Embed Size (px)
Citation preview
ELECTROFUSION DE CÉLULAS DENDRÍTICAS ELECTROFUSION DE CÉLULAS DENDRÍTICAS SINGÉNICAS Y CÉLULAS TUMORALES PARA SINGÉNICAS Y CÉLULAS TUMORALES PARA LA GENERACIÓN DE UNA POTENTE VACUNA LA GENERACIÓN DE UNA POTENTE VACUNA TERAPEÚTICA FRENTE AL CANCERTERAPEÚTICA FRENTE AL CANCER
MARIA JOSÉ MARTÍNEZ ORTIZMARIA JOSÉ MARTÍNEZ ORTIZ
R1 ONCOLOGÍA MÉDICAR1 ONCOLOGÍA MÉDICA
HGU DE ELCHEHGU DE ELCHE
Jorgen Kjaergaard et al.Jorgen Kjaergaard et al.
Cellular Inmunology 225 (2003) 65-74Cellular Inmunology 225 (2003) 65-74
INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN Células dendríticas: las más potentes y eficaces células
presentadoras de Ag del organismo.
Interdigitadas: Distribuídas en la mayoría de los órganosMuy abundantes en zonas LT de GL y bazo.En epidermis, formas inmaduras: células de LangerhansMuy eficientes en la presentación de Ag proteicos al LT.
Foliculares: atrapan Ag unidos a Ac o a productos del complemento y los expresan en su superficie para que sean reconocidos por los LB.
INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN
Inmunidad frente a tumores CPA procesan y presentan los péptidos tumorales en su
superficie como péptidos unidos a receptores MHC tipo II Las células tumorales en sus receptores MHC tipo I
presentan Ag peptídicos específicos del tumor Inmunidad frente a tumores de 2 tipos: celular y
humoral. Humoral: CMCDA, CDC y opsonización
Celular: LT CD8 citolíticos, células NK y macrófagos.
CÉLULAS PRESENTADORAS DE Ag
INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN
INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN
Inmunidad frente a tumoresINMUNIDAD HUMORAL
INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN
Inmunidad frente a tumoresINMUNIDAD HUMORAL
INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN
Inmunidad frente a tumoresINMUNIDAD HUMORAL
INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN
Inmunidad frente a tumoresINMUNIDAD CELULAR
Inmunidad frente a tumoresINMUNIDAD CELULAR
INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN
INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN
Inmunoterapia tumoralControl del crecimiento tumoral mediante la activación del sistema inmune.
La activación de una respuesta antitumoral específica es consecuencia de la expresión por las células cancerosas de nuevos antígenos denominados tumor-específicos o tumor asociados.
Inmunoterapia activa: estimulación de los componentes del sistema inmunitario responsables de la respuesta antitumoral.
Vacunas antitumoralesInmunidad activa específica
INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN
Células singénicasDiferentes células de la misma especie y genéticamente idénticas.
Células alogénicasDiferentes células de la misma especie pero genéticamente no idénticas.
ElectrofusiónProcedimiento a mediante el cual se obtienen híbridos fusionando células dendríticas y tumorales tras ser estas previamente sometidas a procesos de purificación, suspensión en medio de cultivo, centrifugación, electroforesis e incubación.
INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN ELECTROFUSIÓN
A.CD: rojas; Céls. Melanoma: verdes; híbridos: amarillasB.Híbrido celular: CD+ cél. melanomaC.Microscopio: fluorescencia híbrido celular con doble núcleoD.Fagocitosis de céls. melanoma por CD
INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN
Obtención de células dendríticas
Mediante leucaféresis se seleccionan monocitos de sangre periférica que posteriormente se someten a un período de cultivo in vitro con citoquinas consiguiendose células dendríticas.
Se condiciona a estas con un estímulo de activación y maduración mediado por citokinas.
Se carga en las CD el antígeno. Son reinfundidas de forma I.V. o intradérmica al
receptor.
INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN
OBTENCIÓN DE CÉLULAS DENDRÍTICAS
INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN
La principal dificultad para el uso clínico de las CD radica en la obtención de cantidades suficientes de células, debido a que en la sangre representan sólo el 0,1% de los leucocitos y a que en el estadio inmaduro las células no poseen la capacidad de multiplicarse.
INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN
Los principales inconvenientes que presenta el control inmunológico del cáncer es:
La dificultad para aislar antígenos tumorales específicos
Escasa capacidad inmunógena de los tumores humanos.
INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN
Conjugación con adyuvantes
Entre las estrategias desarrolladas para potenciar y conseguir una respuesta inmune efectiva, se encuentra el proceso de conjugación del antígeno tumoral con adyuvantes ( adyuvante completo o incompleto de Freund, aluminio, liposomas,..) de alto poder inmunógeno. Los adyuvantes no necesariamente necesitan hallarse unidos físicamente al antígeno, es el caso del levamisol, el IFN-gamma, el sagramostin o la BCG.
INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN
INCONVENIENTES ESTUDIOS PREVIOS
El uso de células dendríticas como vehículo para la presentación de Ag tumorales débiles es teoricamente atractiva en el diseño de una vacuna terapeútica.
Estudios previos: trasfiriendo RNA y DNA derivado de tumores a las CD, estimulando las CD con células tumorales necróticas o apoptóticas, con células tumorales lisadas o con exosomas derivados de tumores.
INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN
INCONVENIENTES ESTUDIOS PREVIOS
Variaciones en el progenitor seleccionado para obtener CD, en los medios de cultivo utilizados y las diferencias significativas en estadio madurativo y funciones de las subpoblaciones celulares obtenidas, además de que los modelos tumorales presentan diversos grados de inmunogenicidad y de capacidad de crecimiento.
El método tradicional de fusión utilizando PEG( polietilenglicol) tiene eficacia variable, toxicidad y pobre reproductibilidad
OBJETIVOSOBJETIVOS
Determinar: Características de células híbridas CD-
tumor generadas por electrofusión. Requisitos para inmunoterapia efectiva
con híbridos células CD-tumorales. Uso de CD singénicas frente a alogénicas
para la electrofusión. Efectividad de inmunoterapia en tumores
establecidos en diferentes órganos.
MATERIALES Y MÉTODOSMATERIALES Y MÉTODOS
Ratones hembras B6 y Balb. Tumores. Fibrosarcomas MAC 205 y H12. H12
es un clon del MAC205 que presenta crecimiento estable. Las células cultivadas H12 son utilizadas para electrofusión y las MCA205 para establecer tumores
Electrofusión de células dendríticas y células tumorales H12. Las células dendríticas son generadas desde el bazo de Ratones B6 o Balb/c.Electrofusión de CD y tumorales poniendo células en una cámara de fusión y sometidas a dielectroforesis.
Análisis mediante citometría de flujo.Inmunofluorescencia directa
MATERIALES Y MÉTODOSMATERIALES Y MÉTODOS
Inmunoterapia activa.1. Se establecen tumores en ratones mediante inoculación de células
tumorales
2. Inmunoterapia:Inyección intraesplénica de células de fusión.En algunos casos inyección intranodal.
En otros inyección intraperitoneal + adyuvante:OX-40RmAb.En algunos casos aladyuvante fue 4-1BBmAb.
I.V. MTS pulmonares
Transcraneal Tumor intracraneal
S.C. Tumor piel
MATERIALES Y MÉTODOSMATERIALES Y MÉTODOS
3. Valoración de eficacia terapeútica:
Metástasis pulmonares: los ratones son sacrificados el día 18, se tiñen los pulmones y se hace recuento de número de nódulos
pulmonares.
Tumores subcutáneos: se mide el diámetro de los nódulos 2 veces por semana y se introducen los datose n una curva de crecimiento.
Tumores intracraneales: monitorización del tiempo de supervivencia
MATERIALES Y MÉTODOSMATERIALES Y MÉTODOS
Deplección de células T
Inyeción i.v. De líquido ascítico contiene ratIgG2b mAb, que es un Ac frente a Cd4 murino o CD8.
Análisis estadístico
RESULTADOSRESULTADOS
1. Características de células híbridas CD-tumor generadas por electrofusión.
CD generadas desde bazo de ratones mostraron fenotipo maduro característico con alta expresión de MHC-I y II, moléculas coestimuladoras CD80 y CD86 así como molécula de adhesión ICAM-I(CD54) en su superficie.
Células tumorales marcadas con CFSE y CD marcadas con PE-conjugado mAbs . Las células de fusión presentan doble positividad.
La electrofusión ha generado 40-60% de células híbridas
RESULTADOSRESULTADOS
2. Requisitos para inmunoterapia efectiva con híbridos células CD-tumorales.
1 inyección intraesplénica de células de fusión suficiente para reducir el número de nódulos metastásicos
La terapia eficaz requiere coadministración de adyuvantes: inyección de OX-40R o 4-1BB mAbs intraperitoneal
Electrofusión requiere mezcla de CD y tumorales sometidas a una incubación prolongada.
RESULTADOSRESULTADOS
Solo CD+tumor son capaces de inducir una respuesta terapeútica inmune.
La inyección intraesplénica de híbridos eran eficaces. Una terapia exitosa requiere de la inyección de vacuna dentro de órganos linfoides, bazo o GL.
La vía I.P. o s.c. era ineficaz. Analizar la vía i.v. para vacunación no fue factible ya que elevado tamaño de células fusión daba lugar a embolia pulmonar y muerte del receptor.
