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Universidad de La Salle Universidad de La Salle
Ciencia Unisalle Ciencia Unisalle
Maestría en Ciencias Veterinarias Facultad de Ciencias Agropecuarias
2015
Detección de anticuerpos IGM contra el virus del oeste del Nilo Detección de anticuerpos IGM contra el virus del oeste del Nilo
VON en équidos con síndrome neurológico en Colombia durante VON en équidos con síndrome neurológico en Colombia durante
el año 2012 el año 2012
Jorge Elias Tamayo Rozo Universidad de La Salle, Bogotá
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Citación recomendada Citación recomendada Tamayo Rozo, J. E. (2015). Detección de anticuerpos IGM contra el virus del oeste del Nilo VON en équidos con síndrome neurológico en Colombia durante el año 2012. Retrieved from https://ciencia.lasalle.edu.co/maest_ciencias_veterinarias/47
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i
UNIVERSIDAD DE LA SALLE
FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
MAESTRÍA EN CIENCIAS VETERINARIAS
DETECCIÓN DE ANTICUERPOS IGM CONTRA EL VIRUS DEL OESTE DEL NILO
(VON) EN ÉQUIDOS CON SÍNDROME NEUROLÓGICO EN COLOMBIA DURANTE
EL AÑO 2012
JORGE ELIAS TAMAYO ROZO
Código 76131205
Director
DIEGO SOLER-TOVAR, M.V., M.Sc.
Bogotá, Colombia
2015
ii
UNIVERSIDAD DE LA SALLE
FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
MAESTRÍA EN CIENCIAS VETERINARIAS
DETECCIÓN DE ANTICUERPOS IGM CONTRA EL VIRUS DEL OESTE DEL NILO
(VON) EN ÉQUIDOS CON SÍNDROME NEUROLÓGICO EN COLOMBIA DURANTE
EL AÑO 2012
Trabajo de Grado
JORGE ELIAS TAMAYO ROZO
Código 76131205
Bogotá, Colombia
2015
iii
APROBACIÓN
DIRECTOR
__________________________________________________
DIEGO SOLER-TOVAR, M.V., M.Sc.
JURADO
____________________________________________________
NATALIA MARGARITA CEDIEL BECERRA, M.V. M.SC., Ph.D
JURADO
____________________________________________________
LUIS CARLOS VILLAMIL JIMÉNEZ, M.V. M.Sc., Ph.D.
JURADO
_____________________________________________________
MAIRO ENRIQUE URBINA AMARIS, M.V. M.Sc.
iv
DIRECTIVAS DE LA UNIVERSIDAD DE LA SALLE
Rector Hno. Carlos Gabriel Gómez Restrepo
Vicerrector Académico Hno. Carlos Enrique Carvajal Costa
Vicerrector de Investigación
y Transferencia Dr. Luis Fernando Ramírez
Vicerrector de Promoción y
Desarrollo Humano Hno. Frank Leonardo Ramos Baquero
Vicerrector Administrativo Dr. Eduardo Angel Reyes
Decano Facultad de Ciencias
Agropecuarias Dra. Claudia Aixa Mutis Barreto
Secretario Académico Dr. Alejandro Tobón González
Director de Posgrados Dr. Ernesto Dalmau
v
COMPROMISO
Los trabajos de grado no contienen ideas que sean contrarias a la doctrina católica
en asuntos de dogma y moral.
Ni la Universidad, ni el director, ni el jurado calificador son responsables de las ideas
expuestas por el graduando.
vi
AGRADECIMIENTOS
Al Instituto Colombiano Agropecuario, por permitir la realización de éste trabajo y a
todo el personal del área de Medicina Equina del Laboratorio Nacional de
Diagnóstico Veterinario por su constante apoyo.
A la Dra. Alexandra Guáqueta Agudelo, responsable analítica del área de Medicina
Equina por mi entrenamiento en el método analítico y su constante acompañamiento.
Al Dr. Diego Sóler-Tovar, por la dirección de éste trabajo, orientación permanente y
por el apoyo brindado durante todo el proceso.
vii
DEDICATORIA
A DIOS, porque gracias a él se realizan todas las metas que cada persona se
propone durante la vida, por protegerme y proteger a mi familia.
A mis Padres María Teresa y Jorge Alberto por su invaluable apoyo.
A mí Esposa Lina María y mi Hija María Juliana por su apoyo, amor, comprensión y
ser mi motor de inspiración.
viii
RESUMEN
El virus del Oeste del Nilo (VON) ha emergido en los últimos años en zonas
templadas de Europa y Norteamérica, representando una amenaza a la salud
pública. La manifestación más severa de la infección es una encefalitis letal en
humanos y équidos, así como también en ciertas aves domésticas y silvestres. La
reaparición del VON en Estados Unidos, podría propagarse y mantenerse a lo largo y
ancho de América Central y Sudamérica, como resultado de la migración de aves
infectadas, presencia de vectores competentes e ingreso de équidos infectados. La
situación geográfica de Colombia, en el área del corredor de las aves migratorias y la
presencia de algunas especies de mosquitos asociadas a la transmisión del virus,
hacen posible la presentación de la enfermedad en el país, pudiendo afectar a
humanos y équidos, razones por la cuales se desarrolló el presente trabajo para
conocer la situación actual frente a presencia de anticuerpos contra VON, mediante
la prueba de ELISA de captura Inmunoglobulina M en muestras serológicas con
notificación de síndrome neurológico ingresadas por vigilancia pasiva en el
Laboratorio Nacional de Diagnóstico Veterinario del Instituto Colombiano
Agropecuario, ICA. Se realizó diagnóstico de VON a 1090 muestras, de 727 animales
provenientes de 119 predios arrojando 1079 muestras con resultado negativo y 11
muestras con resultado indeterminado. La prueba recomendada para confirmar
resultado es la seroneutralización, la cual no se realiza en el Laboratorio Nacional de
Diagnóstico Veterinario ni en ningún otro laboratorio en Colombia. Este estudio
buscó contribuir con la disponibilidad de pruebas serológicas para el diagnóstico de
VON en Colombia y destaca la importancia de realizar diagnóstico diferencial para
las encefalitis equinas.
ix
Palabras clave: encefalitis, migración, transmisión
x
ABSTRACT
The West Nile virus (WNV) has emerged in recent years in temperate areas of
Europe and North America, posing a threat to public health. The most severe
manifestation of infection is fatal encephalitis in humans and horses, as well as
certain domestic and wild birds. The recurrence of the VON in the United States,
could spread and stay throughout Central and South America, as a result of migration
of infected birds, the presence of competent vectors and entry of infected animals.
