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EVALUACIÓN DE BACILOS AEROBIOS FORMADORES DE
ENDOSPORAS (BAFES) PARA EL CONTROL BIOLÓGICO DE
Rhizoctonia solani Kuhn EN EL CULTIVO DE PAPA CRIOLLA
(Solanum tuberosum Grupo Phureja)
DIANA CAROLINA BLANCO ZAPATA
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE CIENCIAS
MAESTRÍA EN CIENCIAS – MICROBIOLOGÍA
SEDE BOGOTÁ
2012
I
EVALUACIÓN DE BACILOS AEROBIOS FORMADORES DE
ENDOSPORAS (BAFES) PARA EL CONTROL BIOLÓGICO DE
Rhizoctonia solani Kuhn EN EL CULTIVO DE PAPA CRIOLLA
(Solanum tuberosum Grupo Phureja)
DIANA CAROLINA BLANCO ZAPATA
Tesis de Grado presentada como requisito para optar al título de Magister en Ciencias
en Microbiología
Director:
DANIEL URIBE VÉLEZ PhD.
Profesor Asociado Instituto de Biotecnología
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE CIENCIAS
MAESTRÍA EN CIENCIAS – MICROBIOLOGÍA
SEDE BOGOTÁ
2012
II
“La vida es el arte de sacar conclusiones
suficientes a partir de datos insuficientes.”
Samuel Butler
III
IV
AGRADECIMIENTOS
A mis Padres y a mi Hermano por su apoyo incondicional
A Camilo por su amor ilimitado, su motivación y su compañía en la culminación de esta
etapa de mi vida.
A la Universidad Nacional por brindarme la oportunidad de reencontrarme con mi
vocación.
Al Profesor Daniel Uribe Vélez por acogerme en su grupo de investigación, por la
formación que me impartió, sus enseñanzas de vida y su dirección.
A la Fundación Juan Pablo Gutiérrez Cáceres por su apoyo económico.
Al Posgrado de Microbiología por su compromiso y colaboración en gestionar y apoyar
gastos de viáticos requeridos para asistir a congresos y pasantías durante la maestría.
Al Instituto de Biotecnología por su gestión, sus instalaciones y las facilidades que me
ofreció para el desarrollo de este trabajo
A la Profesora Martha Fontanilla por sus consejos y sus enseñanzas y a los demás
docentes que contribuyeron en mi formación académica.
A Socorrito por su infinita ayuda y disposición.
Al Personal del Instituto de Biotecnología por su colaboración y dedicación.
A la Profesora Valeska Villegas por su cordial invitación a las prácticas de entrenamiento
en la Universidad EAFIT en Medellín que hicieron parte del desarrollo de esta
investigación.
A Mis Queridos Compañeros de Laboratorio (Grupo Feliz) Javi, Moni, Cata, Dianita, Linita,
Luis Mi y Luis Fer por su ayuda, por sus ánimos, por sus voces de aliento, su incondicional
apoyo y trabajo arduo en los ensayos de laboratorio y de invernadero.
A Fernanda Sánchez por su incondicional apoyo y ayuda en los momentos más
agobiantes.
A todas las personas que de una u otra forma aportaron al desarrollo y culminación de
este proyecto
A la Vida….y al Universo
V
RESUMEN
EVALUACIÓN DE BACILOS AEROBIOS FORMADORES DE ENDOSPORAS (BAFES) PARA EL CONTROL BIOLÓGICO DE Rhizoctonia solani Kuhn EN EL CULTIVO DE PAPA CRIOLLA
(Solanum tuberosum Grupo Phureja)
Rhizoctonia solani es un hongo fitopatógeno que produce la enfermedad de la Rizoctoniasis en cultivos de papa (Solanun tuberosum) a nivel mundial causando reducción en el rendimiento y la producción entre el 10% y el 26% Los mecanismos de control que se utilizan en la actualidad no permiten un control efectivo de la enfermedad, demandan altos costos y generan problemas medioambientales que estimulan a la búsqueda de estrategias alternativas y/o adicionales como el uso de bacilos formadores de endosporas (BAFES) antagonistas. En el presente estudio se evaluaron 64 BAFES provenientes de suelo rizosférico de plantas de papa criolla (Solanum tuberosum Grupo Phureja) en floración con manejos agrícolas contrastantes (tradicional y orgánico) y se caracterizaron fenotípicamente en términos de su capacidad antagonista in vitro frente a cinco (5) hongos fitopatógenos, dos (2) cepas de Fusarium sp. y tres (3) cepas de Rhizoctonia solani y dos (2) fitopatógenos bacterianos (Burkholderia glumae y Pectobacterium carotovora). 12 cepas con alto potencial biocontrolador in vitro fueron seleccionadas para dilucidar sus posibles mecanismos de acción a través de pruebas in vitro diseñadas para evaluar la producción de metabolitos secundarios de tipo lipopeptídico y compuestos volátiles, encontrando inhibición del crecimiento micelial de R. solani por encima del 85% por efecto de estos mecanismos. La identificación molecular de los aislamientos por amplificación de la región del gen 16S demostró que el 100% corresponden a especies del genero Bacillus sp. Por otra parte, la inoculación de las suspensiones bacterianas en tubérculos semillas de papa criolla (Solanum tuberosum Grupo Phureja) bajo condiciones de invernadero permitió evidenciar disminución en la severidad de la enfermedad en raíces entre un 50 y 80%. Se destaca la cepa 4P-03 por su consistencia en los ensayos in vitro e in vivo. La caracterización de metabolitos secundarios mostró la presencia de lipopéptidos tipo fengicinas y surfactinas, estos metabolitos fueron extraídos y purificados del sobrenadante por medio de precipitación ácida y cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC-RP) y analizados y confirmados por espectrometría de masas lo que sugiere un posible modo de acción que explicaría la alta actividad biopesticida de la cepa 4P-03.
Palabras Claves: Rhizoctonia solani, Solanum tuberosum, BAFES, Control biológico, Bacillus, Lipopéptidos, HPLC.
VI
ABSTRACT
EVALUATION OF AEROBIC ENDOSPORE-FORMING BACTERIA STRAINS FOR BIOLOGICAL CONTROL OF Rhizoctonia solani Kuhn ON POTATO CROPS (Solanum tuberosum Grupo
Phureja)
Rhizoctonia solani is a worldwide plant pathogenic fungus that cause black scurf and stem canker on potato crops (Solanum tuberosum) reducing yield between 30 and 50%. Actual cropping practices are not effective; demands high costs and create environmental problems that force us to look for sustainable alternatives as the use of aerobic endospore-forming bacteria strains with antagonistic activity. In this study, we evaluated sixty-four aerobic endospore-forming bacteria strains isolated from rizhospheric soil of flowering potato plants (Solanum tuberosum Group: Phureja) with different cropping practices (chemical based management and organic management), all strains were phenotypically characterized by dual culture agar assays in vitro, in terms of their capacity to control five phytopathogenic fungi (two Fusarium sp. and three Rhizoctonia solani) and two bacterial phytopathogens (Burkholderia glumae and Pectobacterium carotovora). Twelve strains with the highest potential as biological control agents were selected for further analysis related to possible mechanisms through in vitro assays design to evaluate secondary metabolite compounds of lipopeptide type and volatile compound production resulting in growth inhibition of R. solani up to 85%. Molecular identification by sequencing 16S gene of all twelve strains shows that 100% were Bacillus spp. On the other hand, inoculation of bacterial suspension on potato seed-tubers under greenhouse conditions showed decrease in severity of the roots disease between 50 and 80%. The strain 4P-03 showed consistency in all in vitro e in vivo assays. A further characterization of the secondary metabolites showed the presence of lipopeptide metabolites (surfactin and fengicins) extracted and isolated from supernatant culture by acid precipitation and high-performance liquid chromatography (HPLC-RP) and analyzed and identified by mass spectrum, suggesting a possible mode of action to explain its higher biopesticide activity. KEY WORDS: Rhizoctonia solani, Solanum tuberosum, endospore-forming bacteria, biological control, Bacillus, Lipopeptides, HPLC.
VII
Contenido
RESUMEN ............................................................................................................................................ V
ABSTRACT ........................................................................................................................................... VI
Lista de Figuras ................................................................................................................................... IX
Lista de Tablas ..................................................................................................................................... X
Lista de Anexos ................................................................................................................................... XI
Lista de Abreviaturas ......................................................................................................................... XII
1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................... 1
2. MARCO TEÓRICO ......................................................................................................................... 4
2.1. Cultivo de la papa criolla ..................................................................................................... 4
2.1.1. El cultivo de la papa criolla en Colombia ..................................................................... 5
2.2. Rhizoctonia solani: Hongo fitopatógeno ............................................................................. 7
2.2.1. Ciclo de vida y modo de acción: .................................................................................. 8
2.2.2. Mecanismos y sistemas de control ........................................................................... 11
2.3. Control Biológico ............................................................................................................... 12
2.3.1. Bacilos Aerobios Formadores de Endosporas (BAFES) .............................................. 13
3. OBJETIVOS ................................................................................................................................. 17
3.1. OBJETIVO GENERAL: .......................................................................................................... 17
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS: ................................................................................................... 17
4. METODOLOGÍA .......................................................................................................................... 18
4.1. COLECCIÓN DE BAFES OBTENIDOS DE SUELOS RIZOSFÉRICOS DE PAPA: ..................... 18
4.2. MICROORGANISMOS FITOPATÓGENOS: ........................................................................ 19
4.3. PRUEBAS DE ANTAGONISMO IN VITRO .......................................................................... 19
4.4. SELECCIÓN DE BAFES: ...................................................................................................... 21
4.5. EVALUACIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS ............................................................ 21
4.5.1. Preparación de sobrenadantes: ................................................................................ 22
4.5.2. Ensayos de inhibición por sobrenadantes: ................................................................ 22
4.5.3. Ensayo de termo-estabilidad: ................................................................................... 23
4.6. EVALUACIÓN DEL EFECTO ANTAGONISTA DE COMPUESTOS VOLÁTILES PRODUCIDOS
POR LOS BAFES: ............................................................................................................................ 23
VIII
4.7. IDENTIFICACIÓN MOLECULAR POR LA REGION DEL GEN DEL 16S: ............................... 24
4.8. ENSAYOS DE POTENCIAL BIOCONTROLADOR BAJO CONDICIONES DE INVERNADERO:
25
4.8.1. Preparación de inóculos: ........................................................................................... 25
4.8.1.1. BAFES: .................................................................................................................... 25
4.8.1.2. Rhizoctonia solani: ................................................................................................ 26
4.8.2. Condiciones del ensayo: ............................................................................................ 26
4.8.3. Evaluación de la enfermedad causada por R. solani: ................................................ 27
4.9. EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE METABOLITOS: ......................................................... 28
4.9.1. Purificación de compuestos activos .......................................................................... 29
4.9.2. Identificación de compuestos ................................................................................... 30
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................................................ 31
5.1. SELECCIÓN DE AISLAMIENTOS RIZOSFÉRICOS BAFES ....................................................... 31
5.2. MECANISMOS DE ACCIÓN ................................................................................................. 34
5.2.1. EFECTO ANTAGÓNISTA DE METABOLITOS SECUNDARIOS SOBRE EL CRECIMIENTO
DE Rhizoctonia solani in vitro .................................................................................................. 34
5.2.2. EFECTO ANTAGONISTA DE COMPUESTOS VOLÁTILES SOBRE EL CRECIMIENTO DE
Rhizoctonia solani in vitro ......................................................................................................... 36
5.3. IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LOS 12 AISLAMIENTOS SELECCIONADOS .................... 39
5.4. EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD BIOCONTROLADORA DE LOS 12 AISLAMIENTOS
BACTERIANOS BAFES CONTRA R. solani EN PAPA CRIOLLA BAJO CONDICIONES DE
INVERNADERO. .............................................................................................................................. 39
5.4.1. INÓCULOS BACTERIANOS .......................................................................................... 39
5.4.2. EVALUACIÓN INICIAL DE LA ENFERMEDAD A LOS 45 DÍAS DE LA SIEMBRA ............. 40
5.5. EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS DE NATURALEZA
LIPOPEPTIDICA .............................................................................................................................. 46
5.5.1. Identificación de compuestos antimicrobianos ........................................................ 48
6. DISCUSIÓN GENERAL ................................................................................................................. 51
7. CONCLUSIONES ......................................................................................................................... 56
9. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................................ 60
10. ANEXOS ................................................................................................................................. 71
IX
Lista de Figuras
Figura 1. Ciclo de vida de Rhizoctonia solani………………………………………………………………………………10
Figura 2. Lesiones causados por R. solani en papa…………………………………………………………..………..11
Figura 3. Categorías de inhibición en los ensayos de antagonismo in vitro contra hongos..……..33
Figura 4. Evaluación de la actividad inhibitoria de R. solani por metabolitos secundarios en el
sobrenadante (30% v/v con PDA)….…………………..……………………………………………………………..………..35
Figura 5. Efecto de la producción de metabolitos secundarios en el sobrenadante (esterilizado y sin
esterilizar) sobre el crecimiento de R. solani, AP-188 cepa control. ………………………………………….36
Figura 6. Efecto de compuestos volátiles producidos por la cepa 4P-03 sobre el crecimiento de R.
solani……………………………………………………………………………………………………………………………..……………37
Figura 7. Efecto de la producción de compuestos volátiles sobre el crecimiento de R. solani…….38
Figura 8. Efecto de R. solani sobre el peso seco de raíces de plantas de papa criolla a los 45
días………………………………………………………………………………………………………………………………………………43
Figura 9. Número de lesiones en raíces causadas por R. solani en papa criolla a los 45 días..…...43
Figura 10. Promedio longitud de lesiones en raíces causadas por R. solani de papa criolla a los 45
días........................................................................................................................................44
Figura 11. Porcentaje de severidad de la enfermedad causada por R. solani en plantas de papa
criolla a los 45 días…………………………………………………………………………………………………………………….…45
Figura 12. Análisis por HPLC-RP del extracto libre de células de la cepa 4P-03 previamente
separado por extracción en fase solida a: a) 80% de MeOH y b) 100% de
metanol………………………………………………………………………………………………………………………………………..57
Figura 13. Espectro de masas de los extractos metanólicos obtenidos por SPE a.) 80% de MeOH y
b.) 100% de MeOH de la cepa 4P-03.……………………………………………………………………………………..….…58
Figura 14. Análisis filogenético resumen de los 12 aislamientos de Bacillus sp evaluados en para el
control de R. solani in vitro y bajo condiciones de invernadero…………………………………………………….61
X
Lista de Tablas
Tabla 1. Características agrícolas del cultivo de papa criolla (Solanum tuberosum Grupo
Phureja)…................................................................................................................................5
Tabla 2. Descripción de las tres (3) familias de lipopéptidos cíclicos con actividad antifúngica y
antibacterial……………………………………………………………………………………………………………………………......15
Tabla 3. Modo de operación en gradiente de HPLC en fase reversa para análisis 20μL de extracto
metanólico a una concentración de 20mg/mL del residuo sólido obtenido ………………………….…...25
Tabla 4. Categorías de inhibición en los ensayos de antagonismo in vitro…………………………….…….32
Tabla 5. : Resultado de las pruebas de antagonismo in vitro de los 64 aislamientos bacterianos
BAFES contra cinco (5) fitopatógenos, Rs (R. solani), Fo (F. oxysporum), Bg (B. glumae) y Pc (P.
