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Universidad Nacional de Córdoba
Facultad de Ciencias Agropecuarias
Escuela para Graduados
Instituto de Reproducción Animal Córdoba (IRAC)
FRECUENCIAS ALÉLICAS DEL GEN COQ9 Y
RELACIÓN GENOTÍPICA CON PARÁMETROS
REPRODUCTIVOS EN UNA POBLACIÓN DE
GANADO HOLSTEIN.
Néstor Gerardo Michel Regalado
Trabajo Final
Para optar al Grado Académico de
ii
Especialista en Reproducción Bovina
Córdoba 2019
INDICE
1. RESUMEN ................................................................................................................................................. iii
2. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................................................... 4
HIPÓTESIS ......................................................................................................................................................... 7
OBJETIVO GENERAL ...................................................................................................................................... 7
3. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................................... 8
3.1 DESCRIPCIÓN DE LA POBLACIÓN ANIMAL .................................. ¡Error! Marcador no definido.
3.2 TOMA DE MUESTRAS SANGUÍNEAS Y EXTRACCIÓN DE ADN ............................................... 9
3.3 ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA DE PCR-RFLP................................................................... 9
3.4 OBTENCIÓN DE LAS VARIABLES REPRODUCTIVAS................................................................ 10
3.5 ESTIMACION DE FRECUENCIAS GENOTÍPICAS Y GÉNICAS .................................................. 11
3.6 RELACIÓN DE LOS GENOTIPOS CON LAS VARIABLES REPRODUCTIVAS ......................... 11
3.7 CÁLCULO DE LOS EFECTOS DE ADITIVIDAD Y DOMINANCIA POR MODELO DE
REGRESIÓN .................................................................................................................................................... 12
4. RESULTADOS ......................................................................................................................................... 12
4.1 ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA .......................................................................................... 12
4.2 FRECUENCIAS GENOTÍPICAS Y GÉNICAS .................................................................................. 14
4.3 EFECTOS DEL POLIMORFISMO EN EL DESEMPEÑO REPRODUCTIVO ................................. 15
4.4 EFECTOS DE ADITIVIDAD Y DOMINANCIA ............................................................................... 16
5. DISCUSIÓN ............................................................................................................................................. 17
6. CONCLUSIONES .................................................................................................................................... 19
7. BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................................................................... 20
iii
1. RESUMEN
El SNP (por sus siglas en inglés Single Nucleotide Polymorphism, 18:25527339, Pub
Med) del gen COQ9 en el ganado Holstein se caracteriza por una sustitución de una
adenina por una guanina. Esta sustitución genera un cambio en la estructura terciaria de la
proteína traducida por el gen. La coenzima Q9 es una molécula precursora de la coenzima
Q, componente en la cadena de transporte de electrones de la mitocondria. El alelo A ha
sido asociado con un mejor desempeño reproductivo para tasa de preñez, días abiertos y
número de servicios. En el presente trabajo se estandarizó la técnica de diagnóstico
molecular por medio de PCR-RFLP (por sus siglas en inglés: Polymerase Chain Reaction –
Restriction Fragment Length Polymorphism) para genotipificar los alelos A y G del gen
COQ9, se calcularon las frecuencias genotípicas y génicas en una población de ganado
Holstein. Se creó una base de datos con las variables reproductivas: intervalo del parto al
primer celo, días abiertos y número de servicios por concepción. Para la asociación de los
genotipos con las variables se formaron 4 grupos de acuerdo al número de lactancia (1, 2, 3,
4) en que se encontraban las vacas y tres grupos para genotipo (AA, AG, GG), se
analizaron los datos por medio del procedimiento MIXED del programa estadístico SAS
mediante un modelo estadístico de efectos mixtos. Los resultados encontrados demuestran
un efecto de significancia estadística para las vacas heterocigóticas AG y la variable
número de servicios por concepción, por lo que éste polimorfismo podría utilizarse como
un marcado de selección molecular para mejorar el desempeño reproductivo en los establos
lecheros.
Palabras clave
Fertilidad, Bovino, Coenzima Q9, PCR- RFLP
4
2. INTRODUCCIÓN
La selección del ganado lechero y la alta especialización para la producción de leche han
derivado en una disminución significativa en el desempeño reproductivo de los hatos
lecheros (Veerkamp et al., 2003). Desde el año 1989, investigadores de la Universidad de
Cornell daban cuenta de la asociación entre la creciente producción lechera y el constante
decremento en la tasa de preñez, atribuyendo principalmente ésta reducción al balance
energético negativo de la vaca en el postparto, situación que genera un ambiente similar al
de la subnutrición y que inhibe la respuesta a las gonadotropinas para la liberación
preovulatoria de la hormona luteinizante (Wathes et al., 2007).
