Embed Size (px)
Citation preview
Diagnóstico Bioquímico de las Enfermedades Lisosomales por el Laboratorio Clínico Dr. Joaquín Bobillo Lobato Laboratorio de Enfermedades Lisosomales HHUU Virgen del Rocío de Sevilla
Sevilla, 16 de octubre de 2014
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014
Diagnóstico Bioquímico de las
Enfermedades Lisosomales por el
Laboratorio Clínico
Las enfermedades lisosomales
Estrategias diagnósticas Actividad enzimática
Sustrato acumulado
Productos atípicos
Algunos ejemplos diagnósticos
8º C
ON
GR
ES
O N
AC
ION
AL
DE
LA
BO
RA
TO
RIO
CL
ÍNIC
O
Sevilla, 16 de octubre de 2014
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014
Las enfermedades lisosomales
Enfermedades metabólicas “citológicas” Lisosoma
Enzimas, proteínas, cofactores
Enfermedades de depósito Progresivas
≈ 50 enfermedades 1/7000-8000
Clasificación Naturaleza del compuesto acumulado
Lipidosis Mucopolisacaridosis Glucogenosis
Defecto molecular Hidrolasas lisosomales Def. postraduccionales Def. tráfico
8º C
ON
GR
ES
O N
AC
ION
AL
DE
LA
BO
RA
TO
RIO
CL
ÍNIC
O
Glucoproteinosis Mucolipisosis Liposusinosis
Def. protección Proteínas no enzimáticas Proteínas transmembrana
Sevilla, 16 de octubre de 2014
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014
Sevilla, 16 de octubre de 2014
Enfermedades Lisosomales Fundamento
8º C
ON
GR
ES
O N
AC
ION
AL
DE
LA
BO
RA
TO
RIO
CL
ÍNIC
O
Acción enzimática lisosomal
Deficiencia enzimática lisosomal
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014
Enfermedades Lisosomales Consecuencias fisiopatológicas
Déficit enzimático
Acúmulo de sustancias no degradadas
Deficiencia de productos
Aparición de productos
atípicos
8º C
ON
GR
ES
O N
AC
ION
AL
DE
LA
BO
RA
TO
RIO
CL
ÍNIC
O
DIAGNÓSTICO
Diagnóstico
Sevilla, 16 de octubre de 2014
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014
Sevilla, 16 de octubre de 2014
DIAGNÓSTICO Déficit Enzimático
Poner de manifiesto la deficiencia de actividad enzimática
8º C
ON
GR
ES
O N
AC
ION
AL
DE
LA
BO
RA
TO
RIO
CL
ÍNIC
O
SUSTRATO
Marcador
Marcador
Cuantificación equipo de
análisis
Inte
nsi
dad
de
señ
al
Actividad enzimática
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014
Sevilla, 16 de octubre de 2014
DIAGNÓSTICO Déficit Enzimático
Poner de manifiesto la deficiencia de actividad enzimática
Sangre seca en papel
Células Tejidos
Muestras
8º C
ON
GR
ES
O N
AC
ION
AL
DE
LA
BO
RA
TO
RIO
CL
ÍNIC
O
Sustratos Específico
de la enzima
Marcador
Marcadores
Productos Óxido-reducción
Fluoróforos 4-metil-umbeliferona
Derivat. de sustratos Productos z/m específicos
Nuevos marcadores “Nano-química”
Métodos de análisis
Espectrofotometría
Espectrofluorimetría
Espectrometría de masas
Nuevos sistemas de detección
Fabry Galactosa
Gaucher 4-MU-β-D-glucopiranosido
Análisis multiplex
Puntos cuánticos
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014
Sevilla, 16 de octubre de 2014
DIAGNÓSTICO Déficit Enzimático
Poner de manifiesto la deficiencia de actividad enzimática
8º C
ON
GR
ES
O N
AC
ION
AL
DE
LA
BO
RA
TO
RIO
CL
ÍNIC
O
LIM
ITA
CIO
NE
S
Isoenzimas
Control condiciones ensayo
Sustratos específicos
Inhibidores específicos
Efecto Lyon y/o Mosaicismos
Índices enzimas específicas
Estudio genético
Otras limitaciones
Soluciones particulares