caratovora)……………………………………………………………………………………………………………….………………….35
Tabla 6. Identificación molecular a partir de la región del gen 16S de las 12 cepas
seleccionadas……………………………………………………………………………………………………………………………....39
Tabla 7. Reconteos bacterianos de suspensiones y tubérculos……………………………………..…………..47
Tabla 8. Efecto de R. solani sobre parámetros de longitud y peso seco de tallo y raíces de plantas
de papa criolla a los 45 días de siembra…………………………………….................................................46
Tabla 9. Efecto de R. solani sobre el número y peso total de tubérculos producidos por plantas de
papa criolla…………………………………………………………………………………................................................53
Tabla 10. Efecto de R. solani sobre parámetros de longitud y peso seco de tallo y raíces de plantas
de papa criolla en producción……………………………………………………………………………………..……...........54
XI
Lista de Anexos
Anexo 1. Composición medios de cultivo……………………………………………………………………………..……..83
Anexo 2. Resultados de análisis del suelo…………………………………………………………………………………….85
Anexo 3.Extracción y purificación de metabolitos presentes en el sobrenadante de la cepa 2P-01
….…………………………………………………………………………………………………………………………………………………86
Anexo 4. Resultados de repetición en el tiempo de ensayo síntomas a los 45 días…………………...87
XII
Lista de Abreviaturas
AG: Grupo de anastomosis
ABS: Absorbancia
BACs: Agentes de Control Biológico
BAFES: Bacterias Aeróbicas Formadoras de Endospora
D.E: Desviación Estándar
dNTP: Dinucleótidos trifosfatados
HCN: Ácido Cianhídrico
HPLC-PR: Cromatografía Liquida de Alta definición en Fase Reversa
LB: Luria-Betani
MeOH: Metanol
MOLP: Medio óptimo para la producción de lipopéptidos
nm: Nanómetros
OD: Densidad Óptica
PCR: Reacción de la Polimerasa en cadena
PDA: Agar Papa Dextrosa
Prom: Promedio
SPE: Extracción en fase solida
TSA: Agar Tripticasa de Soya
UFC: Unidades Formadoras de Colonias
V/V: Proporción volumen a volumen
% INH: Porcentaje de inhibición
1
1. INTRODUCCIÓN
El cultivo de la papa ocupa el cuarto puesto como producto básico más expandido en el
mundo, después del trigo, el arroz y el maíz (FAO, 2009), cada vez tiene un mayor
crecimiento y en la actualidad se produce once (11) veces más que en los años sesenta
(Bigio, 2008). Se encuentra entre los diez alimentos más importantes producidos en países
en vía de desarrollo debido a su alta capacidad de adaptación a diferentes climas, a los
sistemas de cultivos y a su alto valor nutricional, por ser fuente de proteína,
carbohidratos, vitaminas y minerales, lo que ha generado un aumento en producción y
consumo principalmente en países como China e India. (MADR, 2005).
En Colombia, la papa es uno de los productos básicos incluidos en el plan alimentario de
la población, es el producto agrícola de mayor consumo en el país (58,0 kg/persona/año)
después del maíz (MADR, 2008; Ñústez, 2011). Anualmente se producen más de
2’500.000 toneladas de papa que generan más de 90.000 empleos directos representando
el 21% con respecto al total de los empleos en agricultura y de esta producción
aproximadamente el 10% se exporta a países como Estados Unidos (MADR, 2009). Según
cifras del Consejo Nacional de papa en el 2009, el área cultivada de papa mostró una
disminución significativa, pasando de 160.690 hectáreas cultivadas en el 2007 a 134.640
hectáreas en el 2009, sin embargo los rendimientos aumentaron de 17 ton/ha a 19 ton/ha
en el mismo periodo (Ñústez, 2011) lo que sugiere un aumento en la eficiencia del cultivo
y por ende un esfuerzo por producir más en menos terreno.
Por su parte, la papa criolla (Solanum tuberosm Grupo Phureja) en Colombia, representa
aproximadamente el 10% de la papa que se produce en el país con rendimientos cercanos
a la 10 ton/ha (MADR, 2009) siendo Cundinamarca, Boyacá, Antioquia y Nariño los
principales departamentos productores del país (Martínez, 2006). Es un producto
ancestral de importancia para la seguridad alimentaria por el potencial de los recursos
genéticos, su valor nutricional y su calidad culinaria (Herrera y Rodríguez, 2011) En la
2
actualidad, el Gobierno Nacional en cabeza del Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural
promueven el desarrollo biotecnológico para la producción de papa criolla, mediante el
cual pretende incrementar los rendimientos y calidad de producto, con el fin de responder
a las demandas de países como Japón, México, Estados Unidos y Venezuela que cada vez
exigen un mayor número de producto de alta calidad y con buenas prácticas de manejo
agrícola (MADR, 2009).
No obstante, el cultivo de papa criolla se ha visto afectado por un buen número de plagas
emergentes y otras recurrentes de importancia regional y nacional como la polilla
guatemalteca (Tecia solanivora (Povolny) (Lepidoptera: Gelechiidae)) y las enfermedades
ocasionadas por protistas y hongos como Phytophthora infestans y Rhizoctonia solani
(Espinel et al., 2005.) altamente limitantes en la producción y calidad de los tubérculos,
alcanzando altas incidencias en los departamentos productores del país (Mosquera, 1992 ;
MADR, 2009). Entre las enfermedades causadas por hongos se destaca la causada por el
fitopatógeno Rhizoctonia solani que causa pérdidas importantes en calidad y producción
de la papa ya que afecta brotes, tallos y tubérculos (Virgen-Calleros et al., 2000). Este
hongo está presente en todas las áreas productoras de papa, generando chancros en
tallos y estolones y costras negras en los tubérculos (Hooker, 1986), además reduce la
emergencia de los brotes, el vigor de la planta y frecuentemente, los tubérculos
infectados se agrietan o se deforman (Powelson et al., 1993). R. solani causa
deformaciones y grietas en la superficie de los tubérculos y lesiones en raíces y tallos
generando pérdidas en los rendimientos del cultivo entre el 10% y el 26% (Guerrero, 1998;
Díaz, 2002)
Hasta ahora, no existe un control completamente eficaz de esta enfermedad por lo que R.
solani representa uno de los mayores limitantes del cultivo de papa en Colombia (Díaz,
2002), no obstante se han implementado prácticas que reducen la gravedad de la misma
entre las que se destacan el uso de semilla libre de inóculo, destrucción de residuos, la
rotación de cultivos y la aplicación de fungicidas de tipo bendimidazoles como parte de un
manejo integrado de la enfermedad (Tsror, 2010), sin embargo está comprobado que los
fungicidas químicos además de los altos costos producen impactos negativos en la
3
biodiversidad de los agroecosistemas por que generan resistencia en las poblaciones de
microorganismos patógenos, por esta razón, el desarrollo de alternativas de control
biológico, sostenibles y amigables con el ambiente atraen la mayor atención (Zavaleta,
2000). Por lo anterior, una estrategia prometedora es el uso del control biológico
mediante microorganismos antagonistas o agentes de control biológico (BCAs), como el
caso de bacterias aerobias formadoras de endosporas (BAFES) especialmente las del
genero Bacillus spp por su capacidad biocontroladora de diversos patógenos de suelo en
cultivos de interés agronómico (Kloepper et al., 1999).
Las bacterias esporuladas del tipo Bacillus spp son efectivas para inhibir el desarrollo de
hongos entre los que se destacan Fusarium oxysporum, Phytophthora capsici, Alternaria
solani, entre muchos otros (Jiménez et al., 2001; Chan et al., 2003,; Brewer y Larkin 2005,
Guillén-Cruz et al., 2006.) Ensayos in vitro han demostrado inhibición del crecimiento de R.
solani mediante el uso de especies de Bacillus (Brewer y Larkin, 2005; Abeysinghe, 2009;
Calvo et al., 2010; Huang et al., 2012;) y algunos ensayos en papa demuestran efectos en
la reducción de la enfermedad de la Rizoctoniasis mediante la implementación de
microorganismos antagonistas (Wicks et al,. 1995; Silva, 1999; Soliz, 2004; Grosch et al.,
2005; Bautista et al., 2007) Asimismo, otros estudios indican que además del efecto
inhibitorio de fitopatógenos, ciertas especies de Bacillus spp. promueven el crecimiento
vegetal debido a la síntesis de auxinas, citoquininas, vitaminas y etileno (Van Veen et al.,
1997, Lugtenberg y Kamilova, 2009).
Es por eso que la colección de aislamientos nativos aislados de la rizósfera de papa criolla
(Flórez y Uribe-Vélez, 2011), pertenecientes al Grupo de Microbiología Agrícola del
Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia, fueron caracterizados y
seleccionados por su potencial antagonista en contra de fitopatógenos de papa en
ensayos in vitro; lo anterior, mediante la evaluación de diferentes mecanismos de acción
como metabolitos secundarios y producción de volátiles in vitro y bajo condiciones de
invernadero en plantas de papa criolla.
4
2. MARCO TEÓRICO
2.1. Cultivo de la papa criolla
La papa criolla Solanum tuberosum Grupo Phureja (Huamán y Spooner, 2002) ó
recientemente Solanum tuberosum grupo Andigenum (Spooner et al., 2007) pertenece a
la amplia familia de las Solanáceas, el grupo correspondiente a las papas criollas está
compuesto por un buen número de variedades nativas que crecen extensamente en los
Andes, desde el occidente de Venezuela hasta el centro de Bolivia (Ghislain et al., 2006).
En Colombia, su cultivo se lleva a cabo entre los 1.800 y los 3.200 m.s.n.m., siendo
óptimas para su cultivo las alturas comprendidas entre los 2.300 y los 2.800 m.s.n.m., lo
que representa un rango de temperatura promedio de 10°C a 20° C., el cultivo de papa
crece mejor en suelos profundos con buen drenaje, de preferencia francos y franco
arenosos, fértiles y ricos en materia orgánica, con una pendiente máxima del 30% y un pH
entre 5.2 y 5.9 (MADR- FEDEPAPA, 2004).
El cultivo de papa criolla se propaga por tubérculos, uno de los insumos más costosos en
el proceso productivo de la papa; requiere agua especialmente en los primeros días
después de la siembra y desde la aparición de las flores hasta cuando los tubérculos han
adquirido buen tamaño y peso. Es recomendable, por lo anterior, que la siembra coincida
con el inicio de la época de lluvias o que se haga durante la misma (MADR- FEDEPAPA,
2004).
En cuanto a producción, el indicador indirecto del rendimiento del cultivo es la
proporción entre semilla sembrada y tubérculos recogidos (ton/ha), por ejemplo, para
sembrar una hectárea con papa criolla se requieren entre 0,7 y 1,1 toneladas de papa, de
las cuales se espera obtener entre 7 y 12 toneladas de producto (Espinel et al., 2005).
5
En la tabla siguiente se resumen las características agrícolas del cultivo de la papa criolla:
Tabla 1. Características agrícolas del cultivo de papa criolla (Solanum tuberosum Grupo Phureja) variedad Colombia.
Adaptación 2.400- 3.200 metros sobre el nivel del mar, se cultiva en diferentes regiones del país.
Suelos Son muy favorables los suelos de textura franca sin mucha materia orgánica.
Periodo Vegetativo 120 días a 2.600 m.s.n.m., no tiene periodo de reposo.
Rendimiento óptimo 15 a 25 toneladas/año
Materia Seca 21 a 23%
Calidad Culinaria Excelente calidad culinaria, versátil para distintos platos como sopas y para fritar, es la variedad que se ha procesado como precocida congelada.
Fuente: Ñústez, 2011. Variedades Colombianas de papa.
La papa criolla es más susceptible al ataque de plagas y enfermedades que el de la papa
común, por lo que se recomienda realizar rotaciones con otras especies agrícolas como,
trigo, zanahoria, arveja, cebada y pastos. Otras prácticas tendientes a disminuir la
incidencia de enfermedades comprenden la siembra de cultivos asociados e intercalados
entre los que se destacan las asociaciones con otras variedades de papa o con calabaza,
haba, arveja, maíz, fríjol ajo, brócoli, caléndula, coliflor y repollo y como cultivos
intercalados, los frutales caducifolios (MADR- FEDEPAPA, 2004).
2.1.1. El cultivo de la papa criolla en Colombia
Colombia es el mayor productor comercial de papa criolla a nivel internacional, es el
mayor consumidor y exportador de papa criolla en el mundo y tiene ventaja competitiva
por ser centro de diversidad de S. phureja y porque existe gran aceptación en los
6
consumidores, debido a las características organolépticas y nutricionales de este
tubérculo (Rodríguez et al., 2009). Adicionalmente, en el país se ha desarrollado una
amplia tradición como cultivo, con gran potencial de industrialización y exportación. Su
cultivo se haya extendido en todas las partes altas de la región andina y las siembras de
este cultivo en Colombia representa entre el 5 y 10 % del área nacional sembrada en papa,
dependiendo de los estímulos de precio en el mercado (Alonso, 2009).
En el periodo 2002 - 2009 representó apenas un 6% del área dedicada al cultivo de la papa
a nivel nacional; sin embargo, el área sembrada de papa criolla pasó de 6.520 hectáreas a
8.140 hectáreas en el mismo periodo, con una tasa de crecimiento medio anual de 3,22%
(MADR, 2009). En el año 2010, se registró la misma tendencia en área cultivada de papa
criolla llegando a las 8. 300 hectáreas y se realizaron exportaciones cercanas a 1.000
t/año (Fedepapa, 2010).
Por lo anterior, el Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural prioriza a la papa criolla
como uno de los productos promisorios exportables, para lo cual se han diseñado varios
instrumentos de política en los aspectos financiero, fitosanitario, de investigación y de
promoción de productos de valor agregado a base de papa criolla para mercados de
exportación. Estas medidas buscan fortalecer la productividad del cultivo haciéndolo más
atractivo a los productores e incentivando la innovación y búsqueda de mercados para
productos como harina, croquetas y productos a base de papa criolla procesados para
atender el mercado externo; es importante aclarar que la necesidad de exportar en forma
procesada se debe a que en estado fresco presenta alta perecibilidad que la lleva a una
rápida pérdida de su valor económico y nutricional, además los mercados internacionales
están demandando productos con mayor valor agregado. (MADR, 2006).
Por otro lado, a nivel de económico los fungicidas son los agroquímicos que mayor peso
tienen en los costos de producción de papa después de los fertilizantes, alcanzando cerca
7
del 7% del costo total lo que corresponde en pesos para las zonas productoras del
altiplano cundiboyacense y Nariño, a aproximadamente $1,260.000/ha por semestre
(Fedepapa, 2007), estos productos son aplicados a la semilla en almacenamiento o
durante la siembra, la emergencia y el deshierbe del cultivo (Ñústez, 2002), sin embargo la
eficacia de los mismos frente al manejo de la enfermedad es baja (Tsror, 2010) y sí
representan riesgos para la salud humana y el medio ambiente (Liñán, 1997) por esto
abordar problemas fitosanitarios que afectan el cultivo de papa criolla, se ha convertido
en un blanco importante de investigación debido al alto impacto que generaría la
implementación de tecnologías biológicas que permitan una mejor calidad de producto y
reducción de costos, en este sentido, las enfermedades causadas por hongos
fitopatógenos atraen la mayor atención y entre ellos la enfermedad causada por
Rhizoctonia solani.
