Diversidad de bacterias ácido lácticas en queso doble ...bdigital.unal.edu.co/55711/1/1035414706.2016.pdf · queso momposino, queso doble crema, queso costeño y quesito) los mayor

Diversidad de bacterias ácido lácticas en queso doble crema

tradicional colombiano.

Andres Felipe Londoño Zapata

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias Agropecuarias

Medellín, Colombia

2016

Diversidad de bacterias ácido lácticas en queso doble crema

tradicional colombiano

Andres Felipe Londoño Zapata.

Tesis de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título de:

Magister en Ciencia y Tecnología de los Alimentos

Directora: Claudia Ximena Moreno Herrera

Ph.D., Ciencias Mención Microbiología.

Codirector: José Uriel Sepúlveda Valencia

Magister en Ciencia y Tecnología de los Alimentos

Línea de Investigación:

Microbiología de Alimentos

Grupo de Investigación:

MICOBIOP- GICTA-Biociencias

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias Agropecuarias

Medellín, Colombia

2016

A mis padres por sus oraciones y comprensión.

A Verónica por su apoyo incondicional.

A Mónica y a Margarita por todo.

Agradecimientos

A la Institución Universitaria Colegio Mayor de Antioquia y a la Universidad Nacional de

Colombia Sede Medellín, por la financiación de este proyecto.

Al laboratorio de Productos Lácteos y al Laboratorio de Biología Celular y Molecular de la

Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín y al Laboratorio control de calidad

LACMA, por apoyar al desarrollo de todo los análisis que estaban previstos dentro del

proyecto.

A los profesores Claudia Ximena Moreno Herrera y José Uriel Sepúlveda Valencia, por su

apoyo y su acogida en sus grupos de investigación.

A la convocatoria Jóvenes Investigadores 645, con el proyecto: 26676-Diversidad de

bacterias acido lácticas en queso doble crema tradicional colombiano. Código QUIPU:

201010014813.

Compañeros de laboratorio, por su colaboración y compañerismo.

A todas y cada una de las personas que de una u otra forma contribuyeron para llegar a la

meta.

Resumen y Abstract IX

Resumen

En el presente estudio, los métodos microbiológicos convencionales y

herramientas moleculares, tales como electroforesis en gradiente de temperatura

temporal (TTGE), se utilizaron para evaluar la composición de las comunidades

bacterianas asociadas al queso doble crema de tres empresas en el municipio de

Ubaté-Cundinamarca en Colombia. También se estudió la evaluación de las

características tecnológicas de algunas cepas, como la actividad acidificante, la

producción de diacetilo, actividad proteolítica y lipolítica, actividad antimicrobiana,

el crecimiento a diferentes temperaturas y concentraciones de sal.

El análisis genético de las comunidades bacterianas reveló una baja diversidad, la

cual se estableció por el número de bandas detectadas por TGGE. Las afiliaciones

filogenéticas dominantes se determinaron por secuenciación del gen RNAr 16S y

se agruparon en cuatro géneros Enterococcus sp, Lactobacillus sp, Leuconostoc

sp y Lactococcus sp, secuencias relacionadas con microorganismos importantes

en los procesos de acidificación y en la formación de aromas y sabores en este

tipo de productos. La caracterización e identificación de los aislados de bacterias

ácido lácticas (BAL), mostraron predominio de los géneros Leuconostoc sp y

Weissella sp, los cuales poseen algunas propiedades metabólicas que contribuyen

al desarrollo de características como la textura y la producción de metabolitos

antimicrobianos, reflejando que la microbiota asociada al Queso Doble Crema,

desempeña un rol determinante en la consolidación de sus propiedades

organolépticas

La combinación de diferentes acercamientos permiten inferir sobre la presencia de

la población de BAL diversas e igualmente complejas presentes en el queso doble

crema tradicional colombiano, información que puede ser utilizada para comenzar

X Diversidad de bacterias ácido lácticas en queso doble crema tradicional colombiano.

a establecer un sello de calidad, que lleve a establecimiento de un producto

protegido bajo el status de Denominación de Origen (DO).

Palabras clave: Queso Doble Crema, Bacterias Acido Lácticas, Diversidad.

XI

Abstract

In the present study, conventional microbiological methods, molecular tools, such

as temporal temperature gradient electrophoresis (TTGE), were used to assess the

composition of bacterial communities associated with artisan double cream cheese,

from three companies in the municipality of Ubate-Cundinamarca in Colombia.

Further evaluation of the technological characteristics of some strains, such as

acidifying activity, production of diacetyl, proteolytic and lipolytic activity,

antimicrobial activity, growth at different temperatures and salt concentrations were

also studied.

A genetic analysis of these bacterial communities revealed a low level of diversity,

based on the number of bands detected using TGGE. The dominant phylogenetic

affiliations of the bacteria, determined using 16S rRNA gene sequencing, were

grouped into four genera Enterococcus, Lactobacillus, Leuconostoc and

Lactococcus, which may have a crucial role in the acidification processes and

desirable flavors to cheese. The identification and characterization of lactic acid

bacteria (LAB) isolates showed predominance of the genera Leuconostoc and

Weissella. These strains have some metabolic properties that can be involved in

texture and production of antimicrobial metabolites development in a double cream

cheese, reflecting that the associated microbiota may imparts diverse sensory

characteristics to cheese.

The combination of different approaches allows to infer, the presence of the diverse

and equally complex lactic acid bacteria population present in the artesian double

cream cheese from Colombian, the information could be used to establish a quality

seal of the product and the achievement of a Protected Designation of Origin (PDO).

Keywords: Double Cream Cheese, lactic acid bacteria, Diversity

Contenido XII

Contenido

Pág.

Resumen ......................................................................................................................... IX

Lista de figuras.............................................................................................................. XIV

Lista de tablas ................................................................................................................ XV

Lista de símbolos y abreviaturas ................................................................................... XVI

Introducción ...................................................................................................................... 1

1. Capítulo 1: Marco teorico……………………………………………………………...…...4

2. Capítulo 2: Materiales y metodos ............................................................................... 8 2.1 Muestras de queso doble crema. .................................................................... 8 2.2 Análisis fisicoquímico .................................................................................... 10

2.2.1 Acidez titulable y medición de pH………………………………………... 10 2.2.2 Determinación de proteína 10 2.2.3 Cenizas………………………………………………………………………10 2.2.4 Humedad…………………………………………………………………….10 2.2.5 Grasa total…………………………………………………………………...10

2.3 Métodos dependientes de cultivo .................................................................. 11 2.3.1 Aislamiento de cepas de BAL …………………………………………….11 2.3.2 Cuantificación de bacterias totales y de BAL……………………………11 2.3.3 Análisis del espaciador intergénico ribosomal (RISA) de los aislados.12 2.3.4 Identificación de los aislados con el gen ribosomal 16S rDNA. 12

2.3.1 Capacidad tecnológica de cepas de bacterias ácido lácticas………….13

Actividad acidificante y producción de diacetilo……………………………13

Actividad proteolítica y lipolítica……………………………………………..13

Crecimiento a diferentes temperaturas y a diferentes concentraciones de sal………………………………………………………………………………14

Actividad antimicrobiana……………………………………………………..14 2.4 Método independiente de cultivos ................................................................. 15

2.4.1 Extracción del DNA total….………………………………………………..15 2.4.2 Análisis PCR-TGGE ……………………………………………………….15 2.4.3 Secuenciación de bandas y análisis filogenético………………………..16 2.4.4 Análisis RISA para fracción cultivable y fracción total………………….16

2.5 Análisis estadísticos………………………………………………………………..16

XIII

3. Capítulo 3. Resultados ............................................................................................. 19 3.1 Análisis fisicoquímico ..................................................................................... 19 3.2 Métodos dependientes de cultivo ................................................................... 19

3.2.1 Aislamiento de cepas de BAL …………………………………………….20 3.2.2 Cuantificación de bacterias totales y de BAL ………………………...…20 3.2.3 Análisis del espaciador intergénico ribosomal (RISA) de los aislados..21 3.2.4 Identificación de los aislados con el gen ribosomal 16S rDNA 22

3.2.5 Capacidad tecnológica de cepas de bacterias ácido lácticas………….24

Actividad acidificante y producción de diacetilo…………………….……..24

Actividad proteolítica y lipolítica……………………………………….…….24

Crecimiento a diferentes temperaturas y a diferentes concentraciones de sal………………………………………………………………………………24

Actividad antimicrobiana……………………………………………………..25 3.3 Método Independiente de Cultivos ................................................................. 25

3.3.1 Análisis de comunidades microbiana por PCR-TGGE ………………...25 3.3.2 Afiliación filogenética de las secuencias obtenidas provenientes de las

bandas TGGE…………………………………………………………….…27 3.3.4 Análisis RISA para fracción cultivable y fracción total 30

4. Capítulo 4. Discusion ............................................................................................... 33

5. Capítulo 5. Conclusiones y recomendaciones……………………………..…………...41 5.1 Conclusiones ................................................................................................. 41 5.2 Recomendaciones ......................................................................................... 42

A. Anexo A: Tablas con recuentos totales y de bacterias ácido lácticas ....................... 43

B. Anexo B: Análisis RISA de los aislados .................................................................... 44

C. Anexo C: Tinción gram de los géneros identificados ................................................ 45

D. Anexo D : Fotos de las pruebas de caracterización tecnológicas de cepas BAL .. 46

E. Anexo E: Gel del resultado del TGGE y relacion filogenetica de las bandas ............ 48

F. Anexo F: Presentación en congreso internacional ……………………………………..49

Bibliografía ...................................................................................................................... 52

XIV Caracterización de las comunidades de bacterias acido laticas asociadas a un queso tradicional

colombiano: queso doble crema

Lista de figuras Pag.

Figura 1. Mapa ubicación del lugar de Muestreo………...………………….………………..7

Figura 2. Recuento de bacterias totales y de bacterias ácido lácticas……...………….…18

Figura 3. Análisis clúster de los patrones de bandeo ITS de las bacterias aisladas de los

quesos. …………………………………………………………………………………………..19

Figura 4. Ubicación filogenética de los aislados bacterianos basados en las secuencias

del gen RNAr 16S…………………………………………………………………………….….21

Figura 5. Análisis de las bandas y las relaciones que existen entre los diferentes quesos

producidos…...……………………………………………………………………………….…..25

Figura 6. Dendograma construido mediante el método Neighbor joining para las

secuencias 16S DNAr analizadas por la técnica TTGE………………………………………27

Figura 7. Análisis Cluster elaborado por el coeficiente de similitud Dice (Presencia o

ausencia de bandas) y el método de agrupamiento UPGMA basado en patrones de bandeo

ITS de las muestras de Queso Doble Crema…………………………………………………28

Figura 8. Análisis de cluster elaborado por el coeficiente de similitud Dice (Presencia o

ausencia de bandas) y el método de agrupamiento UPGMA basado en patrones de bandeo

ITS de las muestras de Queso Doble Crema de la fracción de DNA cultivable vs análisis

de la fracción de DNA total…………………………………………………………………..….29

XV

Lista de tablas

Pág.

Tabla 1. Análisis fisicoquímico de Quesos Doble Crema…………………………..17

Tabla 2. Relación taxonómica de los aislados de los quesos doble crema…...…20

Tabla 3. Caracterización tecnológica de cepas BAL………………………………..23

Tabla 4. Índices de diversidad, obtenidos a partir de los análisis Bandas de TGGE………………………………………………………………………….24

Tabla 5. Índices de diversidad, obtenidos a partir de los análisis RISA…...……..30

Contenido XVI

Lista de Símbolos y abreviaturas

Abreviatura Término

PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa.

DNAr Ácido Desoxirribonucleico ribosomal.

16S RNAr Secuenciación del gen 16S RNAr.

RISA Análisis del espaciador intergénico ribosomal

BAL Bacterias ácido lácticas.

QDC Queso doble crema.

DO Denominación de origen.

UPGMA Método de agrupamiento de pares con la media aritmética no ponderada.

BLAST Basic Local Alignment Search Tool.

NCBI National Center for Biotechnology Information.

RDP Ribosomal Database Project

T/DGGE Temperature /Denaturing gradient gel electrophoresis.

Introducción

El queso es un producto de la coagulación de la leche entera, semi-descremada o

descremada, constituido principalmente por proteína (caseína), con una cantidad

materia grasa y una fracción variable de minerales (1). En las últimas décadas su

producción a nivel mundial ha aumentado debido a la creciente cultura por el

consumo de los quesos madurados, estimándose en el 2015 una producción anual

de 2,4 millones de toneladas (2). En Colombia el queso es producido de manera

industrial y artesanal, se estima que de la producción anual de leche se destina del

8 al 9% a su elaboración, siendo los quesos frescos (queso campesino, quesillo,

queso momposino, queso doble crema, queso costeño y quesito) los mayor

preferencia comercial (3).