The geographical location of Colombia, in the corridor area for migratory birds and the
presence of some species of mosquitoes associated with the transmission of the
virus, make possible the presentation of the disease in the country, can affect human
and equine reasons the which this work was developed to meet the current situation
against the presence of antibodies against WNV, by capture ELISA test
Immunoglobulin M in serum samples with neurological syndrome notification
deposited by passive surveillance at the National Veterinary Diagnostic Laboratory
Institute Colombian Agricultural, ICA. 1090 VON diagnosis samples of 727 animals
from 119 farms yielding 1079 samples and 11 negative samples with indeterminate
results was performed. The recommended test to confirm the result is the
neutralization, which is not done at the National Veterinary Diagnostic Laboratory or
in any other laboratory in Colombia. This study sought to contribute to the availability
of serological tests for the diagnosis of WNV in Colombia and highlights the
importance of differential diagnosis for equine encephalitis.
Keywords: encephalitis, migration, transmission
xi
TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN
2. MARCO TEÓRICO……………………………………………………………………...19
2.1 Síndrome Neurológico Equino (SNE)……………….………………………………..20
2.2 Epidemiología…..…….…………………………………………………………………21
2.2.1 Ecología…..………………………………………………………………………….21
2.3 Importancia en Colombia………….……………..………………………………....... 23
3. METODOLOGIA………………………………………………………………………...26
3.1 Localización………….………………………………………………………………….26
3.2 Población y muestra…………………………………………………………………….27
3.3 Métodos y procedimientos…………………………………………………………….28
4.3.1 Validación y criterios de aceptación de la prueba..……………………………….29
3.4 Diseño estadístico………………...…………………………………………………….33
4. RESULTADOS…………………....…………………….………………………………34
5. DISCUSIÓN ……………………………………………………………………………..41
6. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES……..…………………………………45
7. LISTA DE REFERENCIAS…………………………..…………………….…………..47
8. ANEXOS………………………………………………………………………………....50
xii
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Métodos analíticos disponibles para el diagnóstico de la Encefalitis del
Oeste del Nilo y sus finalidades…………………………………………………………...18
Tabla 2. Distribución por departamento del número de sueros sanguíneos analizados
año 2012 en Colombia…………………………………………………….……………… 27
Tabla 3. Resultados detección anticuerpos VON……………………………………….37
xiii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Principales rutas de aves migratorias en América. …………..………………24
Figura 2 Censo Equino Colombia……………………………… ………………………..25
Figura 3 Esquema ELISA de captura IgM …………………………………….……..….29
Figura 4 Placa muestras con resultado indeterminados…..……..……………………31
Figura 5 Número de sueros por especie……..……..……………………………………34
Figura 6 Número de sueros por sexo…….……………………………………………….35
Figura 7 Número de sueros por grupo Etáreo……..…………………………………....35
Figura 8 Número de sueros por Animales Sintomáticos y animales contacto...…….36
Figura 9 Resultados ELISA IgM……………………………………..…………………….36
Figura 10 Indeterminados………………………………………………………………….37
Figura 11 Ubicación de predios con resultado indeterminado VON.………………….38
Figura 12 Ubicación de predios objeto de estudio……....………………………….......39
Figura 13 Ubicación de predios para determinar altitud……………....………………..40
xiv
LISTA DE ANEXOS
Anexo 1. Forma 3-444, ELISA indirecta-Bloqueo para la detección de anticuerpos
IgM con fase de cubrimiento………….……………………………................................41
Anexo 2. Forma 3-290, Preparación de soluciones para ELISA indirecta captura-
Bloqueo IgM y ELISA indirecta Ig G…………..……………………………....................43
Anexo 3. Productos relacionados: Memorias VI Simposio Colombiano de Virología.55
Anexo 4. Productos relacionados: Poster VI Simposio Colombiano de Virología…..56
xv
LISTA DE SIGLAS
Sigla Español
AN Antígeno negativo
AP Antígeno positivo
CDC Centros para el control y prevención de
enfermedades de los Estados Unidos de
Norteamérica
DO Densidad Óptica
EEE Encefalitis Equina del Este
EEO Encefalitis Equina del Oeste
EEV Encefalitis Equina Venezolana
EON Encefalitis del Oeste del Nilo
ICA Instituto Colombiano Agropecuario
IgM Inmunoglobulina M
INS Instituto Nacional de Salud
LNDV Laboratorio Nacional de Diagnóstico Veterinario
SNE Síndrome Neurológico Equino
SINECO Sistema de Información Nacional de Enfermedades
de Control Oficial
SNRP Seroneutralización por reducción en placa
SP Suero problema
VON Virus del Oeste del Nilo
1. INTRODUCCIÓN
Actualmente, entre los virus emergentes de importancia en salud pública se
encuentra el Virus del Oeste del Nilo (VON), un Arbovirus RNA de cadena sencilla
(Brinton, 2002) miembro de la familia Flaviviridae. En este grupo de agentes
transmitidos por vectores, también se incluyen los virus del dengue, la Encefalitis
Japonesa, la Fiebre amarilla, la Encefalitis de San Louis y el virus del Valle de Murray
(Weiss et al 2001; Campbell et al 2002; Mackenzie et al 2002; McLean 2003; Hayes
et al 2005; Beasley et al 2005).