En un estudio retrospectivo, evaluando los datos productivos y reproductivos durante un
periodo de 10 años (1991- 2000) en la región del noreste de España, López-Gatius (2002)
encontró que la producción lechera anual incrementó de 7,800 kg por vaca en 1991 a
10,200 kg en el año 2000, los análisis de regresión revelaron que por cada 1,000 kg de
aumento en producción lechera, había un decremento de entre un 3.2 a 6% en la tasa de
preñez, de 4.4 a 7.6% en la ciclicidad y un incremento en la incidencia de ovarios inactivos
de entre 4.6 a 8%.
Una situación similar fue reportada en una población de ganado en el Reino Unido
(Royal et al., 2000), utilizando determinaciones de progesterona en leche, se compararon
los parámetros reproductivos tomados en el periodo de 1975- 1982, con los del periodo
1995-1998. Se encontró que existía un decremento porcentual promedio de un punto por
año en la tasa de preñez, incrementándose la proporción de perfiles hormonales atípicos.
Este decremento en el desempeño reproductivo se puede atribuir a que la selección
genética ha sido principalmente orientada hacia rasgos productivos, es por esto que es
necesaria una herramienta para identificar polimorfismos que tengan una relación positiva
directa con el desempeño reproductivo (Beuzen et al., 2000).
5
Debido a esto, las técnicas de selección tradicionales que se basaban en mediciones
fenotípicas del comportamiento de la progenie respecto a los parámetros de interés, se han
complementado con el uso de evaluaciones genómicas, las cuáles reducen el intervalo
generacional de manera notable y permiten trabajar con rasgos de baja heredabilidad, como
es el caso de la fertilidad, éstas pruebas han incrementado la precisión de las evaluaciones.
Se ha reportado una reducción del intervalo generacional en sementales, de 7 a menos de
2.5 años en el ganado Holstein a partir del uso de las evaluaciones genómicas en los hatos
lecheros de Estados Unidos de Norteamérica (García-Ruiz et al., 2016).
A la fecha, se han identificado diversos marcadores moleculares basados en haplotipos
(Sahana et al., 2013; Fritz et al., 2013) o conjuntos de polimorfismos de nucleótido único
(por sus siglas en inglés: Single Nucleotide Polymorphism) que generan mutaciones letales
para los embriones, éstas investigaciones se basan en la búsqueda de genotipos que después
de la segregación no se encuentran en la población, en base a ellos y sustentados en los
registros reproductivos se calcula la asociación con infertilidad. Algunos otros
polimorfismos no son letales para los embriones y es posible asociarlos con mejores
desempeños reproductivos (Hax et al., 2017; Homer et al., 2013; Khatib et al., 2008;
Nicolini et al., 2013; Ortega et al., 2017; Schneider et al., 2013).
Un ejemplo es el gen que codifica para la proteína de biosíntesis ubiquinona Q9
(COQ9), que participa en la vía de producción de la ubiquinona Q10 (COQ10), la cual es
componente importante en el sistema de transporte de electrones de la mitocondria, éste
sistema produce el adenosin trifosfato (ATP), biomolécula que proporciona energía a la
célula para realizar sus funciones metabólicas. Se ha identificado una mutación que
modifica la estructura terciaria de la proteína COQ9 producida por el gen debido a un
cambio conformacional en la estructura de diversas alfa- hélices. Esta mutación se asocia
con menores tasas de respiración mitocondrial (Ortega et al., 2017).
Por lo anterior, los ovocitos tienen menor capacidad energética para realizar sus
funciones metabólicas y son menos viables. Se ha demostrado en los mamíferos que la
proteína COQ9 interacciona con la proteína ubiquinona Q7 (COQ7) para dar origen al
aceptor de electrones COQ10, deficiencias en cualquiera de estas moléculas interfieren con
la producción normal de ATP en la mitocondria (García-Corzo et al., 2012). La función
6
precisa de la COQ9 se desconoce aún, pero se sabe que forma parte de un complejo
multienzimático encargado de realizar metilaciones, descarboxilaciones e hidroxilaciones
hasta formar la estructura quinona funcional, por lo tanto, una deficiencia en alguna de
éstas enzimas, como la COQ9, suprimirán la función de la COQ10 (Duncan et al., 2009).
Ortega et al., (2017) señalan una relación entre el polimorfismo y tres parámetros de
fertilidad en ganado lechero Holstein: tasa de preñez, servicios por concepción e intervalo
entre parto.
Si bien es cierto que se han identificado y relacionado diversos polimorfismos con
rasgos de fertilidad (Ortega et al., 2017; Hax et al., 2017; Homer et al., 2013; Khatib et al.,
2008), hasta el momento no se han reportado estudios donde se muestreen individuos en la
región del estado de Jalisco, por lo que éste estudio permitirá estimar la frecuencia alélica
del gen COQ9 en una población de bovinos lecheros de ésta región.