El queso doble crema se elabora de manera artesanal en Colombia, con una

mezcla de leche acidificada y leche fresca. Durante este proceso de acidificación,

aparecen las bacterias acido lácticas (BAL) nativas, estas influyen en las

características organolépticas que definen a cada producto, dándole propiedades

distintivas (4). Estos microrganismo juegan un papel fundamental en la industria

quesera, porque están involucradas en la síntesis de compuestos precursores de

sabores y aromas (5,6)

El estudio e identificaciones de las BAL se ha llevado a cabo en los últimos años

mediante biología molecular, la cual han aportado de manera significativa a la

consolidación de la ecología de estos microrganismos, como una rama importante

en el desarrollo de conocimiento, no solo en la detección de patógenos, sino en la

caracterización de organismos de interés industrial (7,8). La electroforesis en gel

con gradiente de temperatura (TGGE) es una técnica independiente de cultivo, que

2

proporcionan una visión ecológica de las especies predominantes en comunidades

microbianas complejas (9). Además es utilizado como herramienta para la

identificación de microorganismos presentes en alimentos, la valoración del

impacto de bacterias probióticas en la microbiota gastrointestinal nativa humana y

la evaluación de la diversidad microbiana durante la fermentación de alimentos

(10,11)

Los diferentes estudios enfocados en la diversidad microbiana de los quesos

tradicionales han tenido un gran impacto en los productores, proporcionándoles

herramientas para comprender todos los procesos en los que intervienen los

microorganismos, teniendo en cuenta los metabolitos secundarios implicados en la

consolidación de las propiedades organolépticas y los beneficios para la salud de

los consumidores: la prevención de ciertas enfermedades y el alto valor nutricional

por la presencia de ácidos linoleicos conjugados (ALC) y aminoácidos, derivados

de actividades metabólicas durante los quesos (8, 43).

Existe poca información acerca de la composición y diversidad microbiana,

específicamente de BAL en quesos autóctonos producidos en Colombia como el

queso doble crema. La exploración mediante métodos moleculares dependientes

e independientes de cultivos como el TTGE proporcionará información sobre la

presencia de BAL en este alimento. La consolidación de este tipo de estudios podrá

contribuir a la comprensión de los fenómenos involucrados en la consolidación de

propiedades organolépticas y de esta forma, la mejora de los procesos de

tecnificación en la elaboración de estos productos.

3

1. Capítulo 1: Marco teórico

El queso doble crema es un derivado lácteo elaborado de forma artesanal en

Colombia, siguiendo la tecnología desarrollada en los Valles de Ubaté y

Chiquinquirá, en el altiplano cundiboyacense, pertenecientes a la cordillera oriental

de los Andes, en la región andina del país. Se reconoce como uno de los quesos

más comercializados en Colombia y su producción ha presentado crecimiento

sostenido en los últimos años (12). Desde el año 2007 hasta el 2014, el

comportamiento de los precios en planta del queso doble crema ha tenido una

tendencia creciente con un aumento aproximado del 7%, superando al queso

campesino(13).

Para la elaboración de este queso, se requiere una mezcla de leche de vaca fresca

y acidificada (el tiempo aproximado de acidificación son 24h a temperatura

ambiente de la zona donde se elabora. Ubaté), hasta obtener una acidez de 0,40%

de ácido láctico (1). Ha sido categorizado como un queso ácido, no madurado, de

pasta semi-cocida e hilada (14). Durante el proceso de acidificación de la leche

(que se da de manera natural) se establece la microbiota láctica nativa que

contribuye con las características organolépticas, fisicoquímicas y microbiológicas

al producto elaborado (14,15), donde se encuentran las bacterias acido lácticas

(BAL), grupo microbiano responsable del proceso de acidificación, contribuyendo

indirectamente a la sinéresis de la cuajada, la expulsión del suero y la solubilidad

del micelio de calcio, elementos relacionados con la textura del queso, además de

la producción de compuestos como el diacetilo y acetoina precursores de la

formación de aromas y sabores (17). Igualmente, han sido utilizadas como cultivos

iniciadores y algunos de ellas son consideradas como microorganismos probióticos

(Lactobacillus fermentum) y otras han sido catalogadas como bacterias GRAS

(Lactococcus lactis subsp. lactis) (Generally Recognised As Safe) (10,19–21).

La identificación de las BAL en quesos se ha llevado a cabo teniendo en cuenta

dos tipos de aproximaciones. La primera basada en métodos dependientes de

cultivo, que involucran aislamientos en agares selectivos (MRS, M17, Elliker),

4

identificación morfológica, bioquímica, y molecular, seguida de la caracterización

de sus propiedades tecnológicas, dentro de las que se destacan: generación de

metabolitos secundarios a diferentes temperaturas, resistencia a bacteriófagos,

resistencia a concentraciones de sal, autolisis, producción de componentes

antimicrobianos (péptidos) y producción de enzimas (proteasas, peptidasas

lipasas, esterasas, entre otras). La segunda aproximación se enfoca en métodos

independientes de cultivo, en los cuales se extrae el DNA que está presente en el

queso y se analiza mediante técnicas moleculares combinadas con la reacción en

cadena de la polimerasa (PCR), que permiten la identificación de grupos

microbianos que no son detectados por los métodos convencionales(22).

Las técnicas moleculares en microbiología de alimentos han abierto muchas

posibilidades en el estudio de la diversidad y ecología de la microbiota que está

presente y hace parte de las transformaciones bioquímicas en las matrices

alimentarias como: sabores, olores y texturas (23,24). La exploración mediante

técnicas moleculares independientes de cultivo han complementado la información

obtenida mediante los métodos microbiológicos tradicionales, que dan la

posibilidad de identificar diferentes organismos que no son fáciles de obtener con

los procedimientos basados en medios de cultivos (25,26). Entre las técnicas

moleculares utilizadas en la exploración y el conocimiento de la microbiota presente

en quesos están: Polimorfismo de conformación de cadena simple (SSCP) (27),

Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (T-RFLP) (28,29), Análisis

de restricción de DNA ribosomal amplificado (ARDRA) (10), Electroforesis en gel

con gradiente desnaturalizante/de temperatura. (T/DGGE) (30), Análisis del

espaciador intergénico ribosomal (RISA) (30,31) y Hibridación fluorescente in situ

(FISH) (32,33)

La electroforesis en gel con gradiente de temperatura (TGGE), es una técnica

independiente de cultivo, la cual genera patrones que proporcionan una visión

ecológica de las especies predominantes en comunidades microbianas complejas.

En este método, se separan los fragmentos de DNA que tengan la misma longitud,

pero provenientes de diferentes secuencias, los cuales se obtienen al amplificar

5

regiones de los genes ribosomales del DNA, llegando a separar fragmentos que

difieren en una sola base (9,29). Los agentes desnaturalizantes (la temperatura y

urea) son los encargados de romper los puentes de hidrogeno entre las cadenas

dobles de DNA, de esta forma, cuando se alcanza una temperatura determinada,

la molécula se desnaturaliza parcialmente, disminuyendo su velocidad de

migración. Esas temperaturas de fusión dependen de variaciones en los

nucleótidos presentes en las secuencias analizadas, principalmente en el

contenido de guanina-citosina, por la tanto, fragmentos de DNA pertenecientes a

varios microorganismos tendrán diferentes posiciones en el gel (10,30). Al obtener

el patrón de migración de las bandas, los resultados pueden analizarse mediante:

a) bases de datos que contengan perfiles de migración con cepas de referencias.

b) Presencia y ausencia de bandas en una posición fija.

c) Interpretación visual de la intensidad de las bandas.

d) Digitalización de los perfiles encontrados; para obtener matrices de distancia y

similitud, con los cuales se puede estudiar y comparar los patrones de bandas

generados, a través de programas informáticos (34).

Adicional a esto, el DNA de las bandas puede ser recuperado desde el gel y se

obtienen las secuencias, para saber que grupos microbianos están relacionados

con esas bandas (10). El TGGE ha sido utilizada para determinar la diversidad de

bacterias en diferentes tipos quesos como Robiola di Roccaverano y Parmigiano

Reggiano (35–37), mozzarella (38,39), Camembert (21) y Armada (40)

Los quesos tradicionales producidos artesanalmente en algunas partes del mundo,

son reconocidos con la distinción Denominación de Origen, por tener

características únicas, desarrolladas en su entorno de elaboración y por la

participación de microbiota nativa presente (35,41,42). La composición de la

población microbiana depende de los continuos cambios en las condiciones

ambientales y de la interacción de los microorganismos durante la fabricación y la

dinámica de la microbiota influencia las características de un queso determinado

(43,44). En Colombia existen productos que hacen parte de una riqueza patrimonial

6

e histórica, entre esos se encuentra el queso doble crema, su proceso tecnológico

fue estandarizado por el Instituto de Ciencia y Tecnología de alimentos (1986), pero

aun no cuentan con Denominación de origen (3,45).

Teniendo en cuenta la limitada información disponible sobre las características

microbiológicas de este queso, el objetivo de este trabajo fue estudiar la diversidad

de las comunidades de bacterias ácido lácticas autóctonas asociadas al queso

doble crema artesanal de la región del Valle de Ubaté en Cundinamarca, Colombia,

usando métodos moleculares y de microbiología convencional que permitan la

identificación y caracterización de los microorganismos presentes en los productos

lácteos, lo que llevara a importantes avances en la comprensión de este

ecosistema y su impacto en la elaboración y calidad del queso en la región.

2. Capítulo 2: Materiales y métodos

2.1 Muestras de queso doble crema

Los muestreos se tomaron en el municipio de Ubaté (Cundinamarca-Colombia)

(Imagen 1). Se escogieron tres empresas representativas del sector (nombrados

para este estudio: Q1-Q21-Q3, las cuales elaboran el queso en forma artesanal, de

cada una se tomaron tres quesos de lotes diferentes que se transportaron según la

Norma Técnica Colombiana (NTC) 5667-3 en refrigeración (4°C) al laboratorio

control de calidad LACMA en Medellín, Colombia, para su respectivo análisis de

microbiología convencional y fisicoquímico y al laboratorio de biología celular y

molecular de la Universidad Nacional de Colombia para la realización del análisis

molecular.

1 Para la empresa Q2 solo se pudo tomar una muestra de queso, porque se hizo un lote de quesos con leche acidificada naturalmente específicamente para este estudio. En esta empresa producen el queso con leche acidificada con ácidos orgánicos.

Figura 1. Mapa ubicación del lugar de Muestreo.

8 Diversidad de bacterias ácido lácticas en queso doble crema tradicional colombiano.

2.2. Análisis fisicoquímico

Los análisis fueron realizados siguiendo los métodos oficiales de la AOAC. Para

determinar la Acidez titulable se siguió el método oficial 942.15 Ed.18, para la

medición de pH 981.12 Ed.18, proteína 988.05 Ed.18, humedad 926.08, Ed 18,

grasa total 933.05 Ed. 18 y cenizas 923.03 Ed. 18.

2.3. Métodos dependientes de cultivo

Para el análisis de las BAL por métodos dependientes de cultivo se mezclaron los

homogenizados de los lotes provenientes de cada empresa a los cuales se les

realizo:

2.3.1. Aislamiento de cepas de BAL

Para el aislamiento de BAL se utilizaron 10 g de cada queso, los cuales fueron

agregados a 90 ml de agua peptonada 0,1% (Merck® Darmstadt-Alemania) y

homogenizados por tres minutos en Stomacher (AES Laboratories-Francia). Se

realizaron diluciones decimales seriadas en base 10 (10-1 a 10-7) en 9 ml de agua

peptonada 0,1% (Merck® Darmstadt-Alemania). 0.1 ml de cada dilución fue

sembrado en agar MAN ROGOSA y SHARPE (MRS) (Merck® Darmstadt-

Alemania) y en agar M17 según TERZAGHI (Merck® Darmstadt-Alemania), medios

selectivos para el aislamiento de bacilos y cocos de BAL, respectivamente. Las

cajas de Petri se incubaron a 30°C por 48 h en anaerobiosis, utilizando indicador y

Anaerogen (Oxiod). Los ensayos se realizaron por triplicado.

2.3.2. Cuantificación de bacterias totales y de BAL

El recuento total de células bacterianas presentes en las muestras de queso se

realizó por microscopia de epifluorescencia con naranja de acridina (AMRESCO®)

siguiendo la metodología de Bottari et al.(2010), con algunas modificaciones: De la

dilución 10-2 del homogenizado de los quesos, se tomaron 100 ul y se realizó un

extendido para cada muestra, el cual se tiño con solución de naranja de acridina al

0,1% por 1 minuto en oscuridad, las placas se observaron a 100X al microscopio

Capítulo 2 9

de epiflourescencia (Nikon 80i) con el filtro B-2E/C. El recuento para cada muestra

de queso fue realizado por duplicado.

Cuantificación de BAL

Para el recuento de células viables se seleccionaron las diluciones con crecimiento

entre 30 y 300 colonias, se calcularon las unidades formadoras de colonia (UFC),

los resultados se expresaron como log10 de las unidades formadoras de colonias

(ufc) por gramo de muestra. El recuento para cada muestra de queso fue realizado

por triplicado.

De los medios de cultivo MRS (Merck® Darmstadt-Alemania) y M17 (Merck®

Darmstadt-Alemania) se seleccionaron 31 colonias aleatoriamente, para el Q1: 11

(Q1-1…Q1-11), Q2: 11 (Q2-1…Q2-11) y Q3: 9 (Q3-1…Q3-9); a los cuales se les

evaluó su actividad catalasa- oxidasa negativa y la tinción gram. Las muestras

fueron conservadas en glicerol al 20% a una temperatura de -80°C.

2.3.3. Análisis del espaciador intergénico ribosomal (RISA) de los

aislados.

Para escoger los aislados que se iban a secuenciar, se hizo un análisis RISA.

