UNIVERSIDAD DE SALAMANCA

Departamento de Fisiología y FarmacologíaLaboratorio de Farmacognosia y

Farmacología

Interacciones fármaco-receptorCurvas dosis-respuesta

Complejo F-RF + R

  

Enlaces electrostáticos, fuertes o débiles pero normalmente reversibles

FÁRMACO

“SITIO DE UNIÓN”

Unión por enlaces covalentes son estables y esencialmente irreversibles

RECEPTORES FARMACOLÓGICOS

RESPUESTA

¿Cómo actúan los fármacos en el organismo?

El fármaco no origina mecanismos o reacciones nuevas, sino que se limita a estimular o inhibir los procesos propios de la célula

El conocimiento de la naturaleza de estos sitios de unión, y los mecanismos por los que esta unión origina una respuesta, es la base principal de la investigación en Farmacología

FÁRMACO

RESPUESTARECEPTORES FARMACOLÓGICOS

inicia una serie de modificaciones bioquímicas y fisiológicas

Receptor farmacológico = diana

Proteínas

Un componente macromolecular de una célula con la cuál interacciona un fármaco para producir una respuesta

1.Enzimas2.Canales iónicos 3.Moléculas

transportadoras4.Receptores

ADN Tubulina

Proteínas plasmáticas

RECEPTORES SILENCIOSOS= ACEPTORES

RECEPTOR : macromolécula celular implicada en los procesos de transmisión de señal, con la que interactúan neurotransmisores, fármacos o mediadores para inducir una modificación funcional

Dinámica de activación de un receptor

IUPHAR (Unión Internacional de Farmacología)

NeurotransmisorHormona Receptor

Célula endotelialCélula músculo lisoÓxido nítrico

Arteria contraída

Célula músculo liso contraída

Vasodilatación

modificaciones celulares y moleculares desencadenadas por la interacción entre ambas

moléculas

consecuencia final del proceso

Reconocimientoasociación específica entre el ligando y su

receptor:

Transducción(Acción)

Respuesta funcional(Efecto)

a) La unión fármaco-receptor es reversible.

b) Existe una relación lineal entre el número de receptores ocupados y la respuesta farmacológica.

c) La respuesta máxima aparece con la ocupación de todos los receptores.

Asume que la respuesta de un tejido a un fármaco es debida a la

ocupación de los receptores por las moléculas del fármaco

Teoría ocupacionalClark ,1933

Complejo F-RF + R

Interacción fármaco-receptor

Respuesta

[F] + [R] [F-R] k1

k-1

En equilibrio:

[F] x [R] x k1 = [FR] x k-1

k-1/k1 = constante de disociacion (kd)

k1/k-1 = 1/kd = constante afinidad

A menor kd el fármaco

es más potente

[F] [R]

[F-R]= kd

Afinidad: Es la capacidad del fármaco para unirse a un receptor específico y formar el complejo F-R.

Interacción fármaco-receptor

[F] + [R] [F-R] Efectok1

k-1

[F] . [R]

[F-R]= kd

[RT] = [RL] + [F-R]

[F]. ([RT] -[F-R])

[F-R] = kd

[RT] . [F][F-R] = --------------

kd + [F]

El efecto farmacológico es proporcional a la concentración de complejos [F-R]

Interacción fármaco-receptor

[RT] . [F][F-R] = --------------

kd + [F]

[F-R] [F] -------- = ---------- [RT] kd + [F]

[F] Log [F]

r

0

1

0.5

r

• Velocidad de cambio es rápida al principio y se hace progresivamente más pequeña cuando la dosis se incrementa

• Cuando incrementos en la dosis no producen cambios en el efecto hemos obtenido el efecto máximo

• Dificultad para el análisis matemático

Escala aritmética [RT] . [F]

[F-R] = --------------kd + [F]

[F-R] [F] r = -------- = --------- [RT] kd + [F]

0.10.31 3 100

10

20

30

40

50

L-NAMEControl

Acetylcholine nmol/kg

% fa

ll in

blo

odpr

essu

re

-2 -1 0 1 20

10

20

30

40

50

L-NAME

Acetylcholine nmol/kg

Control

0.1 0.3 1 3 10

% fa

ll in

blo

od p

ress

ure

Escala logarítmica

[RT] . [F][F-R] = --------------

kd + [F]

