FACULTAD DE QUÍMICAEDUCACIÓN CONTINUA

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

DIPLOMADO DEL ÁREA DE FARMACIA

“Bioquímica y Biología Molecular para la Industria Farmacéutica y Biotecnológica” Farmacéutica y Biotecnológica”

Laura Carmona Salazar

Este material es exclusivamente para uso educativo y no de lucro

MÓDULO II. Métodos de Purificación y Análisis de Proteínas

Objetivos.�Revisar los fundamentos en los que se basan los

distintos métodos de purificación de proteínas y

cómo la combinación de éstos permite el

enriquecimiento sustancial de una proteína a partir

de una fuente natural o un organismo que la sobre

expresa.

�Revisar los fundamentos de los distintos métodos �Revisar los fundamentos de los distintos métodos

de análisis de proteínas que permiten la

caracterización fisicoquímica y biológica de

proteínas que son empleadas como fármacos.

�Revisar la fisiología y aplicaciones de algunos

productos biotecnológicos en la terapia.

TEMATICA PONENTES

PURIFICACIÓN LAURA CARMONA SALAZARNATLLELY GARCÍA CARREÑOLUIS T. SÁNCHEZ LINARES

ANÁLISIS NATLLELY GARCÍA CARREÑOSOBEIDA SÁNCHEZ NIETO

ORGANIZACIÓN DEL MÓDULO

SOBEIDA SÁNCHEZ NIETOLEÓN P. MARTINEZ CASTILLAROGELIO RODRIGUEZ SOTRESANGEL G. DÍAZ SÁNCHEZVICTOR ZALDIVAR MACHORRO

EJEMPLOS LAURA CARMONA SALAZARNATLLELY GARCÍA CARREÑO

PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

�Lisis celular y extracción de proteínas

�Precipitación diferencial de proteínas por salado, pH y temperaturasalado, pH y temperatura

PARA LA DETERMINACIÓN DE LA COMPOSICIÓN,ESTRUCTURA Y FUNCIÓN YA SEA DE UN TIPO CELULAR, ORGANELO, BIOMOLÉCULA

SE REQUIERE PURIFICARSE PARA SU ESTUDIO

REQUERIMIENTO BÁSICO PARA EL ESTUDIO ESTRUCTURAL Y FUNCIONAL DE UNA PROTEÍNA

PURIFICACIÓN

CONSIDERACIONES BÁSICAS PARA LA PURIFICACIÓN DE UNA PROTEÍNA

1. Conocer las características propias de la proteína:carga, tamaño, solubilidad, localización celular, función

2. La cantidad, es decir la abundancia celular3. Costos 3. Costos

CARACTERÍSTICAS ESTRUCTURALES COMUNES DE LOS AMINOÁCIDOS

Grupoamino

Grupo carboxilo

Carbono αααα

Aspartato CH2 COOH

Forma que predominaabajo del pKR

pKR Forma que predominapor arriba del pKR 3.9CH2 COO- + H+

Glutamato CH2 CH2 COOH4.1

CH2 CH2 COO- + H+

Histidina6.0

+ H+CH2

NH

N

H+

CH2

NH

N

EL VALOR DE pK NOS AYUDA A SABER EL ESTADO DE PROTONACIÓN Y LA CARGA DE UN GRUPO QUÍMICO A CIERTO pH. Disociación del grupo R de

un aminoácido

Cisteína CH2 SH CH2S-8.4

+ H+

Tirosina OH10.5

O- + H+

Lisina CH2 CH2 CH2 CH2 NH3

+CH2 CH2 CH2 CH2 NH3 + H+10.5

Arginina

+

CH2 CH2 CH2 NH C

NH2

NH2

12.5CH2 CH2 CH2 NH C

NH

NH2

+ H+

EL AMINO, CARBOXILO Y LOS RESIDUOS DE AMINOÁCIDOS CON CADENAS LATERALES CON CARGA CONTRIBUYEN EN LA DETERMINACIÓN DE LA CARGA TOTAL DE LA PROTEÍNA

RESIDUO

CONSIDERACIONES GENERALES PARA LA PURIFICACIÓN DE UNA PROTEÍNA

1. Definir los objetivos de la purificación: grado de pureza, cantidad y nivel de actividad requeridos

2. Seleccionar el material biológico de inicio: Dependerá de la localización de la proteína tanto en tejidos como en compartimentos subcelulares

3. Desarrollar una técnica de análisis: Para la determinación de la pureza, actividad o contenido total de proteína.

4. Minimizar la manipulación de la muestra4. Minimizar la manipulación de la muestra5. Remover desde el inicio posibles contaminantes: por ejemplo proteasas6. Reducir el uso de aditivos7. Apoyarse en el uso de técnicas diferentes en cada paso: Para ello se debe

considerar las propiedades fisicoquímicas de la proteína.8. Minimizar el número de pasos.