La detección de estos polimorfismos por medio de PCR-RFLP y su asociación con
rasgos reproductivos permitirá establecer una herramienta de selección asistida por
marcadores moleculares al alcance de los productores, lo que se verá reflejado en una
probable mejoría de la fertilidad global y aumentará las ganancias económicas derivadas de
éste concepto, como lo pueden ser el incremento en la producción de leche del hato por una
reducción del intervalo entre partos, una reducción en el número de vacas que se desechan
por causas reproductivas y un menor gasto de alimentación para animales improductivos
(Chebel y Ribeiro, 2016).
7
HIPÓTESIS
El alelo A del gen COQ9 se relaciona con parámetros reproductivos en una población de
ganado Holstein.
OBJETIVO GENERAL
Estimar las frecuencias alélicas del gen COQ9 y la relación de los genotipos con
parámetros reproductivos en una población de ganado Holstein.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1 Implementar el diagnóstico molecular (PCR) para la genotipificación de los alelos
del gen COQ9.
2 Estimar las frecuencias génicas y genotípicas del gen COQ9.
3 Identificar la relación entre los genotipos del gen COQ9 y los parámetros
reproductivos: intervalo del parto al primer celo, días abiertos y número de
servicios.
4 Estimar los efectos de aditividad y dominancia para los alelos del gen COQ9 y los
parámetros reproductivos.
8
3. MATERIALES Y MÉTODOS
La toma de muestras se realizó en una unidad de producción lechera tecnificada, en el
municipio de San Juan de los Lagos, Jalisco. Previo al muestreo se identificó a los
individuos y se agruparon de acuerdo a la lactancia en que se encontraba cada vaca,
formándose 4 grupos: grupo 1 primera lactancia; grupo 2 de segunda lactancia; grupo 3
vacas de tercera lactancia y grupo 4 aquellas que se encontraban en cuarta lactancia
respectivamente, cada grupo se conformó con mínimo 25 animales.
3.1 MANEJO REPRODUCTIVO DE LAS VACAS
Las vacas recibieron una pre sincronización del ciclo estral con una doble inyección de
prostaglandinas espaciada 14 días a partir del día 40 postparto, doce días después (día 66
postparto) de la segunda dosis de prostaglandina (Giordano et al., 2016) se comenzó con
un protocolo convencional Ovsynch (Figura 1). El diagnóstico de gestación se realizó por
medio de palpación rectal a los 45, 70 y 105 días después de la inseminación artificial.
Figura 1. Protocolo utilizado para sincronización de la ovulación. Se enumeran los días a
partir del comienzo del protocolo. PGs (Análogo de prostaglandina F2α, cloprostenol
sódico, 526 mcg, Sincrocio®, Ourofino; GnRH (Análogo de la hormona liberadora de
gonadotropinas, acetato de buserelina, 0.01 mg, Sincroforte®, Ourofino); IATF
Inseminación artificial a tiempo fijo.
9
3.2 TOMA DE MUESTRAS SANGUÍNEAS Y EXTRACCIÓN DE ADN
Las muestras de sangre se tomaron por medio de punción de la vena coccígea media, previa
limpieza del área anatómica con toallas de papel, cada muestra se colectó en un tubo
vacutainer® que contenía EDTA, los tubos se rotularon con el número de registro del
animal y se conservaron bajo refrigeración (4 a 6°C) hasta su transporte al laboratorio. La
temperatura de las muestras se ajustó por medio del uso de refrigerantes y un termómetro
de alcohol para medir la temperatura.
Se tomaron 100 µl de sangre y se mezclaron con 900 µl de buffer A (sacarosa, 0.32 M; Tris
HCI, 10 mM; MgCl2, 5 mM; Triton X-100,1%), posteriormente la mezcla se centrifugó a
13,000 revoluciones por 2 minutos y se retiró el sobrenadante, éste proceso se repitió hasta
obtener un botón celular blanco.
Posteriormente se añadió una solución de proteinasa K (8 mg/ml) en buffer D (KCl, 50
mM; Tris HCl, 10 mM; MgCl2, 2.5 mM; NP-4º, 0.455 Tween 20, 0.45%) y se incubó la
muestra por un periodo de 60 minutos a una temperatura de 50°C, una vez terminada la
digestión se inactivó la proteinasa K incubando la muestra a una temperatura de 90°C
durante 10 minutos (Ayala-Valdovinos et al., 2007).
3.3 ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA DE PCR-RFLP
A partir de la secuencia de ADN reportada para el gen COQ9 (NCBI Secuencia de
referencia: AC_000175.1) se diseñaron un par de oligonucleótidos iniciadores para
amplificar una secuencia que contenga el sitio de localización del polimorfismo (Software
Primer-BLAST-NCBI).
Se realizó un primer ensayo (PCR gradiente) con el objetivo de determinar la temperatura
óptima de alineación de los cebadores. De acuerdo al programa “gradiente” del equipo
termociclador Techne® modelo TC–5000 (Techne Inc., Burlington, NJ, USA), las
temperaturas fueron las siguientes: 50.2°C, 50.8°C, 52.3°C, 54°C, 55.5°C, 57.2°C, 58.8°C,
60.7°C, 62.2°C, 63.9°C, 65°C. La mejor temperatura de alineación se determinó por
10
análisis de los fragmentos amplificados en el fotodocumentador (Kodak Gel Logic 100
System, USA).