Este virus en el mundo, ha infectado más de 14000 personas y ha causado
cerca de 500 muertes. En adición, miles de aves de más de 200 diferentes especies
han muerto por infección del VON. Como consecuencia, el VON se ha convertido en
una seria preocupación para la salud y la conservación en lugares donde está
establecido y en áreas donde puede extenderse (Ciuoderis-Aponte, 2009).
El VON al igual que muchos otros Arbovirus tiene dos ciclos diferentes de
transmisión: un ciclo enzoótico primario o ciclo de amplificación que envuelve un
grupo de vectores y huéspedes aviares, y un ciclo secundario que involucra distintos
tipos de artrópodos y transmisión a otros huéspedes como humanos y caballos. Los
équidos parecen presentar mayor sensibilidad al virus con un número de animales
infectados que sobrepasa de manera evidente a las aves, mosquitos y seres
humanos (Fernández et al 2007).
Estudios realizados en Colombia, demostraron la primera evidencia serológica
de la actividad del VON en aves domésticas y equinos aparentemente sanos, por
17
medio de pruebas de anticuerpos neutralizantes (Mattar et al 2005; Komar y Clark
2006).
La Encefalitis del Oeste del Nilo es una zoonosis, cuya presencia no ha sido
comprobada en Colombia, mediante manifestación clínica, además de presentar un
cuadro similar con enfermedades bajo vigilancia epidemiológica como el dengue y la
Encefalitis equina venezolana de presentación en humanos. No existe diagnóstico
diferencial mediante serología para VON en équidos en Colombia.
En Colombia el síndrome neurológico en équidos, es un cuadro clínico de
notificación obligatoria ante el Instituto Colombiano agropecuario ICA. Cuenta con un
proyecto de vigilancia epidemiológica para Encefalitis equina venezolana y rabia
silvestre el cual permite recolectar, analizar y disponer oportunamente en el tiempo y
en el espacio de datos sobre la conducta de la enfermedad y de los factores que
condicionan su prevalencia (ICA, 2013). Como se mencionó, el diagnóstico de la
Encefalitis equina en Colombia va dirigido principalmente a la Encefalitis equina
venezolana, faltando realizar diagnósticos diferenciales incluyendo VON.
Los silencios epidemiológicos constituyen también una preocupación central
que justifica la formulación de éste proyecto de investigación. La ausencia o
insuficiencia de acciones de vigilancia activa tienen que ver con el poco registro de
los eventos que pueden estar teniendo una importancia mayor que la registrada
Aunque existen métodos analíticos que permiten la identificación y
diferenciación de los virus causantes de las encefalitis (Tabla 1), la mayoría de los
casos carecen del servicio diagnóstico y solo se valen de signos neurológicos
compatibles y en ocasiones de pruebas histopatológicas para sospechar de su
presencia.
18
Tabla 1. Métodos analíticos disponibles para el diagnóstico de la Encefalitis del
Oeste del Nilo y sus finalidades (OIE, 2015).
Éste estudio buscó detectar la presencia de anticuerpos de tipo IgM contra el
virus del Oeste del Nilo en muestras ingresadas al laboratorio Nacional de
Diagnóstico Veterinario del ICA, durante el año 2012, por vigilancia pasiva de
síndrome neurológico equino.
Para poder realizar el diagnóstico se estandarizó la prueba ELISA de captura
IgM, siguiendo protocolo CDC, ya que el diagnóstico de VON no se ofrecía en
LNDV.
19
2. MARCO TEORICO
La Encefalitis del Oeste del Nilo (EON) cuyo agente etiológico es el virus del Oeste
del Nilo (VON), es una zoonosis perteneciente al grupo de los Arbovirus, clasificada
dentro del género Flavivirus, familia Flaviviridae. Mantenido en la naturaleza en un
ciclo enzoótico ave-mosquito-ave. Los principales vectores son los mosquitos del
genero Culex. Las aves son los huéspedes amplificadores primarios. Humanos y
caballos son huéspedes incidentales (Zeller y Schuffenecker, 2004).
En humanos las infecciones por el virus del Oeste del Nilo se presentan como
enfermedad febril autolimitada. En los casos de enfermedad neurológica se puede
presentar encefalitis, meningitis o meningoencefalitis, con mayor incidencia y
mortalidad por encefalitis en personas de mayor edad y pacientes
inmunocomprometidos.
Se han reportado brotes en África, Medio Oriente, Europa y Asia (Kramer, Li y
Shi, 2007). El virus se detectó en Estados Unidos en la ciudad de New York en 1999,
afectando humanos, equinos y aves, principalmente cuervos y azulejos (Garmendia,
Van Kruiningen y French, 2001). De acuerdo a la información obtenida de la página
web del CDC, durante el año 2012, se presentaron en Estados Unidos 5387 casos
humanos con 243 desenlaces fatales.
Existen estudios en México (Estrada, et al., 2003), Islas Caimán (O’Leary,
Nasci, Campbell y Marfin, 2002), Jamaica (Dupuis, Marra y Kramer, 2003), Republica
Dominicana (Komar, et al., 2003), Guadalupe (Pradel, et al., 2009), Cuba y Puerto
Rico (Dupuis, et al., 2005) donde se reporta circulación viral de VON mediante
20
evidencia serológica en équidos y aves con manifestación del cuadro clínico
neurológico.
Desde los años 90, la frecuencia y severidad de las infecciones en humanos
aumentó, como también el número de reportes en una variedad de vertebrados
incluyendo mascotas, animales de granja y animales salvajes. Además, fue
reconocido en áreas no afectadas previamente (Hayes 2005).