Alícuotas de 2 ml de las 31 cepas puras, con crecimiento de 24 horas, se

centrifugaron a 5000 gravedades por 10 minutos. El sobrenadante fue descartado

y el pellet resuspendido en 50ul de buffer TE al 0,1% (EDTA 0,5 m-Tris 1M), se

calentó por 10 minutos en agua hirviendo (100 °C), centrifugando a 10000 rpm por

5 min y el sobrenadante se pasó a un nuevo tubo estéril. Para la reacción de PCR

se utilizaron 2ul del lisado bacteriano y los cebadores L1 (5-

CAAGGCATCCACCGT-3) y G1 (5-GAAGTCGTAACAACG-3), con un tamaño de

producto esperado entre 50 y 1500 pb. La mezcla y el programa de la reacción

usados se describe en (47). El producto de amplificación se verifico por

electroforesis en un gel poliacrilamida al 8% y los geles se tiñeron con nitrato de

plata (AgNO3) (AMRESCO, OH, USA) (48) y analizados con el programa

GelCompar II (Applied Maths TX, USA) (Rademaker y de Bruijin, 2004). Una vez


alineados los carriles representantes de cada muestra de DNA, se realizó un

análisis de agrupamiento mediante el coeficiente de Dice (49) y el promedio

aritmético no ponderado (UPGMA)(50)

2.3.4. Identificación de los aislados con el gen ribosomal 16S rDNA

A los aislados escogidos para secuenciación, se les realizo una PCR amplificando

los cebadores Eubac 27F (AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG), 1492R (GGT TAC

CTT GTT ACG ACT T). Aproximadamente 25 ng del DNA bacteriano se usó como

molde para la reacción. La mezcla y el programa de la reacción como se describe

en Moreno et al, (2002). El producto de amplificación se verifico por electroforesis

en un gel de agarosa al 1% , teñido con EZ-vision (Amresco, OH, USA). Las bandas

de DNA se visualizaron por iluminación con luz ultravioleta y fotografiadas por

Sistem UV Transiluminator (Biometra, Göttingen, Germany). Los amplicones de

aproximadamente 1465 pb se enviaron a secuenciar en Macrogen (Korea) en un

ABI PrimR 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, CA, USA). Los análisis

posteriores se llevaron de acuerdo a los métodos y procedimientos descritos para

las secuencias de las bandas obtenidas desde los geles de TGGE (Sección 2.4.3).

Las secuencias se depositaron en la base de datos del GenBank con los números

de acceso: KX078319 al KX078333.

2.3.5. Capacidad tecnológica de cepas de bacterias ácido lácticas.

Para la evaluación de la capacidad tecnológica de las BAL, se escogieron 5 cepas

(Q3-3, Q2-5, Q1-9, Q2-11 y Q3-6), las cuales corresponden a las especies

representativas identificadas por secuenciación de los quesos estudiados.

Actividad acidificante y producción de diacetilo.

La actividad acidificante fue medida por determinación del pH en un periodo de 24

h. Aproximadamente 200 µl de las bacterias con crecimiento de 24 h, se inocularon

en tubos que contenían 20 ml de leche descremada reconstituida al 10%. Las

mediciones se realizaron a las 0, 6 y 24 horas de incubación, usando pH-metro

previamente calibrado, WTW (Measurement Systems, Inc modelo 330i-SET) (51).

Capítulo 2 11

La producción cualitativa de diacetilo fue determinada, tomando 3 ml de los cultivos

de las cepas del procedimiento anterior (después de 24 horas de incubación a

30°C), agregándole 0.5 ml de una solución de α-naftol (1% w/v) y KOH (16% w/v),

incubandas a 30°C por 15 minutos La presencia de diacetilo, se indica por la

aparición de una franja roja en el tubo (52).

Actividad proteolítica y lipolítica.

La capacidad proteolítica extracelular, se realizó por siembra en estría de cada

cepa en el medio agar leche (Oxoid) suplementado con leche descremeda al 10%,

incubadas a 30°C por 7 días. La prueba se considera positiva por la presencia de

un halo transparente alrededor de las colonias (52).

La actividad lipolítica se midió de forma cualitativa en el medio de cultivo Agar Nata

(agar leche (Oxoid) suplementado con crema de leche al 1%) (53,54). Se realizó

una siembra por estría de cada suspensión bacteriana en el medio referenciado,

con incubación a 30ºC por 7dias. La prueba se considera positiva por la presencia

de un halo transparente alrededor de las colonias.

Crecimiento a diferentes temperaturas y a diferentes concentraciones

de sal.

El crecimiento a diferentes temperaturas se evaluó en Caldo MRS (Merck®

Darmstadt-Alemania) a 15, 30 y 45 ºC. en un tiempo de incubación de 42 h. (55).

El crecimiento a diferentes concentraciones de sal. se evaluó por crecimiento en

Caldo MRS (Merck® Darmstadt-Alemania) suplementado con concentraciones de

NaCl de 2, 6 y 10 %, incubado a 30°C por 48 h (55).

Actividad antimicrobiana.

Fue evaluada siguiendo la metodología de Wilson, Raftos, Corrigan, & Nair (2010).

Los extractos provenientes de las cepas se obtuvieron después de incubación por

siete días a 30°C y agitación constante (150 rpm) en medio MRS (Merck®

Darmstadt-Alemania) con 1,2 g amberlita XAD-16 (AMRESCO®). Después del

tiempo de incubación, la amberlita se recuperó del medio de cultivo por decantación

y se lavó con agua destilada estéril. Los productos absorbidos se eluyeron en 20


ml de metanol al 100% en agitación constante por 30 minutos y se concentraron

por evaporación a 40 °C bajo presión reducida en rotoevaporador (Hei-VAP

Advantage HL), hasta obtener un volumen aproximado de 1 ml. Los extractos se

evaluaron mediante difusión en agar contra cepas bacterianas: Escherichia coli

(ATCC® 8739™), Salmonella typhimurium (ATCC® 13311™), Staphylococcus aureus

(ATCC® 29213™), Enterococcus faecalis (aislado clínico) y Listeria monocytogenes

(ATCC® 7646™), las cuales fueron inoculadas uniformemente en agar Mueller-

Hinton (Becton Dickison). Luego, discos de papel filtro (Whatman N° 1) de 6 mm

de diámetro estériles fueron puestos sobre las superficies de los agares inoculados

y en ellos 15 µl del extracto concentrado se dispensaron en cada disco. las cajas

se incubaron a 30°C durante 18h. La presencia de halos transparentes alrededor

del disco, se midió y los resultados se expresaron en milímetros.

2.4. Método Independiente de Cultivos.

Para los análisis moleculares independientes de cultivos, los lotes de las diferentes

empresas productoras, se analizaron por separado.

2.4.1. Extracción del DNA total.

El DNA total de las muestras de queso se extrajo usando el kit comercial Power

Soil DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories, Inc., Ca.) siguiendo las instrucciones

del fabricante. La concentración del DNA se determinó usando Nanodrops

(Thermo) y su calidad fue determinada en gel de electroforesis al 1%.

2.4.2. Análisis PCR-TGGE

La PCR-TGGE se realizó en un volumen final de 30 µl usando los primers 341F

con una cola extra G-C (50- CCTACGGGAGGCAGCAG-30) y 907R (50-

CCCCGTCAATTCATTTGAGTTT-30) siguiendo las condiciones reportadas en

Gomez, Yannarell, Sims, Cadavid-Restrepo, & Moreno Herrera (2011). Los

fragmentos obtenidos en la amplificación (aproximadamente 500 pb) se corrieron

en geles de poliacrilamida 7% (P/V) en buffer TAE 1,25X (40 mM Tris base, 20 mM

ácido acético glacial, 1 mM EDTA) con concentración de urea al 8M. El gel se corrió

Capítulo 2 13

a las siguientes condiciones: 55 V por 15 h con una temperatura inicial de 66 °C y

una temperatura final de 68 °C (con un incremento de 0.1 °C h-1 ), usando el sistema

DCode Universal Mutation Detection System (BioRad, U.S.A), Los geles se tiñeron

con SYBR GREEN al 1X por 30 min y la imagen obtenida se digitalizo. El patrón de

bandas se analizado usando el software Gelcompar II (Applied Maths Biosystems,

Belgium). La PCR-TGGE se realizó por triplicado.

2.4.3. Secuenciación de bandas y análisis filogenético

Las bandas obtenidas del gel de TGGE, se cortaron y eluyeron en agua bidestilada

estéril por 24 h a 4°C. La reacción de PCR se llevó a cabo con 5 ul de la suspensión

y con las mismas condiciones de la PCR-TGGE, con los primer 341F sin la cola

GC y 907R. Los productos se verificaron en gel agarosa al 1%.

Los amplicones se enviaron a Macrogen (Korea) para ser secuenciados en un ABI

PrimR 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, CA, USA). Las secuencias

obtenidas se editaron usando BioEdit ® (Hall, 1999) y la presencia de secuencias

quimeras se evaluó con DECIPHER (58).

(http://decipher.cee.wisc.edu/FindChimeras.html). Las secuencias editadas se

compararon con secuencias conocidas en el GenBank usando BLAST (Basic Local

Alignment Search Tool)(59) y el software Sequence Match del sitio web Ribosomal

Database Project (RDP). Las secuencias editadas se alinearon usando Clustal W

(60). El software MEGA 6.0 (http://megasoftware.net/) se utilizó para construir un

árbol filogenético por el método de neighbor-joining (61) con un bootstrap de 1000

repeticiones. Las distancias evolutivas se calcularon utilizando el método de Jukes-

Cantor (Jukes y Cantor, 1969).

2.4.4. Análisis RISA para fracción cultivable y fracción total

Para realizar una comparación de las comunidades bacteriana presente en los

quesos, se utilizaron la fracción total y la fracción cultivable, mediante un análisis

RISA. El DNA extraído de las muestras de los quesos (fracción total) y de los


barridos hechos a los medios de cultivos MRS y M17 (fracción cultivable). La

extracción del DNA se llevó a cabo usando el kit comercial Power Soil DNA Isolation

Kit (MO BIO Laboratories, Inc., Ca.) siguiendo las instrucciones del fabricante. La

concentración del DNA se determinó usando Nanodrops (Thermo). Para realizar

esta comparación, se hizo una PCR con los cebadores L1 (5-

CAAGGCATCCACCGT-3) y G1 (5-GAAGTCGTAACAACG-3) (47). El producto de

amplificación se verifico por electroforesis en un gel poliacrilamida al 8% y tinción

de plata. Con los resultados se construyeron dendogramas, según el patrón de

bandeo que fue analizado con el programa de Gelcompar II (Applied Maths

Biosystems, Belgium) con el índice DICE-UPGMA. Se generó una matriz de

presencia ausencia para establecer las relaciones existentes; con algunos

indicadores de diversidad, corridos en el programa PAST versión 3 (107).

2.5. Análisis estadísticos

Los resultados para los análisis fisicoquímicos, los conteos, la actividad acidificante

y la actividad antimicrobiana, se analizaron por medio del método estadístico

ANOVA de una sola vía, con un nivel de confianza del 95% (α=0.05). Todos los

análisis estadísticos se llevaron a cabo en el programa SPSS versión18 para

Windows 7.

3. Capítulo 3: Resultados.

3.1 Análisis fisicoquímico.

Los análisis fisicoquímicos realizados a las muestras de los quesos cumplieron con

los requerimientos contemplados en la Norma Técnica Colombiana 750 (NTC 750)

y la resolución 2310 de 1986 para este tipo de productos. En la tabla 1, se muestran

los valores obtenidos para cada uno de los parámetros evaluados. Los resultados

para los análisis fisicoquímicos fueron variables para las muestras analizadas,

mostrando diferencias significativas (p<0,05) para los parámetros proteínas,

humedad, grasa y ácido láctico. Los valores de pH y porcentaje de cenizas no

presentaron diferencias estadísticas significativas con (p>0,05) entre los quesos

analizados.

Tabla 1. Análisis fisicoquímico de Quesos Doble Crema

Parámetros2 Q1 Q2 Q3 Rangos permisibles1

Ácido Láctico (% m/m) 0,11a 0,14b 0,17c 0,20

pH 5,41b 5,59b 5,52b 5,5-6,0

Análisis de cenizas % (m/m) 2,66a 2,79a 2,87a 3,0

Análisis de proteína % (m/m) 26,35a 22,23b 25,04c 25-30

Humedad % (m/m) 44,44a 48,94b 47,06c 60

Grasa % (m/m) 23,69a 20,98b 21,54c 25-45 1Rangos permisibles establecidos por las normativas colombianas. a,b,c Resultados con la misma letra no presentaron diferencias estadísticamente significativas (p>0,05).


3.2 Métodos dependientes de cultivo

3 2.1. Aislamiento de cepas de BAL

Las bacterias obtenidas en los medios de cultivos MRS y M17 se caracterizaron

por formar colonias de color blanco, crema y grises; de tonos brillantes y opacas,

algunas con halos transparentes en los extremos de la colonia y los bordes de las

colonias algunos regulares e irregulares. Para cada empresa se aislaron las

colonias según las características descritas y luego se re-aislaron hasta obtener

cepas puras, para posteriores análisis. Al final se obtuvieron 31 cepas de las

muestras de todas las empresas, las cuales eran: gram positivas, catalasa y

oxidasa negativa. El 60% fueron cocos (18 aislados) y el 40% (13 aislados) bacilos

cortos. Para Q1 y Q2 se obtuvieron once aislados y para el Q3 nueve, las cuales

fueron utilizados en los análisis posteriores.