2.2. Rhizoctonia solani: Hongo fitopatógeno
Rhizoctonia solani es un hongo fitopatógeno que afecta una gran cantidad de cultivos y
plantas silvestres, ampliamente distribuido en todo el mundo (Zachow et al., 2011), en
plantas de papa ocasiona la enfermedad conocida como rizoctoniasis o cáncer de raíces y
tallos, y costra negra cuando la superficie del tubérculo se encuentra cubierta por
esclerocios (Cotes et al., 2011). El micelio es casi siempre de color marrón o castaño
oscuro y las hifas tienen un diámetro que va desde 8 a 10 μm. Las características más
típicas de R. solani son sus ramificaciones en ángulo recto, constricciones en el punto de
origen de la ramificación de la hifa y formación de un septo tipo doliporo en la rama cerca
de su origen (Sneh et al., 1996).
Las hifas de este hongo son capaces de anastomarse (fusión de hifas), por lo que
inicialmente diferentes aislamientos fueron agrupados en función (grupos AG) de esta
característica (Ogoshi, 1987), aunque actualmente las técnicas moleculares como
8
secuenciación de DNA ribosomal, análisis de proteínas, zimogramas y perfiles de ácidos
grasos son las más usadas para su clasificación (Jeon et al., 2010; Balali et al., 2007).
El grupo de anastomosis (AG) que infecta a la papa, más reportado es el perteneciente al
grupo AG3, más específicamente el grupo AG3PT (Campion et al., 2003), aunque se han
aislado otros grupos de anastomosis de tallos, tubérculos y estolones de papas infectadas
(Carling et al., 1989) tal como los grupos AG2 y AG5 que se han reportado en cultivos de
papa en Gran Bretaña (Woodhall et al., 2007) que en general han mostrado diferencias en
patogenicidad en este cultivo (Woodhall et al., 2008).
El grupo AG3PT produce chancros y lesiones en tallos y estolones, y esclerocios y
malformaciones en tubérculos, este grupo en particular presenta un bajo porcentaje de
esporulación in vitro de alrededor del 10% y en campo se ha aislado con mayor frecuencia
de áreas cultivadas (Virgen-Calleros et al., 2000). En Colombia el grupo de anastomosis
más reportado es el AG3, aunque en el estudio realizado por Ferrucho (2011) se evidencio
la presencia del grupo AG2 infectando papa en los departamentos de Boyacá y
Cundinamarca.
2.2.1. Ciclo de vida y modo de acción:
El ciclo de vida de Rhizoctonia solani incluye periodos parasíticos y saprofiticos así como
ciclos de reproducción sexual y asexual (Zachow et al, 2011). En el cultivo de papa, R.
solani permanece de una cosecha a otra en forma de esclerocios (estructuras de
resistencia) y de micelio en residuos vegetales que se encuentran en el suelo. Los
esclerocios germinan bajo condiciones de humedad favorable y temperaturas
relativamente frías (entre 16-23°C) infectando los brotes y tallos de nuevas plantas
(Calderón, 1978). La formación de esclerocios sobre la superficie de los tubérculos ocurre
en condiciones de suficiente humedad sin embargo, el máximo desarrollo de esclerocios
9
se produce cuando los tubérculos están listos para cosechar (Figura1. 1) (Van den Boogert
y Luttikholt, 2004; Cedeno et al., 2001).
Inicialmente el hongo es atraído por residuos vegetales o estimulantes que produce la
misma planta durante la germinación en un proceso conocido como crecimiento
quimiotrófico positivo o en dirección del estímulo, al germinar los esclerocios producen
hifas que luego de entrar en contacto con la planta, invaden los tejidos principalmente de
raíz y tallos, afectando principalmente los tejidos jóvenes de brotes y estolones (Figura1.
6, 7, 8) (García et al, 2002).
El proceso de infección y penetración del hongo en las plantas de papa puede ocurrir
mecánica o enzimáticamente; mecánicamente cuando el hongo encuentra puntos débiles
en la superficie de tallos y raíces que atraviesa y rompe para penetrar al tejido vegetal;
enzímaticamente, por la secreción de celulasas, quitinasas y pectinasas que degradan los
componentes de la pared celular vegetal promoviendo el crecimiento de hifas, causando
las lesiones necróticas en tallos, brotes y raíces, (Demirci et al., 2002.); cuando la
enfermedad ataca a los estolones, ocasiona lesiones que pueden estrangularlos o
matarlos, evitando y/o disminuyendo el crecimiento de tubérculos (Figura2) (Soliz, 2004),
de esta forma el hongo permanece en forma de micelio hasta la producción en donde se
forman los esclerocios que actúan como inóculos iniciando un nuevo ciclo celular
(Figura1. 9-10) (Parmeter, 1970). En enfermedades agresivas la formación de esclerocios
en forma de costras también puede ocasionar mal formaciones, concavidades y necrosis
(Carling, 1990).
10
Figura 1. Ciclo de vida de Rhizoctonia solani. El micelio formado a partir de los esclerocios diseminados en el suelo, entra en contacto con la planta afectando la superficie externa (1, 2, 3, 4), la infección inicia con la producción de diferentes enzimas extracelulares que degradan la celulosa, pectina y quitina presentes en la pared celular (5, 6), el hongo gradualmente continua con su desarrollo formando apresorios que penetran y toman nutrientes de las células vegetales, lo que ocasiona la sintomatología de la enfermedad en la planta (7, 8), finalmente las hifas que han colonizado progresivamente el tejido permanecen hasta la maduración de tubérculos en donde se forman esclerocios sobre la superficie (9) (Fuente: http://www.agroancash.gob.pe/public/articulos/aip2008/temas/enfermedades.htm
Algunos de los síntomas que se observan durante el inicio de la enfermedad incluyen
lesiones necróticas de color marrón en la base de brotes, es por esto que las plantas más
afectadas por la enfermedad se muestran débiles y crecen lentamente (Figura 2) (Carling
et al, 1989), cuando las plantas maduran muestran amarillamiento y hojas apicales
arrugadas, adicionalmente, debido a que las lesiones interfieren en el normal movimiento
de nutrientes se forman tubérculos aéreos en las axilas de las hojas (Carling, 1990).
1
2
3
4
5 6
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8
9 10
11
Figura 2. A. lesiones causados por R. solani en tallos y estolones de papa criolla (Solanum tuberosum Grupo
Phureja). B. Tubérculos de papa con esclerocios en su superficie (costra negra) (Fuente:
http://fluentesdemexico.com/pudricion-basal-rhizoctonia-solani/).
2.2.2. Mecanismos y sistemas de control
Es importante tener en cuenta que la siembra continúa de papa en el mismo terreno y el
uso de semilla altamente infestada de esclerocios incrementan las poblaciones de R.
solani (García et al., 2002), por lo que las prácticas de manejo en cultivo más relevantes
para el control de esta enfermedad se basan principalmente en un manejo integrado que
incluye utilización de semilla libre de la enfermedad tratada con fungicidas, rotación de
cultivos, buen manejo de los residuos de cosecha y manejo del tiempo de corte de rama y
cosecha (Tsror, 2010).
El momento más adecuado para su control es en la siembra de semillas por lo que es
importante utilizar tubérculos libres de la enfermedad y/o tratadas con productos
antifúngicos y evitar la siembra en suelos demasiado húmedos y poco drenados. (Van den
Boogert y Luttikholt, 2004) Contrariamente, en Colombia solo el 1% del total de la
producción de papa en Colombia utiliza semilla certificada, siendo esto una problemática
importante en la baja productividad de este cultivo; esto sucede porque tradicionalmente
A B
12
el agricultor no le da importancia al uso de semilla de buena calidad en su cultivo,
limitándose a usar para la próxima siembra la semilla de menor calidad o menor precio en
el mercado, esto genera pérdidas significativas en producción y dispersión de esclerocios y
de otros fitopatógenos de importancia (Cotes et al., 2011).
Es por esto que se recurre al uso de fungicidas en exceso entre los que se destacan para el
control de Rhizoctonia sp el Mancozeb a base de ditiocarbamatos, algunos de contacto
(iprodiones y el clorotalonil) (Campion et al., 2003) y sistémicos (carboxina, triadimefon y
tiofanato de metilo) que también son usados para el control de las enfermedades
causadas por Rhizoctonia en otros cultivos diferentes (MADR, 2009), en el mercado
colombiano, se encuentra para el control de R. solani en papa el Pulsor® del grupo de los
tiazolecarboxanilidas cuya acción bloquea la enzima succinato-deshidrogenasa del ciclo
del ácido tricarboxílico, confiriéndole actividad preventiva y curativa en el tratamiento de
semillas (Dow Agrosciences de México, 2012), sin embargo el uso casi exclusivo de esta
molécula para el control de R. solani genera unas condiciones de presión de selección muy
favorables para el surgimiento de eventos de resistencia en la población del hongo.
Finalmente aunque se ha observado que el tratamiento químico de los tubérculos antes
de la siembra genera uniformidad en el desarrollo de las plantas y más número de tallos
por parcela (Soliz, 2004), el uso indiscriminado de estos fungicidas en el control de
enfermedades causadas por hongos en papa ha ocasionado graves daños al ambiente y
una fuerte presión selectiva que genera resistencia de fitopatógenos fúngicos a los
productos químicos aplicados (Virgen-Calleros et al., 2000).
2.3. Control Biológico
El control biológico se define como la reducción de la actividad de patógenos ejercida por
uno o más microorganismos en forma natural, a través del manejo ambiental del
13
hospedero o del antagonista o por la introducción de uno o más antagonistas; rara vez se
erradica al patógeno, pero sí reduce su población o su capacidad patogénica (DeBach y
Rosen, 1991).
Para el caso particular de R. solani la implementación y uso de microorganismos para su
control in vitro y condiciones de invernadero ha demostrado reducción de la enfermedad
como en el caso de los hongos antagonistas Trichoderma harzianum (Wilson et al., 2008),
T. koningiopsis (Cotes et al., 2011) y con bacterias del genero Bacillus spp. y Pseudomonas
spp. (Grosch et al., 2005; Bautista et al., 2007), así como la combinación de
microorganismos como el caso de B. subtilis y T. virens, en donde se evidenció que en
combinación producían mejores efectos en el control de R. solani que por separado
(Brewer y Larkin, 2005). Es importante destacar que a pesar de los estudios realizados,
actualmente no existe en el mercado un producto biológico completamente efectivo para
el control de la enfermedad causada por este hongo (Tsor, 2010).
2.3.1. Bacilos Aerobios Formadores de Endosporas (BAFES)
Dentro de los microorganismos utilizados en estudios de control biológico se destacan los
bacilos aerobios formadores de endosporas (BAFES) que son bacilos Gram positivos
generalmente del genero Bacillus sp. caracterizados por su capacidad de sobrevivir en
ambientes hostiles debido a la estructura de su pared celular y la formación de
endosporas resistentes a condiciones de estrés, características muy deseables en la
formulación de productos biológicos (McSpadden, 2004).
Los BAFES poseen diferentes mecanismos que les permite controlar un buen número de
patógenos de plantas (hongos, bacterias y oomicetos) entre los que se destacan: la
competencia por espacio o nutrientes la producción de enzimas como proteasas,
quitinasas y β glucanasas (Lian et al., 2007) y otras sustancias antibióticas y antifúngicas
14
con actividad inhibidora del crecimiento de fitopatógenos (Bernal et at., 2002.) entre las
que se destacan: iturinas (Cho et al., 2003; Yu et al, 2002), surfactinas (Huszcza y Burczyk,
2006), fengicinas (Ongena et al., 2007), kanosaminas (Milner et al, 1996), pliplastatinas
(Volpon et al., 2000) y otros compuestos de naturaleza lipopeptídica (Kim et al., 2004.), así
como sustancias antibióticas (Stein, 2005.).
Estos metabolitos secundarios de bajo peso molecular se caracterizan por ser anfifílicos y
poseer un heptapéptido cíclico de siete (surfactinas e iturinas) ó 10 aminoácidos
(fengicinas), que se une a una larga cadena alquil- hidrófoba (Lang, 2002). En la actualidad,
este tipo de lipopéptidos están siendo estudiados y utilizados como biopesticidas para la
protección de plantas debido a las características que se resumen en la tabla 2 (Vater et
al., 2002; Touré et al., 2004).
Estas sustancias antibióticas y antifúngicas han sido caracterizadas como parte de los
mecanismos de acción de cepas de Bacillus subtilis generando actividad en contra de
diferentes fitopatógenos in vivo e in vitro tales como: Botrytis cinerea (Helbig y Bochow,
2001; Touré et al., 2004), Fusarium sp. (Chan et al., 2003) y Gaeumannomyces graminis
var. tritici (Liu et al., 2009); adicionalmente, se han descrito otros mecanismos de acción
dentro de las cuales se destacan la producción de sustancias volátiles (Kai et al., 2007),
producción de lactonasas (interfieren con la comunicación celular de bacterias gram
negativas) (Dong et al., 2002) e inducción de resistencia sistémica (RSI) en las plantas
hospederas (Kloepper et al, 2004; Ongena y Jacques, 2008).
15
Tabla 2. Descripción de las tres (3) familias de lipopéptidos cíclicos con actividad antifúngica y antibacterial.
Lipopéptido Estructura Función
Surfactinas
Heptapéptido cíclico que tienen un ácido graso β-hidroxilo con una cadena de átomos de carbono de 13 a 16
Disminuyen la tensión superficial y actúan como detergentes emulsionantes con actividad desestabilizante de membranas biológicas (Yakimov et al., 1995)
Tiene actividad hemolítica, bactericida, antimycoplasmica y antiviral.
No tiene actividad antifúngica por sí sola, sin embargo muestra actividad al estar en sinergismo con la Iturina A.
Poderoso surfactante que facilita la colonización bacteriana en la raíz.
Iturinas
Heptapéptido cíclico con un ácido graso β-amino de 14 a 17 carbonos de largo, incluye micosubtilina y bacilomicina.
No tiene función antiviral, tiene una limitada actividad antibacteriana, sin embargo se le atribuye actividad hemolítica y antifúngica contra una amplia variedad de hongos y levaduras.
Fengicinas
Decapéptido con un anillo interno de lactona en la fracción peptídica y un ácido graso β-hidroxilo de C14-C18 que puede ser saturado o insaturado.
No tiene actividad hemolítica, se han reportado efectos bacteriostáticos con E. coli, sin embargo su actividad antifúngica es específica contra hongos filamentosos.
Interactúa fácilmente con componentes de la membrana celular del hongo como el ergosterol, alterando la estructura y la permeabilidad de la célula.
Inhibe la enzima fosfolipasa A2.