PROTOCOLO GENERAL PARA LA PURIFICACIÓN DE UNA PROTEÍNA

I. Ruptura o lisis celularII. Centrifugación diferencialIII.Centrifugación en gradientes de densidadIV.Precipitación selectiva de proteínas por

adición de sales o solventesV. Separación proteica por carga, tamaño

y afinidad

CRITERIOS PARA LA SELECCIÓN DE LA FUENTE PROTEICA

� Varias pueden ser las fuentes biológicas

� Facilidad para la obtención de la biomasa

� La cantidad de la proteína en el tejido o célula

� Estabilidad

MATERIAL BIOLÓGICO

Animal

MATERIAL SISTEMA

Vegetal

¿QUÉ ES EL MATERIAL BIOLÓGICO?

¿QUÉ ES EL SISTEMA BIOLÓGICO?

LOS SERES VIVOS SE CLASIFICAN EN TRES DOMINIOS

Envoltura celular

CARACTERÍSTICAS COMUNES DE LAS CÉLULAS BACTERIANAS

LAS CÉLULAS EUCARIONTES POSEEN DIVERSOS ORGANELOS MEMBRANOSOS

PROCARIONTES EUCARIONTES

Aproximadamente 1 µm 5-100 µm

El material genético no se localiza en el núcleo

Material genético en el núcleo

Carece de organelos Organelos determinados

LAS CÉLULAS PROCARIÓTICAS Y EUCARIÓTICAS EXHIBEN DIFERENCIAS EN SU MORFOLOGÍA Y FUNCIÓN

Carece de organelos Organelos determinados por membranas y tienen funciones específicas:MitocondriasRetículo endoplasmáticoComplejo de GolgiLisosomasVacuolas

MATERIALBIOLÓGICO

AISLAMIENTO CELULAR

AISLAMIENTO SUBCELULAR

I. RUPTURA O LISIS CELULAR

FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR

I. RUPTURA O LISIS CELULAR

1) LISADO 2) SEPARACIÓN

HomogenizaciónMecánicaNo Mecánica

ASPECTOS BÁSICOS A CONSIDERAR DURANTE LA LISIS O RUPTURA CELULAR

ASPECTOS BÁSICOS A CONSIDERAR DURANTE LA LISIS O RUPTURA CELULAR

Medio homogenización

H+

H+ H+

H+ H+

H+Na+Na+

Na+Na+

Cl-

Cl-Cl-

Cl-

HClCl-

TRIZMAFosfatos

EDTA

Mg2+

Inhibidoresde

proteasasDTT,

ββββ-mercaptoetanol

Medio homogenizaciónRuptura celular

Medio de resuspensiónMantenimiento de integridad

ASPECTOS BÁSICOS A CONSIDERAR DURANTE LA LISIS O RUPTURA CELULAR

Mantenimiento de integridadde organelos

PROTOCOLO GENERAL PARA LA PURIFICACIÓN DE UNA PROTEÍNA

I. Ruptura o lisis celularII. Centrifugación diferencialIII.Centrifugación en gradientes de densidadIV.Precipitación selectiva de proteínas por

adición de sales o solventesV. Separación proteica por carga, tamaño

y afinidad

FRACCIONAMIENTOSUBCELULAR

1.Homogenización(medio isotónico)

2. La separación 2. La separación por tamaño

Fundamento de la centrifugacióndiferencial:Se basa en las propiedades de tamaño, forma y densidad de las partículas parala separación, donde el efecto de la gravedad es diferente para cada molécula.

