Universidad Nacional Autnoma de Mxico

Facultad de Estudios Superiores Cuautitln

14

Enzimas y Vectores de

Restriccin. Bioinformtica

Medina Velzquez Laura Quetzally

Grupo: 2001

Profesoras:

M. en C. Maritere Domnguez Rojas

p.BQD Larissa Andrea Gonzlez Salcedo.

Se ingresa a la pgina de addgene desde el link: http://www.addgene.org/ se hace la

bsqueda del plasmido pTKIP-neo.

Se obtiene su secuencia en formato FASTA dando click en el botn de sequences:

>pTKIP-neo sequence 4290 bps

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Se obtiene su mapa circular:

Se obtiene el mapa linear al dar click en el botn correspondiente.

Se pueden obtener los aminocidos de los dos ORF seleccionando la pestaa de

Translate y la opcin de ORF.

Para observar las enzimas se da click en el botn de Digest.

En el recuadro que se encuentra hasta debajo de la anterior imagen se pude elegir entre

observar las enzimas de corte nico, las que cortan dos veces, todas o ninguna.

NEBcutter es una herramienta que va a tomar una secuencia de ADN y encontrar los

marcos de lectura abierta que no se solapan, utilizando el cdigo gentico de E. coli y los

sitios para todos los tipo II y las enzimas de restriccin tipo III disponibles comercialmente

que cortan la secuencia de una sola vez. Por default, slo se utilizan enzimas disponibles

de NEB, pero otros conjuntos pueden ser elegidos. Solo se tiene que introducir la

secuencia y dar click en "submit". El tamao mximo del archivo de entrada es de 1

Mbyte, y la secuencia de longitud mxima es 300 kbases. Para ingresar a la pgina de

NEBcutter se puede seguir el siguiente link: http://tools.neb.com/NEBcutter2/

Al dar click en submit NEBcutter muestra la estructura del plsmido.

En la opciones que se encuentran hasta el final de la pagina se selecciona Custom digest,

aparece una tabla con todas las ezimas. En este caso se selecciono ApaI y BcII.

Se da click en el botn Digest

Se muestra los fragmentos

resultantes de los cortes de las

enzimas, se observan dos

fragmentos debido a que son dos

enzimas las que estn cortando en

diferentes puntos.

En las opciones que se muestran

del lado izquierdo inferior, se

encuentra la de View gel, la cual

permitir correr una electroforesis

virtual de los fragmentos.

Se volvi a disear otro corte, pero en esta ocasin solo usando a BcII; dando el siguente

resultado, donde muestra el lugar en donde BcII corta al plsmido.

Se corre su electroforesis con las siguientes condiciones:

Se obtiene un fragmento de tamao 4290 debido a que la secuencia es circular.

Se puede comparar los resultados de la digestin sencilla con la doble. En la doble se

observan claramente dos segmentos de diferentes tamaos, como se muestra en el

esquema 1. Mientras que en la digestin sencilla se obtiene solo un fragmento de 4290pb

esto es debido a que la secuencia original es circular entonces al momento de cortar se

genera solo un fragmento, como se muestra en el esquema 2

Esquema 1 Esquema 2

The Restriction Enzyme Data Base

Es una base de datos de las enzimas de restriccin esta proporciona informacin bsica

sobre las enzimas como su secuencia de reconocimiento as como el organismo en el que

fue aislada.

BcII

Ejercicio:

El plsmido seleccionado en AddGenne fue: UBC promoter - GFP - PGK promoter

Hygro con el nmero de identificacin, Plasmid 17627: Duet011.

Este plsmido tiene un marcador de resistencia a ampicilina, y dos marcadores de

seleccin, uno que es para hygromicina y otro que es GFP.

Las enzimas que se eligieron fueron: Fspl y Pacl

Posteriormente se ingresa la secuencia FASTA en NEBcutter, obtenindose el mapa

circular.

Se selecciona las dos enzimas y se hace un corte doble.

Se corre una electroforesis virtual.

Posteriormente se hace un corte sencillo usando solo la enzima que corta al gen de

resistencia a ampicilina; es decir; Fspl.

Obteniendose en la digestin doble, dos fragmentos uno de 7468pb y un segundo de

3296; mientras que en la digestin simple solo se obtuvo un fragmento de 10764pbs de

longitud.