Entre 1999 y 2002, la mortalidad aviar en Norte América, alcanzó más de
28.000 aves y comprendiendo 198 especies. Komar y colaboradores (2003, citado en
Berrocal, 2006), evaluaron las dinámicas de transmisión en 25 especies de aves que
representaron 10 órdenes diferentes y 17 familias, exponiéndolas al virus por la
picadura de mosquitos. Se observó mortalidad en ocho especies que desarrollaron
altos títulos de viremia, particularmente en las passerinas. La mayoría de aves en
este estudio sobrevivieron la fase aguda de la infección y desarrollaron anticuerpos
neutralizantes, y varios órdenes fueron incompetentes, incluyendo piciformes,
psittaciformes y galliformes. La susceptibilidad a la infección varía considerablemente
entre las especies de aves (Komar, et al., 2003).
2.1 Síndrome Neurológico Equino (SNE)
Se considera síndrome neurológico equino al conjunto de signos que incluyen
depresión profunda, anorexia, somnolencia, tambaleo al caminar, torneo, caída del
labio inferior y parálisis (ICA, INS y MAVDT, 2004).
La infección por VON en caballos y otros équidos domésticos oscila entre
presentación asintomática a la encefalitis mortal. Una mayor proporción de équidos
infectados desarrollan encefalitis en comparación con los seres humanos.
21
Experimentalmente los estudios sugieren que aproximadamente el 10% de los
caballos infectados desarrollan enfermedad clínica (Bunning, et al., 2002).
Por cuanto son muchas las enfermedades con síndrome neurológico, es
importante hacer diagnóstico diferencial principalmente entre Encefalitis equina
venezolana, Encefalitis equina del este, Encefalitis equina del Oeste, Encefalitis del
Oeste del Nilo, Rabia, Piroplasmosis, Encefalitis tóxica y Botulismo (ICA, INS y
MAVDT, 2004).
2.2 Epidemiología
El Virus del Oeste del Nilo es mantenido en la naturaleza en un ciclo enzoótico
ave-mosquito-ave. Humanos, équidos y otros vertebrados se infectan por la picadura
de mosquitos del genero Culex principalmente. En humanos se han identificado y
descrito nuevos modos de transmisión de VON incluyendo infección a través de
productos sanguíneos contaminados, transplante de órganos, transmisión a través
de la leche materna, transmisión intrauterina, y exposición ocupacional (Álvarez,
González y Máttar, 2010).
El VON causa encefalitis y puede ir de un lugar a otro, en huéspedes
infectados que se movilizan por medios de transporte. La amplia distribución de
algunos de esto virus en zonas tropicales y templadas, pueden explicarse dentro de
los movimientos migratorios de aves (Zárate, Morilla y Campero, 1999).
2.2.1 Ecología
Las aves, son los huéspedes vertebrados primarios para el VON.
Principalmente, casi todos los huéspedes vertebrados que son expuestos, ya sea por
22
inoculación o por la picadura de mosquitos infecciosos (experimental o naturalmente)
desarrollan viremia y producen anticuerpos. Sin embargo, las aves sobresalen de los
otros huéspedes vertebrados por ser amplificadores de viremias de suficiente
duración y magnitud para infectar a los mosquitos vectores (Komar, N., 2003).
El VON es mantenido en la naturaleza en un ciclo enzoótico ave-mosquito-
ave. Actualmente 43 especies de mosquitos han sido encontradas positivas para el
virus (Granwehr, et al., 2004). Las especies de huéspedes varían en su habilidad
para infectar mosquitos, esto es debido a que los huéspedes difieren en su nivel de
viremia, o la cantidad de virus que se replica y circula por su sangre.
Al igual que muchos otros arbovirus, el VON tiene dos ciclos distintos de
transmisión: un ciclo enzoótico primario o ciclo de amplificación que envuelve un
grupo de vectores y huéspedes aviares, y un ciclo secundario que envuelve
artrópodos diferentes y transmisión a otros huéspedes como humanos y équidos. En
el ciclo primario, los mosquitos ornitofílicos como Cx. Pipiens se alimentan de aves
virémicas (huéspedes amplificadores), llegan a ser infectados, y transmiten el virus a
otros huéspedes amplificadores. Si las condiciones apropiadas se dan (temperatura,
especies de mosquito, densidad de la población de mosquitos, numero de
huéspedes susceptibles) ocurrirá una epizootia en la población aviar (Berrocal, et al.,
2006).
El primer reporte de actividad del VON en el Cono Sur del continente
americano coincidió con la muerte de tres equinos en el 2006 en Buenos Aires,
Argentina (Morales et al 2006; Diaz et al 2008), y en el mismo país, Diaz y Col (2008)
demostraron en un estudio que 474 especies de aves silvestres resultaron positivas
para Flavivirus por la técnica de ELISA de bloqueo, de las cuales, en 43 muestras
23
arrojó positividad serológica por la prueba de neutralización por reducción en placa,
evidenciando la circulación viral en el sur de Suramérica. Igualmente en Venezuela,
Bosch y Col (2007) mediante la prueba de neutralización por reducción en placa,
encontraron la positividad serológica del VON en 5 aves adultas, 4 de las cuales
fueron paseriformes (Ciuoderis-Aponte, 2009).
En Brasil en la región de Pantanal, hay evidencia serológica de amplia
circulación del VON y otros flavivirus en Equinos, mediante la técnica de ELISA y
seroneutralización en placa; de 760 equinos muestreados, 172 (22,6%) arrojaron
títulos para VON (Pauvolid-Correa, et al., 2014).
2.3 Importancia en Colombia
Colombia es la puerta de entrada a la porción sur del continente americano,
con aproximadamente 1830 especies de aves (179 migratorias), 43 de las cuales el
virus se ha reportado a través de infecciones o mortalidad, anidan en Norteamérica y
realizan migraciones al Neotrópico (Figura 1). Colombia cuenta con
aproximadamente 43 especies de aves migratorias procedentes de EE.UU. y
Canadá, países en donde se ha encontrado la presencia del VON (NWHC, 2002;
CDC, 2013).
