DISPOSITIVO HÍBRIDO DE PVA/COLÁGENO/ÁCIDO HIALURÔNICO … · 2017-01-23 · Células-tronco de tecido adiposo (ASCs), participam de diferentes fases da cicatrização (18), por

DISPOSITIVO HÍBRIDO DE PVA/COLÁGENO/ÁCIDO HIALURÔNICO

CULTIVADO COM CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS PARA

REGENERAÇÃO DÉRMICA

Device Hybrid PVA/Collagen/Hyaluronic Acid Cultivated with Mesenchymal Stem Cells for Regeneration Skin

J. A. Domingues1, M. Hausen2, D. V. Mistura2, D. L. P. de Campos2, E. A. de Rezende Duek2, J. A. Camilli1

1,2 Departamento de Biologia Celular e Estrutural, Instituo de Biologia, Unicamp, Brasil;

2 Departamento de Ciências Fisiológicas, Laboratório de Biomateriais, PUC, São Paulo, Brasil

Endereço postal e e-mail: Laboratório de Biomateriais, Faculdade de Ciências Médicas e da Saúde

PUC/SP, Rua Joubert Wey, 290, Sorocaba, São Paulo, Brasil, CEP18030-070. E-mail:

[email protected]

Resumo Os substitutos dérmicos existentes estão associados com uma gama de

problemas tais como reduzida vascularização, formação de fibrose, inflexibilidade,

dentre outros. Nesse estudo desenvolveu-se um equivalente cutâneo buscando-se

suprir algumas das necessidades, o dispositivo é composto por poli (álcool vinílico) -

PVA, como análogo epidérmico, e como análogo dérmico um arcabouço de

colágeno/ácido hialurônico (col/AH). O arcabouço foi cultivado com células-tronco

mesenquimais (ASCs). O PVA 8% apresentou módulo de elasticidade de 2X105

N/m2, a força máxima de tensão foi de 0,27 MPa e a deformação máxima foi de

170%, semelhante ao descrito para pele humana, exceto a força de tensão. O MEV

mostrou que o PVA é liso. Enquanto que o arcabouço de col/AH foi poroso. A

análise por Confocal demonstrou a presença das ASCs no col/AH, indicando que o

material foi citocompatível. Portanto, o dispositivo desenvolvido nesse trabalho,

demostra potencial uso como substituo cutâneo, uma vez que apresenta

características necessárias a esses biomateriais.

Palvras-chave: Células-tronco mesenquimais, colágeno, PVA, substituo

dérmico

9º Congresso Latino-Americano de Orgãos Artificiais e Biomateriais13º Congresso da Sociedade Latino Americana de Biomateriais, Orgãos Artificiais e Engenharia de Tecidos - SLABO

24 a 27 de Agosto de 2016, Foz do Iguaçu, PR

548

mailto:[email protected]

Abstract Existing dermal substitutes are associated with a range of problems such as

reduced vascularization, fibrosis formation, inflexibility, among others. In this study,

we developed a skin equivalent seeking to meet some of the requirements, the

device consists of polyvinyl alcohol (PVA) - PVA as epidermal analogue and an

analogue dermal a collagen scaffold/hyaluronic acid (col/HA). The scaffold was

cultured with mesenchymal stem cells (ASCs). The PVA 8% had elastic modulus of

2x105 N/m2, the maximum tension strength was 2.7 MPa and the maximum

deformation was 170%, similar to that described for human skin. The SEM showed

that the PVA is smooth. While the scaffold of col/HA was porous. The Confocal

analysis showed the presence of ASCs in col/HA, indicating that the material was

citocompatible. Thus the device developed in this work demonstrates the potential

use as skin substitute, since it presents characteristics needed for such biomaterials.

Keywords: collagen, dermal substitute mesenchymal stem cells, PVA

INTRODUÇÃO Indivíduos com extensas lesões de pele, como em caso de queimaduras de

terceiro grau, sofrem uma perda substancial da derme, a qual não se regenera

espontaneamente(1). O reparo desse tipo de lesão só ocorre a partir das

extremidades, estando associada a consideráveis contrações da pele(2) e formação

de fibrose cicatricial, gerando problemas estéticos e funcionais para o paciente(1).

Além disso, essas feridas estão sujeitas à perda de fluídos corpóreos e invasão

por microrganismos, que geralmente levam a sepsia, falência de múltiplos órgãos e

morte. Com isso faz-se necessário o tratamento desses pacientes logo após a

admissão no hospital, iniciando com a remoção do tecido morto e restauração da

barreira da pele preferencialmente em um único procedimento (3).