RESULTADOSRESULTADOS
3. Uso de CD singénicas frente a alogénicas para la electrofusión.
La actividad significativa antitumoral fue observada solo en
ratones tratados con CD singénicas.
La participación de CD4 y CD8 es necesaria para obtener una inmunoterapia eficaz con células de fusión.
RESULTADOSRESULTADOS
Los ratones quefueron depleccionados de células CD4 o CD8 con la admón. de CD4 o CD8 mAbs i.v. el día previo a la vacunación no presentaron efectos antitumorales tras la vacunaicón.
MHC-I y MHC-II en CD4 y CD8 son necesarios para que exista un efecto terapeútico de la inmunoterapia con células de fusión.
La deplección de células T se relaciona con ineficacia de la inmunoterapia..
RESULTADOSRESULTADOS
4. Efectividad de inmunoterapia en tumores establecidos en diferentes órganos.
Tumor en piel: se observó retraso del crecimientotumoral en 6 de 10 ratones tratados.
Tumor intracraneal: se observó una supervivencia prolongada en 3 de 6 ratones tratados.
3 ratones curados de tumor intracraneal son sometidos 60 días después a una nueva inoculación de tumor. No desarrollaron un nuevo tumor, mientras que el grupo control moría a los 20 días por tumor intracraneal. Se concluye que las células de fusión CD-tumor inducen memoria inmunológica a largo plazo.
La eficacia de la inmunoterapia requiere utilización de CD y adyuvante
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONESDISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
La fusión de membranas es un paso fundamental en multitud de procesos celulares tal como: exocitosis, endocitosis, fertilización, mitosis, miogénesis.
La fusión celular inducida por agentes químicos ha proprocionado un modelo útil para conocer el proceso de fusión celular. En este estudio se expone que la fusión celular tambien se puede llevar a cabo sometiendo a células a campos eléctricos.
La electrofusión no requiere sustancias fusógenas y el proceso es sincrónico e instantáneo.
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONESDISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
Si dos células están en contacto durante el proceso de depresión de membrana lamformación de poros microscópicos que se produce lleva a la formación de canales y finalmnete a la formación de una célula híbrida esférica.
Los autores sometieron a las células a corriente eléctrica alterna para inducir un bipolo eléctrico en la célula. Este proceso se denomina dielectroforesis.
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONESDISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
Se demuestra la eficacia de la electrofusión para crear híbridos de fusión CD-tumor, terapeúticamente eficaces, en el tratamiento de tumores químicamente inducidos.
Las células de fusión CD-tumor tienen la propiedad posibilidad de estimular las células TCD4 y CD8; la respuesta de las células T va a mediar en la regresión tumoral.
Los híbridos eficaces son los generados desde CD singénicas.
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONESDISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
Se demuestra la eficacia de la electrofusión para crear híbridos.
La inmunoterapia eficaz requiere administración de células de fusión más adyuvantes así como la presencia de células T CD4 y CD8.
OX-40R y 4-1BBmAb son eficaces adyuvantes. La mayor eficacia de la inmunidad inducida
frente al tumor se logra con la vacuna inoculada en bazo.
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONESDISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
La eficacia terapeútica de la inmunoterapia se demuestra para tumores establecidos en el pulmón, pero no así frente a los tumores intracraneales.
El SNC es considerado privilegiado desde el punto de vista inmunológico, ya que carece de drenaje linfático y la naturaleza de la barrera hematoencefálica con uniones intercelulares supone una barrera física al paso de agnetes químicos, anticuerpos y células.
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONESDISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
La electrofusión de las células tumorales irradiadas son la fuente de obtención de Ag tumorales.
Las células tumorales tambien continen Ag presentes en tejidos normales, lo que limita su uso.
La electrofusión comparada con otros métodos de fusión es un proceso que permite obtener numerosas células de elevada eficacia y con fácil reproductibilidad.
ENSAYOS CLÍNICOS CON VACUNAS ENSAYOS CLÍNICOS CON VACUNAS ANTITUMORALESANTITUMORALES
VACUNA CANCER TIPO DE ENSAYO
Péptidos sintéticos de epitopos de Ig de Linfocitos B tumorales
Leucemia Linfocítica Fase1
Células autólogas tumorales de colon con BCG con estimulante inespecífico
Colon Fase3
Lisado polivalente de células de melanoma; adyuvante Detox
Melanoma Fase3
Ag múltiples procedentes de cuatro líneas celulares de melanoma; ady. alumbre
Melanoma Fase3
Células de melanoma irradiadas Melanoma Fase3
Ag clonado, Jen CRG Colorrectal y pulmón Fase1