3.2.2. Cuantificación de BAL y de bacterias totales

Los recuentos de células viables de BAL realizados a los quesos se muestran en

la figura 2. El recuento para Q3 fue el más alto de los tres quesos estudiados, con

un valor promedio de 6,8 y 7,0 log UFC/g para M17 y MRS respectivamente.

Seguido por Q1, con valores de 6,8 y 6,7 log UFC/g y por último Q2 con valores de

6,4 y 6,3 log UFC/g. No se encontraron correlaciones entre los recuentos hechos a

los quesos con las diferentes empresas en estudio (p<0.05). Al comparar los

medios usados se denota un mayor crecimiento en el medio M17 para (Q1 y Q2).

En Q3 el crecimiento fue mayor en el medio MRS.

17

Figura 2. Recuento de bacterias totales y de bacterias ácido lácticas.

En el recuento de bacterias totales por epiflourescencia, se presentaron resultados

similares con respecto a los recuentos de células viables (Figura 2), Q3 presento

el conteo más alto 7,1 log Células/g , Q1 7,0 log Células/g y Q2 6,9 log Células/g.

3.2.3. Análisis del espaciador intergénico ribosomal (RISA)

Los patrones en los perfiles RISA encontrados, fueron similares en muchas de los

aislados, con bandas en común entre 700-900 bp, y los 400-600 bp, algunos

presentaron bandas específicas (figura 3). De acuerdo a los agrupamientos que se

formaron mediante los perfiles RISA, 15 aislados cuyos patrones ITS diferían

alrededor de un 20%, según árboles con índices de similitud generados con el

software Gelcompare® (Figura 3) fueron seleccionados para identificación por

secuenciación. Los grupos encontrados no tuvieron una relación directa con la

empresa productora de quesos, evidenciándose una agrupación aleatoria donde

no se distinguen aislados que pertenezcan a un solo queso en específico (Figura

3).

5,6

5,8

6

6,2

6,4

6,6

6,8

7

7,2

7,4

Queso 1 Queso 2 Queso 3

Lg (

UFC

-Cel

ula

s/g-

ul)

Recuento de bacterias totales y de BAL

M17 MRS Epifluorecencia


Figura 3. Análisis clúster de los patrones de bandeo en RISA de las bacterias aisladas de los quesos. Resultado obtenido por el método: DICE- UPGMA, encerrados en los rectángulos, están los aislados que se escogieron para secuenciar.

19

3.2.4. Identificación de los aislados con el gen ribosomal 16S rDNA

Las características tecnológicas y similitudes filogenéticas de los aislados

seleccionados para secuenciación de acuerdo a diferencias en sus patrones ITS

se muestran en la tabla 2

Aunque los patrones RISA de todos los aislados seleccionados diferían en gran

medida (20%), el análisis de secuencias mostro que el 53% de los individuos

presentaban afiliación filogenética con el género Weissella paramesenteroides (4

Tabla 2. Características tecnológicas y similitudes filogeneticas

Código (Origen- muestra)

Similitudes filogenéticas. (Código de acceso )

Similaridad NCBI # acceso

Capacidad tecnológica.

Q1a-8 Leuconostoc mesenteroides; (AB023245)

97% KX078333 Actividad Acidificante.

Producción de acetoina y diacetilob

Q2-7 Leuconostoc mesenteroides (AB056545)

100% KX078321

Q2-11 Leuconostoc mesenteroides (JK273684)

99% KX078327

Q3-1 Leuconostoc lactis (AB295117)

100% KX078322

Q1-9 Leuconostoc citreum (KC836576)

98% KX078320

Q3-3 Pediococcus acidilactici (EU147309)

100% KX078323 Producción de acetoina y diacetiloc.

Q2-3 Pediococcus acidilactici (KJ083748)

99% KX078325

Q2-6 Weissella paramesenteroides (AB023238)

98% KX078330 Actividad Antimicrobianad.

Q1-3 Weissella paramesenteroides (FJ751790)

100% KX078319


98% KX078328


98% KX078326

Q1-1 Weissella viridescens (KJ580423)

97% KX078332

Q2-5 Weissella viridescens (AB053236)

98% KX078331


97% KX078329


100% KX078324

a Aislados bacterias acidolacticas. b (53), c (41), d (62)


aislados), Weissella viridescens (4 aislados), seguido por Leuconostoc

mesenteroides (3 aislados) y en menor proporción Pediococcus acidilactici,

Pediococcus pentosaceus, Leuconostoc lactis y Leuconostoc citreum (1aislado).

La relación filogenética entre los aislados se muestra en el dendograma construido

por el método de neighbor-joining y se observan en la figura 4.

Figura 4. Ubicación filogenéticas de los aislados bacterianos basados en las secuencias del gen RNAr

16S. El dendograma Neighbor-joining fue generado en MEGA usando Kimura-2 y se utilizaron 1000

réplicas en análisis boostrap. la secuencia del gen RNAr 16S de Pyrococcus furiosus fue usada como “out-

group”.

21

3.2.5. Caracterización tecnológica de cepas.

Los resultados para las propiedades tecnológicas realizadas a las cepas de BAL

se muestran en la tabla 3.

Actividad acidificante y producción de diacetilo.

En evaluación de la actividad acidificante, la cepa Q3-3 presento a las 6h, el mayor

descenso de pH y las cepas Q2-5 y Q2-11 a las 24 h.

De las 5 cepas de BAL, solo tres dieron positivo para la prueba de producción de

diacetilo, en Q2-5 y Q3-6 no fue detectado.

Actividad proteolítica y lipolítica.

No se evidencio en ninguna cepa actividad proteolítica y lipolítica extracelular, por

el método cualitativo usado.

Crecimiento a diferentes temperaturas y a diferentes concentraciones

de sal

Se observó que las cepas Q1-9 y Q2-11 no crecieron a 15°C y Q2-5 no creció en

45°C (Tabla 3). Todas las cepas crecieron en concentraciones de 2 y 6% de sal.

En 10% solo una bacteria tuvo crecimiento (Q2-5).

Actividad microbiana.

La actividad antimicrobiana de los extractos obtenidos del crecimiento de las cepas

evaluadas mostro un efecto inhibitorio sobre: Listeria monocytogenes, Escherichia

coli y Salmonella typhimurium. Los extractos de las cepas BAL que presentaron

valores iguales o por encima de 15 mm en el halo de inhibición fueron Q1-9

(Leuconostoc citreum) y Q2-11(Leuconostoc mesenteroides) y Q3-3 (Pediococcus

acidilactici) siendo las que tuvieron mayor efecto sobre el crecimiento de los

patógenos. El extracto de las BAL tuvo un menor efecto frente Enterococcus

faecalis con halos de inhibición inferiores a 15 mm.


3.3. Métodos independientes de cultivo.

3.3.1. Análisis de comunidades microbiana por PCR-TGGE

La evaluación de la diversidad de las poblaciones bacterianas de los quesos de

diferentes empresas se llevó a cabo por la técnica PCR-TGGE, amplificando la

región V3-V5 el gen RNAr 16S. Los resultados de la amplificación para cada una

de las muestras fueron reproducibles en los patrones de TGGE, observándose

pocas bandas (Figura 5A). Se notan diferencias en intensidad dentro de cada punto

muestreado pero no entre profundidades. En general, se observó un patrón de

Tabla 3. Caracterización tecnológica de cepas BAL.

Pruebas

Q3-31 Q2-5 Q1-9 Q2-11 Q3-6

Acidificación (pH)2

6h 5,10±0,20 6,10±0,01 5,39±0,03 5,45±0,20 5,95±0,01

24h 4,38±0,01 4,29±0,02 4,36±0,20 4,29±0,10 4,35±0,20

Actividad antimicrobiana

(mm)

Escherichia coli 16 16 15 15 16

Salmonella typhimurium

15 15 20 15 12

Staphylococcus aureus

7 5 15 17 8

Enterococcus faecalis

8 0 12 12 9

Listeria monocytogenes

25 18 20 17 17

Act. Proteolítica

- - - - -

Act. Lipolítica

- - - - -

Concentración de sal (%)

2 + + + + +

6 + + + + +

10 - +/- - - +

Temperaturas (C)

15 + + - - +

45 + - + + +

Producción de diacetilo

+ - + + -

1Nomenclatura de las cepas en estudio Q3-3: Pediococcus acidilactici, Q2-5: Weissella viridescens, Q1-9: :Leuconostoc citreum. Q2-11 Leuconostoc mesenteroides, Q3-6: Weissella paramesenteroides, 2 pH inicial: 6,8.

23

migración de bandas similar a lo largo de cada uno de los carriles donde estaban

representados los quesos y sus respectivos lotes. En gel de TGGE, todos los

carriles tienen en común las bandas número 2, 3, 4 y 7 (figura 5A). Las diferencias

entre cada uno de los patrones se presentaron principalmente en Q2 y Q3, donde

se observó la ausencia y presencia respectivamente, de las bandas 1, 5 y 6(figura

3 A). En algunos carriles se observan manchas provenientes de todas las

muestras.

Las diferencias en los patrones de diversidad entre las tres empresas y los lotes,

se tomaron como parámetros de análisis. Después de analizar los patrones de

bandeo para cada perfil con el software Gelcompar II® (Figura 5A), no se observó

una tendencia definida a la agrupación o formación de clusters por lotes (L1, 2 y 3;

en Q1 y Q2). Sin embargo, se evidencia similaridades entre 90 - 100 % y un 60-

80% para las empresas productoras. Con el análisis de componentes principales

se evaluaron las correlaciones existentes entre los diferentes quesos y sus lotes,

(Figura 3B) observándose que los quesos con sus correspondientes lotes, tuvieron

cercanía, presentándose poca variación entre ellos y teniendo más relación los

quesos de Q1 y Q3. Los índices de diversidad y riqueza (Tabla 4), mostraron

variación entre los lotes y los quesos producidos en las diferentes empresas.

Tabla 4. Índices de diversidad, obtenidos a partir de los análisis Bandas de TGGE. Q1L2

a Q1L3 Q1L1 Q3L1 Q3L2 Q3L3 Q2L1b

Taxa_S 5 5 6 7 7 7 3

Individuals 5 5 6 7 7 7 3

Dominance_D 0,200 0,2000 0,1667 0,1429 0,1429 0,1429 0,3333

Simpson_1-D 0,800 0,8000 0,8333 0,8571 0,8571 0,8571 0,6667

Shannon_H 1,609 1,6090 1,7920 1,9460 1,9460 1,9460 1,0990 a Designación de las muestras analizadas Q1L1 (Queso empresa 1, Lote 1), así para todos los demás. b Para la empresa Q2 solo se pudo obtener una muestra.


3.3.2. Afiliación filogenética de las secuencias obtenidas

provenientes de las bandas TGGE:

Se destacan bandas asociadas a unidades taxonómicas operacionales específicas

o especies bacterianas que se repitieron a lo largo de todos los puntos de muestreo

Figura 5. Análisis de las bandas y las relaciones que existen entre los diferentes quesos producidos. A) Clúster de los patrones de bandeo de la diversidad de bacterias en quesos doble crema hechos en tres diferentes empresas. (Método: DICE- UPGMA). B) Análisis de PCA.

1 2 3 4 5 6 7

A

B

25

(Figura 5). Treinta bandas de interés en cuanto a ocurrencia en todos los carriles o

exclusivas a ciertos puntos fueron escindidas, re-amplificadas y secuenciadas. Un

total de 5 bandas produjeron secuencias de calidad, pudiendo ser ensambladas,

alineadas e identificadas usando los paquetes Bioedit (Halt,1999), Mega 6.0

(Tamura et al, 2007) y Blast (Altschul et al, 1990). A pesar de que 30 bandas

pudieron ser escindidas y secuenciadas, la mayoría provenientes de los diferentes

quesos analizados, no pudieron ser relacionadas con secuencias en bases de

datos de genes ribosomales debido a la obtención de cromatogramas con ruido

excesivo y secuencias de pobre calidad con múltiples ambigüedades que evitaron

que estas pudieran ser ensambladas y asociadas exitosamente a unidades

taxonómicas operacionales. Adicionalmente, en algunos carriles, la presencia de

manchas, hizo difícil la caracterización y por ende la escisión de bandas

individuales. La identidad de cada una de las bandas que pudieron ser

exitosamente identificadas además de su asociación filogenética a grupos

bacterianos específicos. Todas las bacterias encontradas han sido detectadas en

estudios previos relacionados con muestras provenientes de derivados lácteos,

especialmente con quesos y leches fermentadas. Las identidades de los patrones

de bandeo recurrentes (Figura 5A) se asociaron a las especies Enterococcus sp

con una identidad 99 % (banda 7), Weissella sp una identidad del 100 % (banda 4)

Pediococcus sp una identidad del 100% (banda 1), Lactobacillus fermetum una

identidad del 99% (banda 3), Lactococcus lactis una identidad del 99% (banda 5),

Lactoccoccus lactis subesp lactis una identidad del 99 % (banda 6) y Leuconostoc

mesenteroides una identidad del 100% (banda 2). En general el filum Firmicutes,

representados por los géneros Leuconostoc, Weissella y Lactobacillus, son los

grupos dominantes en todos los quesos muestreados (Figura 6).


B1

gi|940789697|gb|KT906209.1| Pediococcus sp.

gi|592748636|gb|KF973207.1| Pediococcus sp.

gi|402169848|gb|JX193618.1| Pediococcus sp.

gi|390165382|gb|JQ806707.1| Pediococcus acidilactici.

gi|684782318|gb|KM005147.1| Pediococcus acidilactici.

gi|959479619|gb|KU213668.1| Lactobacillus fermentum.