Figuras tomadas de Ongena y Jaques, 2008.
16
En cuanto a productos biológicos que se encuentran en el mercado la mayoría están
basados en bacterias antagonistas que utilizan cepas de Bacillus spp. tal como el producto
Serenade®, que se comercializa en Colombia, Rhapsody® cuyo ingrediente activo es la
cepa B. subtilis QST 173 (Navarro et al., 2004), Bioraiz® a base de Bacillus subtillis utilizado
en para el control de R. solani en tomate (Fernández et al., 2007) y otros cuya formulación
está hecha a base de cepas de Bacillus thuringiensis como Dipel® por Valent BioSciences
Corporation, Xentary® por Bayer S.A. y Turilav® por Serif S.A. (Ceballos, 2009).
17
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GENERAL:
Determinar el potencial biocontrolador de aislamientos nativos de Bacilos aerobios
formadores de endosporas (BAFES) obtenidos de cultivo de papa criolla (Solanum
tuberosum Grupo Phureja) contra el hongo fitopatógeno Rhizoctonia solani
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Caracterizar y seleccionar aislamientos rizosféricos de BAFES con alta actividad
biocontroladora in vitro contra diferentes microorganismos fitopatógenos.
Determinar la actividad inhibitoria de metabolitos secundarios y de compuestos
volátiles de los BAFES con mayor potencial antagonista contra Rhizoctonia solani.
Caracterizar e identificar molecularmente los aislamientos rizosféricos de los
BAFES promisorios seleccionados.
Evaluar los aislamientos rizosféricos de BAFES con mayor potencial biocontrolador
de Rhizoctonia solani en papa criolla (Solanum tuberosum Grupo Phureja) bajo
condiciones de invernadero.
18
4. METODOLOGÍA
A continuación se describe la metodología establecida para cumplir cada uno de los
objetivos propuestos:
Objetivo 1: Caracterizar y seleccionar aislamientos rizosféricos de BAFES con alta
actividad biocontroladora in vitro contra diferentes microorganismos
fitopatógenos.
4.1. COLECCIÓN DE BAFES OBTENIDOS DE SUELOS RIZOSFÉRICOS DE PAPA:
En este trabajo se partió de una colección de 64 aislamientos de Bacterias Aeróbicas
Formadoras de Endosporas (BAFES) pertenecientes a la colección de BAFES de papa del
Grupo de Microbiología Agrícola del IBUN, las cuales se encuentran preservadas en medio
Gherna (Anexo 1) a -20°C (colección de trabajo) y -70°C (colección madre). Estos
aislamientos fueron obtenidos previamente en el estudio de Flórez-Zapata y Uribe-Vélez
(2011) a partir de suelo rizosférico de cultivos de papa criolla (Solanum tuberosum Grupo
Phureja) en estado de floración de 7 fincas del departamento de Cundinamarca,
Colombia. En este contexto las cepas están nombradas así: El primer número corresponde
a la finca de donde fueron aisladas (1 a la 7), la P al tipo de cultivo (Papa) y el número final
corresponde a el número de morfotipo o aislamiento de cada finca.
Como cepas control se utilizaron dos (2) cepas de referencia de la colección del Dr.
Kloepper de la Universidad de Aubourn nombradas AP-303 (FZB-42) y AP-188
correspondientes a B. amyloliquefaciens (Koumoutsi et al., 2004)
19
4.2. MICROORGANISMOS FITOPATÓGENOS:
Las cepas 6A5P y 4A14P de Rhizoctonia solani aisladas de cultivo de papa y caracterizadas
como grupo de anastomosis AG3, hacen parte del cepario de la Dra. Celsa García del
Grupo de Investigación en Papa de la Facultad de Agronomía de la Universidad Nacional
de Colombia sede Bogotá. Para los estudios de antagonismo in vitro se empleó de igual
forma, una cepa de Rhizoctonia solani aislada de la rizósfera de arroz, proporcionada
amablemente por la Dra. Olga Lucia Higuera de Fedearroz seccional Meta, dos (2) cepas
de Fusarium oxysporum aisladas de un cultivo de tomate y uno de ñame respectivamente
que hacen parte del cepario del IBUN del Grupo de Investigación en Ñame, las cuales
fueron amablemente proporcionadas por la Bióloga Silvia Bustamante y dos (2) cepas
bacterianas Pectobacterium carotovora y Burkholderia glumae aislada de la rizósfera de
papa y arroz respectivamente y cedidas amablemente por la Dra. Silvia Restrepo de la
Universidad de los Andes y la Dra. Gloria Mosquera del CIAT respectivamente.
Todos los hongos se mantuvieron por repiques en medio PDA (Anexo 1.) a 4°C y las cepas
bacterianas en medio Gherna a -20°C.
4.3. PRUEBAS DE ANTAGONISMO IN VITRO
El tamizaje inicial de las BAFES se llevó a cabo a través de pruebas de antagonismo en el
ensayo dual frente a los siguientes microorganismos fitopatógenos: tres (3) cepas de
Rhizoctonia solani, dos (2) cepas de Fusarium oxysporum, una (1) cepa de Pectobacterium
caratovora y una (1) cepa de Burkholderia glumae.
20
4.3.1. Antagonismo contra hongos:
Para determinar la capacidad inhibitoria del crecimiento fúngico por acción de las cepas
de BAFES, se utilizó la metodología propuesta por Bautista et al., 2007 con algunas
modificaciones: En cajas de PDA se sembró una colonia de los aislamientos bacterianos a
evaluar con 48 horas de crecimiento en dos líneas rectas (distanciadas una de la otra por 4
cm), a continuación se incubó a 30°C durante 48 horas (2 cepas diferentes por caja y 3
repeticiones por BAFE) como control positivo se utilizó la cepa de referencia AP-188.
La inoculación de los hongos fitopatógenos se llevó a cabo colocando en el centro de la
caja una porción de hongo de 0,25 cm² tomada de cultivos de 5 días de crecimiento, lo
anterior, se incubó a 25°C por 7 días, tiempo después del cual se tomó medida del área de
crecimiento del hongo en cm², mediante el programa Rhinoceros® versión 4.0 de Robert
McNeel y Associates 2007.
4.3.2. Antagonismo contra bacterias:
Tanto las bacterias fitopatógenas como los BAFES objetos del estudió se trataron de la
siguiente manera para la obtención de los inóculos de acuerdo al protocolo del
Laboratorio de Microbiología Agrícola del IBUN:
Las bacterias controladoras a evaluar y las bacterias fitopatógenas fueron puestas a
crecer en caldo LB durante 24 h a 30°C con agitación constante a 150 rpm. Luego de la
incubación se prepararon inóculos a 0,2 absorbancias + 0,050 a 600 nm en 5 mL de
solución salina (NaCl al 0,85%). A continuación, se inoculó un volumen de 100 µL de la
suspensión de la bacteria fitopatógena previamente ajustada en una caja de petri con agar
LB y se distribuyó con un hisopo de algodón estéril homogéneamente en toda la caja.
21
Posteriormente se dispusieron equidistantemente cinco (5) círculos de papel filtro
Whatman No 1 de 5 mm previamente esterilizados sobre la caja de petri donde se realizó
la siembra de la cepa fitopatógena y en cada circulo se dispuso 10μL de la suspensión de
BAFES previamente ajustada, para esta prueba se empleó como control positivo la cepa
AP- 303 (FZB-42) y como control negativo solución salina al 0,85%. Las cajas inoculadas se
incubaron a 30°C por 48 h (tres (3) BAFES más dos (2) controles por caja y tres (3)
repeticiones) y al cabo de este tiempo se realizó la medición del halo inhibitorio de cada
BAFE y del control positivo restando el diámetro del papel de filtro.
4.4. SELECCIÓN DE BAFES:
De acuerdo a la información generada en las pruebas de antagonismo in vitro de los BAFES
evaluados, se generó una matriz que permitió seleccionar las cepas con potencial
biocontrolador de hongos fitopatógenos, esto con el objeto de llevar a cabo ensayos más
específicos tendientes a dilucidar los posibles mecanismos de acción y posteriormente los
ensayos bajo condiciones de invernadero.
Objetivo 2: Determinar la actividad inhibitoria de metabolitos secundarios y de
compuestos volátiles de los BAFES con mayor potencial antagonista contra
Rhizoctonia solani.
4.5. EVALUACIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS
Se realizaron las evaluaciones de metabolitos secundarios como pruebas de inhibición de
crecimiento de R. solani cepa 6A5PS de acuerdo a la metodología descrita por Thasana et
al, (2010), con las siguientes modificaciones:
22
4.5.1. Preparación de sobrenadantes:
Se tomó una asada de los aislamientos de los BAFES seleccionados crecidos durante 48
horas y se inocularon en tubos Falcon® de 50 mL con 15 mL de caldo LB, los caldos
inoculados se incubaron a 30°C por 72 horas en agitación constante a 150 rpm. El
sobrenadante se colectó por centrifugación a 8.500 rpm por 20 min a 4°C y luego se filtró
utilizando una membrana estéril marca Millipore® para soluciones acuosas con un tamaño
de poro de 0,22 μm.
4.5.2. Ensayos de inhibición por sobrenadantes:
El sobrenadante filtrado se adicionó a medio de cultivo PDA antes de solidificación (45°C)
a una concentración de 30% (1,5mL) v/v y se dispuso (5 mL) en microplatos de seis (6)
pozos (cinco (5) BAFES por microplato y cuatro (4) repeticiones), luego de solidificación se
sembró una porción del hongo fitopatógeno de 0,25 cm² tomado de un cultivo de cinco
(5) días de crecimiento y se incubó a 25°C por cuatro (4) días, al cabo de este tiempo se
midió el área de crecimiento del hongo en cm² mediante el programa Rhinoceros® versión
4.0 de Robert McNeel y Associates 2007. Como control negativo se sembró el hongo
fitopatógeno en medio PDA + Caldo LB (30% v/v), siguiendo el mismo procedimiento
descrito antes. La inhibición del crecimiento del hongo se expresó como porcentaje (%)
de inhibición utilizando la siguiente formula (Calvo, et al., 2010).
% Inh. = prom área cm² Control negativo – área cm² Tratamiento x 100
prom área cm² Control negativo
23
4.5.3. Ensayo de termo-estabilidad:
Con el objeto de determinar si los compuestos antifúngicos producidos por los BAFES
seleccionados eran termoestables, parte del sobrenadante filtrado se sometió a
tratamiento por calor esterilizando a 121°C por 20 minutos y luego de enfriarse se evaluó
su actividad en los bioensayos de inhibición siguiendo el mismo procedimiento descrito en
el numeral anterior.
4.6. EVALUACIÓN DEL EFECTO ANTAGONISTA DE COMPUESTOS VOLÁTILES
PRODUCIDOS POR LOS BAFES:
Para determinar el efecto inhibidor de crecimiento de los compuestos volátiles producidos
por los aislamientos rizobacterianos, se utilizó el sistema de cajas Petri enfrentadas con
medio de cultivo en ambas cajas, El hongo R. solani cepa 6A5P fue sembrado en medio
PDA, mientras que las BAFES fueron sembradas en agar inductor HCN (Anexo 1), de
acuerdo al protocolo utilizado por Bastidas (2010) y Lara (2007).
En las cajas con el medio PDA se colocó una porción de 0,25 cm² de R. solani crecido
previamente por cinco (5) días y en el otro lado que contiene agar inductor HCN se
sembró masivamente una asada del cultivo bacteriano a evaluar crecido previamente por
48 horas. Posteriormente, las cajas se enfrentaron y sellaron debidamente con parafilm,
luego se incubaron por siete (7) días a 25°C y al cabo de este tiempo se tiempo se midió el
área de crecimiento del hongo en cm² mediante el programa Rhinoceros®, se hicieron tres
(3) repeticiones por BAFE sin repeticiones en el tiempo. La inhibición del crecimiento del
hongo se expresó como porcentaje (%) de inhibición utilizando la fórmula de % de
inhibición (Calvo et al., 2010); como controles negativos se utilizaron los siguientes
sistemas: R. solani frente a R. solani y R. solani enfrentado a medio inductor HCN sin
inocular.
24
Objetivo 3: Caracterizar e identificar molecularmente los aislamientos rizosféricos
de los BAFES promisorios seleccionados.
4.7. IDENTIFICACIÓN MOLECULAR POR LA REGION DEL GEN DEL 16S:
Con el objeto de hacer la determinación taxonómica de los aislamientos, se llevó a cabo la
caracterización de la secuencia de DNA del gen 16s rDNA de las BAFES seleccionadas. Para
cumplir con dicho propósito se realizó la extracción del DNA bacteriano a cada uno de los
aislamientos seleccionados por el método de ebullición (Ausubel et al., 2003), luego se
realizó la amplificación del gen 16s rRNA por PCR utilizando los primers universales 27F y
1492R de acuerdo al protocolo de Martin-Laurent et al., (2001).
La reacción de PCR se llevó a cabo bajo las siguientes condiciones:
Para un volumen final de 50 μL: 5μL de buffer PCR 10X, 1,5 μL de MgCl2 50mM, 2μL de
dNTP 20mM, 1μL de cada primer 20μM, 2μL de la muestra de DNA y 0,4μL de Taq
polimerasa (5U/μL). El ciclo de amplificación inicial se llevó a cabo a 94°C por 5 min,
seguida de 30 ciclos de 1 min a 94°C, 45 seg a 55°C, 1 min a 72°C y un ciclo de extensión
final de 5 min a 72°C. Los productos de amplificación del gen 16s rRNA, fueron
secuenciados en MACROGEN Inc., en Seoul, Korea, en los dos sentidos utilizando los
primers universales 27F y 1492R respectivamente.
Posteriormente, las secuencias fueron analizadas utilizando la herramienta BLAST (Basic
Local Alignment Search Tool) del NCBI (National Center for Biotechnology Information)
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRAMS=megaBlast
&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK_LOC=blasthome).
25
Objetivo 4: Evaluar los aislamientos rizosféricos de BAFES con mayor potencial
biocontrolador de Rhizoctonia solani en papa criolla (Solanum tuberosum Grupo
Phureja) bajo condiciones de invernadero.
4.8. ENSAYOS DE POTENCIAL BIOCONTROLADOR BAJO CONDICIONES DE
INVERNADERO:
Los ensayos de invernadero se llevaron a cabo en las instalaciones de la Facultad de
Agronomía y se evaluaron las BAFES seleccionadas empleando suelo inoculado
artificialmente con la cepa 645P de R. solani (proporcionada amablemente por la Dra.
Celsa García) aislada de cultivo de papa.
4.8.1. Preparación de inóculos:
4.8.1.1. BAFES:
Para cada uno de los aislamientos seleccionados se obtuvo un cultivo bacteriano en 15 mL
de caldo LB crecido a 30°C por 96 h el cual fue centrifugado a 8500 rpm por 10 minutos
para separar el pellet celular del sobrenadante, el pellet fue resuspendido en 10 mL de
solución salina estéril al 0,85% y posteriormente se ajustó una dilución del sobrenadante
1:10 con agua destilada estéril a 0,2 abs a 600 nm.