Posterior a la amplificación del fragmento por PCR, se adicionó la endonucleasa de
restricción MboI (Thermo Scientific®), las muestras se incubaron a 37°C por 1 hora en el
termociclador Applied Biosystems 2720 (Thermo scientific®, Waltham, Massachusetts,
USA).
Para el análisis de los fragmentos se colocó la totalidad de la mezcla PCR-RFLP en un gel
de agarosa al 4 % teñido con GelRed® en buffer TBE 1X, se corrieron las muestras en la
cámara de electroforesis a 70 volts durante 50 minutos y posteriormente se fotografiaron las
bandas bajo luz ultravioleta por medio de un fotodocumentador (Kodak Gel Logic 100
System, USA).
3.4 OBTENCIÓN DE LAS VARIABLES REPRODUCTIVAS
De acuerdo a los genotipos encontrados se formaron tres grupos:
Grupo GG. Individuos homocigóticos para el alelo mutante.
Grupo AG. Individuos heterocigóticos.
Grupo AA. Individuos homocigóticos para el alelo silvestre.
Las variables se calcularon para cada grupo genético de la siguiente manera (Wall et al.,
2003):
Intervalo del parto al primer celo: Días transcurridos del parto al primer celo en
cada vaca.
Días abiertos: Días transcurridos del parto hasta la concepción en cada vaca.
Número de servicios: Suma de servicios de inseminación artificial en cada vaca
hasta quedar preñada.
Para el cálculo de las variables se utilizaron los siguientes datos por cada vaca: fecha de
parto, fecha del primer celo exitoso y subsecuentes, fecha de todos los servicios de
inseminación hasta el servicio fecundante y fecha del diagnóstico de preñez.
11
3.5 ESTIMACION DE FRECUENCIAS GENOTÍPICAS Y GÉNICAS
Para la estimación de frecuencias genotípicas y génicas se utilizó el método de conteo
directo (Baltian et al., 2017).
Frecuencias genotípicas:
f (AA)= n°. De individuos con tipo AA f (GG)= n°. De individuos tipo GG
n°. Total de individuos n°. Total de individuos
f (AG)= n°. De individuos con tipo AG
n°. Total de individuos
Frecuencias génicas:
f(A)= f(AA)+1/2 f(AG) f(G)= 1- f(A)
Considerando lo esperado en equilibrio de H-W se realizó una prueba de Chi-cuadrada
(P<0.05) para una muestra empleando el programa estadístico POPGENE32.
3.6 RELACIÓN DE LOS GENOTIPOS CON LAS VARIABLES
REPRODUCTIVAS
Los datos fueron analizados con un modelo mixto, incluyendo como efectos fijos el
genotipo (con 3 niveles: AA, AG y AG) y el número de lactancia (con 4 niveles: 1ª
lactancia, 2ª, 3ª y 4ª lactancia), y como efecto aleatorio el animal:
Yij= µ + GENOTIPOi + LACTANCIAj + animal+ Ɛij
Donde:
Y= valor observado del parámetro reproductivo en cuestión (días transcurridos del parto al
primer celo en cada vaca, días abiertos y número de servicios).
µ= la media general para el parámetro evaluado.
GENOTIPO= el genotipo para el gen COQ9 al que pertenece cada animal (AA, AG y GG).
LACTANCIA= efecto del número de lactancia del animal (1ª, 2ª, 3ª o 4ª lactancia).
animal= componente genético aleatorio de cada animal.
Ɛ= error experimental.
12
Se estimaron las diferencias entre genotipos y lactancias con el método de Tukey (P<0.05)
y los análisis estadísticos se efectuaron con el PROC MIXED del Sistema de Análisis
Estadísticos (SAS, 2003).
Previamente se evaluó el efecto de interacción entre el genotipo y lactancia, ésta no resultó
significativa, por lo que fue excluida del modelo estadístico.
3.7 CÁLCULO DE LOS EFECTOS DE ADITIVIDAD Y DOMINANCIA POR
MODELO DE REGRESIÓN
Para ajustar el modelo de regresión a los efectos de aditividad se creó una base de datos
donde se asignó el valor de +1 a los individuos homocigóticos AA (alelo mejorante), -1 a
los homocigóticos GG (alelo mutante) y 0 para los heterocigóticos AG. Para los efectos de
dominancia se asignó el valor de 1 para los individuos homocigóticos AG y 0 para los
homocigóticos AA y GG, se utilizó el programa estadístico SPSS (Óvilo et al., 2002).