B3

gi|726968612|gb|KM485580.1| Lactobacillus fermentum.

gi|726968611|gb|KM485579.1| Lactobacillus fermentum.

gi|930156700|gb|KR135402.1| Lactobacillus fermentum.

B7

KU644349.1|_Enterococcus_sp.

KU644404.1|_Enterococcus_sp.

KU324913.1|_Enterococcus_lactis

KT438165.1|_Enterococcus_faecium

gi|937668281|gb|KT887254.1| Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides.

gi|932253262|gb|KT361118.1| Leuconostoc sp.


B2


Lactococcus lactis AJ271851

B5

Lactococcus lactis AJ488174

Lactococcus lactis X64887

Lactococcus lactis subsp. cremoris HM218811

B6

gi|937668276|gb|KT887249.1| Lactococcus lactis subsp. lactis

gi|917614574|gb|KT427451.1| Lactococcus lactis subsp. lactis

gi|902883044|gb|KP764114.1| Lactococcus lactis subsp. lactis

gi|902883005|gb|KP764099.1| Lactococcus lactis subsp. lactis

B4

gi|1000811929|dbj|LC127181.1| Weissella paramesenteroides.

gi|884465791|gb|KP789026.1| Weissella sp.

gi|413965743|gb|JX826527.1| Weissella_sp.

gi|407725290|dbj|AB671284.1| Weissella sp.

gi|402169865|gb|JX193635.1| Weissella sp.

gi|2343082|gb|U96622.1| Pyrococcus furiosus

99

98

95

90

98

70

33

63

32

99

0.2

Figura 6. Dendograma construido mediante el método Neighbor joining para las secuencias 16S DNAr

analizadas por la técnica TTGE. El dendograma fue generado en MEGA 6.0 usando Kimura-2 y se

utilización 1000 réplicas en análisis boostrap. la secuencia del gen RNAr 16S de Pyrococcus furiosus

fue usada como “out-group”.

27

3.3.3. Análisis RISA para fracción cultivable y fracción total

Mediante el análisis RISA para la fracción cultivable (Figura 7A) se evidencio la

agrupación entre los diferentes medios de cultivos utilizados. Las diferencias entre

los bandeos en cada medio de cultivo presentaron similaridades aproximadas del

88 % para Q3 y 76% para Q1. Las muestras formaron dos grupos, integrados por

Q3-Q1, Q2 tuvo diferencias marcadas entre los medios evaluados. En la fracción

total también se agruparon los diferentes quesos estudiados según el patrón

obtenido (Figura 7.B), pero en este caso, los quesos con mayor relación fueron: Q1

y Q2. Siendo Q3 el que presento patrones diferentes. Para cada uno de las

fracciones los índices de diversidad no variaron (Tabla 5), presentándose algunas

diferencias en Q2.

Figura 7. Análisis Cluster elaborado por el coeficiente de similitud Dice (Presencia

o ausencia de bandas) y el método de agrupamiento UPGMA basado en patrones

de bandeo ITS de la muestras de Queso Doble Crema. A) análisis de la fracción de

DNA cultivable. B) análisis de la fracción de DNA total.

A

B


Fracción total vs fracción cultivable.

En el análisis de ITS para la fracción cultivable comparada con la fracción total, se

presentaron algunas diferencias entre los perfiles de bandeos de cada fracción

(Figura 8). No se agruparon las muestras de cada fracción que pertenecen a las

mismas empresas, entre los diferentes medios evaluados y las muestras de DNA

total. Los índices de diversidad muestran que la variación entre cada queso

evaluado fueron similares (Tabla 5). Esto también se observó en lo obtenido por

medio de TGGE (Tabla 4).

Figura 8. Análisis de clúster elaborado por el coeficiente de similitud Dice (Presencia o ausencia de

bandas) y el método de agrupamiento UPGMA basado en patrones de bandeo ITS de las muestras

de Queso Doble Crema de la fracción de DNA cultivable vs análisis de la fracción de DNA total.

29

TABLA 5. Índices de diversidad, obtenidos a partir de los análisis RISA. Q1 Q2 Q3

FCa FTb FC FT FC FT M17 MRS L1

c L2 L3 M17 MRS L1 M17 MRS L1 L2 L3

Taxa_S 9 10 6 5 5 6 10 3 9 9 7 7 7

Individuals 9 10 6 5 5 6 10 3 9 9 7 7 7

Dominance_D 0,11 0,10 0,17 0,20 0,20 0,17 0,10 0,33 0,11 0,11 0,14 0,14 0,14

Simpson_1-D 0,89 0,90 0,83 0,80 0,80 0,83 0,90 0,67 0,89 0,89 0,86 0,86 0,86

Shannon_H 2,20 2,30 1,79 1,61 1,61 1,79 2,30 1,10 2,20 2,20 1,95 1,95 1,95 a FC: fracción cultivable, bFT: fracción total, c L1,L2,L3: Lote 1, 2 y 3.

4. Capítulo 4: Discusión

El estudio de la diversidad de bacterias acido lácticas (BAL) en quesos, ha

permitido conocer la función que tienen este grupo de microorganismos en los

procesos de producción. (63–66). En este trabajo se presenta un acercamiento a

la diversidad bacteriana asociada al queso doble crema tradicional del Valle de

Ubaté, ubicado en Cundinamarca, Colombia. Se utilizaron métodos dependientes

e independientes de cultivo para inferir sobre la presencia de BAL, diversas e

igualmente complejas, presentes en este tipo de queso.

Los parámetros fisicoquímicos evaluados en los quesos, muestran en todas las

empresas un cumplimiento de la normatividad vigente. Sin embargo, se

presentaron variaciones entre las empresas estudiadas, las cuales generalmente

se asocian a diferencias en el nivel de industrialización del proceso de producción

(17). Novoa & Lopez, (2008) y Osorio et al.,(2012) han estudiado el efecto de

algunas características fisicoquímicas en quesos artesanales y como estas

influencian los perfiles organolépticos, mostrando que su variación está ligada a

una acción conjunta de parámetros relacionados con la cantidad de grasa, el pH y

la humedad. Los resultados de este estudio sugieren un rango estrecho en cuanto

a diversidad de especies cultivables en las muestras (Figura 2), ligado a

características complejas fisicoquímicas y por supuesto a los sesgos potenciales

que pueden representar los estudios cultivo-dependientes (67).

Los recuentos obtenidos para cada una de las empresas estudiadas mostraron

variabilidad, presentando valores entre 6,0 - 7,0 Log UFC g-1 , valores menores a

los encontrados en otros quesos frescos y de pasta hilada (Caciocavallo), donde

los conteos alcanzan hasta 8,0-9,0 Log UFC g-1, estos cambios están relacionados

principalmente al origen de la materia prima y a las condiciones de manufactura,


que presentan diferentes condiciones a los cuales se beneficia el crecimiento de

estas bacterias (68,69). Los recuentos de microorganismos totales por

epifluorescencia, fueron mayores que los realizados en los medios selectivos,

resultados similares se han reportado anteriormente (33,70,71), esto se debe a la

presencia de células no viables y células viables no cultivables en el conteo de

células totales.

En la metodología cultivo dependiente, predomino la presencia de los géneros

Weissella sp y Leuconostoc sp. Algunos de los aislados fueron específicos de

algunas empresas, como es el caso de Leuconostoc lactis (Q3) y Pediococcus

acidilactici (Q2). Esta bacterias han sido reportadas en estudios hechos en

diferentes quesos tradicionales (72,73).

El género Weissella sp aparece como el más dominante entre las BAL aisladas de

las muestras (53%). Esto se corroboró haciendo un análisis de cuales patrones

RISA en los 31 aislados obtenidos coinciden exactamente con 15 aislados

identificados por secuenciación. Por ejemplo, basados solo en el análisis de

patrones RISA, entre todos los aislados, Weissella sp. sigue dominando,

representando el 50% de las secuencias, sin mencionar las coincidencias desde el

punto de vista fenotípico como morfología y tinción de Gram que se presentaron

igualmente con otros aislados, indicando que el porcentaje puede ser mayor. Se

debe tener extremo cuidado en establecer asociaciones taxonómicas y/o

filogenéticas solo desde el punto de vista morfológico, más aún cuando se ejerce

un sesgo tan grande como es el aislamiento en medios selectivos (22,74).

Weissella sp es un género principalmente aislado de alimentos fermentados que

están relacionados con frutas, algunos vegetales y cereales (75,76). En los últimos

años se ha convertido en una bacteria de interés en el ámbito de derivados lácteos,

en especial por su estrecha relación con quesos producidos a partir de leches

ácidas (28,43). También ha sido reportado como un microrganismo con algunas

características que están asociadas a factores benéficos dentro de la producción

de quesos, entre las más importantes encontramos: producción de compuestos

volátiles, exopolisacáridos y algunos péptidos con funciones bioactivas (77).

39

El análisis de patrones ITS muestra que Leuconostoc sp, representó

aproximadamente 30% de todos los aislados obtenidos siendo detectado en todas

las muestras. Esta especie es bien conocida dentro de las BAL por las funciones

que cumple en la consolidación de las propiedades organolépticas de muchos

quesos (7,53,69,78,79). Sus características más importantes van desde la

producción de componentes bioactivos, hasta acondicionar la matriz del queso,

específicamente, mediante cambios fisicoquímicos, lo cual favorece el crecimiento

de otras BAL. (29,72,73,80). En algunos estudios se han destacado las funciones

de este microorganismo y sus variedades de especies en los quesos, atribuyéndole

factores diferenciales al producto como: la reducción del pH, deshidratación ,

incremento de sales y reducción de la actividad del agua (77,81). En este estudio

se encontraron tres especies diferentes relacionadas con este género:

Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc lactis y Leuconostoc citreu, que han

sido reportados en diferentes tipos de quesos de pasta hilada (76,78,82).

Otro de los géneros encontrados fue Pediococcus sp., este coco gram positivo,

homofermentativo, se ha reportado en menor proporción en quesos, asociado

principalmente a microbiota nativa no iniciadora (24,74,83,84). Este género ha sido

asociado a la generación de olores y sabores característicos en derivados lácteos,

su metabolismo, se ha asociado a actividades proteolíticas y lipoliticas (83),

En la evaluación de las características tecnológicas de algunas cepas aisladas, los

valores de pH encontrados muestran que estas bacterias tienen un potencial

acidificante, los valores encontrados a las 24 h estuvieron entre 4,2 y 4,3, los cuales

son similares con otros estudios hechos (40,85,86). La actividad antimicrobiana en

contra de patógenos de interés en alimentos, se evidenció en las bacterias

estudiadas, lo que indica que existen posibles antagonismos relacionados con la

producción de agentes antibacterianos (Tabla 3). Las bacterias ácido lácticas han

sido relacionadas con la producción de agentes antimicrobianos; Cheong et al.,

(2014) evaluaron la acción de algunas BAL sobre el crecimiento de mohos sobre la

superficie de un queso fresco, donde encontraron un control efectivo del

crecimiento del hongo. También, otras investigaciones muestran los posibles


efectos de consorcios microbianos aislados de quesos, en contra de patógenos

como Listeria sp (87). Las demás características tecnológicas mostraron resultados

muy variables, las cepas resistieron concentraciones de sales del 2 y 6%, esto se

relaciona con la producción de quesos, que incluyen salmueras en sus procesos

de elaboración y es evidencia de su adaptación a estos ambientes. La producción

de diacetilo es uno de los productos del metabolismo del citrato (4,73,85) y es un

compuesto importante en la consolidación de algunos sabores en los quesos, en

este estudio, se encontraron tres cepas BAL (Pediococcus acidilactici, Leuconostoc

citreum, Leuconostoc mesenteroides) que mostraron producción. Las actividades

proteolíticas y lipolítica no estuvieron presentes en las cepas evaluadas, estos dos

propiedades enzimáticas han sido relacionadas principalmente con aislados

obtenidos de quesos madurados, donde se desarrollan gran variedad de

metabolismos que involucran estas dos actividades (51,88–90).

Los análisis independientes de cultivo realizados por PCR- TGGE, de las tres

empresas, evaluando la región V3-V5 del gen rDNA 16S, se realizaron para

completar la información encontrada con los aislados en los medios de cultivos. La

determinación de la diversidad bacteriana en muestras de queso por técnicas de

detección e identificación como TTGE o DGGE, está caracterizada por arrojar

resultados variables, con perfiles de diversidad y mostrando representantes de

diferentes filum (30).