Luego los tubérculos semillas previamente desinfectados (empleando una solución de
alcohol al 70% por 2 min, una solución de hipoclorito de sodio al 0,5% por 8 minutos y
enjuague con abundante agua corriente 5 veces), se inocularon con las suspensiones
bacterianas, por inmersión en un período de 15 minutos con agitaciones repetidas cada 3
minutos a una dosis de 15 mL de la suspensión por tubérculo-semilla de acuerdo al
protocolo de Bastidas 2010, luego se dejaron escurrir por 10 minutos antes de la siembra.
26
4.8.1.2. Rhizoctonia solani:
Para la preparación de los inóculos del fitopatógeno R. solani cepa 6A5P se utilizó un
medio basado en cebada en grano, en frascos de vidrio de 500 mL en donde se
dispusieron 200 g de cebada previamente sumergido en agua corriente por 24 horas y
esterilizado en autoclave a 121°C por dos periodos de 15 minutos. Los frascos de vidrio se
inocularon con 1cm² de micelio de R. solani crecido por cinco (5) días en medio PDA. Los
frascos debidamente tapados fueron incubados a 25°C durante dos (2) semanas hasta
detectar crecimiento micelial alrededor del sustrato según la metodología de Bautista et
al., (2007).
El inóculo de R. solani fue mezclado manualmente con el suelo un (1) día antes de la
siembra de los tubérculos a una concentración de 4 g/ kg de suelo.
4.8.2. Condiciones del ensayo:
Para llevar a cabo los ensayos de biocontrol bajo condiciones de invernadero, se utilizaron
materas de 250 g para los ensayos de evaluación de la enfermedad en su estado inicial a
los 45 días de la siembra. En cada caso la siembra se llevó a cabo con un tubérculo por
matera y con suelo obtenido de la Sabana de Bogotá previamente analizado físico-
químicamente (Anexo 2).
Como tubérculo-semilla se emplearon papas de S. tuberosum Grupo Phureja cultivar
criolla Colombia (COL) con peso entre 10 a 15 gramos. El riego se realizó cada tres (3) días
hasta obtener humedad equivalente a capacidad de campo y se realizó fertilización
química que consistió en aplicar al momento de la siembra únicamente 4 gr de triple 15 a
las materas de 250 gr de acuerdo a las recomendaciones dadas por el ingeniero agrónomo
Carlos Ñústez, y el análisis físico-químico del suelo (Anexo 2) al momento de la siembra.
27
El control positivo de la enfermedad consistió en suelo inoculado con el patógeno sin
adiciones bacterianas, como control negativo se utilizó suelo tratado con Basamid®
(0,16g/kg de suelo) y se utilizó un control químico de tifluzamida principio activo del
Pulsor® en dilución, a una concentración de 0,24g/mL, se tomó 1 ml de esta solución y se
diluyo en 250 ml de agua para la aplicación al momento de la siembra en una proporción
de 4 cmᵌ/kg de suelo, encima de la semilla recién plantada.
Se utilizó un diseño estadístico completamente al azar por tratamiento se establecieron 7
unidades experimentales para el ensayo de evaluación de la enfermedad con una
repetición en el tiempo.
Los resultados obtenidos fueron procesados con el paquete estadístico MINITAB 14,
aplicando estadística básica, análisis de varianza (ANOVA) y la prueba Kruskall Wallis (KW).
4.8.3. Evaluación de la enfermedad causada por R. solani:
En el día 45 después de la siembra se llevó a cabo la evaluación inicial de la enfermedad
causada por R. solani de las plantas sembradas en materas de 250 g. En este caso se hizo
la evaluación en raíces por cada uno de los tratamientos realizando las siguientes
mediciones:
Número de lesiones
Longitud de las lesiones
Longitud de tallo
Longitud de raíces
Peso de tallo
Peso de raíces
28
Finalmente y con el fin de establecer qué tipo de metabolitos estaban siendo producidos
por la cepa más promisoria (4P-03), dados los buenos resultados obtenidos en cuanto a
inhibición del crecimiento in vitro y alta reducción de la enfermedad causada por R. solani
en plantas de papa de criolla bajo condiciones de invernadero, se llevó a cabo un ensayo
de extracción y purificación de metabolitos secundarios de acuerdo a la metodología
establecida por Villegas, (2012), con algunas modificaciones:
4.9. EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE METABOLITOS:
A partir de un crecimiento bacteriano de 24h en agar LB de la cepa 4P-03 se preparó un
preinóculo de 12 h (30ºC, 150 rpm) en un erlenmeyer de 100 mL previamente preparado
con 20 mL de caldo MOLP (Jacques et al., 1999) (Anexo 1). Luego del tiempo de incubación
el caldo crecido fue inoculado en un erlenmeyer de 500 mL con 180 mL de caldo MOLP e
incubado por 4 días (30ºC, 150 rpm). Al cabo del tiempo de incubación, el cultivo celular
se centrifugo a 8.500 rpm por 20 min y el sobrenadante se acidificó con HCl hasta pH 2 y
se mantuvo a 4°C por 12 h (Ohno, et al., 1995), el sobrenadante precipitado se dispuso en
tubos Falcon® de 50 mL y se centrifugaron a 4,500 rpm por 20 minutos. El pellet obtenido
se resuspendió en 5 mL de MeOH al 100% utilizando vortex por 10 min, posteriormente la
suspensión metanólica se filtró en membranas de poliamida de 0,2μm tamaño de poro y
posteriormente se concentró a presión reducida en un rotoevaporador Yamato RE 300
(50°C, -50psig) hasta obtener un residuo sólido que fue resuspendido en 4 mL de agua
destilada y almacenado a 4°C.
El extracto obtenido se fraccionó por medio de extracción en fase sólida (SPE) en una
columna SPE C18 (Baker®, 500mg) a flujo menor de 3 mL/min, acondicionada con 4 mL de
MeOH seguida por 4mL de agua destilada, la muestra de 4 mL se aplicó a la columna y se
eluyeron los compuestos con diferentes gradientes de MeOH-H2O (4mL) (20%, 40%, 60%,
29
80%) y 8mL al 100%, las fracciones metanólicas obtenidas a 80% y 100% fueron
evaporadas a 50°C en un concentrador Staur SBH130D/3, pesadas y almacenadas a 4°C.
4.9.1. Purificación de compuestos activos
Los extractos crudos fueron resuspendidos en 2 mL de MeOH al 100% y posteriormente
filtrados (membrana de poliamida de 0,2μm), la purificación de los metabolitos presentes
en la solución se realizó por cromatografía líquida (HPLC) en fase reversa (Agilent 1200)
utilizando una columna eclipse XDB C18 (de dimensiones 250 x 4,6 mm, y tamaño de poro
5μm), como fase móvil (agua + 0,1% TFA) y (acetonitrilo + 0,1% TFA), con un flujo de
1mL/min y con detección UV a 214 nm. El modo de operación fue en gradiente de
acetonitrilo como se observa en la tabla 3.
Tabla 3. Modo de operación en gradiente de HPLC en fase reversa para análisis 20μL de extracto metanólico a una concentración de 20mg/mL del residuo sólido obtenido
Tiempo Concentración de acetonitrilo + 1,1%TFA
0 a 52 minutos 41%
52 a 65 minutos 70%
65 a 75 minutos 100%
Con el fin de confirmar la actividad de los extractos eluídos a 80% y 100% de MeOH, se
realizó una prueba in vitro que consistió en disponer tres (3) discos de papel filtro
Wathman No.1 de 5mm estériles equidistantemente en una caja de petri con medio PDA,
cada disco de papel fue inoculado con 30μL de los extractos a evaluar, como control
negativo se utilizó MeOH al 100% y como control positivo se dispuso un disco de Agar LB
en donde previamente había crecido la cepa seleccionada objeto de la evaluación por 48
30
horas, posteriormente, se dispuso una porción de hongo de 0,25 cm² previamente
crecido en PDA a 24°C por 5 días en el centro de la caja y el sistema completo se incubo
por 4 días a 24°C, al cabo del tiempo de incubación se midieron los halos de inhibición.
4.9.2. Identificación de compuestos
Finalmente, se utilizó espectrometría de masas para la identificación de los compuestos
con actividad antimicrobiana presentes en los extractos obtenidos por SPE en las
fracciones de 80% y 100% de MeOH de acuerdo a la metodología estandarizada por
Villegas, (2012) para lo cual se utilizó un espectrómetro de masas tipo trampa de iones
con fuente de ionización ESI (Agilent modelo SL serie 6300), los datos fueron obtenidos en
un rango de scan de 50 – 2200 m/z en modo ión positivo.
31
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1. SELECCIÓN DE AISLAMIENTOS RIZOSFÉRICOS BAFES
El principal criterio de selección de los aislamientos de BAFES promisorios para el manejo
de R. solani consistió en la evaluación in vitro de la actividad antagonista contra diferentes
aislamientos de hongos y bacterias considerados como fitopatógenos en diferentes
cultivos. Con el objeto de tener un criterio de selección uniforme se establecieron cuatro
(4) categorías de inhibición del crecimiento de R. solani in vitro, dichas categorías se
muestran en la tabla 4 y figura 3. Como control positivo se empleó la cepa de referencia
AP 188 correspondiente a B. amyloquefaciens descrita previamente (Kloepper et al.
1999).
A partir de los resultados obtenidos en las pruebas de antagonismo in vitro por el ensayo
dual en cajas de petri se elaboró una matriz de datos por categorías de inhibición (Figura 3
y tabla 4) que se muestra en la tabla 5, en donde se observa que al menos 30 aislamientos
mostraron algún nivel de antagonismo en por lo menos uno (1) de los cinco (5)
fitopatógenos evaluados, de estos, se seleccionaron 12 aislamientos teniendo en cuenta
el mayor potencial antagónico mostrado in vitro contra los fitopatógenos del cultivo de la
papa y que corresponden a las siguientes cepas: 2P-01, 4P-03, 4P-07, 6P-01, 6P-03, 6P-07,
6P-10, 7P-04, 7P-07, 7P-08, 7P-09, 7P-10.
Es importante tener en cuenta que la mayor actividad inhibitoria in vitro se registró en los
aislamientos que provienen de cultivos de papa criolla con manejo orgánico (cepas
nombradas con los números 6 y 7) (Flórez-Zapata, 2010; Flórez y Uribe-Vélez, 2011) lo
que sugiere que los sistemas agroecológicos sin fertilización química ni uso de pesticidas
32
favorece la actividad microbiana particularmente aquella relacionada con el control de
fitopatógenos. Esto es consecuente con lo que reporta Altieri, (1999) quien afirma que en
la agricultura sostenible los altos niveles de materia orgánica incrementan el efecto
inhibitorio de antagonistas debido a una microbiota más abundante, diversa y estable
cuyas funciones reguladoras en el suelo, eventualmente disminuyen la incidencia y
severidad de la enfermedad causada por fitopatógenos edáficos, como se observó en
cultivos de aguacate desarrollados en ecosistemas de bosque lluvioso en donde disminuyó
la incidencia de la enfermedad causada por Phytophtora cinnamoni (Cambel 1989.)
Figura 3. Categorías de inhibición en los ensayos de antagonismo in vitro contra hongos. a.) No inhibición,
b.)Limitación, c.)Inhibición y d.)Antagonismo
Tabla 4. Categorías de inhibición en los ensayos de antagonismo in vitro
Valoración Símbolo Descripción
No inhibición ― Sin presencia de halo inhibitorio
Limitación + Crecimiento del patógeno hasta la estría del BAFE
Inhibición ++ Área de inhibición hasta 9,5 cm²
Antagonismo +++ Área de inhibición mayor a 9,51 cm²
33
Tabla 5: Resultado de las pruebas de antagonismo in vitro de los 64 aislamientos bacterianos BAFES contra cinco (5) fitopatógenos, Rs (R. solani), Fo (F. oxysporum), Bg (B. glumae) y Pc (P. caratovora)
BAFES→ 1P-01
1P-02
1P-03
1P-04
1P-05
1P-06
1P-07
1P-08
1P-09
2P-01
2P-02
2P-03
2P-04
2P-05
2P-06
2P-07
2P-08
3P-01
3P-02
3P-03
3P-04
3P-05
3P-06
3P-07
3P-08
3P-09
4P-01
4P-02
4P-03
4P-04
4P-05
4P-06
4P-07
4P-08
↓Fitopatógenos
Rs 4A14P - - - - - - - - - ++ 4,63
- - - - - + - - - - - - - - - - - - +++ 19,42
- - - + +
Rs 6A5P - - - - - - - - - ++ 6,23
- - - - - - - - - - - - - - - - - - +++ 14,04
- - - + +
Fo Tomate - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - +++ 13,80
- - - + +
Fo Ñame - - + - - - - - - ++ 5,67
- - - - - - + - - - - ++ 3,89
- - + - - - +++ 16,77
- - + + +
Rs Arroz - - - - - - - - - ++ 5,53
- - - - - - ++ 5,34
- - - - - - - - - - - +++ 15,04
- - - ++ 6,5
++ 4,3
Bg Arroz - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - +++ - - - - -
Pc Papa - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
BAFES→ 5P-01
5P-02
5P-03
5P-04
5P-05
5P-06
5P-07
5P-08
5P-09
5P-10
6P-01
6P-02
6P-03
6P-04
6P-05
6P-06
6P-07
6P-08
6P-09
6P-10
7P-01
7P-02
7P-03
7P-04
7P-05
7P-06
7P-07
7P-08
7P-09
7P-10
AP-188
↓Fitopatógenos
Rs 4A14P - - - - - - - - - - + - +++ 13,71
- - ++ 4,20
++ 3,81
- - +++ 12,28
- - + +++ 12,93
- - ++ 5,41
++ 6,34
++ 7,55
++ 6,27
+++ 15,85
Rs 6A5P - - + - - - - - - - + - +++ 10,05
- - ++ 6,81
++ 5,33
- - +++ 10,48
- - + +++ 11,40
- - ++ 6,51
++ 4,22
+++ 11,26
++ 8,09
+++ 13,66
Fo Tomate - - - - - - - - - - + + +++ 10,48
+ - - ++ 7,55
- - +++ 14,47
++ 5,99
- + +++ 10,17
+ + ++ 4,60
++ 4,17
++ 5,97
++ 6,23
+++ 14,03
Fo Ñame - + - - - - - - - - + - +++ 12,60
+ - - - + - + - - + +++ 15,47
+ + - + ++ 6,93
++ 4,27
+++ 17,46
Rs Arroz - - - - - - - - - - + - + - - - + + - + - - - + + + ++ 4,84
++ 4,13
+ ++ 4,13
+++ 16,63
Bg Arroz - - - - - - - - - + - - - - - - ++ - - - - - - - - - - - - - +++
Pc Papa - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Convenciones: ― Sin presencia de halo inhibitorio, + Crecimiento del patógeno hasta la estría del BAFE, ++Área de inhibición hasta 9,5 cm² y +++ Área de inhibición mayor a 9,51 cm²
34
5.2. MECANISMOS DE ACCIÓN
5.2.1. EFECTO ANTAGÓNISTA DE METABOLITOS SECUNDARIOS SOBRE EL
CRECIMIENTO DE Rhizoctonia solani in vitro
Para la siguiente fase de este trabajo se evaluaron los 12 aislamientos seleccionados por
presentar alto potencial biocontrolador de fitopatógenos de la papa in vitro así: La
evaluación de la actividad biocontroladora de metabolitos secundarios presentes en el
sobrenadante. Esta actividad fue realizada en platos de cultivo de seis (6) pozos
mostrando alta inhibición del crecimiento de R. solani in vitro por las 12 cepas
seleccionadas (Figura 4 y 5). Además de medir la capacidad antagónica de los
sobrenadantes, se determinó si dicha actividad era termoestable luego de ser sometida a
un ciclo de esterilización a 120 libras de presión por 15 minutos, encontrando que al
menos 8 de los aislamientos producían algún nivel de metabolitos secundarios
termoestables, los cuales permitían mantener al menos un 30% de actividad inhibitoria
del crecimiento. En la figura 4 se muestra la actividad biocontroladora de los
sobrenadantes sin esterilizar y esterilizados de cinco (5) aislamientos, donde se destaca la
cepa 4P-03 que presento una inhibición del 93% del crecimiento de R. solani antes y
después de esterilizar el sobrenadante.