• Transformación de una curva hiperbólica en sigmoidea

• Parte central es una línea recta

• Se comprime la escala de la dosis

• Dosis proporcionales aparecen a intervalos iguales

• Más fácil para el análisis matemático

[F-R] [F] r = -------- = --------- [RT] kd + [F]

0.10.31 3 100

10

20

30

40

50

L-NAMEControl

Acetylcholine nmol/kg

% fa

ll in

blo

odpr

essu

re

-2 -1 0 1 20

10

20

30

40

50

L-NAME

Acetylcholine nmol/kg

Control

0.1 0.3 1 3 10

% fa

ll in

blo

od p

ress

ure

[RT] . [F][F-R] = --------------

kd + [F]

[RT] [RT] . [F50]-------- = --------------

2 kd + [F50]

kd = [F50]

Cuando F-R = 50% F-R Entonces receptores ocupados = RT / 2

A igual grado de ocupación todos los agonistas producen el mismo efecto Solo se distinguen dos tipos de fármacos: los agonistas, y los antagonistas

(kd + [F50]) . [RT] = 2 . [RT] . [F50]

kd + [F50) = 2 [F50]

Fármacos agonistas

Fármacos antagonistas• Fármaco que interacciona con el receptor

pero NO lo activa• Tiene afinidad pero NO actividad

• Fármaco que interacciona con el receptor y lo activa

• Tiene afinidad y actividad

Posición relativa de las curvas dosis-respuesta en el eje de abcisas

Tiene poca significancia clínica para un efecto terapéutico dado.

Un fármaco más potente que otro no significa que clínicamente sea superior

La potencia baja es una desventaja sólamente si la dosis es tan grande que es un problema administrarla.

Potencia

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

-9,0 -7,0 -5,0 -3,0

Fármaco A

Fármaco B

Fármaco C

Fármaco D [F50]

[RT] . [F][EF] = ----------------

kd + [F]

[RT] . [F][F-R] = --------------

kd + [F]

EF = [F-R]

Emax = [RT]

Emax . [F]EF = ----------------

kd + [F]

Actividad intrínseca () capacidad de los fármacos de generar un efecto tras interaccionar con un receptor

Teoría de Ariens (1964)

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

-10 -8 -6 -4 -2 0

Log (M)

Interacción fármaco-receptor

Emax . [F]EF = ----------------

kd + [F]

E50 = Emax /2

Emax . [F50]E50 = ----------------

kd + [F50]

Emax (kd + [F50]) = 2 Emax . [F50]

kd + [F50] = 2 [F50]

kd = [F50]

Interacción fármaco-receptor

0

20

40

60

80

100

120

-9 -7 -5 -3Log (M)

Res

pu

esta

(%)

Emax Emax . [F50]------ = ---------------- 2 kd + [F50]

0

20

40

60

80

100

120

-9 -7 -5 -3Log (M)

Res

pu

esta

(%)

kd = [F50]

p[F50]

pCE50

pD2

Logaritmo negativo en base 10 de la concentración de un agonista que produce el 50% de la respuesta máxima

Constante de disociación : concentración del agonista que produce el 50% de la respuesta máxima

Cuanto mayor es pCE50 mayor

es la potencia del agonista

- Log kd = - Log [F50]

0

20

40

60

80

100

120

-9 -8 -7 -6 -5

(Log M)

Re

sp

ue

sta

(%

)

La actividad intrínseca se expresa en unidades arbitrarias, mediante el cociente entre el efecto máximo que se obtiene y el efecto máximo con el que responde el sistema biológico agonista perfecto: = Emax / EMAX

Agonista total = 1 = 1

= 0.7

= 0.3

Agonista parcial 0<<1

Antagonista = 0

Interacción fármaco-receptor

Fármacos agonistas

• Interaccionan con receptores y los activan. Tienen afinidad y actividad– Completo: un agonista con la máxima

actividad intrínseca– Parcial: un agonista con menos de la máxima

actividad intrínseca

Fármacos antagonistas

• Interaccionan con los receptores pero NO los modifican. Tienen afinidadafinidad pero NO actividad

Emax . [F]EF = ----------------

kd + [F]1 kd + [F] kd 1 1

--- = ----------------- = ------- . ---- + ------EF Emax . [F] Emax [F] Emax

Representación deDoble recíproco

y = a x + b

Interacción fármaco-receptor

[RT] . [F][F-R] = --------------

kd + [F]

Teoría de Stephenson (1956)

1.- La respuesta es una función desconocida de la ocupación de los receptores

2.- El efecto máximo se puede producir con una ocupación pequeña de receptores.