Los resultados obtenidos en este trabajo, muestran bajos niveles de diversidad,

con grupos dominantes pertenecientes al filum Firmicutes y 3 géneros

representando estos grupos: Enterococcus sp, Lactobacillus sp y Lactococcus sp

(figura 5A); los cuales se encontraron asociadas a los quesos estudiados, pero no

crecieron en los medios utilizados. Sin embargo, en algunos carriles se observan

manchas provenientes de todas las muestras y cuyas bandas individuales no

pudieron ser caracterizadas, lo que puede representar a comunidades muy

diversas pueden ser erróneamente interpretadas. Tras el análisis de los patrones

de bandas y la realización de análisis de agrupación, se observó que la comunidad

asociada es constante a través de las diferentes muestras. Este análisis de

39

agrupamiento fue confirmado por tres repeticiones (datos no presentados). Estos

resultados pueden reflejar lo que según algunos autores acontece (42, 91) en

situaciones de presión extrema o perturbación, donde las baterías enzimáticas

bacterianas se ven obligadas a concentrar su acción en mecanismos de

supervivencia en oposición a encaminar su acción a procesos de crecimiento

celular disminuyendo por su puesto el número de aquellos individuos incapaces de

adaptarse evolutivamente (42,56,91). Los otros géneros encontrados por esta

técnica fueron correspondientes a los obtenidos por métodos cultivo. De la misma

manera hay evidencia de la gran influencia que ejercen los cambios fisicoquímicos

en la estructura de la comunidad bacteriana (92,93) donde los índices de diversidad

se ven afectados por cambios en las concentraciones de sal, pH, temperaturas,

concentraciones de oxígeno, entre otros.(37,94)

Sin embargo, es imperativo tener en cuenta las limitaciones que posan en la técnica

TTGE/DGGE. Es claro que los perfiles obtenidos solo representan las comunidades

más representativas o dominantes, es imposible tener una idea de la riqueza total,

lo que puede en algún momento desestimar los perfiles de diversidad y número de

especies, igualmente una sola banda detectada puede representar más de un OTU

o una especie particular puede dar pie a la formación de varias bandas (65,95,96).

Igualmente, es necesario contemplar las limitaciones antes mencionadas con

respecto a los sesgos que representan las técnicas moleculares basadas en PCR,

principalmente, las que se refieren a los sesgos existentes a la hora de obtener

ADN representativo de todas las comunidades presentes (97).

Los géneros de Enterococcus sp, Lactobacillus sp y Lactococcus sp, son aislados

con frecuencia y hacen parte de la microbiota nativa de quesos producidos con

leches acidas y quesos de pasta hilada. Enterococcus sp es un género que ha

tomado mucha relevancia en los últimos años, las especies E. faecuim y E. durans,

se han consolidado como microorganismos con importancia tecnológica en los

procesos de acidificación y maduración (74,98,99). De otro lado los géneros

Lactobacillus sp. y Lactococcus sp, son comunes y han sido encontrados en


muchos tipo de quesos de diferentes regiones del mundo

(8,21,42,72,76,78,100,101).

Q1 y Q3 fueron las empresas que tuvieron mayor relación, de acuerdo a las bandas

obtenidas por medio de TGGE (figura 5A), es decir, comparten comunidades

bacterianas similares. Las diferencias encontradas frente a Q2, pueden estar

relacionadas con los procesos de producción, utensilio utilizados en la fabricación

y las prácticas de manufactura (41,102), uso de sustancias químicas para la

acidificación, factores que influencia de alguna manera a la diversidad de la

microbiota nativa existente.

La comparación de la diversidad encontradas mediante el análisis RISA, no mostro

una diferenciación entre las empresas. Las variaciones en la comunidades

bacterianas presente en los quesos, se dan generalmente cuando se cambia la

microbiota nativa por cultivos iniciadores o cuando se comparan diferentes sitios

donde se realizan procesos de maduración (96,103).

La microbiota encontrada por el método PCR-TGGE, mostro relación con los

géneros encontrados en los medios selectivos evaluados, contrario a lo que se ha

descrito en este tipo de acercamientos (20,27). Sin embargo, en estudios hechos

en quesos elaborados con leches acidas, han evidenciado que esta

correspondencia puede llegar a darse, por la selectividad que tienen este tipo de

ambientes con las bacterias presentes (29).

Las BAL identificadas dan bases sobre el entendimiento de que bacterias están

presentes en el queso doble crema y abren el curso de otras investigaciones que

conlleven a conocer cuales es la importancia de utilizar cultivos iniciadores con

cepas autóctonas, para así preservar las características organolépticas y

sensoriales del producto original, como lo han logrado muchos de los quesos

artesanales en Europa. En Latinoamérica, existen un gran interés de resaltar el

valor de sus productos autóctonos, tal es el caso de México (77,104), Argentina

(105,106). y Brasil (96) donde se han realizado estudio de caracterización de

algunos de sus quesos autóctonos. Colombia en la actualidad tiene muchos retos

39

para consolidar e identificar sus productos nacionales como sus quesos

tradicionales, que son parte fundamental de su cultura.

Una idea fundamental, se desprende del hecho de encontrar similitudes entre los

análisis moleculares y los cultivos dependientes. Es importante anotar que en

ambas técnicas de tamizaje priman organismos cultivables como dominantes en

las diferentes muestras analizadas. Según lo anterior, surge la pregunta acerca de

quiénes son los miembros más activos y con mayor importancia en el ecosistema;

la fracción cultivable, o ese 95-99 % que aún no ha podido ser aislado, asunto que

sin duda requiere atención e investigación adicional (28,74). El enfoque

bidireccional seguido en este trabajo, demuestra que particularmente en esta

muestra, las dos técnicas efectivamente exponen los componentes dominantes de

la comunidad. En este orden de ideas, tal parece ser que el reto en futuros estudios

de ecología y diversidad bacteriana, es de vital importancia desarrollar nuevas

tecnologías de cultivo de organismos no antes cultivados e integrar las técnicas

moleculares, cultivo dependientes y de función de las comunidades en un enfoque

totalmente polifásico, lo que sería de gran utilidad para llevar importantes avances

en la comprensión de este ecosistema y su impacto en la elaboración y calidad del

queso en la región.


5. Capítulo 5. Conclusiones y recomendaciones

5.1 Conclusiones

La diversidad de BAL aisladas e identificadas en los quesos doble crema, que se

evaluaron en este estudio correspondieron a: Pediococcus acidilactici, Weissella

paramesenteroides Weissella viridescens, Leuconostoc citreum, Leuconostoc

mesenteroides y Leuconostoc lactis. Por otro lado especies y géneros

pertenecientes a Enterococcus sp, Weissella sp, Pediococcus sp, Lactobacillus

fermetun, Lactococcus lactis, Lactoccoccus lactis subesp lactis y Leuconostoc

mesenteroides, se detectaron por TGGE.

Las bacterias que se encontraron relacionadas con el queso doble crema por medio

de métodos dependientes e independientes de cultivos han sido reportadas en

muchos tipos de quesos y ellas están relacionadas con actividades metabólicas de

importancia, que contribuyen al desarrollo de propiedades organolépticas

Las relaciones existentes entre las diferentes empresas productoras de queso

doble crema analizados en este estudio, mostraron que existen algunas

poblaciones de bacterias acido lácticas que están presentes en las muestras y los

lotes analizados para cada uno de los quesos. La diversidad de bacterias tampoco

fue muy diferente, solo Q2 presento algunos cambios, que sugieren esta

involucrados con la forma de producción.

39

Características relacionadas con el potencial tecnológico, se evaluaron para

algunos aislados representativos de especies de bacterias acido lácticas

encontrados en los quesos, donde la actividad acidificante, la producción de

diacetilo y crecimiento a concentraciones de sal (2 y 6%) fueron las importantes.

La producción de compuestos antibacterianos, evidencio la existencia de actividad

contra: Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus,

Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes.

Los cambios en las comunidades bacterianas relacionados con el queso doble

crema, presentes en este estudio, contribuyen al fortalecimiento del conocimiento

en este tipo de productos autóctonos, que dan pie a proponer nuevas alternativas

para promover su conservación mediante distinciones como protección de

Denominación de Origen (DO).

5.2. Recomendaciones.

En Colombia existen pocos acercamientos al conocimiento de la composición

microbiana en sus productos autóctonos; establecer y entender como están

actuando en determinado alimento es fundamental para ayudar entender su aporte

en la producción. Para esto se debe profundizar en estudios donde se apliquen

métodos moleculares más gruesos, relacionados con genómica y transcriptomica,

donde se puedan obtener con mayor información sobre la composición de este

queso y sus metabolismos relacionados

41

A. Anexo A: Tablas con recuentos totales y de bacterias ácido lácticas.

Anexo 1. Recuento1 de bacterias acido lácticas. Q1 SD3 Q2 SD Q3 SD

M172 6,8 6,2 6,4 6,2 6,8 6,4

MRS2 6,7 6,2 6,3 5,3 7,0 6,5

Epifluorecencia3 7,0 6,3 6,9 6,4 7,1 6,1 1Log10 de los valores obtenidos en los recuentos UFC- Celulas/g. 2Medios de cultivos evaluados. 3 Recuento de bacterias totales. 3SD: desviación estándar.

I Anexo 1. Bacterias en tinción con naranja de acridina,

en microscopia de epiflouerecencia, 100X .

43

B. Anexo B: Análisis RISA de los aislados.

Anexo B. Análisis clúster de los patrones de bandeo ITS de las bacterias aisladas de los

quesos. Resultado obtenido por el método: PEARSO- LINKAGE,

45

C. Anexo C: Tinción gram de los géneros identificados.

Leuconostoc sp.

Pediococcus sp.

Weissella sp.

46

D. Anexo D: foto de las pruebas de caracterización tecnológicas de cepas BAL.

Q3-3

Q2-5 Q1-9 Q2-11 Q3-6

Q3-3

Q2-5 Q1-9 Q2-11 Q3-6

Control +: Act. Proteolítica Act. Lipolítica.

Act. Lipolítica Act. Proteolítica

Q3-3 Q2-5 Q1-9 Q3-6 Q2-11 C+ C-

Control +: Act. Proteolítica Act. Lipolítica. Control +: Act. Proteolítica Act. Lipolítica.

Producción de diacetilo.

Salmonella typhimurium

Q3-3

Q2-5

Q1-9

Q2-11

Q3-6 C+

C-

Staphylococcus aureus

Q3-3

Q2-5

Q1-9

Q2-11 Q3-6

C+

C-

Escherichia coli

Q3-3

Q2-5

Q1-9

Q2-11 Q3-6

C+ C-

Actividad antimicrobiana.

47

Q3-3

Q2-5 Q1-9

C+ Q2-11

Q3-6

C-

Listeria monocytogenes Enterococcus faecalis

Q3-3

Q2-5 Q1-9

C+ Q2-11

Q3-6

C-

48

E. Anexo E: Gel resultado del TGGE y relación taxonómica de las bandas.

Anexo E. Taxonomía de las identificaciones de las bandas de TGGE.

Reino: Bacteria Bacteria Bacteria Bacteria Bacteria Bacteria

División: Firmicutes Firmicutes Firmicutes Firmicutes Firmicutes Firmicutes

Clase: Bacilli Bacilli Bacilli Bacilli Bacilli Bacilli

Orden: Lactobacillales Lactobacillales Lactobacillales Lactobacillale

s Lactobacillal

es

Lactobacillales

Familia: Leuconostoca

ceae Lactobacillace

ae Leuconostocaceae

Streptococcaceae

Lactobacillaceae

Enterococcaceae

Género Leuconostoc Pediococcus.

( Banda 1) Weissella. (Banda 4)

Lactococcus Lactobacillus Enterococcus (Banda 7)

Q1 L1 Q1 L2 Q1L3 Q2 Q3L1 M Q3L2 Q3L3

2

4

3

5

7

1

6

Anexo E. Patrones de bandas para tres diferentes quesos mediante la electroforesis en gel con

gradiente de temporal de temperatura.

49

Especie Leuconostoc

mesenteroides (Banda 2)

. Lactoccoccus lactis subesp lactis (Banda

6) Lactococcus lactis.(Banda

5)

Lactobacillus fermetun (Banda 3)

Códigos de acceso en GenBank: Banda1: KX097974 , banda 2: KX097975 , Banda 3: KX097976 , banda 4: KX097977, banda 5: KX097978 , banda 6: KX097979, banda 7: KX097980

50

F. Anexo F: Presentación en congreso internacional.

51

Bibliografía.

1. Mejía LG, De Arango MJ, Sepúlveda JU. Quesos frescos y de pasta hilada. (Medellín) -Universidad Nacional de Colombia, editor. Colombia; 1995. 190 p.

2. Trade and Market Division of FAO. Food Outlook, Biannual report on global food markets. 2015;(November):1–133.

3. Arango J. La industria del queso en Colombia cultura láctea. Despertar lechero. Colombia; 2004. p. 117–37.

4. Papagianni M. Metabolic Engineering of Lactic Acid Bacteria for the Production of Industrially Important Compounds. Comput Struct Biotechnol J [Internet]. Research Network of Computational and Structural Biotechnology; 2012;3(4):1–8. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S2001037014600593

5. Pedersen TB, Ristagno D, McSweeney PLH, Vogensen FK, Ardö Y. Potential impact on cheese flavour of heterofermentative bacteria from starter cultures. Int Dairy J [Internet]. Elsevier Ltd; 2013;33(2):112–9. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.idairyj.2013.03.003

6. Yvon M, Rijnen L. Cheese flavour formation by amino acid catabolism. Int Dairy J [Internet]. 2001;11(4–7):185–201. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958694601000498

7. Alegría Á, Szczesny P, Mayo B, Bardowski J, Kowalczyk M. Biodiversity in Oscypek, a traditional Polish Cheese, determined by culture-dependent and -independent approaches. Appl Environ Microbiol. 2012;78(6):1890–8.

8. Casalta E, Sorba JM, Aigle M, Ogier JC. Diversity and dynamics of the microbial community during the manufacture of Calenzana, an artisanal Corsican cheese. Int J Food Microbiol [Internet]. Elsevier B.V.; 2009;133(3):243–51. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2009.05.022

9. Ahrne S, Pettersson B, Molin G, Va a. Temporal temperature gradient gel electrophoresis ( TTGE ) as a tool for identi ® cation of Lactobacillus casei , Lactobacillus paracasei , Lactobacillus zeae and Lactobacillus rhamnosus. Lett Appl Microbiol. 2001;215–9.