Figura 4. Evaluación de la actividad inhibitoria de R. solani por metabolitos secundarios en el sobrenadante (30% v/v con PDA). a.) Sobrenadante sin esterilizar, b.) Sobrenadante esterilizado.
35
Figura 5. Efecto de la producción de metabolitos secundarios en el sobrenadante (esterilizado y sin esterilizar) sobre el crecimiento de R. solani, AP-188 cepa control. Datos con la misma letra no son significativamente diferentes entre sí de acuerdo a la prueba de Kruskal Wallis (P=0,05). Letras en mayúsculas entre tratamientos esterilizados y letras en minúsculas entre tratamientos sin esterilizar. Las barras corresponden a la desviación estándar.
Siete (7) aislamientos bacterianos incluyendo el control (cepa AP-188) mostraron una
inhibición por encima del 80% del crecimiento micelial del hongo, destacando a las cepas
6P-10, 7P-04, 4P-03 y 6P-03 (Figura 5) que mantuvieron su actividad inhibitoria aun
después de someter el sobrenadante a altas temperaturas, demostrando que los
metabolitos presentes en estos aislamientos con acción inhibitoria contra R. solani son
termo resistentes. Esto sugiere que podrían tratarse de compuestos lipopeptídicos como
iturinas, surfactinas y fengicinas que resisten altas temperatura y tienen acción
antibiótica y antifúngica (Ongena et al. 2008). Resultados similares han sido obtenidos
por Ceballos, (2009) y Ceballos et al. (2012) quienes registraron― inhibición del
crecimiento de Mycosphaerella fijiensis cercano al 85% por efecto del sobrenadante de
aislamientos nativos de Bacillus sp. Así mismo Thasana et al., (2010) empleando
aislamientos de B. subtilis vs. Colletotrichum gloeosporioides y vs. Sclerotium rolfsii
mostraron porcentajes de inhibición del crecimiento de los hongos por encima del 80%,
comprobando además la presencia de iturinas como el principal metabolito con actividad
antifúngica.
36
Otros estudios han demostrado que la actividad inhibitoria del crecimiento de hongos
fitopatógenos in vitro por especies de Bacilllus sp está dada por la producción de
lipopéptidos (Alvarez et al. 2012, Leelasuphakul et al. 2008, Romero et al. 2007). Incluso
contra R. solani en el trabajo de Yu et al., (2002) se observó inhibición bajo condiciones in
vitro por efecto de Iturinas presentes en el sobrenadante de B. amylolyquefaciens, lo
anterior sugiere la producción de lipopéptidos como principal mecanismo de acción de
Bacillus sp. en el control de hongos filamentosos (Ongena y Jacques, 2008).
5.2.2. EFECTO ANTAGONISTA DE COMPUESTOS VOLÁTILES SOBRE EL
CRECIMIENTO DE Rhizoctonia solani in vitro
En la figura 6 se observa la inhibición del crecimiento micelial de R. solani por efecto de
compuestos volátiles producidos por la cepa 4P-03; En general los resultados de
producción de compuestos volátiles con actividad sobre R. solani (Figura 7), mostraron
que las 12 cepas evaluadas restringieron en un alto porcentaje el crecimiento del hongo
(por encima del 85%) siendo la cepa 7P-07, la única que mostro inhibición por debajo del
80%.
Figura 6. Efecto de compuestos volátiles producidos por la cepa 4P-03 sobre el crecimiento de R. solani.
37
Los tratamientos control que se realizaron enfrentando R. solani contra el mismo y R.
solani contra medio inductor sin inocular, no restringieron en lo absoluto el crecimiento
de R. solani, indicando que este hongo no produce compuestos volátiles con acción
inhibitoria y no existe inhibición debido a la concentración de CO2 como producto de la
respiración.
Figura 7. Efecto de la producción de compuestos volátiles sobre el crecimiento de R. solani. AP-188 cepa control. Control R-R (Rs frente a Rs), Control R-M (Rs frente a medio HCN). Datos con asteriscos son significativamente diferentes entre sí de acuerdo a la prueba de Kruskal Wallis (P=0,05). Las barras corresponden a la desviación estándar.
Estudios similares de especies de Bacillus sp. han demostrado la producción de
compuestos volátiles con actividad inhibitoria por encima del 80% de hongos tales como
R. solani (Kai et al. 2007; Liu, et al. 2008), Sclerotinia sclerotiorum, Botrytis cinerea y F.
oxysporum, por otro lado Arrebola et al., (2010) encontraron que la mayoría de
compuestos volátiles producidos por cepas de B. subtillis y B. amyloliquefaciens con
actividad antifúngica corresponden a cetonas y ácido cianhídrico, sin embargo, otros
compuestos volátiles producidos por especies de Bacillus como el 2,3-butanediol tienen
efecto de promoción de crecimiento vegetal en plantas como Arabidopsis thaliana
(Vespermann et al. 2007).
38
Tabla 6. Identificación molecular a partir de la región del gen 16S de las 12 cepas seleccionadas
BAFE Número de acceso del mejor match
Género Especie presuntiva
% Similitud Referencia
2P-01 KC248215.1 Bacillus cereus 100% http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KC248215.1
4P-03 KC150029.1 Bacillus amyloliquefaciens 100% http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ KC150029.1
4P-07 KC248215.1 Bacillus cereus 100% http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KC248215.1
6P-01 NR_036880.1 Bacillus mycoides 100% http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NR_036880.1
6P-03 NR_027552.1 Bacillus subtilis 100% http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NR_027552.1
6P-07 JX847116.1 Bacillus pumilus 100% http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ JX847116.1
6P-10 NR_027552.1 Bacillus subtilis 99% http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NR_027552.1
7P-04 KC150029.1 Bacillus amyloliquefaciens 100% http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ KC150029.1
7P-07 NR_043401.1 Bacillus megaterium 99% http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NR_043401.1
7P-08 KC146707.1 Bacillus subtilis 100% http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ KC146707.1
7P-09 JQ283972.1 Bacillus pumilus 100% http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ JQ283972.1
7P-10 KC146707.1 Bacillus subtilis 100% http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ KC146707.1
39
Por lo anterior, estos resultados sugieren que la producción de compuestos volátiles
hacen parte de los mecanismos de control del hongo in vitro por parte de la colección de
BAFES analizada en este estudio.
5.3. IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LOS 12 AISLAMIENTOS
SELECCIONADOS
La identificación molecular de los 12 aislamientos seleccionados (tabla 6) permitió
confirmar que el 100% de los aislamientos pertenecen al género Bacillus, representadas
en las siguientes especies: B. cereus (2 aislamientos), B. amyloliquefaciens (2
aislamientos), B. pumilus (2 aislamientos) y B. megaterium (1 aislamiento), B. mycoides
(1 aislamiento) y B. subtilis (4 aislamientos).
5.4. EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD BIOCONTROLADORA DE LOS 12
AISLAMIENTOS BACTERIANOS BAFES CONTRA R. solani EN PAPA
CRIOLLA BAJO CONDICIONES DE INVERNADERO.
A continuación se presentan los resultados de los ensayos bajo condiciones de
invernadero para evaluar el control de la enfermedad causada por R. solani a los 45 días
después de la siembra y en producción a los 4 meses.
5.4.1. INÓCULOS BACTERIANOS
Se realizaron conteos por el método de dilución seriada a todas las suspensiones celulares
de los 12 aislamientos seleccionados, las cuales fueron previamente ajustadas a 0,2 abs a
600 nm de longitud (entre 10⁷ y 10⁸).
40
Tabla 7. Reconteos bacterianos de suspensiones y tubérculos
BAFES Suspensión bacteriana (0,2 abs a 600nm)
UFC/mL
Inoculación de tubérculos (16,5 cm² área aprox.) UFC/cm²
2P-01 7,0 X 10⁷ 3,3 X 10⁶
4P-03 1,2 X 10⁸ 7,1 X 10⁶
4P-07 1,6 X 10⁷ 4,4 X 10⁶
6P-01 1,6 X 10⁸ 2,4 X 10⁷
6P-03 1,3 X 10⁸ 5,3 X 10⁶
6P-07 1,6 X 10⁸ 1,0 X 10⁷
6P-10 2,4 X 10⁷ 3,2 X 10⁶
7P-04 2,4 X 10⁷ 4,1 X 10⁶
7P-07 6,5 X 10⁷ 2,8 X 10⁶
7P-08 1,3 X 10⁷ 3,9 X 10⁶
7P-09 1,3 X 10⁸ 9,0 X 10⁶
7P-10 2,2 X 10⁷ 3,5 X 10⁶
Así mismo con el objeto de conocer la concentración final en términos de UFC en los
tubérculos, se determinó la concentración celular de cada BAFE, en relación al área de
cada tubérculo. En este caso se evaluó un tubérculo en un tubo Falcon® de 50 mL con 10
mL de agua destilada estéril en agitación constante a 150 rpm por 30 minutos al cabo de
los cuales se procedió hacer las diluciones seriadas correspondientes. Los resultados
mostraron que las suspensiones celulares se encontraban entre 107 y 108 UFC y lo más
importante se observaron conteos entre 10⁶ y 10⁷ por tubérculo indicando una buena
adherencia de las BAFES a la superficie de los tubérculos semilla (tabla 7).
5.4.2. EVALUACIÓN INICIAL DE LA ENFERMEDAD A LOS 45 DÍAS DE LA SIEMBRA
Para determinar el efecto de los tratamientos sobre la enfermedad causada por R. solani
se tuvo en cuenta la incidencia de la enfermedad en las plantas causada por el testigo de
enfermedad, la cual correspondió al 100% en todos los tratamientos evaluados (datos no
41
mostrados) indicando que las condiciones empleadas en este ensayo fueron altamente
conducentes del desarrollo de la enfermedad.
En cuanto a promedios de peso seco de raíz para los tratamientos que se encuentran
registrados en la figura 8, se destacan las cepas 4P-03, 4P-07 y 2P-01 con altos valores y
sin diferencias significativas con respecto al control negativo (-) (sin enfermedad). En
especial merece destacar el tratamiento con la cepa 4P-03, cuyas plantas mostraron el
promedio de peso seco de raíz más alto y fue incluso diferente significativamente
comparado con el control químico (semillas tratadas con Pulsor®).
En la figura 9, se observa que el control positivo (+) correspondiente al tratamiento con la
enfermedad (con R. solani), presenta los valores más altos en cuanto a número de
lesiones (16,1 lesiones). Los tratamientos 6P-07, 6P-03, 7P-10 y 7P-09 no mostraron
diferencias significativas en relación al control positivo, contrario a lo observado en los
tratamientos 4P-03, 7P-08, 6P-10 y 2P-01 que mostraron en promedio un número de
lesiones en raíz igual al control químico (tubérculos-semillas tratadas con Pulsor®) con los
valores de síntomas de la enfermedad más bajos (7,2 lesiones en promedio). Es
importante tener en cuenta que en los ensayos bajo invernadero el control negativo (-)
registró los síntomas de la enfermedad aunque en niveles bajos, indicando que no fue
posible erradicar completamente a R. solani del suelo mediante la desinfección con
Bazamid®, sugiriendo una alta persistencia del agente fitopatógeno presente en el suelo
y/o presencia de un nivel de infección basal en los tubérculo-semilla empleados (semilla
certificada).
En cuanto a longitud de lesiones (figura 10) se observa que nuevamente el control (+)
registro los valores más altos en promedio (0,96 cm) con diferencias significativas
comparado con el resto de tratamientos y que los niveles más bajos registrados
42
corresponden a los aislamientos 7P-04, 7P-07, 2P-01, 4P-03 y 6P-10 iguales
estadísticamente al control químico (0,42 cm).
Figura 8. Efecto de R. solani sobre el peso seco de raíces de plantas de papa criolla a los 45 días. Datos con
la misma letra no son significativamente diferentes entre sí de acuerdo a ANOVA (P<0,05).Control (+) con
R. solani, control (-) sin R. solani, Control químico (con Pulsor®), las barras de error corresponden a la
desviación estándar, CV% (27,1).
43
Figura 9. Número de lesiones por raíz causadas por R. solani en papa criolla a los 45 días. Datos con la
misma letra no son significativamente diferentes entre sí de acuerdo a ANOVA (P<0,05). Control (+) con R.
solani, control (-) sin R. solani, Control químico (con Pulsor®), las barras de error corresponden a la
desviación estándar, CV% (21,7).
Con los datos anteriormente presentados de peso seco de raíces, número y longitud de
lesiones se planteó la siguiente ecuación como indicador del porcentaje de severidad de
la enfermedad:
% de severidad = Promedio de P.H. de Tratamientos x 100 Promedio de P.H. Control positivo
P.H. (Proporción lesiones) corresponde a: No. de lesiones x longitud de lesiones (cm) / peso seco de raíces
(g)
Figura 10. Promedio de la longitud del total de lesiones medidas por raíz causadas por R. solani de papa
criolla a los 45 días. Datos con la misma letra no son significativamente diferentes entre sí de acuerdo a
ANOVA (P<0,05). Control (+) con R. solani, control (-) sin R. solani, Control químico (con Pulsor®), las barras
de error corresponden a la desviación estándar, CV% (28,1).
En el porcentaje de severidad que se estimó teniendo en cuenta las mediciones del
número y longitud lesiones y el peso seco de raíz, pudimos observar notoriamente el
efecto de los tratamientos bacterianos en la reducción de la severidad de la enfermedad
44
en relación a la superficie con lesiones causada por R. solani comparada con el control (+);
en la figura 11 podemos observar que los aislamientos bacterianos que mejor controlaron
la enfermedad corresponden a 4P-03, 2P-01 y 4P-07 mostrando niveles de control iguales
y/o mejores que el control químico, seguido por las cepas 7P-04 y 6P-10 con una
reducción de la severidad de la enfermedad por encima del 78% comparado con el
control (+).
Figura 11. Porcentaje de severidad de la enfermedad causada por R. solani en plantas de papa criolla a los
45 días. Datos con la misma letra no son significativamente diferentes entre sí de acuerdo a ANOVA
(P<0,05). Control (+) con R. solani, control (-) sin R. solani, Control químico (con Pulsor®), las barras de error
corresponden a la desviación estándar, CV% (17,2).