SEPARA

Centrifugación Diferencial Velocidad de sedimentación (s)Peso

TamañoFormaP

ROPIED

FÍSIR

ACIÓN

DADES

ICAS

Fracciones parcialmente enriquecidas

SEPARACIÓN POR GRADIENTES DE DENSIDAD

1) Centrifugación isopícnicaRequiere de un gradiente desacarosa y en la parte superiorse adiciona una mezcla de organelos,los cuales se van a ir separando acorde a su densidad

MEDIOS DE DENSIDAD DISPONIBLES PARA LASEPARACIÓN DE LOS SISTEMAS BIOLÓGICOS

ALCOHOLES POLIHIDRATADOS: Son gradientes no iónicos, inertes, estables y de bajo costoSacarosa, Sorbitol, Glicerol, Polietilenglicol PEG

POLISACÁRIDOS: Tienen una fuerza osmótica elevadaFicoll (Sacarosa polimerizada con epiclorohidrina), Dextrán

MEDIOS DE SILICA COLOIDAL: No son soluciones, son suspensiones de partículas de silicacubierta de polivinilpirrolidona PVP (15 a 30 nm de diámetro). Presentan unacubierta de polivinilpirrolidona PVP (15 a 30 nm de diámetro). Presentan unafuerza osmótica baja y cambia poco con cambios en la densidad.Percoll

GRADIENTES DE DENSIDAD MEDIA QUE CONTIENEN YODO Y SON NO-IÓNICOSBasados en el ácido triyodobenzoico, tiene un grupo hidrofílico que favorecela solubilización.Nycodenz, Optiprep

SALES INORGÁNICAS: Son gradientes iónicos de sales de metales pesados usados para separaciones de ácidos nucleicos en gradientes isopícnicos

Centrifugación en gradiente de densidad

De: Organelles and membranes of animal cells, Biological membranes,W. H. Evans

PUREZA

Marcadores: Actividades, características morfológicas o reactividad específica

a un tipo membranal

¿Para qué?

DistribuciónRecuperación

EnriquecimientoContaminación

¿Para qué?

VISUALIZACIÓN DE LA PURIFICACIÓN A TRAVÉS DE LA TABLA DE RECUPERACIÓN

DETERMINACIÓN DE LA CANTIDAD RECUPERADA. CUANTIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA

Existen diversos métodos para la cuantificación de las proteínas donde cada uno sebasa en alguna propiedad específica de las proteínas, lo cual puede tener ventajas y desventajas.

Cuantificación por medición de absorbencia a 280 nm: depende dela presencia de residuos aromáticos tirosina y triptófano. Tiene la desventaja deque otros componentes no proteicos pueden absorber en el UV.

Ensayo de Biuret: Las proteínas reducen los iones cúprico (Cu3+) en iones cuproso (Cu1+) el cual reacciona con los enlaces peptídicos y da una coloración azul. Ventajas no interfiere el PEG y desventaja a pHalcalinos hay interferencia

Ensayo de Lowry: Es una extensión del ensayo de Biuret, donde los iones cuprosos reaccionan con el reactivo Folin-Ciocalteu formando un complejo defosfato-tungnsteno-molibdato que da un color azul intenso. Ventaja es más sensibley requiere una menor cantidad de proteína, pero es más sensible a la interferencia

DETERMINACIÓN DE LA CANTIDAD RECUPERADA. CUANTIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA

Existen diversos métodos para la cuantificación de las proteínas donde cada uno sebasa en alguna propiedad específica de las proteínas, lo cual puede tener ventajas y desventajas.

Ensayo de Bradford: Es el más ampliamente utilizado, es sensible, sencillo, rápidoy resistente a la interferencia, se basa en el colorante azul de Coomassie G-250 en una solución ácida, conforme reacciona con las proteínas se torna café-rojizo.Desventaja es que reacciona con las celdas de lectura para el espectroscopio.Desventaja es que reacciona con las celdas de lectura para el espectroscopio.