3.- Los fármacos pueden tener diferentes capacidades para iniciar una respuesta

Eficacia (e) : capacidad de generar estímulos

Se pueden obtener respuestas iguales por distintos fármacos con ocupaciones diferentes de receptores

Interacción fármaco-receptor

e [F-R] S = -------- [RT]

EF

R = ------- = (S) Emax

Teoría de Stephenson (1956)

• Elimina la necesidad de asumir que la respuesta máxima de un tejido requiera la ocupación total de los receptores por el agonista

• Explica la actividad de agonistas, agonistas parciales y antagonistas competitivos, • Explica los cambios en la localización de las curvas concentración-respuesta a lo

largo del eje de las concentraciones (potencia), así como las respuestas máximas.

: función desconocida que establece la proporcionalidad entre el estímulo al receptor y la respuesta del tejido

[F-R] [F] -------- = ---------- [RT] kd + [F]

EF e [F] ---- = -----------

Emax kd + [F]

Interacción fármaco-receptor

RECEPTORES DE RESERVA

Nickerson (1956)

0

20

40

60

80

100

120

-9 -7 -5 -3Log (M)

Res

pu

esta

(%)

Experimentos en tiras de ileon de cobaya

Histamina produce contracción.

En presencia de un antagonista irreversible (GD-121), las curvas se desplazaban hacia la derecha sin cambios en la pendiente ni en la respuesta máxima.

Concentraciones más altas del GD-121 reducían la respuesta máxima de histamina.

Interacción fármaco-receptor

Las evidencias experimentales sugerían que 1% de receptores necesitaban estimularse por la histamina para conseguir la respuesta máxima.

Teoría anteriores asumen que todos los receptores deberían estar ocupados para producir una respuesta máxima. En ese caso la mitad del efecto máximo CE50=Kd. A veces, el efecto máximo se consigue con una ocupación parcial de receptores.

¿PORQUÉ HAY RECEPTORES DE RESERVA?

Interacción fármaco-receptor

Respuesta Ocupación1. Permite respuesta máxima sin la

ocupación total de los receptores. Incrementa la sensibilidad del sistema

2. Los receptores de reserva pueden unir (e internalizarse) ligando extra para prevenir una respuesta exagerada si hay demasiado ligando presente

EF [RT] [F]

------ = --------------

Emax kd + [F]

Furchgott(1966)

Eficacia intrínseca () = capacidad de un fármaco para iniciar un estímulo de un receptor

Stephenson(1956)

EF e [F] ---- = ----------- Emax kd + [F]

e = ------ [RT]

Con este cambio, la capacidad de generar estímulos constituye un término estrictamente relacionado con el fármacoLa eficacia (e) del modelo de Stephenson es un término dependiente del tejido y del fármaco, ya que se pueden tener eficacias diferentes en distintos tejidos.

Interacción fármaco-receptor

Distinguir entre ocupación de un receptor por un agonista y la

activación de ese receptor, distinción no era considerada en los primeros trabajos sobre receptores.Explica cómo las diferencias en la función de transducción y la densidad de los receptores en diferentes tejidos pueden incidir en el mismo agonista

Interacción fármaco-receptor

Respuesta Ocupación

Log (Agonista)

MEDIDA DIRECTA DE LA UNIÓN F-R

Requisitos

• La unión del radioligando debe ser un proceso saturable

• La afinidad del radioligando debe ser elevada

• La unión debe ser reversible

• Competencia de agonistas/antagonistas con el radioligando

ENSAYOS DE UNIÓN DE RADIOLIGANDOSestudios de “binding”

Interacción fármaco-receptor

1.  Identificar un ligando radioactivo apropiado para el

experimento

2.  Utilizar un tejido adecuado para el experimento

3.  Seleccionar un método de separación para separar la

fracción unida de la libre

4.  Identificar un método para diferenciar la unión específica

de la no específica

5.  Condiciones apropiadas para el ensayo:

a.  pH del buffer

b.  Buffers utilizado

c.  Reactivos adicionales para el binding

d.  Temperatura de la reacción de binding

FACTORES A CONSIDERAR EN EL DISEÑO DE EXPERIMENTOS DE BINDING

Interacción fármaco-receptor

Elección del radioligando

Tipo de isótopo• El radioligando debería ser químicamente estable

en el medio y durante la reacción de binding• El radioligando debería ser puro

Afinidad

Especificidad 

Selectividad 

El radioligando debería tener alta afinidad por el receptor

La especificidad del radioligando debería ser bastante alta para detectar receptores en el tejido estudiado. Esto normalmente quiere decir una radioactividad específica de 30 Ci/mmol o mayor 