Geralmente a cobertura imediata de lesões cutâneas provocadas é dificultada

pela falta de pele doadora(4). A engenharia tecidual tem fornecido novas estratégias

para o tratamento dessas lesões(5).

Vários materiais estão disponíveis comercialmente como substitutos para pele,

como por exemplo: Epicel®, composta de camadas de queratinócitos(6), Integra®, (7)

composto de matriz 3-D porosa formada por colágeno tipo I e glicosaminoglicanos



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como equivalente dérmico, associado a uma camada de silicone, para porção

epidérmica, além dos produtos citados acima que utilizam polímeros naturais existe

o Dermagraft® que emprega o polímero sintético denominado Poli (ácido láctico –

co- glicólico) - PLGA, que serve como substituto dérmico, e sobre o qual cultivam-se

fibroblastos humanos obtidos de prepúcio de recém-nascido(8).

Outro polímero sintético que está sendo estudado como curativo cutâneo é o

Poli (álcool vinílico) – PVA(8,9), uma vez que possui muitas das propriedades

requeridas a um curativo. Esses materiais são capazes de manter a lesão hidratada

e absorver o exsudato da lesão, diminuindo o risco de infecção (10). Além disso, são

resistentes mecanicamente e são transparentes, o que permite o acompanhamento

da lesão, evitando a troca de curativo(11).

O colágeno tem sido amplamente utilizado na engenharia tecidual para a pele.

Isso se deve ao fato do colágeno ser o principal componente dérmico, com cerca de

60-80% do peso seco da pele livre de gordura(12). O ácido hialurônico (AH) tem sido

incorporado a arcabouços de colágeno uma vez que estimulam a migração celular e

angiogênese(13). O AH é também um dos principais componentes da pele que está

associado com o reparo tecidual.

Como mencionado anteriormente um dos problemas enfrentados por

queimados durante sua reabilitação é a formação de fibrose cicatricial e contração

da lesão. Acredita-se que esses processos estejam relacionados com a inflamação

persistente nessas lesões, aumentando dessa forma a expressão de fator de

transformação do crescimento beta 1 (TGF-β1)(14).

É conhecido que células-tronco mesenquimais (MSCs), possuem propriedades

imunossupressoras e anti-inflamatórias. O que poderia suprimir a expressão de

TGF-β1 e diminuir a formação de fibrose e contração da lesão(15). MSCs são células-

tronco adultas multipotentes. Essas células são capazes de se diferenciarem em

adipócito, osteoblasto e condrócito, apresentarem em sua superfície a expressão de

CD73, CD90 e CD105 e não expressarem CD14, CD34, CD45, 79 e HLA-DR e

serem aderentes à placa de poliestireno. Essas células podem ser obtidas de vários

órgãos como medula óssea (BM-MSC), placenta (PMSC), tecido adiposo (ASCs)

entre outros(16). O tecido adiposo tem emergido como um forte candidato para o

isolamento dessas células, por ser de fácil obtenção e abundante no corpo(17).



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Células-tronco de tecido adiposo (ASCs), participam de diferentes fases da

cicatrização (18), por secretarem citocinas anti-inflamatórias (19), promoverem neo-

vascularização e regular o fenótipo de fibroblasto e deposição de matriz extracelular

(20). Sendo assim, buscou-se desenvolver um novo dispositivo híbrido constituído de

PVA/col/AH, cultivado com ASCs, visando à utilização em queimaduras graves para

redução de cicatriz.

MATERIAIS E MÉTODOS

Preparação do dispositivo híbrido de PVA/colágeno/ácido hialurônico Para obtenção do PVA uma solução de 8% m/v de PVA em água destilada foi

aquecida a 80ºC e colocada sob agitação. Após o hidrogel foi vertido em placas e

colocados em temperatura de -18ºC por 16 horas.. Após o desenvolvimento do

hidrogel, uma solução de colágeno de pele bovina (6mg/mL) contendo 1% de ácido

hialurônico foi, congelada por 24 horas e liofilizada.

Morfologia do dispositivo – Microscopia eletrônica de varredura – MEV A morfologia do dispositivo foi observada por meio de MEV. Para a obtenção

das imagens, as amostras foram levadas em um suporte adequado e metalizadas

(Balzers 050) pela deposição de uma fina camada de ouro em suas superfícies e

observadas em microscópio eletrônico de varredura (JEOL JXA-840A).