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014
Sevilla, 16 de octubre de 2014
DIAGNÓSTICO ENZIMÁTICO Enfermedad de Pompe
Actividad α-Glucosidasa ácida (EC 3.2.1.20)
8º C
ON
GR
ES
O N
AC
ION
AL
DE
LA
BO
RA
TO
RIO
CL
ÍNIC
O
MUESTRA SUSTRATO-4MU PRODUCTO
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Linfocitos
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014
Sevilla, 16 de octubre de 2014
DIAGNÓSTICO ENZIMÁTICO Enfermedad de Pompe
Actividad α-Glucosidasa ácida (EC 3.2.1.20)
8º C
ON
GR
ES
O N
AC
ION
AL
DE
LA
BO
RA
TO
RIO
CL
ÍNIC
O
Actividad Ácida Total
AαG
Actividad Inhibida
AαGIA
Actividad Neutra Total
NαG
Blanco Ácido
Blanco Neutro
Buffer ácido Sustrato ácido Acarbosa Buffer neutro Sustrato neutro Buffer ácido Buffer neutro
AαG
• Actividad αG en el lisosoma
• Incluye maltasas ácidas
NαG
• Actividad glucosidasa total
• Similar entre Sanos y Pompe
• Calidad del proceso
AαGIA
• Actividad efectiva
• AαG componente principal
• Pompe: AαG AαGIA
NαG/AαGIM
(AαG-AαGIM)/ /AαGIM
• Diferente comportamiento de las distintas facciones de actividad αG permite diferenciar pacientes Pompe
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014
DIAGNÓSTICO Sustancias no degradadas
Poner de manifiesto el acúmulo de sustratos no degradados
8º C
ON
GR
ES
O N
AC
ION
AL
DE
LA
BO
RA
TO
RIO
CL
ÍNIC
O
PRODUCTO
FINAL Enzima
Productos
Intermedios Enzima
SUSTRATO ESPECÍFICO
SUSTRATOS
Sangre Orina Tejidos
DETERMINACIÓN
Microscopía / Tinción Fotometría
Cromatografía Espectrometría…
Déficit de productos
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014
Sevilla, 16 de octubre de 2014
DIAGNÓSTICO Sustancias no degradadas
Poner de manifiesto el acúmulo de sustratos no degradados
8º C
ON
GR
ES
O N
AC
ION
AL
DE
LA
BO
RA
TO
RIO
CL
ÍNIC
O
Ferraz et al. Biochim Biophys Acta. 2014;1841(5):811-25
Groener et al. Clin Chem. 2007;53(4):742-47
Chuang et al. Orphanet J Rare Dis. 2014; 9:135
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014
DIAGNÓSTICO SUSTANCIAS NO DEGRADADAS MPS
Poner de manifiesto el acúmulo de sustratos no degradados
8º C
ON
GR
ES
O N
AC
ION
AL
DE
LA
BO
RA
TO
RIO
CL
ÍNIC
O
Diagnóstico de MPS
Test de Berry
GAG´s en orina
Cromatografia en capa fina
Sevilla, 16 de octubre de 2014
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014
DIAGNÓSTICO Productos atípicos
Poner de manifiesto la presencia/aumento de sustancias atípicas
8º C
ON
GR
ES
O N
AC
ION
AL
DE
LA
BO
RA
TO
RIO
CL
ÍNIC
O
Ruta alternativa
Ruta alternativa
Ruta alternativa
Ruta alternativa
PRODUCTO
FINAL Enzima
Productos
Intermedios Enzima
SUSTRATO ESPECÍFICO
COMPENSACIÓN
HOMEOSTÁTICA
PRODUCTOS ATÍPICOS
DETERMINACIÓN
Fotometría Fluorometría
Cromatografía Espectrometría…
Sevilla, 16 de octubre de 2014
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014
Sevilla, 16 de octubre de 2014
DIAGNÓSTICO Productos atípicos
Poner de manifiesto la presencia/aumento de sustancias atípicas
8º C
ON
GR
ES
O N
AC
ION
AL
DE
LA
BO
RA
TO
RIO
CL
ÍNIC
O
Cht
CCL18/PARC
Complejo HC IIT Glc4
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014
DIAGNÓSTICO PRODUCTOS ATÍPICOS Enfermedad de Fabry
Poner de manifiesto la presencia/aumento de sustancias atípicas
8º C
ON
GR
ES
O N
AC
ION
AL
DE
LA
BO
RA
TO
RIO
CL
ÍNIC
O
X Xfb
Co
ntr
ol
Fa
bry
Rombach et al. Biochim Biophys Acta. 2010;1802(9):741-8.