Las aves migratorias son un riesgo de propagación del virus hacia el sur del
continente ya que existen zonas donde podría estar presente y multiplicarse durante
todo el año convirtiéndose en fuente de reinfección para el Hemisferio Occidental
(Soler y Vera, 2006).
24
Figura 1. Principales rutas de aves migratorias en América (Adaptado de SENASA,
2012).
La importancia en salud pública del VON si es introducido en áreas de Centro
y Sur América dependerá del resultado de la interacción de múltiples factores.
Colombia reúne las condiciones que favorecen su entrada y desarrollo. Esto
dependerá de la susceptibilidad de las especies aviares colombianas al virus por las
diferencias en su biología, y a las variaciones geográficas específicas en la
competencia de las diferentes especies de mosquito y los efectos de las condiciones
medioambientales sobre su habilidad para transmitir el virus, y estos factores son
determinantes en el ciclo de amplificación primario (Berrocal, Peña, González y
Mattar, 2006).
25
Colombia reúne las condiciones que favorecen la entrada y desarrollo del
VON y que puede afectar a la especie équida cuya población está estimada en
1.533.432 animales (Figura 2), además de la susceptibilidad de las especies aviares
Colombianas al virus por las diferencias en su biología, y a la variaciones geográficas
específicas.
Figura 2. Censo Equino Colombia (ICA, 2013).
26
3. METODOLOGÍA
El estudio se realizó en el Laboratorio Nacional de Diagnóstico Veterinario, LNDV,
del ICA con sede en Bogotá, en el Area de Medicina Equina. Se realizó un estudio
transversal de presencia de anticuerpos, mediante la técnica de ELISA de captura
IgM para el Virus del Oeste del Nilo. Se realizó diagnóstico diferencial de la
Encefalitis del Oeste del Nilo sobre las muestras serológicas de animales
sindrómicos y de animales contactos de los casos ingresados al área de Medicina
Equina con síndrome neurológico equino y solicitud de diagnóstico de Encefalitis
equina venezolana durante el año 2012 y cuyas muestras provenían de diferentes
regiones del país y que se registraron mediante vigilancia pasiva.
3.1. Localización. Los departamentos que incluyó el estudio fueron, Antioquia,
Arauca, Atlántico, Bolívar, Caldas, Casanare, Cauca, César, Chocó, Córdoba,
Cundinamarca, Magdalena, Nariño, Norte de Santander, Quindío, Risaralda,
Santander, Tolima y Valle del Cauca. Con base en la revisión del Sistema de
Información Nacional de Enfermedades de Control Oficial –SINECO- se estableció
ubicación de predios, mediante datos de geoposicionamiento y cuadrante, para ser
plasmados en mapas usando programas ArcGIS versión 9.2 y MapSource versión
6.15.11.0.
27
3.2 Población y Muestra. La población Équida reportada por el ICA en 2013 para los
anteriores departamentos es de 1.271.667 ejemplares, de un total en Colombia de
1.559.216 (figura 2). Mediante la depuración de la base de datos del Area de
Medicina Equina del LNDV y revisión del banco de sueros, el número de muestras
que se procesaron y que ingresaron al laboratorio por vigilancia pasiva durante el
año 2012 fueron de 1090 (Tabla 2).
Tabla 2. Distribución por departamento del número de sueros sanguíneos analizados
año 2012 en Colombia.
Departamento Sueros Sanguíneos
Antioquia 197
Arauca 21
Atlántico 1
Bolívar 42
Caldas 2
Casanare 88
Cauca 157
César 80
Chocó 31
Córdoba 42
Cundinamarca 2
Magdalena 197
Nariño 23
Norte de Santander 22
Quindío 2
Risaralda 9
Santander 9
Tolima 39
Valle 126
TOTAL 1090
28
3.3 Métodos y procedimientos. Los análisis para la detección de la inmunoglobulina
M (IgM) viral específica detectan los anticuerpos producidos durante los primeros
días después del inicio de síntomas clínicos en una infección primaria evitando la
necesidad de muestras en la fase convaleciente en muchos casos.
Las muestras sanguíneas o serológicas deben estar libres de contaminación,
hemólisis y lípidos. Se centrifugan las muestras que lleguen con sangre completa a
3000 rpm por 5 minutos y se separan los sueros en viales debidamente identificados
con el número de solicitud, la identificación del animal y la fecha de recepción (A-M-D).
Se organizan las muestras serológicas en gradillas por número de solicitud y orden de
relación. Se almacenan todos las muestras diagnosticas a 4C antes de realizar el
ensayo y a -20C después de haber completado el ensayo, evitar ciclos continuos de
congelación y descongelación.
Para el montaje del método, se usan microplacas de 96 pozos que son
sensibilizadas (cubiertas) con un anticuerpo anti IgM de equino, seguido por la
adición de la muestra serológica del animal y del antígeno específico de la
enfermedad. La presencia del antígeno es detectada usando un anticuerpo anti
grupo viral conjugado con la enzima y un resultado colorimétrico es generado por la
interacción de la enzima y el cromógeno del sustrato (Figura 3). Esto es lo que
constituye la técnica de ELISA de Captura, siguiendo el protocolo de estandarización
CDC, descrito por Martin y Colaboradores en el año 2000, el cual se desarrolló en
condiciones de bioseguridad nivel 2.
29
Figura 3. Esquema ELISA de captura IgM (Martin, 2000).
3.3.1 Validación y criterios de aceptación de la prueba
Los criterios de aceptación del método analítico consisten en calcular la
relación P/N (promedio de densidad óptica del control positivo sobre el promedio de
densidad óptica del control negativo), del control positivo (CP) de los pozos que
reaccionan con el antígeno positivo (AP) con respecto al control negativo (CN) que
reacciona con el AP así:
Valor final P/N= Promedio de DO del CP reaccionando con el AP Promedio de DO del CN reaccionando con el AP
Se verifica que en cada placa utilizada en el ensayo, el valor final de P/N del CP
sea mayor o igual a 2.0. En caso contrario, repetir el ensayo.