Resultados similares en cuanto a reducción de la enfermedad causada por R. solani
mediante el uso de Bacillus sp han sido observados en otros cultivos como tomate con
reducciones cercanas al 60% (Asaka y Shoda, 1996), maíz (48%) (Ugoji y Laing, 2007),
pimientos chile (65%) (Guillén-Cruz et al., 2006), en Pepino (68%) (Huang et al., 2012) y
en papa variedad César (50%) (Hernández-Castillo, et al., 2008); destacando al presente
estudio por evaluar aislamientos nativos de Bacillus sp en plantas de papa criolla variedad
Colombia bajo condiciones de invernadero con resultados positivos.
45
Estos resultados fueron consistentes con una segunda repetición en el tiempo (anexo 4),
por lo que podemos afirmar que los aislamientos 4P-03, 2P-01, 7P-04 y 4P-07 mostraron
los mejores niveles de inhibición de la enfermedad causada por R. solani bajo condiciones
de invernadero.
Tabla 8. Efecto de R. solani sobre parámetros de longitud y peso seco de tallo y raíces de plantas de papa criolla a los 45 días de siembra. Control (+) con R. solani, control (-) sin R. solani, Control químico (con Pulsor®), D.E. corresponden a la desviación estándar. Datos con la misma letra no son significativamente diferentes entre sí de acuerdo a ANOVA (P<0,05).
Tratamiento Longitud de tallo (cm)
D.E. Longitud de raíces (cm)
D.E. Peso seco tallo (g)
D.E. Peso seco raíces (g)
D.E.
2P-01 17,00 bc 1,77 17,28 ab 2,95 1,06 ab 0,22 0,62 abc 0,15
4P-03 21,63 a 1,70 19,28 a 2,34 1,10 ab 0,28 0,77 a 0,24
4P-07 18,30 bc 1,41 18,68 a 3,07 0,99 ab 0,23 0,67 abc 0,18
6P-01 14,60 c 1,36 15,72 bc 2,31 0,70 cd 0,16 0,44 cd 0,12
6P-03 10,76 e 0,92 16,98 ab 3,15 0,54 ef 0,16 0,29 ef 0,09
6P-07 12,00 de 1,47 16,73 ab 2,56 0,63 cde 0,12 0,41 cd 0,18
6P-10 13,36 bcd 3,07 16,36 b 2,67 0,62 cde 0,25 0,39 de 0,14
7P-04 17,46 b 1,55 19,48 a 2,88 0,83 bc 0,18 0,60 bc 0,10
7P-07 16,08 bc 2,20 19,75 a 2,25 0,71 bcd 0,19 0,61 abc 0,14
7P-08 10,44 e 2,24 16,54 ab 2,13 0,61 cde 0,16 0,39 de 0,08
7P-09 12,00 de 2,27 17,25 b 0,99 0,68 bcd 0,21 0,48 cd 0,11
7P-10 13,45 cd 0,67 16,50 b 1,29 0,69 cd 0,12 0,44 cd 0,15
CONTROL QUIMICO
17,25 b 2,40 16,52 b 0,92 0,74 cd 0,24 0,56 bc 0,23
CONTROL (-) 21,79 a 2,12 16,27 b 1,42 1,31 a 0,03 0,83 a 0,08
CONTROL (+) 12,00 de 0,94 16,85 b 1,47 0,61 de 0,10 0,32 ef 0,13
CV% (11,9) (12,4) (23,8) (27,2)
Adicionalmente en la tabla 8 se presentan los datos de longitud y pesos secos de tallo y
raíces; se observa que la presencia de R. solani afectó el desarrollo de las plantas
disminuyendo en promedio de longitud de tallos hasta un 55%, peso de tallos hasta un
46% y en peso de raíz un 38% comparado con el control (-) sin enfermedad; en cuanto a
longitud de raíces no se observaron diferencias marcadas entre los tratamientos,
seguramente porque las condiciones del ensayo (materas de 250g) limitaron el espacio y
no permitió un crecimiento óptimo de las raíces que dejara observar diferencias
46
marcadas (Garzon y Keijzer, 2011), nuevamente la cepas 4P-03, 4P-07, 2P-01 y 7P-04 se
destacan por los altos valores tanto en peso seco de raíces como en longitud y peso seco
de tallo, los cuales estuvieron cercanos a los registrados en control (-) sin enfermedad,
confirmando que su aplicación contrarresto los efectos causados por el hongo
fitopatógeno.
5.5. EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS DE
NATURALEZA LIPOPEPTIDICA
Con el fin de confirmar cuales podrían ser los posibles metabolitos secundarios que se
estaban produciendo en el sobrenadante, que tenían efecto inhibitorio del crecimiento
de R. solani y adicionalmente resistían altas temperaturas, procedimos a extraer y
purificar estos metabolitos de la cepa 4P-03, la cual fue seleccionada por mostrar
consistencia en los ensayos de antagonismo tanto in vitro como bajo condiciones de
invernadero.
Figura 12. Evaluación de la actividad de los extractos de SPE eluídos a 80% y 100% de MeOH de la cepa 4P-03 en contra de R. solani
47
Siguiendo el procedimiento descrito en la metodología se obtuvieron las fracciones
metanólicas de 80 y 100% en las cuales se obtuvo un rendimiento de residuo sólido de
20mg/mL. Una vez obtenida la fracción se confirmó la actividad antagonista de las
fracciones obtenidas, en la prueba in vitro, los halos de inhibición producidos se observan
en la figura 12. El halo del extracto a 80% fue de 0,9 cm, a 100% de 0,2 cm y como
control se empleó la cepa sembrada directamente sobre el medio, mostrando un halo de
inhibición de crecimiento de 1,1 cm.
Los cromatogramas de las extracciones en fases solida a una concentración de 80 y 100%
con MeOH se muestran en la figura 13. En el cromatograma de la extracción a 80% de
MeOH se observan picos de separación desde los 5 minutos a diferencia de lo observado
en el extracto al 100% de MeOH en donde la elución de compuestos mostró picos a partir
del minuto 15, estos resultados fueron similares a los obtenidos por Villegas, (2012),
quien realizó una caracterización detallada de los metabolitos secundarios asociada a
varios aislamientos nativos de Bacillus sp activos contra M. fijensis. En dicho estudio se
observó un patrón similar en la elución de compuestos antimicrobianos, aunque los
valores de los tiempos de retención difirieron levemente (entre 1 y 3 minutos),
comparados con lo aquí presentado, sugiriendo que muy posiblemente se trata de los
mismos tipos de compuestos encontrados por Villegas, (2012) los cuales corresponden
según los picos observados en este estudio a: 1. Iturinas en la fracción eluída con MeOH
al 80% (entre 4 y 7 minutos), 2. fengicinas (entre 10 y 30 minutos) y 3. surfactinas (entre
58 y 66 minutos). En la fracción eluída con MeOH al 100% según los picos encontrados
podría atribuirse a fengicinas (entre 14 y 35 minutos) y surfactinas (a partir del minuto 56
hasta 66).
Otro estudio similar realizado en B. subtillis por Malfanova et al., (2012) confirman esta
tendencia ya que la extracción por precipitación acida y la purificación de compuestos a
48
través de HPLC-RP mostró que las iturinas eluyen primero alrededor del minuto 4 seguido
por las fengicinas a partir del minuto 8 y finalmente las surfactinas a partir del minuto 21,
los tiempos de elución en Malfanova et al., (2012) ocurren antes de los mostrados en este
estudio dado que la operación en gradiente se hizo en un tiempo más corto (26 minutos).
Figura 13. Análisis por HPLC-RP del extracto libre de células de la cepa 4P-03 previamente separado por
extracción en fase solida a: a) 80% de MeOH y b) 100% de metanol
5.5.1. Identificación de compuestos antimicrobianos
Con el fin de confirmar a qué tipo de compuestos corresponden a los picos encontrados
en las eluciones de 80% y 100% de metanol se realizó el espectro de masas de los
extractos metanólicos de la cepa 4P-03 que se observan en la siguiente figura (Figura 14).
El espectro de masas de los dos (2) extractos de SPE a 80% (Figura 14. a) y a 100% (Figura
14.b) mostraron dos grupos de picos, uno alrededor de los 1000 m/z y otro alrededor de
1400 a 1500 m/z; las señales de picos moleculares que se observan a m/z 1017, 1031,
1044, 1059 de mayor intensidad (en mayor cantidad) corresponden a moléculas
sodionadas [M+Na]⁺ de peso molecular 993, 1007, 1021 y 1035 Da respectivamente, lo
49
que sugiere que se trata de moléculas homologas que se diferencian entre sí por 14 Da lo
que equivale a un CH2. Esto concuerda con los pesos moleculares de surfactinas C-12, C-
13, C-14 y C-15 respectivamente, luego se observan las señales de m/z 1436, 1464, 1478,
1492 y 1506 de menor intensidad que corresponden a moléculas protonadas [M+H]⁺ de
peso molecular 1435, 1463, 1477, 1491 y 1505, que concuerdan respectivamente con el
peso de las fengicinas A C-14, C-16, C-17, fengicina B C-16 y C-17 de acuerdo a lo
encontrado por Ongena y Jacques (2008), Pecci et al. (2010), Villegas (2012) y Malfanova
et al. (2012). El espectro de masas no mostró ningún pico molecular que pudiera ser
atribuido a Iturinas, por lo que se sugiere que la cepa 4P-03 produce surfactinas (en
mayor proporción) y fengicinas A y B que tienen actividad inhibitoria del crecimiento de
R. solani.
Figura 14. Espectro de masas de los extractos metanólicos obtenidos por SPE a.) 80% de MeOH y b.) 100% de MeOH de la cepa 4P-03.
50
En contraste a la cepa 4P-03 se llevó a cabo la extracción y purificación de metabolitos
secundarios de la cepa 2P-01 (Anexo 3), la cual mostró buenos resultados en el control de
la enfermedad causada por R. solani bajo condiciones de invernadero, pero que no
inhibió en alta medida el crecimiento de R. solani por metabolitos termostables (solo el
64%). Los resultados indicaron que esta cepa no produce significativamente compuestos
de tipo lipopeptídico ya que únicamente se detectaron surfactinas en baja cantidad según
el corrido de HPLC y en el espectro de masas para el extracto eluído a 100% de MeOH.
Adicionalmente los rendimientos en la extracción del residuo sólido fue de 1mg/mL para
la cepa 2P-01 significativamente menor al de la cepa 4P-03 cuyo rendimiento fue de
20mg/mL tal como se mencionó arriba.
51
6. DISCUSIÓN GENERAL
El diseño metodológico empleado en el presente estudio permitió caracterizar 64
aislamientos bacterianos, obtenidos de la rizósfera de papa criolla en términos del
potencial antagonista in vitro contra cinco (5) agentes fitopatógenos. Esto se realizó con
el fin de seleccionar un grupo de (12) cepas que presentaran el mayor potencial
biocontrolador para ser evaluados en ensayos posteriores que permitieran dilucidar
algunos mecanismos de acción relacionados con la producción de metabolitos
secundarios y compuestos volátiles. Finalmente los mejores aislamientos fueron
evaluados en términos de su potencial biocontrolador contra R. solani en un cultivo de
papa criolla bajo condiciones de invernadero.
Los ensayos en plantas de papa criolla bajo condiciones de invernadero, permitieron
determinar la capacidad de los 12 aislamientos para disminuir la severidad de la
enfermedad causada por R. solani. En este contexto merece resaltar que la fuente y
concentración de inóculo del hongo fitopatógeno utilizado en el presente estudio, generó
altos niveles de infección, que se observaron cómo lesiones necróticas en raíces a los 45
días. Bajo estas condiciones las cepas 4P-03, 7P-04 (B. amyloliquefaciens), 2P-01 y 4P-07
(B. cereus) disminuyeron entre el 78 y 90% la severidad de la enfermedad en el ensayo
de síntomas a los 45 días.
52
Figura 15. Análisis filogenético resumen de los 12 aislamientos de Bacillus sp evaluados en para el control de R. solani in vitro y bajo condiciones de invernadero.
53
En la figura 15 se presenta un análisis filogenético resumen de los 12 aislamientos con las
características evaluadas en el presente trabajo, en el mismo se observan dos grandes
clados que se dividen en 2 subgrupos y que se caracterizan principalmente por la
composición de especies que lo conforman.
Inicialmente un gran subgrupo conformado por 6 aislamientos de las especies B. subtillis y
B. amyloliquefaciens que corresponden a 4P-03, 6P-03, 6P-10, 7P-04, 7P-08 y 7P-10 que
en su mayoría fueron aislados de suelo rizosférico de cultivos de papa con manejo
orgánico a excepción de la cepa 4P-03 (B. amyloliquefaciens) y comparten características
como alta producción de compuestos volátiles y de metabolitos termoestables que
inhiben el crecimiento de R. solani in vitro en más de 60% y reducen la enfermedad
causada por el hongo en plantas de papa criolla bajo condiciones de invernadero entre el
40 y 80% a excepción de la cepa 4P-03 que generó una reducción por encima del 80%.
Luego un grupo conformado por las cepas 7P-09 y 6P-07 pertenecientes a la especie B.
pumilus, estos aislamientos fueron aisladas de cultivos con manejo orgánico y comparten
características de producción de compuestos volátiles que inhiben el crecimiento de R.
solani en más del 50%, producción de metabolitos secundarios termolábiles y reducción
de la enfermedad causada por el hongo entre un 40 a 80%. Le sigue el aislamiento 7P-07
en un único subgrupo la cual corresponde a la especie B. megaterium como característica
particular esta cepa fue la única en producir compuestos volátiles con inhibición del
crecimiento de R. solani in vitro por debajo del 50%, así como metabolitos secundarios
termolábiles y reducción del enfermedad de la Rizoctoniasis entre el 40 y 80%.
Finalmente el cuarto subgrupo donde se encuentran las cepas 2P-01, 4P-07 (B. cereus) y
6P-01 a (B. mycoides), estos aislamientos al interior del subgrupo se encuentran
separados por especie de acuerdo a sus características particulares. Es así como la cepa
54
6P-01 proviene de un cultivo de papa con manejo orgánico, produce metabolitos
secundarios termolábiles y reduce la enfermedad causada por R. solani en papa criolla
entre un 40 y 80%. Por otra parte las cepas de B. cereus fueron aisladas de cultivos con
manejo tradicional, producen metabolitos secundarios que inhiben a R. solani in vitro
hasta en un 60% y bajo condiciones de invernadero reducen la enfermedad causada por
el hongo en plantas de papa por encima del 80%.
De lo anterior se destaca a los aislamientos provenientes de cultivos con manejo
tradicional correspondiente a B. amyloliquefaciens y B. cereus por su mejor desempeño
en la reducción de la rizoctoniasis bajo condiciones de invernadero y a las especies B.
subtilis y B. amyloliquefaciens por producir metabolitos secundarios termoresistentes que
inhiben el crecimiento de R. solani in vitro por encima del 60%.