METODOLOGÍA HPLC
Extracción lipídica con solventes orgánicos
Fase de derivatización OPA
Columna de separación UNISON UK-C18
Fase móvil: Metanol/agua
Flujo de 1,0 ml/min
Tiempo recorrido cromatográfico 30 min.
Tiempo de retenión 9,5 min.
Detección fluorescente:
Excitación: 340 nm
Emisión: 435 nm
Estándar interno: D-eritro-dihidroesfingosina
Groener et al. Clin Chem. 2007;53(4):742-47
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014
Diagnóstico Bioquímico de las
Enfermedades Lisosomales
Estrategias diagnósticas
8º C
ON
GR
ES
O N
AC
ION
AL
DE
LA
BO
RA
TO
RIO
CL
ÍNIC
O
Sevilla, 16 de octubre de 2014
PATOLOGÍA ACTIVIDAD
ENZIMÁTICA SUSTRATO
ACUMULADO PRODUCTOS
ATÍPICOS
ENFERMEDAD DE POMPE
α-glucosidasa ácida y fracciones
(DBS y Linfocitos) …
Glucosa tetrasacárido
(Orina)
ENFERMEDAD DE FABRY
α-galactosidasa (DBS y Plasma)
… Lyso-Gb3 (Plasma)
ENFERMEDAD DE GAUCHER
β-glucosidasa (DBS y Leucocitos)
… Quitotriosidasa
y CCL18/PAR (Plasma)
MPS TIPO I α-iduronidasa
(DBS y Leucocitos) GAG´s (orina)
…
OTRAS ENF. LISOSOMALES
β-galactosidasa β-glucuronidasa
… …
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014
Laboratorio de enfermedades lisosomales Sevilla
8º C
ON
GR
ES
O N
AC
ION
AL
DE
LA
BO
RA
TO
RIO
CL
ÍNIC
O
Laboratorio de enfermedades lisosomales 3ª Planta, Ed. Laboratorios, HHUU Virgen del Rocío
Manuel Siurot s/n, 41013 Sevilla Dr. Luis Jiménez Jiménez ([email protected]) Hospital Universitario Virgen del Rocío
Dr. Joaquín Bobillo Lobato ([email protected])
Hospital Universitario Virgen de Valme
Pilar Durán Parejo (TEL) ([email protected]) Hospital Universitario Virgen del Rocío
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014
Diagnóstico bioquímico de enfermedades lisosomales en España
Hospital Clínico Universitario de Santiago
de Compostela
Dr. Cristóbal Colón Mejeras
8º C
ON
GR
ES
O N
AC
ION
AL
DE
LA
BO
RA
TO
RIO
CL
ÍNIC
O
Sevilla, 16 de octubre de 2014
Inst. de Bioquímica Clínica Hospital Clínic
Dr. Wladimiro Jiménez Povedano Dra. Antònia Ribes Rubió
Fundación Jiménez Díaz
Dr. Jesús Egido de los Ríos
Hospital Universitario Virgen del Rocío
Dr. Luis M. Jiménez Jiménez
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014
MUCHAS GRACIAS
8º C
ON
GR
ES
O N
AC
ION
AL
DE
LA
BO
RA
TO
RIO
CL
ÍNIC
O
Sevilla, 16 de octubre de 2014
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014
MUCHAS GRACIAS
8º C
ON
GR
ES
O N
AC
ION
AL
DE
LA
BO
RA
TO
RIO
CL
ÍNIC
O
Sevilla, 16 de octubre de 2014
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014
MUCHAS GRACIAS
8º C
ON
GR
ES
O N
AC
ION
AL
DE
LA
BO
RA
TO
RIO
CL
ÍNIC
O
Sevilla, 16 de octubre de 2014
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014