30
Para la obtención de resultado del suero problema (SP) se debe calcular el valor
promedio de las Densidades Ópticas (DO) de los duplicados del SP con antígeno
positivo. Para hallar el valor del P/N de cada SP, se utiliza la siguiente fórmula:
Valor final P/N = Promedio de DO del SP reaccionando con el AP Promedio de DO del CN reaccionando con el AP
La positividad o negatividad del cada SP se determina teniendo en cuenta:
Un resultado es positivo a presencia de anticuerpos IgM contra VON, cuando
el valor de P/N es mayor o igual a 2.0 y el valor de DO promedio del SP con el
antígeno positivo es mayor al umbral de positividad y el valor de DO promedio del
mismo SP con el antígeno negativo es menor que el valor de umbral de positividad
hallado para la placa.
Si se evidencia reactividad del SP tanto con el AP como con el AN, para
definir el resultado como positivo se debe aplicar la siguiente fórmula:
Reactividad = Promedio de DO del SP con AP - Promedio de DO del SP con AN.
El resultado debe ser mayor que el valor del umbral de positividad de la placa
para considerar el SP como Positivo.
Valores de P/N que resulten entre 2.0 y 3.0 son considerados como críticos y
pueden ser reacciones falsas positivas. Por tanto, se debe repetir el análisis y verificar
los resultados. Si el valor de P/N en el segundo ensayo permanece igual, el SP es
considerado como positivo a presencia de anticuerpos IgM.
Un resultado es negativo a presencia de anticuerpos IgM contra el virus VON,
cuando los valores de P/N son menores a 2.0 y el valor de DO promedio del SP
con el antígeno positivo es menor al umbral de positividad hallado para la placa.
31
Un resultado es indeterminado a presencia de anticuerpos IgM contra VON,
cuando se evidencia reactividad en los valores promedio de las DO del SP tanto
con el AP como con el AN y el resultado de la reactividad hallada para el SP es
menor al umbral de positividad (Figura 4). Para este resultado se debe solicitar una
nueva muestra.
Figura 4. Placa muestras con resultado indeterminado.
Ejemplo: para el SP # 1
Pozo SP DO Promedio
DO
Valor del umbral de Positividad de la
placa
A1 SP con AP
0.800 0.846
0.200 B1 0.892
C1 SP con AN
0.690 0.678
D1 0.666
32
Análisis del resultado: comparar los valores promedio de la DO del SP tanto
con el AP como con el AN para determinar presencia de reactividad con respecto al
valor del umbral de positividad de la placa:
Promedio DO con AP = 0.846
Ambos valores exceden el umbral de positividad (0.200) Promedio DO con AN = 0.678
Hallar la reactividad así:
Reactividad = Promedio de DO del SP con AP - Promedio de DO del SP con AN.
Reactividad = 0.846 – 0.678 = 0.168
Determinar si el resultado de la reactividad excede o no el valor del umbral de
positividad. Para el ejemplo 0.168 no excede el umbral de positividad de la placa. Por
lo tanto, el resultado es inespecífico y se debe solicitar una nueva muestra y el
resultado debe ser informado como indeterminado.
Todo resultado positivo o indeterminado, se recomienda confirmarlo por la
prueba de seroneutralización en placa (SNRP), la cual se lleva a cabo en cultivos
celulares Vero en recipientes de 25 cm2 o en placas de 6 pocillos. Los sueros se
pueden analizar a una dilución final de 1/10 y 1/100 o se pueden valorar para
establecer un punto final.
33
3.4 Diseño estadístico. Se realizó un estudio transversal en animales con síndrome
neurológico y en animales contactos para detectar presencia de anticuerpos IgM
contra el VON y que permitiera clasificarlos como positivos, negativos o
indeterminados. Resultados se mostrarán a través de gráficos y tabla que
relacionarán la presencia o ausencia de anticuerpos IgM.
Animales Sintomáticos Animales Contactos
Resultados Positivos
Resultados Negativos
Resultados Indeterminados
34
4. RESULTADOS
Se analizaron 1090 muestras, de 727 animales provenientes de 119 predios en 19
departamentos de Colombia. De las 1090 muestras serológicas de los équidos
estudiados, 51 correspondieron a asnales, 982 correspondieron a equinos y 57
correspondieron a mulares (Figura 5).
Figura 5. Número de Sueros por Especie
De los 727 animales, la distribución por sexo fue de 371 (51,03 %) hembras y
356 (48,97 %) machos (Figura 6); en cuanto a grupos etáreos, 367 (50,49 %) muestras
corresponden al grupo comprendido entre 0 y 5 años de edad, 273 (37,56 %) muestras
al grupo de entre 5 y 10 años de edad, 76 (10,46 %) muestras al grupo de entre 10 y 15
años de edad y 11(1,49 %) muestras al grupo de entre 15 y 20 años de edad (Figura
7).
35
Figura 6. Número de Sueros por Sexo
Figura 7. Número de Sueros por Grupo Etáreo
De las 1090 muestras analizadas, 155 (14.22%) correspondieron a animales
sintomáticos y 935 (85.78%) correspondieron a animales contactos (Figura 8).
36
Figura 8. Número de Sueros por Animales Sintomáticos y Animales Contacto
En la determinación por ELISA IgM se detectaron 1079 (98.99%) sueros
negativos y 11 (1.01%) sueros indeterminados (Figura 9).
Figura 9. Resultados ELISA IgM.
De las 11 muestras con resultado indeterminado, 2 muestras corresponden a
animales sintomáticos y 9 muestras corresponden a animales contactos (Tabla 3).
37
Tabla 3. Resultados detección anticuerpos VON
Animales Sintomáticos Animales Contactos
Resultados Positivos 0 0 0
Resultados Negativos 153 (98,70 %) 926 (99,04 %) 1079
Resultados Indeterminados 2 (1,3 %) 9 (0,96 %) 11
155 (100 %) 935 (100 %) 1090
Los resultados indeterminados en animales sintomáticos fueron 13 veces más
frecuentes que los resultados indeterminados en los animales contactos.