El radioligando debería tener un alto grado de selectividad por el receptor que se estudia

Interacción fármaco-receptor

Preparación del tejido1. Membranas celulares aisladas de

células de cultivos

2. Membranas celulares de tejidos de órganos que han sido lavadas varias veces para eliminar cualquier ligando endógeno

3. Células intactas de cultivos celulares

4. Cortes histológicos de órganos (p.e. cerebro) para estudios de binding en autorradiografía

5. Receptores solubles que están presentes en tejidos o receptores de membranas que se han solubilizado

Interacción fármaco-receptor

TIPOS DE ENSAYOS

1.- Determinación de la unión

específica y no específica

2.- Experimentos de saturación:

determinación de Bmax y Kd

3.- Experimentos de competición:

determinación de Ki

4.- Experimentos de cinética

Interacción fármaco-receptor

1.- Unión específica y no específica

Incubación del tejido con concentraciones crecientes del fármaco radiactivoUNIÓN TOTAL

Repetir el experimento en presencia de una concentración saturante de ligando no radiactivo: UNIÓN NO ESPECÍFICA

Determinación de la unión específica y no específica

UNIÓN ESPECÍFICA = UNIÓN TOTAL - UNIÓN NO ESPECÍFICA

Bmax significa todos los receptores que están ocupados por el radioligando Es la unión total.

Kd es la concentración de radioligando necesaria para unirse al 50% de los receptores

Sirven para el cálculo de la densidad de receptores (Bmax) y la constante de disociación (Kd)

2.- Experimentos de saturación

[B] = [F-R] =cantidad unida

[Bmax] = RT

= nº total de sitios de unión (pmol/mg proteína)

2.- Experimentos de saturación

[RL]. [F] [F-R] = -------------

Kd

[Bmax-B]. [F] [B] = -------------------

Kd Radioligando libre (M)

Rad

ioli

gan

do

un

ido

(p

M)

[Bmax-B]. [F][B] = ---------------- Kd

[B] -1 Bmax

----- = ------ [B] + ---------[F] Kd Kd

Ecuación para la representación de Scatchard

[B] -B Bmax

----- = ------ + ---------[F] Kd Kd

Interacción fármaco-receptor

La unión también se mide en presencia de la misma concentración de radioligando más concentraciones crecientes de ligando no marcado

La unión se mide en presencia de una concentración muy alta de radioligando para ocupar todos los receptores. Curvas de saturación

Miden la capacidad de una sustancia no marcada para competir con el radioligandoSirven para el cálculo de la constante de inhibición (Ki)

3.-Experimentos de competición (inhibición)

4.- Experimentos cinéticos de asociación y disociación

La concentración de receptores se mantiene constante y la fijación se determina en función del tiempo

Tiempo (minutos)Estos experimentos permiten:- Determinar el tiempo al cual se alcanza el estado de equilibrio, para utilizarlo como tiempo de incubación en los experimentos de saturación y competición.- La determinación de K+1. Junto con la K-1 estimada en los estudios de disociación, permiten determinar la Kd.

Rad

ioli

gan

do

un

ido

(cp

m)

Estado de equilibrio

• Interaccionan con los receptores pero NO los modifican.

• Tienen afinidadafinidad pero NO actividad

• Dos tipos– Competitivos

– No competitivos

Fármacos antagonistas

Interacción fármaco-receptor

Antagonismo Competitivo

• Compite con el agonista por el receptor

• Remontable aumentando la concentración del agonista

• Desplaza las curvas concentración respuesta del agonista hacia la derecha

• Reduce la afinidad del agonista., incrementa 1/Ke (constante de disociación

Interacción fármaco-receptor

-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1-10

10

30

50

70

90

110AChACh +A 10-8ACh +A 10-7ACh +A 3x10-7

Acetilcolina (Log M)

% C

on

trac

ció

n

ANTAGONISMO COMPETITIVO

Reversible

Irreversible

NA

NA

NA +Propranolol

NA +Fenoxibenzamina

Fenoxibenzamina

Interacción fármaco-receptor

ANTAGONISMO COMPETITIVO

Reversible Irreversible

B =0B =10

B =100

Log (A) Log (A)

