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5/16/2018 EcMichaelis - slidepdf.com

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2070305DEDUCCIÓN DE LA ECUACIÓN DE MICHAELIS-MENTEN

CURVA CINÉTICA DE MICHAELIS-MENTENPARA UNA REACCIÓN ENZIMÁTICA

Al aumentar la consentración del substrato seobserva un aumento en la velocidad de lareacción,pero en forma de una isoterma que tienetres segmentos uno de primer orden seguido por otro de segundo y el final de orden cero.

MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MENTEN

Se debe haber hecho ya la deducción de la KM, con todos los supuestos cinéticos queinvolucra, de tal manera que debe tenerse ya:

POSTULADOS DE LA TEORÍA DE MICHELIS-MENTEN

1. La enzima debe unirse al substrato para llevar a cabo la reacción

2. Se forma un complejo enzima-substrato

3. La velocidad de formación del producto depende de la cantidad de complejoenzima-substrato

Según el tercer postulado, la concentración del complejo enzima-substrato ( [ES] ) determinala velocidad total de la reacción al medirla por la aparición del producto, de tal manera que esnecesario enfatizar que la concentración del complejo depende del balance de su velocidadde formación con la de su descomposición. A saber:

[ ]1vEScomplejodelformacióndevelocidad

dt

ESd=

[ ]32 vvEScomplejodelcióndescomposidevelocidad

dt

ESd+

V2

E + S ES E + Pv

1 v3

V

[S]

1 2 0



para continuar, se hace necesario hacer algunas definiciones:

[S] = concentración del substrato (muy superior a la de la enzima)[E] = concentración total de enzima[ES] = concentración del complejo enzima-substato

[E – ES] = concentración de enzima libre en cualquier momento

Por otro lado, de acuerdo con la ley de acción de las masas pueden escribirse las siguietnesrelaciones:

[ ] [ ] [ ] [ ]ESvESvSESEv 321 ∞

las que, para transformarse en ecuaciones, requieren de una constante de proporcionalidad

[ ] [ ] [ ] [ ]ESkvESkvSESEkv 332211 =

esta constante se conoce como constante de velocidad de reacción y esta relacionada con la

afinidad, lo que la convierte en específica para cada mezcla reaccionante, además, dependesolamente de la temperatura.En el equilibrio de la reacción, las velocidades de formación y descomposición del complejoenzima-substrato deben ser iguales:

[ ] [ ]

dt

ESd

dt

ESd− por lo que deberá cumplirse v1 = v2 + v3 así, se

tendrá k1[E-ES][S] = k2[ES] + k3[ES]

factorizando k1[E-ES][S] = (k2 + k3)[ES]

y al reacomodar [ ] [ ]

[ ] 1

32

k

kk

ES

SESE +=

−

con lo cual queda definida la constante de Mchaelis-Menten:[ ] [ ]

[ ]ES

SESEKM

−=

De conformidad con los postulados de lateoría, es fácil entender que se llegará auna concentración de substrato con la quese obtiene el máximo de velocidad (VMAX);en ese momento, el total de las moléculasde enzima permanecen todo el tiempounidas al substrato y se dice que la enzimase ha saturado.

Así, es lógico pensar que a la mitad de lavelocidad máxima, sólo el 50 % de lasmoléculas de enzima se encuentran unidasal substrato y el otro 50% están libres, con

VMAX

½ VMAX

KM

V

[S]



lo que la expresión anterior se transforma en[ ]

[ ]S%50

S%50KM = , y como puede verse en la

gráfica, es posible definir prácticamente la KM como la concentración molar del substrato a lamitad de la velocidad máxima. Es claro que mientras mayor sea la KM la enzima necesitarámáyor concentración de substrato para trabajar adecuadamente, es decir la afinidad entre

enzima y substrato es menor. Véase por ejemplo el caso de la hexocinasa que fosforilamonosacáridos, en igualdad de concentración del azúcar, por cada 100 moléculas deglucosa fosforiladas, sufren la reacción 110 de galactosa y 70 de fructosa.