4. RESULTADOS
4.1 ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA
En el cuadro 1 se muestran los oligonucleótidos diseñados para la amplificación del
fragmento del gen COQ9, el programa utilizado para la prueba fue el siguiente: temperatura
de desnaturalización inicial 94°C por 3 minutos, seguido de 32 ciclos de amplificación con
94°C por 20 segundos, 54°C por 20 segundos, 72°C por 35 segundos y una temperatura de
extensión final de 72°C por 5 minutos.
Cuadro 1. Oligonucleótidos iniciadores diseñados para la prueba de PCR.
Oligonucleótidos Secuencia 5´ - 3´ Tamaño del fragmento
Delantero 5´- AGTTTCTGTTTCAGTGCCCCG- 3´ 202 pares de bases
Reverso 5´- GCAGGTGTTCTGATGCCTACC- 3´
13
La temperatura de alineación óptima para los oligonucleótidos (primers) diseñados se
determinó mediante un programa de PCR gradiente en un termociclador Techne® modelo
TC-5000. En la imagen (Figura 1) se muestran las diferentes temperaturas a las que se
sometió la misma muestra de DNA (bovino control). Se observa un amplio margen de
amplificación en la temperatura de alineación para los primers diseñados (Figura 1, carriles
2 – 9). Para la selección de la mejor temperatura se consideró la amplitud y luminiscencia
de la banda, así como la ausencia de amplificaciones inespecíficas en el carril. En base a
éstos resultados se determinó 54°C como la temperatura de alineamiento para el
diagnóstico de los individuos en el estudio.
Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa del fragmento de DNA amplificado mediante
los primers diseñados en el estudio, se muestran las temperaturas de alineamiento para
cada carril.
Mediante la prueba de PCR- RFLP se logró amplificar un fragmento de DNA de 202 pares
de bases (Cuadro 2) y generar un patrón de bandeo para identificar los genotipos de los
individuos muestreados. Los patrones específicos (Figura 2) fueron fragmentos de 82 y 109
pb para el genotipo GG, 82, 109 y 120 pb para el genotipo GA y para el genotipo AA
fragmentos de 82 y 120 pb.
Cuadro 2. Región amplificada del gen COQ9. (G) Localización del polimorfismo;
(negritas) Oligonucleótidos delantero y reverso; (GATC) Sitios de corte
identificados por la enzima MboI (NCBI secuencia de referencia: AC_000175.1).
Fragmento del gen COQ9
AGTTTCTGTTTCAGTGCCCCGCTGCCGACCAGCCCTGGCCCCACGTGCCTTCC
GTGCTTCAGCTATGCAGCTAAGGTCTTTGGATCAGCAGAAGATCAACCCCCGC
CCTCTTCTTCTCAGCAACAGTCTGAGGCGCAGGGCGCAGAGGAACCCAATCCA
GAGGCTCTGCGTTCACCCCCCAGGTAGGCATCAGAACACCTGC
14
Figura 2. Electroforesis en gel de agarosa al 4% del fragmento del gen COQ9
amplificado por PCR- RFLP y digerido con enzima MboI. Carril 1, se muestra el
marcador molecular (25 pb, Thermo Scientific®); Carriles 2,3 y 4, muestras controles
para cada genotipo; Carril 5, muestra blanco sin DNA; Carriles 6 a 12, muestras de
individuos analizadas en el estudio.
4.2 FRECUENCIAS GENOTÍPICAS Y GÉNICAS
En el cuadro 3 se presentan las frecuencias genotípicas y génicas del polimorfismo
(18:25527339). La frecuencia génica mayor fue la del alelo mutante G, con 0.5359 y
0.4641 para el alelo A. Las frecuencias genotípicas fueron 0.1830, 0.5620 y 0.2549 para
AA, AG y GG respectivamente (Cuadro 3).
Cuadro 3. Frecuencias genotípicas y génicas
Frecuencia genotípica
Genotipo Número de animales Frecuencia
AA 28 0.1830
AG 86 0.5620
GG 39 0.2549
Frecuencia génica
Alelo A 0.4641
Alelo G 0.5359
El valor calculado para la prueba de Chi-cuadrado fue menor que el valor obtenido en
tablas con un nivel de confianza del 95% y 1 grado de libertad, por lo que se acepta la
15
hipótesis nula que la población está en equilibrio Hardy-Weinberg, razón por la cual, no
existe diferencia significativa entre las frecuencias observadas y esperadas (Cuadro 4). Lo
que indica que en la población estudiada no han sucedido fenómenos de selección,
mutación, flujo génico y deriva génica lo suficientemente penetrantes para generar
fluctuaciones de consideración estadística en las frecuencias alélicas del gen COQ9.