% R

esp

ues

ta

B=0B=10

B=100% R

esp

ues

taInteracción fármaco-receptor

Antagonismo no competitivo

• El fármaco se une al receptor y permanece unido• Es irreversible• Cuanto más receptores se ocupan (esencialmente se

inactivan) el agonista es incapaz de alcanzar el efecto máximo

• No modifica la afinidad del agonista

Interacción fármaco-receptor

ANTAGONISMO NO COMPETITIVO

B =0

B =10

B =100

Log (A)

% R

esp

ues

ta

Interacción fármaco-receptor

Emax

= Kd

Cálculo de la potencia de un antagonista

[A] + [R] [A-R] k1A

k-1A

En equilibrio:

[A] x [R] x k1A = [R-A] x k-1A

[B] x [R] x k1B = [R-B] x k-1B

[B] + [R] [B-R] k1B

k-1B

[RT] = [R] + [R-A] + [R-B]

[R] = [RT] - [R-A] - [R-B]

[A] x ([RT] - [A-R] - [B-R]) x k1A = [A-R] x k-1A

[R-B] [R-A] [kA]-------- = 1 + ------- (1 + ------- ) [RT] [RT] [A]

kB [R-A] kA kB ------- = ------- (1 + ------- ) (1 + ---- ) -1 [B] [RT] [A] [B]

[R-A] [A] -------- = ----------------------------- [RT] [A] + kA (1+ [B]/kB)

[R-A] [A] -------- = ------------- [RT] [A] + kA

[R-A] [A’] -------- = -------------------------------- [RT] [A’] + kA (1+ [B]/kB)

[A] [A’] ------------ = ------------------------- [A] + kA [A’] + kA (1+ [B]/kB)

[A] [B] ------ = 1 + -------- [A’] kB

[A] [A] [A’] [A’] ----- +----- = ------- +---------------- [A] kA [A’] kA (1+ [B]/kB)

[A’] kA ----- = ------ (1+ [B]/kB) [A] kA

Schild (1947) simplificó la ecuación de Gaddum de la siguiente manera:

Interacción fármaco-receptor

Gaddum

log ([A’]/[A] -1) = log B- log KB

Representando en abscisas log B y en ordenadas log ([A']/[A] -1), se obtiene una línea recta de pendiente 1 y la intersección con el eje de abscisas es = log KB por tanto podemos determinar la constante de afinidad (1/KB) del antagonista competitivo.

pA2 = - Log B

CÁLCULO DEL pA2

Representación de Schild

-9 -8 -7 -6 -5Log B

[A] [B] ------ = 1 + -------- [A’] kB

[A] [B] ------ -1 = ------ [A’] kB

log B = log KB

La medida práctica del antagonismo no competitivo se efectúa determinando el pD'2 que es el logaritmo cambiado de signo de la concentración molar del antagonista que reduce al 50% el efecto del agonista.

pD’2 =-Log B-2

-1,5

-1

-0,5

0

0,5

-8 -7 -6 -5 -4

Papaverina (Log M)

log

(X

-1)

log ([Emax]/[E'max] -1) = log B- log KB

Interacción fármaco-receptor

CÁLCULO DEL pD’2 PARA ANTAGONISTAS NO COMPETITIVOS

B =0

B =10

B =100

Log (A)

% R

espu

esta

Curvas Dosis-respuesta

• Graduales – respuesta medida en una escala continua

• Cuantales – respuesta del todo o nada– Relaciona dosis y frecuencia de respuesta en

una población de individuos – A menudo derivadas de frecuencia de

distribución de dosis requerida para producir un efecto específico

Interacción fármaco-receptor

Curvas dosis-respuesta cuantal (respuestas de sí/no)

Interacción fármaco-receptor

Curvas dosis-frecuencia

Cuantificación de la seguridad

Índice Terapéutico = DL50

DE50

sueño100

50

0

DE50 DL50

sueño

muertemuerte

DE50 DL50

100

50

0Po

rcen

taje

de

resp

ues

ta

Interacción fármaco-receptor

Cuantificación de la seguridad

Índice Terapéutico = DL50

DE50

Interacción fármaco-receptor

Cuanto más alto es el IT mejor es el fármaco

El IT varia de: 1.0 (algunos fármacos para el cáncer ) a: >1000 (penicilina)

Fármacos que actúan sobre el mismo receptor o sistema enzimático a menudo tienen el mismo IT