Ensaio Mecânico A propriedade mecânica da membrana de PVA foi determinada usando uma

maquina de teste de materiais uniaxial para tração (MTS 810-FlexTest 40) equipada

com uma célula de carga de 1500 N. Para isso as membranas foram tracionados a

uma velocidade constante de 50 mm/minuto. O comportamento da carga de

elongamento dos dispositivos e modo de falhas foi registrado. A propriedade dos

dispositivos foi representada por uma curva de tensão-deformação, módulo de

Young (MPa), resistência a ruptura (MPa) e deformação na ruptura (%). Os

resultados foram transformados em valores de tensão-deformação por:

Carga/(largura x espessura).



551

Obtenção, isolamento, caracterização e cultura das ASCs Para obtenção das ASCs foi utilizado tecido adiposo do abdome de paciente do

sexo feminino. O tecido foi digerido com solução de Tripsina/EDTA a 37ºC por 30

min. Após foi centrifugado a 300 x g. O pellet foi ressuspenso em DMEM contendo

10% de soro fetal bovino. Devido à capacidade das células mesenquimais

diferenciarem-se em adipócitos e osteoblastos, essas foram caracterizadas através

de análise morfológica, com o uso de corantes Oil Red que evidencia o acumulo

intracelular de lipídeos e Alizarin Red que cora cálcio.

Citocompatibilidade O ensaio de citotoxicidade foi feito por microscopia confocal. Para isso, os

arcabouços foram esterilizados por 1 hora em etanol 70%, após foram lavados com

DMEM sem soro e mantidos por 24 horas em estufa a 37ºC contendo 5% CO2. As

ASCs foram cultivadas na concentração de 5 X 104 células/mL. As análises foram

realizadas após 1, 7 e 14 dias de cultivo das ASCs. Transcorridos os tempos, as

células foram fixadas com paraformaldeído 4%, permeabilizadas com Triton-X 100 e

incubadas com DAPI. Para que se pudesse obter a quantificação de todas as células

contidas no arcabouço realizou-se a reconstrução 3D do material, o limite

estabelecido para o aprofundamento foi à amostra de 10 dias no qual seria a

infiltração máxima que poderíamos observar das células, nesse caso foi de 150µm.

Morfologia das ASCs sobre os dispositivos através da microscopia confocal As imagens de alta resolução foram obtidas através de cortes ópticos, que

foram agrupados para fazer a reconstrução tridimensional da topografia do

arcabouço. As amostras foram analisadas na Universidade Federal de São Carlos,

Campus Sorocaba, utilizando equipamento Microscopia Confocal de Varredura à

Laser Leica TCS SP5. As imagens das ASCs marcadas com faloidina conjugada

com Alexa Flúor 647.



552

O dispositivo bilaminar consiste em uma membrana de PVA e um arcabouço

de col/AH. O dispositivo foi caracterizado por MEV, é possível observar que a

superfície do PVA é lisa (Fig. 1 A), a fratura demonstra que esse material é denso,

não apresentando poros (Fig. 1 B). Enquanto que o arcabouço de colágeno/AH é

extremamente poroso, com poros interconectados (Fig. 1 C e D), o diâmetro dos

poros é de aproximadamente 100 µm.

Fig. 1. Eletromicrografia dos materiais que compõe o dispositivo bilaminar.

Superfície do PVA (A); fratura do PVA (B); arcabouço de colágeno/AH aumento de

1000X (C); arcabouço de colágeno/AH aumento de 100X (D).

Ensaio de tração

O ensaio de tração mostrou que o módulo de elasticidade do PVA testado

foi de 2X105 N/m2. A força máxima de tensão foi de 0,27 MPa e a deformação

máxima foi de 170% (Fig. 2).

Fig. 2. Curva Tensão X Deformação da membrana de PVA.

D C

A B



553

RESULTADOS Morfologia do dispositivo

As ASCs obtidas a partir de tecido adiposo humano foram caracterizadas

através do seu potencial de diferenciação. Após 14 dias de diferenciação essas

células foram coradas com Alizarin red (depósito de cálcio) e Oil red (depósitio de

lipídeo) Fig. 3.

Fig. 3. Citoquímica das ASCs após 14 dias de diferenciação. Escala de 100µm.

Citocompatibilidade

O ensaio de citocompatibilidade foi realizado após 1, 7 e 14 dias de cultivo. É

possível observar que houve crescimento celular ao longo do tempo e invasão das células

para o interior do arcabouço (Fig. 4). Essa análise foi realizada após a reconstrução 3D do

material. O tempo de 14 dias foi utilizado como controle para que pudéssemos determinar

a espessura a ser analisada, uma vez que essa seria a espessura máxima que as células

foram capazes de invadir. Observamos que a profundidade máxima onde encontrávamos

células era de 150µm.