Los bajos niveles de inhibición mediado por metabolitos secundarios sugieren que las
cepas 2P-01, 4P-07 y 7P-08 ejercieron control sobre la enfermedad causada por R. solani
por otros mecanismos adicionales a la producción de metabolitos secundarios
termoestables. En particular merece destacar la cepa 2P-01, la cual no produce
significativamente metabolitos de tipo lipopeptídico (surfactinas) (confirmado por los
ensayos de HPLC y espectrometría de masa. Estas observaciones se han manifestado en
especies de Bacillus sp. que poseen la capacidad de promover crecimiento vegetal a
través de otros mecanismos como inducción de resistencia sistémica en plantas,
mediante la producción de moléculas señal como ácido jasmónico, etileno y compuestos
volátiles como el 2,3 butanoediol, (Kloepper et al. 2004) y otras fitohormonas como
citoquininas (Ortíz-Castro et. al. 2008) y giberelinas (Joo et al. 2004).
La cepa 4P-03 (B. amyloliquefaciens) fue la más consistente en todo el estudio. Los
análisis realizados en términos de la caracterización de los metabolitos secundarios a
55
través de las técnicas de HPLC y espectrometría de masas indicaron que muy
posiblemente la inhibición del crecimiento micelial del hongo in vitro y la enfermedad
causada por R. solani bajo condiciones de invernadero, se debió principalmente a la
producción de metabolitos de tipo lipopeptídico (surfactinas y fengicinas tipo A y B)
producidas por la bacteria y secretados al medio de cultivo.
Por otro lado con respecto a los resultados obtenidos con el control químico que
correspondió a Thifluzamide principio activo del Pulsor®, se observó que hubo una
reducción de la severidad de la enfermedad en los estadios iniciales (45 días) similar a la
obtenida con los aislamientos bacterianos (2P-01, 4P-03, 4P-07 y 7P-04).
En consecuencia, los resultados obtenidos en el presente estudio permiten resaltar la
importancia del uso de agentes biocontroladores de tipo bacterias formadoras de
endosporas del genero Bacillus sp con actividad controladora de R. solani en plantas de
S. tuberosum Grupo Phureja. Lo anterior representa una estrategia que puede sumarse a
las prácticas de manejo actuales para el control de la enfermedad causada por R. solani
en el cultivo de la papa que incluyen entre otros la utilización de semilla libre de la
enfermedad, rotación de cultivos, buen manejo de los residuos de cosecha y manejo del
tiempo de corte de rama y cosecha (Tsor, 2010).
56
7. CONCLUSIONES
Las 12 cepas de Bacillus sp. seleccionadas mostraron actividad antagonista in vitro
contra R. solani atribuida a la producción de metabolitos secundarios, de los
cuales cuatro (4) cepas (6P-10, 7P-04, 4P-03 y 6P-03) correspondientes a B. subtilis
y B. amyloliquefaciens, presentaron compuestos termoestables sugiriendo que
son de tipo lipopeptídico con acción anfifúngica (como iturinas, surfactinas y
fengicinas) y a la producción de compuestos volátiles indicando que estas dos (2)
características deben hacer parte de los mecanismos de acción de estos
aislamientos para el control de R. solani.
Bajo condiciones de invernadero cuatro (4) aislamientos (2P-01, 4P-03, 4P-07 y 7P-
04), mostraron alto potencial biocontrolador del fitopatógeno R. solani en
términos de la disminución entre un 68 y 89%, de la severidad de la enfermedad
medida a los 45 días, siendo estos valores iguales o mejores que los valores
registrados por el control químico.
La cepa 4P-03 (B. amyloliquefaciens) resaltó por su consistencia en cuanto a
inhibición del crecimiento micelial de R. solani y reducción de los síntomas de la
enfermedad en plantas de papa criolla en los ensayos in vitro e invernadero
desarrollados en el presente estudio. Además, los resultados de HPLC,
espectrometría de masas y evaluación de la actividad antagónica de los
sobrenadantes indican que dicha actividad puede ser atribuida a la producción de
surfactinas y fengicinas tipo A y B como principal mecanismo de acción. Por lo
anterior, la cepa 4P-03 se sugiere como una propuesta alternativa y/o adicional
57
para ser incluida en el manejo actual de la enfermedad causada por R. solani en el
cultivo de la papa.
La metodología empleada en el presente estudio para evaluar el potencial
biocontrolador de las cepas seleccionadas bajo condiciones de invernadero en
cuanto a fuente de inóculo del fitópatógeno e inoculación de los tubérculos-
semilla con las suspensiones bacterianas permitió observar la actividad inhibitoria
de los aislamientos más promisorios con resultados consistentes y reproducibles
en el tiempo de gran utilidad para ensayos futuros.
58
8. RECOMENDACIONES
Es necesario continuar con ensayos en papas bajo condiciones de invernadero y de
campo hasta producción empleando los 12 BAFES más promisorios utilizando diferentes
concentraciones tanto del inóculo de R. solani como de los aislamientos bacterianos con
el fin de precisar bajo qué condiciones su desempeño en el control de R. solani es óptimo.
Se recomienda hacer una caracterización molecular detallada de los genes relacionados
con los metabolitos secundarios de tipo lipopeptídico en particular de la cepa 4P-03 con
el fin de determinar molecularmente si se producen otro tipo de lipopéptidos.
Sería importante dilucidar otros posibles mecanismos de acción relacionados con
promoción de crecimiento vegetal como la producción de fitohormonas tipo auxinas,
citoquininas y compuestos volátiles como etileno y 2,3 butanoediol.
Se hace importante determinar e identificar el tipo de compuestos volátiles que están
siendo producidos por los BAFES más promisorios y que tiene acción inhibitoria sobre el
crecimiento de R. solani in vitro.
Uno de los pasos a seguir son las evaluaciones de compatibilidad de los aislamientos
bacterianos con mayor potencial biocontrolador de R. solani con otros microorganismos
con acción biocontroladora como son las cepas de Pseudomonas sp. que hacen parte de
la colección del Grupo de Microbiología Agrícola con acción biocontroladora contra R.
solani y Spongospora subterránea y otros como cepas de T. hamatum y T. koningiopsis
que se consiguen comercialmente en el mercado; de igual manera se hace imprescindible
realizar ensayos de compatibilidad con fungicidas químicos con miras a integrar junto con
el manejo químico tradicional el uso de biocontroladores que permitan reducir las
cantidades de fungicidas que se aplican actualmente.
59
Finalmente es necesario dar comienzo al desarrollo de medios óptimos de producción
para la formulación de los aislamientos que mejor se comporten en condiciones de
campo con el fin de escalar un proceso de producción comercial que de cómo resultado
un formulado que optimice y preserve la bioactividad de los microorganismos y facilite la
aplicación en los tubérculos para el control de R. solani en el cultivo de la papa.
60
9. BIBLIOGRAFÍA
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71
10. ANEXOS
ANEXO 1. COMPOSICIÓN MEDIOS DE CULTIVO. Agar Luria-Betani (LB)
Reactivo Cantidad (g L-1)
Triptona 10
Cloruro de sodio 10
Agar bacteriológico 10
Extracto de levadura 5
Medio Gherna
Reactivo Cantidad por 100mL
Tripticasa de soya 3,13g
Glucosa 0,52g
Leche en polvo descremada 2,07g
Glicerol al 87% 4,15mL
Medio Inductor de HCN
Reactivo Cantidad (g L-1)
Tripticasa de soya 30
Glicina 4,4
Agar bacteriológico 15
Agar Papa Dextrosa (PDA)
Reactivo Cantidad (g L-1)
Agar PDA 39,1
Medio Tripticasa de Soya (TSA)
Reactivo Cantidad (g L-1)
Digerido péptico de soya 3
Glucosa 2,5
Digerido pancreático de caseína 17
Fosfato dipotásico de hidrógeno 2,5
Cloruro de sodio 5
72
Medio de cultivo MOLP :Medium Optimal for Lipopéptide Production
Reactivo Cantidad (g L-1)
Peptona 30
Sacarosa 20
KH2PO4 1,9
extracto de levadura 7
solución de elementos traza* 1mL/L
solución de Mn-Mg** 9mL/L
*La solución de elementos traza compuesta por: CuSO4, 1 mg/L; FeCL36H2O, 5 mg/L;
Na2MoO42H2O, 4 mg/L; KI, 2 mg/L; ZnSO47H2O, 0,14 mg/L; H3BO4, 10 mg/L, Ácido cítrico, 10 g/L.
** La solución de Mn-Mg por: MnSO4H2O, 0,4 g/L, MgSO4, 50 g/L.
73
ANEXO 2. RESULTADOS DE ANÁLISIS DEL SUELO
No. de Laboratorio
Fecha de Recepción 2012 3
28
Fecha de Resultado 2012 4 3
Cód. interno de Lab.: 43679 Arenoso A
TEXTURA BOUYOUCOS -
Arenoso Franco A F
Arena - % Franco Arenoso F A
Limo - % Franco F
Arcilla - % Franco Limoso F L
TEXTURA AL TACTO F Ar A
Franco Arcilloso F Ar
Franco Arcilloso Limoso F Ar L
CONDUCTIVIDAD ELÉCTRICA 0,2 dS/m Franco Arcillo Arenoso F Ar A
DENSIDAD APARENTE - g/cm3 Arcilloso Ar
CAP. INTERCAMBIO CATIONICO EFECTIVA 2,1684 meq/100g Arcillo Arenoso Ar A
Arcillo Limoso Ar L
PARAMETRO VALOR UNIDAD
INTERPRETACION
RANGO ADECUADO RESULTADOS
pH 5,51 - - - - - -
MATERIA ORGA. 8,66 % - - - - -
NITROGENO (N) 0,43 % 0,09 0,17 ALTO
FOSFORO(P) 19,60 ppm 15,00 25,00 MEDIO
POTASIO (K) 0,90 meq/100g 0,20 0,30 ALTO
MAGNESIO (Mg) - meq/100g 4,00 6,00 #N/A
CALCIO (Ca) 1,27 meq/100g 5,00 10,00 BAJO
ALUMINIO (Al) - meq/100g 0,00 1,00 #N/A
SODIO (Na) - meq/100g 0,00 1,00 #N/A
AZUFRE (S) - ppm 5,00 10,00 #N/A
HIERRO (Fe) - ppm 20,00 50,00 #N/A
BORO (B) - ppm 0,60 1,00 #N/A
COBRE (Cu) - ppm 1,50 3,00 #N/A
MANGANESO (Mn) - ppm 15,00 20,00 #N/A
ZINC (Zn) - ppm 1,50 3,50 #N/A
RELACIONES CATIONICAS
Ca/Mg - 3,00 6,00 #N/A
Ca/K 1,41 15,00 30,00 BAJO
Mg/K - 10,00 15,00 #N/A
(Ca+Mg)/K - 20,00 40,00 #N/A
% Sat. De Na - 5,00 15,00 #N/A
% Sat. De K - 3,00 4,00 #N/A
% Sat. De Ca - 50,00 60,00 #N/A
% Sat. De Mg - 15,00 20,00 #N/A
% Sat. De Bases - 35,00 50,00 #N/A
74
ANEXO 3. EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE METABOLITOS
PRESENTES EN EL SOBRENADANTE DE LA CEPA 2P-01
a.) Análisis por HPLC-RP del extracto separado por extracción de fase solida (SPE) a 100%
de MeOH de la cepa 2P-01 cuyo rendimiento del residuo sólido fue de 1 mg/mL.
b.) Espectro de masas del extracto a 100% de MeOH obtenido por SPE de la cepa 2P-01
75
ANEXO 4. RESULTADOS DE REPETICIÓN EN EL TIEMPO DE ENSAYO SÍNTOMAS A LOS 45 DÍAS.
Tratamiento No.
Lesiones D.E. Long. Lesiones
(cm) D.E. % de
severidad D.E. Longitud de
tallo (cm) D.E. Longitud de
raíces (cm) D.E. Peso seco
tallo (g) D.E. Peso seco
raíces (g) D.E.
2P-01 9,00 de 2,24 0,38 f 0,04 13,99 g 2,99 17,00 bc 1,77 17,28 ab 2,95 1,06 ab 0,22 0,62 bc 0,15
4P-03 7,50 ef 3,11 0,39 ef 0,14 8,25 h 0,95 21,63 a 1,70 19,28 ab 2,34 1,10 ab 0,28 0,77 a 0,24
4P-07 8,00 e 2,35 0,66 bc 0,02 18,25 f 1,53 18,30 bc 1,41 18,68 ab 3,07 0,99 b 0,23 0,67 ab 0,18
6P-01 10,60 d 2,07 0,69 bc 0,08 49,75 c 10,63 14,60 c 1,36 15,72 bc 2,31 0,70 cd 0,16 0,44 cd 0,12
6P-03 14,60 ab 2,70 0,63 c 0,03 82,11 b 16,83 10,76 e 0,92 16,98 ab 3,15 0,54 ef 0,16 0,29 ef 0,09
6P-07 12,50 bc 2,38 0,63 c 0,07 54,71 c 13,70 12,00 de 1,47 16,73 ab 2,56 0,63 cde 0,12 0,41 cd 0,18
6P-10 8,60 de 2,07 0,39 f 0,07 23,22 de 6,55 13,36 bcd 3,07 16,36 ab 2,67 0,62 cde 0,25 0,39 d 0,14
7P-04 10,20 d 1,30 0,42 ef 0,02 16,83 fg 1,94 17,46 b 1,55 19,48 ab 2,88 0,83 bc 0,18 0,6 bc 0,1
7P-07 10,75 d 1,50 0,48 de 0,17 20,11 ef 3,85 16,08 bc 2,20 19,75 ab 2,25 0,71 cd 0,19 0,61 bc 0,14
7P-08 7,60 f 1,14 0,51 d 0,10 23,41 e 2,98 10,44 ef 2,24 16,54 ab 2,13 0,61 cde 0,16 0,39 de 0,08
7P-09 11,75 bc 3,50 0,54 d 0,07 29,72 d 1,38 12,00 de 2,27 17,25 bc 0,99 0,68 cd 0,21 0,48 cd 0,11
7P-10 14,00 b 2,83 0,53 d 0,10 46,72 c 13,06 13,45 cd 0,67 16,50 b 1,29 0,69 cd 0,12 0,44 cd 0,15
CONTROL QUIMICO
8,67 de 1,86 0,56 d 0,03 20,09 ef 1,65 17,25 b 0,94 16,52 b 1,47 0,74 cd 0,10 0,56 c 0,13
CONTROL (-) 5,43 a 1,51 0,33 g 0,04 4,70 i 0,85 21,76 a 2,40 16,27 b 0,92 1,31 a 0,24 0,83 a 0,23
CONTROL (+) 16,25 g 1,71 0,81 a 0,08 100,00 a 13,28 12,00 de 2,12 16,85 b 1,42 0,60 e 0,03 0,32 ef 0,08
CV% 21,8 14,3 16,8 12,1 12,4 22,9 27,1
Control (+) con R. solani, control (-) sin R. solani, Control químico (con Pulsor®). Datos con la misma letra no son significativamente diferentes entre sí de acuerdo a ANOVA (P<0,05).
76