10. Monnet C, Bogovic Matijasic B. Application of PCR-based methods to dairy products and to non-dairy probiotic products. Polymerase Chain Reaction. 2012. 11-51 p.

11. Walter J. Ecological Role of Lactobacilli in the Gastrointestinal Tract: Implications for Fundamental and Biomedical Research. Appl Environ Microbiol [Internet]. 2008 Aug 15;74(16):4985–96. Available from: http://aem.asm.org/content/74/16/4985.short

12. Novoa CF, Lopez NC. Evaluación de la vida útil sensorial del queso doble crema con dos niveles de grasa. Rev Med Vet y Zootec 55. 2008;(1):91–9.

13. Palacios Villarraga IA. Análisis de la demanda de lácteos en Colombia (2007-2013) [Internet]. 2014. Available from: http://repositorio.escuelaing.edu.co/handle/001/176

14. Osorio DP, Novoa CF, Gutierrez LF. Determinación e la viabilidad de la nariz electrónica en la predicción de la vida útil del queso doble crema. Rev Aliment Hoy 21. 2012;26(45):26–42.

15. Ramírez-Navas JS. Propiedades funcionales de los quesos. Tecnol Láctea Latinoam. 2010;64(1):40–7.

16. Beresford TP, Fitzsimons NA, Brennan NL, Cogan TM. Recent advances in cheese microbiology. Int Dairy J. 2001;11(4–7):259–74.

17. Fox PF, McSweeney PLH, Cogan TM, Guinee TP. Cheese: Chemistry, Physics and Microbiology: Major Cheese Groups [Internet]. Elsevier Science; 2004. Available

52

from: https://books.google.com.co/books?id=7juYW_Rz9y4C 18. Paul L.H. McSweeney MJS. Biochemical pathways for the production of flavour

compounds in cheeses during ripening: A review. Lait. 2000;80(3):293–324. 19. Lara-Villoslada F, Olivares M, Xaus J. Chapter 4 - Safety of Probiotic Bacteria. In:

Preedy RRWR, editor. Bioactive Foods in Promoting Health [Internet]. Boston: Academic Press; 2010. p. 47–58. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780123749383000049

20. Papagianni M, Leroy F, De Vuyst L, Monnet C, Bogovic Matijasic B, Lara-Villoslada F, et al. Lactic acid bacteria as functional starter cultures for the food fermentation industry. Preedy RRWR, editor. Trends Food Sci Technol. Boston: Academic Press; 2004;15(2):67–78.

21. Mei J, Guo Q, Wu Y, Li Y. Microbial diversity of a camembert-type cheese using freeze-dried Tibetan kefir coculture as starter culture by culture-dependent and culture-independent methods. Al-Ahmad A, editor. PLoS One [Internet]. San Francisco, USA: Public Library of Science; 2014 Oct 31;9(10):e111648. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4216126/

22. Aponte M, Fusco V, Andolfi R, Coppola S. Lactic acid bacteria occurring during manufacture and ripening of Provolone del Monaco cheese: Detection by different analytical approaches. Int Dairy J. 2008;18(4):403–13.

23. Botina SG, Tsygankov YD, Sukhodolets V V. Identification of industrial strains of lactic acid bacteria by methods of molecular genetic typing. Russ J Genet [Internet]. 2006;42(12):1367–79. Available from: http://dx.doi.org/10.1134/S1022795406120039

24. Bonomo MG, Ricciardi A, Zotta T, Parente E, Salzano G. Molecular and technological characterization of lactic acid bacteria from traditional fermented sausages of Basilicata region (Southern Italy). Meat Sci. 2008;80(4):1238–48.

25. Flórez AB, Hernández-Barranco AM, Marcos I, Mayo B. Biochemical and microbiological characterization of artisan kid rennet extracts used for Cabrales cheese manufacture. LWT - Food Sci Technol [Internet]. 2006 Aug [cited 2016 Mar 23];39(6):605–12. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0023643805000873

26. Wessels S, Axelsson L, Bech Hansen E, De Vuyst L, Laulund S, Lähteenmäki L, et al. The lactic acid bacteria, the food chain, and their regulation. Trends Food Sci Technol [Internet]. 2004 Oct [cited 2016 Mar 23];15(10):498–505. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0924224404000950

27. Quigley L, O’Sullivan O, Beresford TP, Ross RP, Fitzgerald GF, Cotter PD. Molecular approaches to analysing the microbial composition of raw milk and raw milk cheese. Int J Food Microbiol [Internet]. Elsevier B.V.; 2011;150(2–3):81–94. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2011.08.001

28. Fuka MM, Wallisch S, Engel M, Welzl G, Havranek J, Schloter M. Dynamics of Bacterial Communities during the Ripening Process of Different Croatian Cheese Types Derived from Raw Ewe’s Milk Cheeses. PLoS One [Internet]. Public Library of Science; 2013;8(11):e80734. Available from: http://dx.doi.org/10.1371%2Fjournal.pone.0080734

29. Cocolin L, Alessandria V, Dolci P, Gorra R, Rantsiou K. Culture independent methods to assess the diversity and dynamics of microbiota during food fermentation. Int J Food Microbiol [Internet]. Elsevier B.V.; 2013;167(1):29–43. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2013.05.008

30. Dolci P, Alessandria V, Rantsiou K, Cocolin L. Advanced methods for the

53

identification, enumeration, and characterization of microorganisms in fermented foods [Internet]. Advances in Fermented Foods and Beverages: Improving Quality, Technologies and Health Benefits. Elsevier Ltd; 2014. 157-176 p. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/B978-1-78242-015-6.00007-4

31. Pogačić T, Mancini A, Santarelli M, Bottari B, Lazzi C, Neviani E, et al. Diversity and dynamic of lactic acid bacteria strains during aging of along ripened hard cheese produced from raw milk and undefined natural starter. Food Microbiol. 2013;36(2):207–15.

32. Ercolini D, Hill PJ, Dodd CER. Bacterial community structure and location in Stilton cheese. Appl Environ Microbiol. 2003;69(6):3540–8.

33. Bottari B, Santarelli M, Neviani E, Gatti M. Natural whey starter for Parmigiano Reggiano: Culture-independent approach. J Appl Microbiol. 2010;108(5):1676–84.

34. Fernández R, Le S. DGGE : electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante. 2009;149–74. Available from: www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/710/dgge.pdf

35. Bonetta SS, Bonetta SS, Carraro E, Rantsiou K, Cocolin L. Microbiological characterisation of Robiola di Roccaverano cheese using PCR-DGGE. Food Microbiol [Internet]. 2008 Sep [cited 2016 Mar 22];25(6):786–92. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0740002008000828

36. Gala E, Landi S, Solieri L, Nocetti M, Pulvirenti A, Giudici P. Diversity of lactic acid bacteria population in ripened Parmigiano Reggiano cheese. Int J Food Microbiol. Netherlands; 2008 Jul;125(3):347–51.

37. Neviani E, Bottari B, Lazzi C, Gatti M. New developments in the study of the microbiota of raw-milk, long-ripened cheeses by molecular methods: the case of Grana Padano and Parmigiano Reggiano. Front Microbiol [Internet]. Frontiers Media S.A.; 2013 Feb 28;4:36. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3584316/

38. Guidone A, Ricciardi A, Romaniello A, Bonomo MG, Morone G, Zotta T, et al. Microbial changes of natural milk cultures for mozzarella cheese during repeated propagation cycles. LWT - Food Sci Technol [Internet]. Elsevier Ltd; 2016;65:572–9. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.lwt.2015.08.031

39. Guidone A, Zotta T, Matera A, Ricciardi A, De Filippis F, Ercolini D, et al. The microbiota of high-moisture mozzarella cheese produced with different acidification methods. Int J Food Microbiol [Internet]. Elsevier B.V.; 2016;216:9–17. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2015.09.002

40. Herreros MA, Fresno JM, González Prieto MJ, Tornadijo ME. Technological characterization of lactic acid bacteria isolated from Armada cheese (a Spanish goats’ milk cheese). Int Dairy J [Internet]. 2003;13(6):469–79. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958694603000542

41. Scatassa ML, Gaglio R, Macaluso G, Francesca N, Randazzo W, Cardamone C, et al. Transfer, composition and technological characterization of the lactic acid bacterial populations of the wooden vats used to produce traditional stretched cheeses. Food Microbiol [Internet]. Elsevier Ltd; 2015;52(2074):31–41. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0740002015001197

42. Gobbetti M, De Angelis M, Di Cagno R, Mancini L, Fox PF. Pros and cons for using non-starter lactic acid bacteria (NSLAB) as secondary/adjunct starters for cheese ripening. Trends Food Sci Technol [Internet]. Elsevier Ltd; 2015;45(2):167–78. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.tifs.2015.07.016

43. Quigley L, O’Sullivan O, Stanton C, Beresford TP, Ross RP, Fitzgerald GF, et al.

54

The complex microbiota of raw milk. FEMS Microbiol Rev. 2013;37(5):664–98. 44. Peláez C, Requena T. Exploiting the potential of bacteria in the cheese ecosystem.

Int Dairy J [Internet]. 2005;15(6–9):831–44. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958694604003206

45. Instituto de Ciencia y Tecnología de alimentos. Guía para producción de quesos Colombianos, Inventario y desarrollo de la Tecnología de Productos lácteos Campesinos Colombia. 1986.

46. Bottari B, Santarelli M, Neviani E, Gatti M. Natural whey starter for Parmigiano Reggiano: Culture-independent approach. J Appl Microbiol. 2010;108(5):1676–84.

47. Moreno C, Romero J, Espejo RT. Polymorphism in repeated 16S PRNA genes is a common property of type strains and environmental isolates of the genus Vibrio. Microbiology. 2002;148(4):1233–9.

48. Sanguinetti CJ, Dias Neto E, Simpson AJ. Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels. Vol. 17, BioTechniques. UNITED STATES; 1994 Nov.

49. Nei M, Li WH. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases. Proc Natl Acad Sci U S A. UNITED STATES; 1979 Oct;76(10):5269–73.

50. Mohammadi SA, Prasanna BM. Analysis of Genetic Diversity in Crop Plants—Salient Statistical Tools and Considerations. Crop Sci [Internet]. Madison, WI: Crop Science Society of America; 2003;43. Available from: http://dx.doi.org/10.2135/cropsci2003.1235

51. Piraino P, Zotta T, Ricciardi A, McSweeney PLH, Parente E. Acid production, proteolysis, autolytic and inhibitory properties of lactic acid bacteria isolated from pasta filata cheeses: A multivariate screening study. Int Dairy J [Internet]. 2008;18(1):81–92. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958694607001203

52. Franciosi E, Settanni L, Cavazza A, Poznanski E. Biodiversity and technological potential of wild lactic acid bacteria from raw cows’ milk. Int Dairy J [Internet]. 2009;19(1):3–11. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958694608001428

53. Nieto-Arribas P, Sesena S, Poveda JM, Palop L, Cabezas L. Genotypic and technological characterization of Leuconostoc isolates to be used as adjunct starters in Manchego cheese manufacture. Food Microbiol. 2009/11/17. 2010;27(1):85–93.

54. Latorre I, Navarro CER. Caracterización bioquímica y tecnológica de cepas ácido lácticas aisladas de leche cruda de oveja en el proceso de elaboración de queso artesano de Teruel [Thesis]. Vol. Especializ, Departamento de Química Analítica, Área de Química Analítica . [España.]: Universidad de Zaragoza; 2011.

55. Kostinek M, Specht I, Edward VA, Schillinger U, Hertel C, Holzapfel WH, et al. Diversity and technological properties of predominant lactic acid bacteria from fermented cassava used for the preparation of Gari, a traditional African food. Syst Appl Microbiol. 2005;28(6):527–40.

56. Wilson GS, Raftos DA, Corrigan SL, Nair S V. Diversity and antimicrobial activities of surface-attached marine bacteria from Sydney Harbour, Australia. Microbiol Res [Internet]. Elsevier; 2010;165(4):300–11. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.micres.2009.05.007

57. Gomez AM, Yannarell AC, Sims GK, Cadavid-Restrepo G, Moreno Herrera CX. Characterization of bacterial diversity at different depths in the Moravia Hill landfill site at Medellín, Colombia. Soil Biol Biochem [Internet]. 2011 Jun [cited 2016 Mar

55

24];43(6):1275–84. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S003807171100109X

58. Wright ES, Yilmaz LS, Noguera DR. DECIPHER, a Search-Based Approach to Chimera Identification for 16S rRNA Sequences. Appl Environ Microbiol [Internet]. 2012 Feb 1;78(3):717–25. Available from: http://aem.asm.org/content/78/3/717.abstract

59. Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. ENGLAND; 1997 Sep;25(17):3389–402.

60. Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. ENGLAND; 1994 Nov;22(22):4673–80.

61. Saitou N, Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol Biol Evol. UNITED STATES; 1987 Jul;4(4):406–25.

62. Cock LS, Hernández LJ V, Gaona RC. Cinética de fermentación y acción antimicrobiana de Weissella confusa contra Staphylococcus aureus y Streptococcus agalactiae. Rev Fac Ing. 2010;1(55):55–65.