Las 11 muestras con resultado indeterminado para VON, todas tienen
resultado negativo a EEV, aclarando que tres de ellas provienen de predios donde
hubo diagnóstico positivo a EEV en otros animales (Figura 10).
Figura 10. Indeterminados
38
Las 11 muestras con resultado indeterminado para VON, provienen de 5
departamentos, coincidiendo con tres predios donde también se diagnosticó EEV
durante el año 2012, en Unguía, departamento de Chocó, Obando y Zarzal
departamento de Valle del Cauca (Figura 11). Son zonas caracterizadas por la
presencia de vectores y por ser paso de aves que siguen las rutas migratorias hacia
el neotrópico.
Para los resultados indeterminados, no se no se realizó prueba confirmatoria
de seroneutralización en placa, debido a que dicha prueba no se realiza en LNDV, ni
en otro laboratorio del país.
Figura 11. Ubicación predios con resultado indeterminado VON.
39
Se seleccionó el número de caso asignado en Laboratorio Nacional de
Diagnóstico Veterinario, para posteriormente con esos datos ingresar al Sistema de
Información Nacional de Enfermedades de Control Oficial -SINECO- para conocer su
ubicación mediante datos de geoposicionamiento y cuadrante (Figura 12). Con dicha
información se realizó un mapa en el sistema de información espacial MapSource,
para establecer la altitud de los predios, en el cual se pudo determinar que 3 predios
se encuentran por encima de los 3000 msnm, 10 predios por encima de 1600 msnm
y 83 predios por debajo de 1600msnm (Figura 13).
Figura 12. Ubicación predios objeto de estudio.
40
Figura 13. Ubicación de predios para determinar altitud.
41
5. DISCUSIÓN
Respecto al resultado indeterminado a presencia de anticuerpos IgM contra VON,
éste se da, cuando se evidencia reactividad en los valores promedio de las DO del
SP tanto con el AP como con el AN y el resultado de la reactividad hallada para el SP
es menor al umbral de positividad. En éste estudio 11 muestras arrojaron resultado
indeterminado. En el estudio de Murray y colaboradores en 2013, las muestras con
resultado indeterminado fueron corridas por duplicado y aquellas que siguieron
arrojando resultado indeterminado fueron excluidas del estudio; Focus diagnostic,
2003, excluye de su estudio a 4 muestras con resultado indeterminado de un total de
293 muestras analizadas.
Soler-Tóvar y Vera, en su estudio de 2006, evaluación del virus del Oeste del
Nilo en aves silvestres de una isla del Caribe colombiano, reportan que tanto para la
detección de antígeno como para el aislamiento viral fueron negativos, empleando la
prueba VecTest West Nile Virus Antigen Assay y la inoculación en células Vero. Si
bien no se encontró evidencia de la presencia del virus en las aves silvestres
evaluadas, existe el riesgo potencial de aparición de este virus en la isla debido a la
existencia de poblaciones de mosquitos vectores activos durante todo el año.
Álvarez, González y Mattar, en 2010, reportan en su estudio, actividad del virus del
Oeste del Nilo y otros flavivirus en cinco departamentos del Caribe colombiano, en
muestras de équidos y aves, que al inicio del estudio encontraron una
seroprevalencia en équidos para VON y encefalitis de San Luis (ESL) del 4.8%,
47/971 animales y del 3%, 30/971 animales respectivamente y a la finalización del
mismo la seroprevalencia en équidos para VON fue del 8%, 79/971 animales y para
42
ESL del 4.5%, 44/971 animales. Se Observó seroconversión a través de los
diferentes muestreos, aplicando la técnica de Elisa de bloqueo para flavivirus usando
anticuerpos monoclonales MAb 6B6C-1. Los positivos, se analizaron con la misma
técnica para la detección de anticuerpos específicos para VON usando anticuerpos
monoclonales Mab 3.1112G. Se realizó confirmación por seroneutralización en placa.
De acuerdo a Pelegrino y colaboradores en 1996 y citado por Mesa, Cárdenas
y Villamil, las encefalitis equinas como la EEE, EEO, EEV, la Encefalitis de San Luis
(ESL), Encefalitis de California (EC), La Crosse, la Encefalitis del Oeste del Nilo
(EON) son ocasionadas por agentes del grupo de los Arbovirus (transmitidos por
vectores), al cual pertenecen también los agentes causales de algunas de las
enfermedades zoonóticas de mayor importancia en las Américas, entre las que se
destacan el Dengue y la Fiebre amarilla, entre otras. Debido a que los arbovirus
estrechamente relacionados producen reacciones serológicas cruzadas, es
necesario desde el punto de vista epidemiológico identificar el virus causante de la
infección mediante pruebas de neutralización por reducción de placas utilizando una
batería apropiada de flavivirus muy relacionados (Roehrig, et al., 2003). Sí bien no se
pudo realizar la prueba confirmatoria en ésta oportunidad, quedó establecido con la
Dirección Técnica de Vigilancia Epidemiológica del ICA, que en futuras ocasiones, ya
sean estudios prospectivos o diagnósticos diferenciales de rutina, toda muestra con
resultado indeterminado o resultado positivo, mediante ELISA IgM, se debe confirmar
y enviar a CDC para diagnóstico de seroneutralización en placa.
De otro lado, el impacto en salud pública y veterinaria del VON en regiones
como Sur América, en donde otros flavivirus circulan, no puede predecirse,
desconociéndose su futura dinámica en estas regiones.
43
En éste estudio, el número de muestras analizadas de hembras y machos fue
de 371 y 356 sobre los 727 sueros respectivamente, casi igual en porcentaje; de
acuerdo a categorías etáreas, 362 muestras corresponden al grupo comprendido entre
0 y 5 años de edad, 273 muestras al grupo de entre 5 y 10 años de edad, 76 muestras
al grupo de entre 10 y 15 años de edad y 11 muestras al grupo de entre 15 y 20 años
de edad. Según reporte realizado por Rey y Rutledge en 2001, la infección con el VON
no tuvo relación con el sexo, edad, raza, o tamaño del caballo.