CURVA PATRÓN

ENZIMÁTICOS: Actividad específica asociada a un organeloparticular

RE: NADPH-citocromo c reductasa

MIT:,Cit c oxidasa,ATPasa sensible a NaN3

GOLGI: GSI

TONOPLASTO: ATPasa sensiblea NO3-

MEMBRANA PLASMÁTICA: GSII,ATPasa sensible VO4

3-

Endosomas tempranosEndosonas tardíos

INMUNOLÓGICOS:

MORFOLÓGICOS: Grosor de membrana

Reactividad

Endosonas tardíosMP basolateral

REGICRE

C. Pasquali et al., J. Chromatogr B, 722 (1999)

VESÍCULAS DE MICROSOMAS

VESÍCULAS DE MEMBRANAPLASMÁTICA

FUNCIONALIDAD E INTEGRIDAD

Capacidad crear y mantener gradientes pH

Transporte de electronesTransporte de electrones

Transporte de solutos

Permeabilidad al agua (Coef.permeabilidadosmótica)

PROTOCOLO GENERAL PARA LA PURIFICACIÓN DE UNA PROTEÍNA

I. Ruptura o lisis celularII. Centrifugación diferencialIII.Centrifugación en gradientes de densidadIV.Precipitación selectiva de proteínas por

adición de sales o solventesV. Separación proteica por carga, tamaño

y afinidad

MÉTODOS DE PRECIPITACIÓN SELECTIVA DE PROTEÍNAS

Fundamento.- Para precipitar una proteína se debe modificar el ambiente que le rodea, debido a que los grupos cargados en la superficie de una proteína pueden interaccionar con las moléculas de agua como con los iones que se encuentran en solución.

TODA MOLÉCULA SE ENCUENTRA SOLVATADA

PRINCIPIOS DE PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS POR SALES

SALTING INLas proteínas globulares aumentan su solubilidad al incrementar la concentración de sales.

SALTING OUTDisminuye la solubilidad cuando se aumenta en exceso la concentración de sales y entonces precipitan. Es decir, se basa en laconcentración de sales y entonces precipitan. Es decir, se basa en laexclusión del cosolvente, en este caso la sal.

La precipitación con Sulfato de amonio (NH4)2SO4

es el método más ampliamente utilizado

¿POR QUÉ EL SULFATO DE AMONIO?

Se pueden utilizar aniones y cationes polivalentes y monovalentes, la preferencia esun anión polivalente y un catión monovalente.

Preferencia de la serie Hofmeister de aniones en concentraciones molares equivalentes:

citrato > sulfato> fosfato > cloruro > nitrato > tiocianato

Tendencia de la estabilidad de las proteínasTendencia de la estabilidad de las proteínas

Considerando que es muy utilizado, se han diseñado tablas y fórmulas para determinar las concentraciones de (NH4)2SO4

que se pueden emplear para adicionar a las proteínas y obtener una concentración específica.

TÉCNICAS PARA EL DESALADOUna vez que se ha precipitado la proteína por sales, el siguiente paso consiste enRemover la sal de la muestra:

DIÁLISIS: Celulosa o celofán con un poro determinado

ULTRACENTRIFUGACIÓNULTRACENTRIFUGACIÓN

PRINCIPIOS DE PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS POR SOLVENTES

Las proteínas se mantienen en solución por la interacción de los grupos hidrofílicosde su superficie con el solvente

Si la polaridad del solvente se reduce por la adición de un solvente orgánico menos polar que el agua, la proteína se vuelve menos soluble

MENORESTABILIDAD

LA PRECIPITACIÓN POR SOLVENTES SE REALIZA CON TEMPERATURAS BAJAS

PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS POR SOLVENTES

Los dos solventes ampliamente utilizados son el Etanol y la Acetona

Ambos logran precipitar adecuadamente a la s proteínas, pero la Acetona preserva mejor las propiedades de las proteínas

Los rangos de temperatura usualmente utilizados son:Los rangos de temperatura usualmente utilizados son:Temperaturas cercanas a 0 oC hasta -20 oC

Para la recuperación de la proteína se debe centrifugar y puede resuspenderse en un amortiguador apropiado

Desventaja: Bajos rendimientos y puede haber desnaturalización

PROTOCOLO GENERAL PARA LA PURIFICACIÓN DE UNA PROTEÍNA

I. Ruptura o lisis celularII. Centrifugación diferencialIII.Centrifugación en gradientes de densidadIV.Precipitación selectiva de proteínas por

adición de sales o solventesV. Separación proteica por carga, tamaño

y afinidad

TÉCNICAS DE ELECTROFORESIS Y CROMATOGRAFÍASobeida y Luis

ESQUEMA GENERAL PARA LA PURIFICACIÓN DE UNA PROTEÍNA

PORTOCOLO PARA EL ESTUDIO DE LA ATPasa DE H+ DE LAMEMBRANA PLASMÁTICADE CÉLULAS VEGETALESDE CÉLULAS VEGETALES

ApoplastoApoplasto ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ = 120 a 160 = 120 a 160 mVmV