En la figura se ilustra este fenómeno, la KM1 corresponde a la glucosa, a la galactosa la KM2 yla KM3 a la fructosa. Es evidente que entre la constante de Michaelis y la afinidad entreenzima y substrato existe una relación inversa.

Tomando en cuenta que la velocidad de la reacción enzimática es entendida como la

velocidad de aparición del producto, es natural que a partir de v3 pueda escribirse

V = k[ES]

por lo que resulta indispensable poner [ES] en función de parámetros de más fácil medida.Para ello, considérese la definición de la KM

[ ] [ ]

[ ]ES

SESEKM

−=

al pasar [ES] al primer miembro y desarrollar el producto del numerador se obtieneKM[ES] = [E][S] – [ES][S]

si se pasa al primer miembro el término con [ES] y se factoriza se ve

[ES](KM + [S]) = [E][S]

VMAX

½ VMAX

KM2

V

[S]K

M1K

M3



que despejando [ES] queda [ ][ ] [ ]

[ ]SK

SEES

M +

=

y al substituir este valor en la ecuación de la velocidad se ve como

[ ] [ ][ ]SK

SEkV

M +

=

pero como [E] es la cantidad total de la enzima , se tiene que k[E] = VMAX

y al substituir este valor nos queda la conocida ecuación de Michaelis-Menten:

[ ]

[ ]SK

SVV

M

MAX

+

=

En esta expresión, si 2

V

VMAX

= , se tiene[ ]

[ ]SK

SV

2

V

M

MAXMAX

+

=

que al reagrupar para tener la VMAX en el mismo miembro queda

[ ] [ ]

MAX

MAXM

V

SV

2

SK=

+

y al simplificar y reacomodar [ ] [ ]S2SKM =

que despejando KM nos da [ ] [ ] [ ]SSS2KM =

resultado que coincide con la deducción intuitiva presentada arriba.

En la práctica, dados los números de recambio que tienen habitualmente las enzimas y laspequeñísimas cantidades de ellas que es posible aislar, es poco práctico intentar obtener suficientes datos para dibujar con cierta precisión una curva de actividad enzimática. Por elloLinewaver y Burk, al ver que la curva cinética de Michaelis-Menten es de tipo hiperbólico,sugirieron la transformación que lleva su nombre, que consiste en obtener la inversa de laecuación completa que queda



[ ]

[ ]

[ ]

[ ]SV

SK

V

1

SK

SVV

MAX

M

M

MAX +=

+

=

y al simplificar se obtiene

[ ] MAXMAX

M

V

1

S

1

V

K

V

1+

que es una recta, por cual bastan unos cuantos puntos experimentales para construir, por

regresión lineal, una gráfica como la que aparece a la derecha, en la que la intersección conel eje de las ordenadas es la inversa de la velocidad máxima, y la intersección con el eje delas abscisas es la inversa negativa de la KM. Así, por ejemplo, si en un experimento seobtiene una gráfica como la que aparece a la izquierda,

MAXV

1

MK

1−

V

1



2.0V

1

MAX

= y 5.2K

1

M

−

entonces

5

2.0

1VMAX = y 4.0

5.2

1KM =

−

−=

EJEMPLO.La isocitrato liasa de Escherichia coli , cataliza la reacción:

Ls-ISOCITRATO →GLIOXILATO + SUCCINATO

en un experimento típico, se midió la actividad de la enzima en un cultivo de la bacteria quetenía ácido acético como única fuente de carbono, a pH 6.8 y 30°C. La concentración delsustrato se dio en µmol dm-3 y la actividad como velocidad inicial en nmol min-1; los siguientesson datos de un experimento típico:

V

1

[ ]S

1

0.2

- 2.5



Es evidente que se trata de unahipérbola del tipo Michaelis-Menten

[ ]

[ ]SK

SVV

M

MAX

+

=

que al hacer la transformaciónde Lineweaver-Burk senormaliza

[LS-Isocitrato](µmol dm-3)

Velocidad inicial(nmol min-1)