Cuadro 4. Equilibrio de Hardy Weinberg para las frecuencias genotípicas
Chi cuadrado calculada 2.459046
Grados de libertad 1
Valor de Chi-cuadrado tablas 3.84
Probabilidad 0.1169
(P>0.05)
4.3 EFECTOS DEL POLIMORFISMO EN EL DESEMPEÑO REPRODUCTIVO
En el cuadro 5 se presentan las medias de mínimos cuadrados para cada variable analizada
con respecto a cada genotipo y el número de lactancia No se encontró relación significativa
entre el genotipo y las variables intervalo del parto al primer celo y días abiertos.
Cuadro 5. Medias de mínimos cuadrados para el promedio de días entre el parto y el
primer celo (IP1C), días abiertos (DIAB) y número de servicios (NUSE) de acuerdo al
genotipo y número de lactancia de las vacas.
Factor Niveles IP1C (días)±EE
Genotipo (NS) AA 72.9 5.1a
AG 69.2 4.2a
GG 69.2 4.6a
Lactancia (*) L1 73.9 7.1a
L2 71.3 5.3a
L3 75.8 3.9a
L4 60.9 3.8b
Factor Niveles DIAB±EE
Genotipo (NS) AA 127.6 12.7a
AG 103.5 7.5b
GG 128.7 9.7a
Lactancia (NS) L1 126 11.1a
L2 116 8.7a
16
L3 122.2 12.3a
L4 115.3 12.4a
Factor Niveles NUSE±EE
Genotipo (*) AA 3.6 0.5a
AG 2.5 0.3b
GG 3.7 0.4a
Lactancia (NS) L1 3.4 0.4a
L2 3.1 0.3a
L3 3.1 0.5a
L4 3.4 0.5a
(NS)= no significativo (P>0.05); (*)= significativo (P<0.05); (**)= altamente
significativo (P<0.01); EE= error estándar de la media; diferentes literales por columna
son diferentes, para cada variable (P<0.05) usando el método de Tukey.
4.4 EFECTOS DE ADITIVIDAD Y DOMINANCIA
No existieron efectos de aditividad significativos para ninguna de las variables del estudio,
razón por la cual, no se identificó una influencia directa para estos rasgos a través de los
genotipos homocigóticos en vacas AA y GG, para los efectos de dominancia, se encontró
significancia estadística al nivel de P<0.05 para las variables de días abiertos y número de
servicios, lo que implica una mejora para estos parámetros en vacas heterocigóticas AG
(Cuadro 6).
Cuadro 6. Análisis de regresión para efectos de aditividad y dominancia
Aditividad
(Efecto AA)
Dominancia
(Efecto AG)
Variable Coeficiente Valor P Variable Coeficiente Valor P
IP1C 2.16 0.33 IP1C -0.06 0.98
DIAB -3.77 0.62 DIAB -7.64 0.02*
NUSE -0.23 0.46 NUSE -1.14 0.007*
* (P<0.05); IP1C= Intervalo del parto al primer celo; DIAB= Días abiertos; NUSE= Número de
servicios.
17
5. DISCUSIÓN
El pobre desempeño reproductivo y los factores que se ven implicados en éste fenómeno
han sido profundamente investigados, para examinar la posibilidad de que algunos rasgos
reproductivos son asociados con la presencia de un polimorfismo, se estandarizó la prueba
de PCR-RFLP y se investigó la asociación estadística entre 3 variables reproductivas
(intervalo del parto al primer celo, días abiertos y número de servicios) con los diferentes
genotipos en el gen de la coenzima Q9.
El gen COQ9 produce una molécula esencial para la síntesis de ATP mitocondrial y otros
procesos metabólicos, las mutaciones en los genes que participan en la biosíntesis de la
COQ generan deficiencia de ésta molécula y conducen a estados patológicos o deterioros
en algunos sistemas (García-Corzo et al., 2012).
Ortega et al., (2017) evaluaron los efectos del polimorfismo (18:25527339) en el
comportamiento reproductivo de 2,273 vacas Holstein localizadas en los estados de Florida
y California. Ellos encontraron que las vacas con el genotipo homocigótico AA tuvieron
mayor tasa de preñez, requirieron menor número de servicios por concepción y tuvieron
menos días abiertos (P<0.05) en comparación con las vacas del genotipo GG.
Adicionalmente midieron la expresión de transcritos de COQ9 en células del cumulus y en
ovocitos, encontrando un efecto de dominancia, ya que el genotipo heterocigótico AG
presentó mayor abundancia en los ovocitos (P<0.05), no así en las células del cumulus. En
el caso de los homocigóticos, la abundancia fue menor y no se encontraron diferencias
entre ellos. Una situación similar fue encontrada cuando recuperaron complejos cumulus
oophorus y midieron concentraciones de la hormona antimulleriana, siendo los
heterocigóticos los que presentaron los mayores valores (P<0.05).
En el presente estudio se encontró un efecto favorable del genotipo AG para la variable
número de servicios (P< 0.05), siendo los heterocigóticos quienes demostraron el mejor
desempeño reproductivo. Ésta información concuerda con los resultados del análisis de
regresión para los efectos de dominancia donde existió significancia estadística (P<0.05)
para el número de servicios y días abiertos.