Fig. 4. Crescimento das ASCs no arcabouço de colágeno/AH após 1, 7 e 14 dias de

cultivo (A, B e C respectivamente). Representação gráfica do crescimento das ASCs no

arcabouço (D). Resultado expresso em média com desvio padrão, n=3. Significância

estatística p<0.01 (* 1 vs. 7 dias; & # 1 vs. 14 dias; ns 7 vs. 14 dias). Escala de 100 µm.

Alizarin red

Oil red

Controle - DMEM Meio indutor

A B C D



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Obtenção das ASCs

Fenótipo das ASCs após cultivo no arcabouço de colágeno/ácido hialurônico

As ASCs marcadas com faloidina conjugada com Alexa Fluor 647 e DAPI após

1, 7 e 14 dias de cultivo no arcabouços de colágeno/AH (Fig. 5), apresentaram-se

com morfologia característica fibroblastóide.

Fig. 5. Morfologia das ASCs no arcabouço de colágeno/AH após 1 (A), 7 (B) e

14 (C) dias de cultivo.

DISCUSSÃO Neste estudo, desenvolveu-se um dispositivo bilaminar composto por

PVA/colágeno-AH cultivado com células-tronco mesenquimais, como substituo para

pele. Essa estrutura bilaminar visa mimetizar a pele, a qual é basicamente composta

por uma camada mais externa avascular, a epiderme, sobre uma camada

vascularizada, a derme (21).

A membrana de PVA será utilizada como análogo à epiderme, por ser

conhecido que esse material mantém a lesão hidratada e absorve o exsudato, o que

diminui o risco de contaminação da ferida (10). O arcabouço de colágeno-ácido

hialurônico será utilizado como equivalente dérmico, por mimetizar a matriz

extracelular da derme.

O ensaio de MEV mostrou que a membrana de PVA é lisa e não

apresenta poros, característica essa importante para um material análogo a

epiderme, uma vez que irá dificultar a perda de água e infecções por micro-

organismos, sendo essa uma das principal funções da epiderme (22). Enquanto que o

arcabouço de colágeno/AH é extremamente poroso, possuindo poros

interconectados, o que proporciona a interação entre as células, pois permite a

passagem de citosinas e fatores de crescimento (23). Os poros presentes no

A B C



555

arcabouço possuíam diâmetro de aproximadamente 100µm, tamanho esse

considerado ideal para infiltração celular e angiogênese (24).

Outra característica importante para um curativo cutâneo são suas

propriedades mecânicas, esses materiais precisam ser resistentes a deformação,

macios e flexíveis, permitindo seu uso em qualquer parte do corpo (25). O módulo de

elasticidade do PVA testado foi de 2X105 N/m2 semelhante ao descrito para pele

humana (26). A deformação máxima foi de 170%. O que demonstra seu potencial

para ser utilizado como curativo cutâneo, uma vez que a elasticidade da pele

humana é de aproximadamente 70% (28). No entanto, a força máxima de tensão foi

de 0,27 MPa, sendo que a resistência a tração da pele humana varia de 2,5 a 16

MPa (27). O implica que o material não pode estar submetido a grandes forças de

tensão.

As ASCs foram cultivadas nos arcabouços de colágeno-AH para estimular

a vascularização e reduzir a formação de fibrose. Alguns dos critérios mínimos para

caracterização das células-tronco mesenquimais seriam a capacidade dessas

células em aderir a placa de poliestireno e capacidade de diferenciação em

osteoblasto, adipócito e condrócito (29). Nesse trabalho demonstrou-se que foi

possível o isolamento das ASCs de tecido adiposo humano e essas foram

confirmadas com células-tronco mesenquimais, através do ensaio citoquímico que

demonstra a capacidade de diferenciação em células do tecido mesodérmico.

O ensaio de citocompatibilidade é necessário em qualquer biomaterial

desenvolvido, para que se possam analisar possíveis efeitos danosos do material as

células. Para que pudéssemos determinar se o arcabouço permitia o crescimento

celular, realizamos a marcação do núcleo das células com DAPI e realizamos sua

contagem. Nesse ensaio foi possível observar que o arcabouço permitiu o

crescimento das ASCs ao longo do tempo, além de sua infiltração. Além disso

através da análise morfológica das células foi possível notar que com 1 dia de cultivo

as ASCs se encontravam espraiadas no arcabouço, com 7 e 14 dias o citoesqueleto

está organizado em fibras de estresse, o que indica forte adesão das células ao

biomaterial (30). O dispositivo bilaminar desenvolvido nesse trabalho, demostra

potencial uso como substituo cutâneo, uma vez que apresenta características

necessárias a esses biomateriais.



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