadas delADN: Adenina (A): 313 gramos(g)/mol Guanina (G): 329 g/mol Timina (T): 304 g/mol Citosina (C): 289 g/mol

Peso molecular de un par de bases (bp) = 618 g/mol 1 copia del genoma haploide humano = ~ 3 x 109 bp (23

cromosomas) 1 mol = 6.023 x 1023 molculas

CANTIDAD DE ADN EN UNA CLULA

Por lo tanto, 1 copia del genoma haploide humano = (~ 3 x 109 bp) x (618

g/mol) = 1.85 x 1012 g/mol= (1.85 x 1012g/mol) x (1 mol/ 6.023 x 1023 molculas) = 3.08 x10-12 g= 3.08 picogramos (pg)

Cantidad total de ADN por clula diploide humana es de 6.16 pgde ADN genmico. 1 ng de ADN genmico (1000 pg) x (1 copia/ 3.08 pg) = ~ 325

copias

CUANTIFICACIN DE ADN MEDIANTE GELES DE AGAROSA

El ADN es una molcula polianinica uniformementecargada (con carga negativa) que le permite migraren un campo elctrico.

Molculas de ADN con un tamao comprendido entrelas 200 bp y la 50 kilobases de longitud se puedenseparar en geles de agarosa de diversaconcentracin.

CUANTIFICACIN DE ADN MEDIANTE GELES DE AGAROSA

Este tipo de geles se someten a electroforesishorizontales en un campo elctrico de direccinconstante.

El bromuro de etidio es un compuesto que se intercalaentre la doble cadena de ADN y emite una sealfluorescente cuando es irradiado con luz ultravioleta.

Para la cuantificacin se suele utilizar un marcador depeso molecular conocido, como puede ser el ADN delfago Lambda cortado con la enzima de restriccinHindIII.

CUANTIFICACIN DE ADN MEDIANTE GELES DE AGAROSA

Cuando se carga una concentracin conocida de Lambda/HindIII en un pocillodel gel, se generan 8 fragmentos de tamao conocido

23130*941665574361*

23222027

564

125

Fragmento (bp) % Cantidad de ADN por banda (ng)

1 23130 47.7 4772 9416 19.4 1943 6557 13.5 1354 4361 9.0 905 2322 4.8 486 2027 4.2 427 564 1.2 118 125 0.3 3

TOTAL: 100 % 1 g

CUANTIFICACIN DE ADN MEDIANTE GELES DE AGAROSA

23130*941665574361*

23222027

564

125

Comparando las intensidades de las bandas de losfragmentos del marcador con la banda que aparece en elpocillo en el que hemos cargado nuestro ADN, podemosdeducir la cantidad de ADN de nuestra muestra de unaforma rpida y sencilla.

Para conseguir una aproximacin ms exacta se puedencargar varios pocillos con distintas concentracionesconocidas del marcador, as como distintas diluciones dela muestra de ADN que queremos cuantificar.

* Puede aparecer una banda extra de 27491 bp, comoconsecuencia de la unin de los fragmentos de 23130 y4361 bp. Esto puede ser evitado calentando el marcadordurante 5 minutos a 65C y pasndolo directamente ahielo durante 3 minutos.

CUANTIFICACIN DE ADN MEDIANTEESPECTROFOTOMETRA

La absorcin en el espectro de la luz ultravioleta, a260 nm (A260) de la bases pricas y pirimidnicaspermiten medir la cantidad de ADN porespectrofotometra.

Una unidad de absorbancia a 260nm equivale a unaconcentracin de 50 g/ml de ADN bicatenario o 25g/ml de ADN de cadena sencilla.

Se realiza una segunda medida de absorbancia a 280nm (A280) que es la longitud en la que las protenastienen su mayor absorbancia.

CUANTIFICACIN DE ADN MEDIANTE ESPECTROFOTOMETRA

Se realiza una segunda medida de absorbancia a 280 nm (A280)que es la longitud en la que las protenas tienen su mayorabsorbancia.

Para muestras de ADN puras el valor A260/ A280 estar entre 1.8 y2.0, mientras que si existe contaminacin con protenas estecociente ser significativamente menor.

Frmula utilizada para diluciones de ADN, 1:2oo:[ADN] (g/l) = (A260) x (50 g/ml) x (1ml/1000l) x (200/1) = 10 xA260

CUANTIFICACIN DE ADN MEDIANTE FLUORIMETRA

El colorante bisbenzimida, conocida comnmente como Hoechts33258, muestra cambios en su patrn de fluorescencia enpresencia de ADN:

Su espectro de absorcin de la es de 356 nm y el de emisinde 492 nm, en ausencia de ADN, mientras que cuando seune al ADN los espectros de absorcin y emisindisminuyen hasta los 365 nm y 458 nm, respectivamente.

CUANTIFICACIN DE ADN MEDIANTE FLUORIMETRA

Se mezcla una solucin de bisbenzimida y TNE con unafraccin del ADN que queremos cuantificar, y se expone lamezcla a 365 nm, con una lmpara de mercurio, se producela emisin de luz a 458 nm que es recogida por el fluormetro

La medida de fluorescencia nos indica, de forma indirecta, laconcentracin de ADN, por comparacin con un ADNestndar de concentracin conocida

CUANTIFICACIN DE ADN MEDIANTE HIBRIDACIN CON SONDAS ESPECFICAS

Se inmoviliza el ADN problema y los ADN estndar en unamembrana cargada positivamente.

Se hibrida la membrana con una sonda, que es complementariaa una secuencia de ADN alfa satlite, especfica de primatessuperiores, situada en el locus D17Z1.

A esta sonda se le unir posteriormente una enzima(peroxidasa) conjugada con estreptavidina (que se uneespecficamente a la biotina).

CUANTIFICACIN DE ADN MEDIANTE HIBRIDACIN CON SONDAS ESPECFICAS

Deteccin colorimtrica: la oxidacin de un cromgeno, TMB,catalizada por la peroxidasa, provoca la formacin de unprecipitado de color azul directamente sobre la membrana.

Deteccin quimioluminiscente: la oxidacin, catalizada por laperoxidasa, de un reactivo luminiscente, provoca la emisin defotones que pueden ser detectados por autoradiografa.