Se han reportado los efectos de la parición en el subsecuente intervalo del parto a la primera
ovulación, siendo las vacas primíparas las que presentan el intervalo más largo comparado
con las multíparas, sin que este comportamiento sea asociado a un cambio en la condición
corporal (Tanaka et al., 2008), en el presente estudio no se encontró un efecto favorable de
algún genotipo para la variable intervalo del parto al primer celo, en el caso de la lactancia
4 se encontró una asociación significativa con un menor intervalo del parto al primer celo,
18
coincidiendo estos datos con los reportados por Tanaka et al., (2008). Una hipótesis que
surge, es que la expresión del gen es diferente para cada lactancia, por lo que sería
interesante en un estudio posterior evaluar el desempeño de las mismas vacas en sus
diferentes lactancias.
Aunque en esta investigación no se realizaron mediciones de hormona antimulleriana
(AMH por sus siglas en inglés) ni se realizó un conteo de la población folicular, el efecto de
sobredominancia encontrado en el estudio de Ortega et al., (2017) es interesante ya que se
ha demostrado que los altos niveles de AMH se relacionan con una mayor población
folicular, una mayor longevidad en el hato y un mejor desempeño reproductivo (Jimenez-
Krassel et al., 2015), por lo que sería de gran importancia realizar éstas mediciones en
estudios posteriores para determinar si existe tal relación.
El hecho de que los heterocigóticos demuestren un comportamiento superior respecto del
alelo mejorante encontrado en este estudio y en el de Ortega et al., (2017) puede ser debido
a un efecto de sobredominancia, donde las diferentes moléculas producidas tengan
propiedades distintas en cuanto a su actividad, estabilidad en ciertas condiciones,
sensibilidad para trabajar, entre otras. Esto genera un desempeño más versátil y menos
susceptible al deterioro comparado con los homocigóticos, un ejemplo de una situación
similar fue encontrado en ovejas con una mutación en el gen FecX1, los heterocigóticos
tuvieron una mayor tasa de ovulación comparado con los homocigóticos silvestres,
mientras que los homocigóticos mutantes fueron infértiles (Smith et al., 1997) .
Las frecuencias genotípicas encontradas en el presente estudio coinciden con las reportadas
por Ortega et al., (2016) ya que se encontró una mayor frecuencia para los heterocigóticos
(0.562 y 0.482 respectivamente), seguido de los homocigóticos mutantes (0.254 y 0.273) y
en menor grado los homocigóticos silvestres (0.1830 y 0.244). Esta situación puede ser
generada por el efecto de sobredominancia mencionado anteriormente, donde la frecuencias
genotípicas tienden a mantenerse en equilibrio sin que exista fijación para cierto alelo a lo
largo de diversas generaciones.
Hasta el momento no existen otros estudios donde se reporten las frecuencias y los efectos
del gen en México, la técnica que se desarrolló para genotipificar a las vacas en el presente
trabajo puede ser implementada en el laboratorio sin la necesidad de equipos y reactivos
costosos. Si bien se encontró asociación estadística con una de las variables analizadas, es
necesario realizar más estudios en diferentes poblaciones y con un número mayor de
individuos para poder determinar si éstos resultados son reproducibles en los diferentes
sistemas de producción.
19
6. CONCLUSIONES
Por medio de la técnica de PCR-RFLP fue posible genotipificar los alelos A y G del
polimorfismo 18:25527339 en una población de ganado Holstein.
El alelo mutante G tuvo mayor frecuencia génica que el alelo deseable A, a pesar de esto, la
mayor frecuencia genotípica observada fue la de los individuos heterocigóticos.
El genotipo heterocigótico AG mostró una relación favorable para la variable número de
servicios, además existe un efecto de dominancia significativo para las variables días
abiertos y número de servicios.
Los resultados encontrados en el presente estudio sugieren que el polimorfismo
(18:25527339) del gen COQ9 puede ser de utilidad en posteriores estudios como un
marcador de selección molecular para mejorar el desempeño reproductivo en los establos
lecheros.
20
7. BIBLIOGRAFÍA
Ayala, V. M. A., Villagomez, D. A. F., Galindo, G. J., Sánchez, C. D., y Ávila, F. D., 2007.
Anatomopathologic, cytogenetic and molecular studies of the freemartin syndrome
in cattle (Bos taurus). Redvet. 9, 1-15.
Baltian, L. R., Ripoli, M. V., Aida, Y., Takeshima, S., y Giovambattista, G. 2017.
Estimación de las frecuencias alélicas del gen BoLA-DRB3 en una población de
ganado Holstein de La Pampa mediante secuenciación directa. Ciencia
Veterinaria, 13(1) 66-69.
Beuzen, N. D., Stear, M. J., y Chang, K. C., 2000. Molecular markers and their use in
animal breeding. The Veterinary Journal, 160(1), 42-52.