6 1.9618 4.08

24 4.6430 5.1040 5.62

100 6.90

1/[S] 1/V0.1667 0.49260.0556 0.24510.0417 0.21550.0333 0.1961

0.0250 0.17790.0100 0.1437

Cinética de Isocitrato liasa

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 50 100 150

[LS-Isocitrato] (µmol dm-3

]

V e l o c i d a d i n i c i a l ( n m o l m i n

- 1 )

0.0000

0.1000

0.2000

0.3000

0.4000

0.5000

0.6000

0.0000 0.0500 0.1000 0.1500 0.2000

1/[S]

1 / V



Esta es una recta para regresión lineal, por lo que se elabora la tabla de regresión comoaparece a continuación:

X Y X2 XY Y2

0.1667 0.4926 0.0278 0.0821 0.24270.0556 0.2451 0.0031 0.0136 0.0601

0.0417 0.2155 0.0017 0.0090 0.0464

0.0333 0.1961 0.0011 0.0065 0.03840.0250 0.1779 0.0006 0.0044 0.03170.0100 0.1437 0.0001 0.0014 0.02060.3322 1.4709 0.0344 0.1171 0.4399

Las ecuaciones normales quedan como:

1.1709 = a0(6) + a1(0.3322)

0.1171 = a0(0.3322) + a1(0.0344)y se resuelven por determinantes:

6 0.3322 A = det A = 6(0.0344) – (0.3322)(0.3322) = 0.0962

0.3322 0.0344

1.1709 0.3322 A0 = det A0 = (1.1709)(0.0344) – (0.1171)(0.3322) = 0.0117

0.1171 0.0344

6 1.1709 A1 = det A1 = 6(0.1171) – (0.3322)(1.1709) = 0.2140

0.3322 0.1171

utilizando estos determinantes es posible usar la regla de Cramer para calcular los valores delos coeficientes de regresión:

a0 = 0.0117/0.0962 = 0.122 y a1 = 0.2140/0.0962 = 2.2239

con estos, se plantea la ecuación de la recta tipo[ ] MAXMAX

M

V

1

S

1

V

K

V

1+= , quedando en la

forma 122.0T12266.18

V1 += , de tal suerte que para obtener los valores de K M y VMAX basta

con hacer las igualaciones siguientes y despejar:

122.0

1Vtotanpor 122.0

V

1MAX

MAX

== = 8.1958 , y



2239.21958.8

KM

= por tanto KM = 2.2239 x 8.1958 = 18.2266

con lo que la ecuación de Michaelis-Menten quedaría[ ]

[ ]S2266.18

S1958.8V

+=

con la puede hacese la tabla siguiente

[LS-Isocitrato](µmol dm-3)

Velocidad inicial (nmol min-1)experimental calculada

0 0.00002 0.81044 1.47496 2.03 2.02988 2.500010 2.903612 3.253714 3.5604

16 3.831318 4.08 4.072220 4.288022 4.482324 4.64 4.658230 5.10 5.098340 5.62 5.630250 6.006360 6.286270 6.502680 6.675090 6.8155100 6.96 6.9322

que sirve para desarrollar la gráfica de presentación que aparece a continuación



Cinética de la Isocitrato liasa

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 20 40 60 80 100 120

[LS-isocitrato] (µmol dm-3)

V e l o c i d a d i n i c i a l ( n m o l m i n -

1 )

Para validar el trabajo se hace análisis de varianza de la manera siguiente:

X Yi Yc (Yi-Ym)2 (Ym-Yc)2 (Yi-Yc)2

6 2.03 2.0298 7.33506944 7.336299949 5.16019E-0818 4.08 4.0722 0.43340278 0.443677005 6.01789E-0524 4.64 4.6582 0.00966944 0.006428724 0.000329568

30 5.10 5.0983 0.13080278 0.129558663 2.97246E-0640 5.62 5.6302 0.77733611 0.795506527 0.000104961100 6.96 6.9322 4.93580278 4.813224917 0.000770637

Ym = 4.7383 13.6220833 13.52469578 0.001268369

r 2 = 0.9929 r = 0.9964 F = 42652.2

Con lo cual puede verse lo bien que se pueden ajustar las ecuaciones empíricas de tipoMichaelis-Menten.

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