Las zonas donde hay predios con resultados de VON indeterminados,
corresponden a sitios por donde migran aves a zonas Australes y además cuentan con
presencia de vectores. Factores que contribuyen a aumentar el riesgo de diseminación
de la enfermedad son, la abundancia de vectores en contacto con aves y humanos y a
la presencia de aves migratorias infectadas, sin embargo, es importante recordar que
para la aparición de un brote o epidemia causada por arbovirus deben converger una
serie de condiciones entre las que destacan la densidad poblacional y suficiente
actividad de mosquitos ornitofílicos, huéspedes virémicos, amplificadores y susceptibles
(Ciuderes y Aponte, 2009). Este escenario pudiera favorecer la aparición de epizootias
en aves, o en équidos, y posibles casos humanos, tanto sintomáticos como
asintomáticos.
La Encefalitis equina del este, la Encefalitis equina del Oeste y la Encefalitis
equina venezolana pertenecen a otra familia de virus, y no hay protección cruzada
con el virus del Oeste del Nilo. Los casos de presentación en Colombia, de
Encefalitis equina venezolana en 2012, se registraron en predios donde no hubo
vacunación contra la misma, de igual manera a otros estudios como los de Valero y
colaboradores en 2004, en donde además no se encontraron diferencias en las
44
prevalencias de acuerdo a género y especie. De 1090 muestras procesadas, 155
muestras fueron de animales sintomáticos y 935 contactos; los 7 casos registrados
de EEV en Colombia, para el año 2012, se produjeron en 19 animales con síndrome
nervioso. Las restantes 136 muestras de équidos con síndrome nervioso y resultado
negativo a EEV, posiblemente obedezcan a otros agentes y resalta la importancia de
realizar diagnóstico diferencial, correspondiendo de igual manera con lo reportado
por Pisano y colaboradores para el año 2009 en Argentina.
Manifestaciones neurológicas encontradas en predios con altitudes superiores
a 1600 msnm, posiblemente se expliquen por algunos de los siguientes cuadros
clínicos: la estenosis cervical, Herpes virus tipo 1, disfunción neurológica por trauma,
neuropatía degenerativa equina, mieloencefalitis protozoaria equina, encefalitis
rábica, infestaciones parasitarias del sistema nervioso causadas por el nemátodo
Halicephalobus gingivalis (Micronema deletrix), intoxicaciones con organofosforados
y sorgo, Tripanosomiasis, y abscesos cerebrales producidos por bacterias como
Escherichia coli, Pasteurella spp y Streptococcus sp.(Urrea, 2012).
45
6. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Colombia, por su ubicación geográfica, diversidad de posibles reservorios, vectores y
características climatológicas de predominio tropical, reúne todas las condiciones
que favorecen el establecimiento de VON.
Los predios en éste estudio, de donde proceden las muestras, hay 2 que
superan los 3000 msnm, 10 predios que se encuentran por encima de 1600 msnm y
83 predios están ubicados a una altitud no mayor de 1600 msnm; como notamos, en
la gran mayoría de predios se encuentran los factores de riesgo ambientales e
infecciosos que harían posible la presencia de aves y mosquitos, que pudieran
transmitir VON.
Es importante reconocer el síndrome neurológico équido mediante el
abordaje de diagnóstico diferencial, incluyendo la Encefalitis del Oeste del Nilo.
Con el presente estudio se espera contribuir a la disponibilidad de pruebas
serológicas para el diagnóstico de VON en Colombia. Ofrecer diagnóstico diferencial
de rutina a muestras registradas bajo vigilancia pasiva con síndrome neurológico
equino.
Este estudio es punto de partida para investigaciones epidemiológicas
prospectivas que lo complementen o profundicen.
Esta prueba se usa por primera vez en el país, para diagnóstico diferencial de
síndrome neurológico. No se demostró infección viral por VON. Se resalta la
importancia de contar con bancos de sueros de Équidos, para ser usados en
estudios epidemiológicos.
46
Se recomienda se considere a este agente en el diagnóstico diferencial de
enfermedades virales de humanos y otros vertebrados de interés veterinario. Dado
que actualmente no se investiga rutinariamente VON en casos de meningitis y/o
encefalitis, y que la enfermedad neuroinvasiva suele ser indistinguible de la
producida por otros virus, es fundamental que exista una rápida comunicación y
coordinación entre sanidad animal y salud pública cuando se detecte mortalidad
anormalmente elevada en aves o caballos en una determinada zona. De esta forma
se podrá alertar a los clínicos para incluir la investigación de VON en el estudio de
meningitis y encefalitis con sospecha de etiología viral. Es por ello que el trabajo en
conjunto del grupo de salud animal como de salud pública, se hace necesario.
Se recomienda el monitoreo y diagnóstico temprano de este riesgo potencial
para nuestro país. Además es importante destacar la necesidad de ampliar los
sistemas de vigilancia a otras especies de reservorios y huéspedes potenciales.
Además, se debe contar con herramientas diagnósticas adicionales en Colombia,
entre ellas, se recomienda la prueba confirmatoria de seroneutralización en placa.
47
7. LISTA DE REFERENCIAS
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50
8. ANEXOS
Anexo 1. Forma 3-444, ELISA indirecta-Bloqueo para la detección de anticuerpos IgM con fase de cubrimiento
51
52
Anexo 2. Forma 3-290, Preparación de soluciones para ELISA indirecta captura-Bloqueo IgM y ELISA indirecta Ig G
53
54
Anexo 3. Productos relacionados: Memorias VI Simposio Colombiano de Virología.
55
Anexo 4. Productos relacionados: Poster VI Simposio Colombiano de Virología.