63. Duval P, Chatelard-Chauvin C, Gayard C, Rifa E, Bouchard P, Hulin S, et al. Microbial dynamics in industrial Blue veined cheeses in different packaging. Int Dairy J [Internet]. 2016 Feb [cited 2016 Feb 15];56:198–207. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958694616300073

64. Georgescu M, Dobrea M, Georgescu D. Microbial Population Dynamics in Presence of Lactococcal Bacteriophage During Ripening of Traditional Raw Milk Romanian Cheese. Agric Agric Sci Procedia [Internet]. 2015 [cited 2016 Mar 25];6:324–31. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2210784315002193

65. Ryssel M, Johansen P, Al-Soud WA, Sørensen S, Arneborg N, Jespersen L. Microbial diversity and dynamics throughout manufacturing and ripening of surface ripened semi-hard Danish Danbo cheeses investigated by culture-independent techniques. Int J Food Microbiol [Internet]. 2015 Dec 23 [cited 2016 Mar 19];215:124–30. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168160515301252

66. Pangallo D, Saková N, Koreňová J, Puškárová A, Kraková L, Valík L, et al. Microbial diversity and dynamics during the production of May bryndza cheese. Int J Food Microbiol [Internet]. 2014 Jan 17 [cited 2016 Mar 25];170:38–43. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S016816051300487X

67. Aldrete-Tapia A, Escobar-Ramirez MC, Tamplin ML, Hernandez-Iturriaga M. High-throughput sequencing of microbial communities in Poro cheese, an artisanal Mexican cheese. Food Microbiol. 2014;44:136–41.

68. Kafili T, Razavi SH, Djomeh ZE, Naghavi MR, ??lvarez-Mart??n P, Mayo B. Microbial characterization of Iranian traditional Lighvan cheese over manufacturing and ripening via culturing and PCR-DGGE analysis: Identification and typing of dominant lactobacilli. Eur Food Res Technol. 2009;229(1):83–92.

69. Golic N, Cadez N, Terzic-Vidojevic A, Suranska H, Beganovic J, Lozo J, et al. Evaluation of lactic acid bacteria and yeast diversity in traditional white pickled and fresh soft cheeses from the mountain regions of Serbia and lowland regions of Croatia. Int J Food Microbiol. 2013/08/27. 2013;166(2):294–300.

70. De Dea Lindner J, Bernini V, De Lorentiis A, Pecorari A, Neviani E, Gatti M.

56

Parmigiano Reggiano cheese: evolution of cultivable and total lactic microflora and peptidase activities during manufacture and ripening. Dairy Sci Technol. 2008;88:511–23.

71. Gatti M, Bernini V, Lazzi C, Neviani E. Fluorescence microscopy for studying the viability of micro-organisms in natural whey starters. Lett Appl Microbiol. 2006;42(4):338–43.

72. Picon A, Garde S, Ávila M, Nuñez M. Microbiota dynamics and lactic acid bacteria biodiversity in raw goat milk cheeses. Int Dairy J. 2015;

73. Garabal JI, Rodríguez-Alonso P, Centeno JA. Characterization of lactic acid bacteria isolated from raw cows’ milk cheeses currently produced in Galicia (NW Spain). LWT - Food Sci Technol [Internet]. 2008;41(8):1452–8. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0023643807003052

74. Carraro L, Maifreni M, Bartolomeoli I, Martino ME, Novelli E, Frigo F, et al. Comparison of culture-dependent and -independent methods for bacterial community monitoring during Montasio cheese manufacturing. Res Microbiol [Internet]. Elsevier Masson SAS; 2011;162(3):231–9. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.resmic.2011.01.002

75. Patel A, Falck P, Shah N, Immerzeel P, Adlercreutz P, Stålbrand H, et al. Evidence for xylooligosaccharide utilization in Weissella strains isolated from Indian fermented foods and vegetables. FEMS Microbiol Lett. 2013;346(1):20–8.

76. Di Cagno R, Buchin S, de Candia S, De Angelis M, Fox PF, Gobbetti M. Characterization of Italian Cheeses Ripened Under Nonconventional Conditions. J Dairy Sci [Internet]. Elsevier; 2007;90(6):2689–704. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022030207700796

77. Chombo-Morales P, Kirchmayr M, Gschaedler A, Lugo-Cervantes E, Villanueva-Rodríguez S. Effects of controlling ripening conditions on the dynamics of the native microbial population of Mexican artisanal Cotija cheese assessed by PCR-DGGE. LWT - Food Sci Technol [Internet]. Elsevier Ltd; 2016;65:1153–61. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.lwt.2015.09.044

78. Terzic-Vidojevic A, Mihajlovic S, Uzelac G, Veljovic K, Tolinacki M, Nikolic M, et al. Characterization of lactic acid bacteria isolated from artisanal Travnik young cheeses, sweet creams and sweet kajmaks over four seasons. Food Microbiol. 2014/01/07. 2014;39:27–38.

79. Nikolic M, Terzic-Vidojevic A, Jovcic B, Begovic J, Golic N, Topisirovic L. Characterization of lactic acid bacteria isolated from Bukuljac, a homemade goat’s milk cheese. Int J Food Microbiol [Internet]. 2008;122(1–2):162–70. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168160507006654

80. Badis A, Guetarni D, Moussa Boudjema B, Henni DE, Kihal M. Identification and technological properties of lactic acid bacteria isolated from raw goat milk of four Algerian races. Food Microbiol [Internet]. 2004;21(5):579–88. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0740002003001199

81. Pogačić T, Chuat V, Madec MN, Samaržija D, Lortal S, Valence F. Phenotypic traits of genetically closely related Leuconostoc spp. Int Dairy J. 2014;39(1):96–101.

82. Cheong EYL, Sandhu A, Jayabalan J, Kieu Le TT, Nhiep NT, My Ho HT, et al. Isolation of lactic acid bacteria with antifungal activity against the common cheese spoilage mould Penicillium commune and their potential as biopreservatives in cheese. Food Control [Internet]. Elsevier Ltd; 2014;46:91–7. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.foodcont.2014.05.011

83. Montoya D, Boylston TD, Mendonca A. Preliminary screening of Bifidobacteria spp.

57

and Pediococcus acidilactici in a Swiss cheese curd slurry model system: Impact on microbial viability and flavor characteristics. Int Dairy J [Internet]. Elsevier Ltd; 2009;19(10):605–11. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.idairyj.2009.04.005

84. Dolci P, Alessandria V, Zeppa G, Rantsiou K, Cocolin L. Microbiological characterization of artisanal Raschera PDO cheese: analysis of its indigenous lactic acid bacteria. Food Microbiol. 2008/01/22. 2008;25(2):392–9.

85. Nieto-Arribas P, Seseña S, Poveda JM, Palop L, Cabezas L. Genotypic and technological characterization of Leuconostoc isolates to be used as adjunct starters in Manchego cheese manufacture. Food Microbiol. 2010;27(1):85–93.

86. Asteri IA, Robertson N, Kagkli DM, Andrewes P, Nychas G, Coolbear T, et al. Technological and flavour potential of cultures isolated from traditional Greek cheeses - A pool of novel species and starters. Int Dairy J [Internet]. Elsevier Ltd; 2009;19(10):595–604. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.idairyj.2009.04.006

87. Callon C, Retureau E, Didienne R, Montel MC. Microbial biodiversity in cheese consortia and comparative Listeria growth on surfaces of uncooked pressed cheeses. Int J Food Microbiol [Internet]. Elsevier B.V.; 2014;174:98–109. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2014.01.003

88. Bozoudi D, Kotzamanidis C, Hatzikamari M, Tzanetakis N, Menexes G, Litopoulou-Tzanetaki E. A comparison for acid production, proteolysis, autolysis and inhibitory properties of lactic acid bacteria from fresh and mature Feta PDO Greek cheese, made at three different mountainous areas. Int J Food Microbiol [Internet]. 2015;200:87–96. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168160515000781

89. Di Cagno R, Quinto M, Corsetti A, Minervini F, Gobbetti M. Assessing the proteolytic and lipolytic activities of single strains of mesophilic lactobacilli as adjunct cultures using a Caciotta cheese model system. Int Dairy J [Internet]. 2006;16(2):119–30. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S095869460500035X

90. Delgado FJ, González-Crespo J, Cava R, Ramírez R. Changes in microbiology, proteolysis, texture and sensory characteristics of raw goat milk cheeses treated by high-pressure at different stages of maturation. LWT - Food Sci Technol [Internet]. Elsevier Ltd; 2012;48(2):268–75. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.lwt.2012.03.025

91. Cretenet M, Laroute V, Ulve V, Jeanson S, Nouaille S, Even S, et al. Dynamic analysis of the Lactococcus lactis transcriptome in cheeses made from milk concentrated by ultrafiltration reveals multiple strategies of adaptation to stresses. Appl Environ Microbiol. United States; 2011 Jan;77(1):247–57.

92. Montel MC, Buchin S, Mallet A, Delbes-Paus C, Vuitton DA, Desmasures N, et al. Traditional cheeses: Rich and diverse microbiota with associated benefits. Int J Food Microbiol [Internet]. Elsevier B.V.; 2014;177:136–54. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2014.02.019

93. Aljewicz M, Cichosz G, Nalepa B, Bielecka M. The effect of milk fat substitution with palm fat on lactic acid bacteria counts in cheese-like products. LWT - Food Sci Technol [Internet]. 2016;66:348–54. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0023643815302607

94. Fox PF, Cogan TM. Factors that Affect the Quality of Cheese BT - Starter cultures: General aspects. Start Cult Gen Asp [Internet]. 2004;Volume 1:583–608. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1874558X04800848\n(null)

95. Singh S, Goswami P, Singh R, Heller KJ. Application of molecular identification tools

58

for Lactobacillus, with a focus on discrimination between closely related species: A review. LWT - Food Sci Technol [Internet]. Elsevier Ltd; 2009;42(2):448–57. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.lwt.2008.05.019

96. Arcuri EF, El Sheikha AF, Rychlik T, Piro-Métayer I, Montet D. Determination of cheese origin by using 16S rDNA fingerprinting of bacteria communities by PCR-DGGE: Preliminary application to traditional Minas cheese. Food Control [Internet]. Elsevier Ltd; 2013;30(1):1–6. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.foodcont.2012.07.007

97. Alessandria V, Dolci P, Rantsiou K, Pattono D, Dalmasso A, Civera T, et al. Microbiota of the Planalto de Bolona: An artisanal cheese produced in uncommon environmental conditions in the Cape Verde Islands. World J Microbiol Biotechnol. 2010;26(12):2211–21.

98. Tormo H, Ali Haimoud Lekhal D, Roques C. Phenotypic and genotypic characterization of lactic acid bacteria isolated from raw goat milk and effect of farming practices on the dominant species of lactic acid bacteria. Int J Food Microbiol. 2015/06/18. 2015;210:9–15.

99. Tormo H, Ali Haimoud Lekhal D, Roques C. Phenotypic and genotypic characterization of lactic acid bacteria isolated from raw goat milk and effect of farming practices on the dominant species of lactic acid bacteria. Int J Food Microbiol [Internet]. 2015/06/18. Elsevier B.V.; 2015;210:9–15. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168160515000720

100. Perin LM, Dal Bello B, Belviso S, Zeppa G, de Carvalho AF, Cocolin L, et al. Microbiota of Minas cheese as influenced by the nisin producer Lactococcus lactis subsp. lactis GLc05. Int J Food Microbiol [Internet]. Elsevier B.V.; 2015;214:159–67. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2015.08.006

101. Vannini L, Patrignani F, Iucci L, Ndagijimana M, Vallicelli M, Lanciotti R, et al. Effect of a pre-treatment of milk with high pressure homogenization on yield as well as on microbiological, lipolytic and proteolytic patterns of “Pecorino” cheese. Int J Food Microbiol [Internet]. 2008;128(2):329–35. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168160508004959

102. Lortal S, Di Blasi A, Madec MN, Pediliggieri C, Tuminello L, Tanguy G, et al. Tina wooden vat biofilm: A safe and highly efficient lactic acid bacteria delivering system in PDO Ragusano cheese making. Int J Food Microbiol [Internet]. Elsevier B.V.; 2009;132(1):1–8. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2009.02.026

103. Randazzo CL, Vaughan EE, Caggia C. Artisanal and experimental Pecorino Siciliano cheese: Microbial dynamics during manufacture assessed by culturing and PCR-DGGE analyses. Int J Food Microbiol. 2006;109(1–2):1–8.

104. Morales-Celaya MF, Lobato-Calleros C, Alvarez-Ramirez J, Vernon-Carter EJ. Effect of milk pasteurization and acidification method on the chemical composition and microstructure of a Mexican pasta filata cheese. LWT - Food Sci Technol [Internet]. Elsevier Ltd; 2012;45(2):132–41. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.lwt.2011.08.015

105. Wolf IV, Perotti MC, Bernal SM, Zalazar CA. Study of the chemical composition, proteolysis, lipolysis and volatile compounds profile of commercial Reggianito Argentino cheese: Characterization of Reggianito Argentino cheese. Food Res Int [Internet]. 2010 May [cited 2016 Mar 27];43(4):1204–11. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0963996910000785

106. Candioti MC, Hynes E, Quiberoni A, Palma SB, Sabbag N, Zalazar CA. Reggianito Argentino cheese: influence of Lactobacillus helveticus strains isolated from natural

59

whey cultures on cheese making and ripening processes. Int Dairy J [Internet]. 2002 Jan [cited 2016 Mar 27];12(11):923–31. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958694602001152

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