LA ATPasa HLA ATPasa H++ SE ECUENTRA EN LA MEMBRANA SE ECUENTRA EN LA MEMBRANA PLASMÁTICA DE CÉLULAS VEGETALESPLASMÁTICA DE CÉLULAS VEGETALES

CitoplasmaCitoplasma ∆∆∆∆∆∆∆∆pH = 1.5 a 2 pH = 1.5 a 2 unidadesunidades

ESTRUCTURA DE LA ATPasa DE HESTRUCTURA DE LA ATPasa DE H++ DE MEMBRANA DE MEMBRANA PLASMÁTICAPLASMÁTICA

CitoplasmaCitoplasma

Exterior celularExterior celular

MPMP

GonzálezGonzález--HalphenHalphen

Polipéptido de 100 kDa

Cantidad de enzima

Tipos de isoformas

a) Expresión génica

b) Regulación traduccional

c) Expresión diferencial

MECANISMOS DE REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA ATPasa DE H+

Tipos de isoformas

Modificaciones

en la enzima

c) Expresión diferencial

f) Oligomerización

d) Fosforilación/defosforilación

e) Interacción con la proteína 14-3-3

g) Interacción con lípidos membranales

SELECCIÓN DEL MATERIAL BIOLÓGICO PARA OBTENER EL SISTEMA BIOLÓGICO

OBJETIVO: PURIFICAR LA MEMBRANA PLASMÁTICA DE TEJIDOS VEGETALES

Edidin, 2003

Fase líquidadesordenada (l )

PURIFICACIÓN DE UNA FRACCIÓN SUBMEMBRANAL

desordenada (ld)

FluidezMovilidad lateral

FosfatidilserinaFosfatidilglicerolFosfatidilinositolFosfatidiletanolamina

FluidezMovilidad lateral

Fase líquidaordenada (lo)

EsfingomielinaCerebrósidosGlobósidosGangliósidosEsteroles

TEJIDO VEGETAL CON DISMINUCIÓN ENLOS NIVELES DE ESFINGOLÍPIDOS ENDÓGENOS

Obtención de FM/MP

Obtención de DRMs

Caracterización:

ESTRATEGIA EXPERIMENTAL

Caracterización:

1) Ultraestructura por MET

2) Análisis proteómico

3) Cuantificación e identificación

de ceramida y de esfingolípidos

4) Cuantificación de ácidos grasos de cadena larga

5) Cuantificación e identificación de esteroles

ESQUEMA GENERAL PARA LA PURIFICACIÓN DE VMP

PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN DE DRM

MP

CRITERIOS PARA LA SELECCIÓN DE LOS AMORTIGUADORES DE HOMOGENIZACIÓN Y SUSPENSIÓN

VISUALIZACIÓN DE LA PURIFICACIÓN A TRAVÉS DE LA TABLA DE RECUPERACIÓN

CARACTERIZACIÓN DE LA PURIFICACIÓN DE LAS VMP

CARACTERIZACIÓN DE LA PURIFICACIÓN DE LAS DRM

TAREA PARA EVALUACIÓN:1. Proteína asignada por la profesora.2. Determinar el material y sistema biológico para el estudio. Criterios3. Elaboración del protocolo de purificación de la proteína de interés:a. Establecer las condiciones de homogenización en específico: soluciones y fundamento.b. Centrifugación diferencial/por densidad: precisar los pasos requeridosc. Determinación de la proteína. Selección del métodod. Aislamiento de la proteína: selección de la precipitacióne. Purificación: Determinación de la electroforesis, cromatografía, etc.f. Pruebas de evaluación de la pureza en específico para el sistema biológicof. Pruebas de evaluación de la pureza en específico para el sistema biológicog. Pruebas de evaluación de la funcionalidad en específico para la proteína de interés.