Chebel, R. C., y Ribeiro, E. S., 2016. Reproductive systems for North American dairy cattle
herds. Veterinary Clinics: Food Animal Practice, 32(2), 267-284.
Duncan, A. J., Bitner-Glindzicz, M., Meunier, B., Costello, H., Hargreaves, I. P., López, L.
C., Hirano, M., Quinzii, C.M., Sadowski, M.I., Hardy, J., Singleton, A., Clayton,
P.T., y Rahman, S., 2009. A nonsense mutation in COQ9 causes autosomal-
recessive neonatal-onset primary coenzyme Q10 deficiency: a potentially treatable
form of mitochondrial disease. The American Journal of Human Genetics, 84(5),
558-566.
Fritz, S., Capitan, A., Djari, A., Rodriguez, S. C., Barbat, A., Baur, A., y Klopp, C., 2013.
Detection of haplotypes associated with prenatal death in dairy cattle and
identification of deleterious mutations in GART, SHBG and SLC37A2. PloS
one, 8(6), e65550.
García-Corzo, L., Luna-Sánchez, M., Doerrier, C., García, J. A., Guarás, A., Acín-Pérez, R.
y Acuña-Castroviejo, D., 2012. Dysfunctional COQ9 protein causes predominant
encephalomyopathy associated with CoQ deficiency. Human Molecular
Genetics, 22(6), 1233-1248.
García-Ruiz, A., Cole, J. B., VanRaden, P. M., Wiggans, G. R., Ruiz-López, F. J., y Van
Tassell, C. P., 2016. Changes in genetic selection differentials and generation
intervals in US Holstein dairy cattle as a result of genomic selection. Proceedings of
the National Academy of Sciences, 201519061.
Giordano, J. O., Thomas, M. J., Catucuamba, G., Curler, M. D., Wijma, R., Stangaferro, M.
L., y Masello, M., 2016. Effect of extending the interval from Presynch to initiation
21
of Ovsynch in a Presynch-Ovsynch protocol on fertility of timed artificial
insemination services in lactating dairy cows. Journal of Dairy Science, 99(1), 746-
757.
Hax, L. T., Schneider, A., Jacometo, C. B., Mattei, P., da Silva, T. C., Farina, G., y Corrêa,
M. N., 2017. Association between polymorphisms in somatotropic axis genes and
fertility of Holstein dairy cows. Theriogenology, 88, 67-72.
Homer, E. M., Derecka, K., Webb, R., y Garnsworthy, P. C., 2013. Mutations in genes
involved in oestrous cycle associated expression of oestrus. Animal Reproduction
Science, 142(3), 106-112.
Jimenez-Krassel, F., Scheetz, D. M., Neuder, L. M., Ireland, J. L. H., Pursley, J. R., Smith,
G. W., Tempelman, R. J., Ferris, T., Roudebush, W. E., Mossa, F., Lonergan, P.,
Evans, A. C. y Ireland, J. J., 2015. Concentration of anti-Müllerian hormone in dairy
heifers is positively associated with productive herd life. Journal of Dairy
Science, 98(5), 3036-3045.
Khatib, H., Monson, R. L., Schutzkus, V., Kohl, D. M., Rosa, G. J. M., y Rutledge, J. J.,
2008. Mutations in the STAT5A gene are associated with embryonic survival and
milk composition in cattle. Journal of Dairy Science, 91(2), 784-793.
López-Gatius, F., 2003. Is fertility declining in dairy cattle? : A retrospective study in
northeastern Spain. Theriogenology, 60(1), 89-99.
Nicolini, P., Carriquiry, M., y Meikle, A., 2013. A polymorphism in the insulin-like growth
factor 1 gene is associated with postpartum resumption of ovarian cyclicity in
Holstein-Friesian cows under grazing conditions. Acta Veterinaria
Scandinavica, 55(1), 11.
Ortega, M. S., Wohlgemuth, S., Tribulo, P., Siqueira, L. G., Null, D. J., Cole, J. B. y
Hansen, P. J., 2017. A single nucleotide polymorphism in COQ9 affects
mitochondrial and ovarian function and fertility in Holstein cows. Biology of
Reproduction, 96(3), 652-663.
Ortega, M. S., Denicol, A. C., Cole, J. B., Null, D. J., y Hansen, P. J., 2016. Use of single
nucleotide polymorphisms in candidate genes associated with daughter pregnancy
rate for prediction of genetic merit for reproduction in Holstein cows. Animal
Genetics, 47(3), 288-297.
Óvilo, C., Oliver, A., Noguera, J. L., Clop, A., Barragán, C., Varona, L., Rodríguez, C.,
Toro, M., Sánchez, A., Pérez-Enciso, N. y Silió, L., 2002. Test for positional
22
candidate genes for body composition on pig chromosome 6. Genetics Selection
Evolution, 34(4), 465.
Sahana, G., Nielsen, U. S., Aamand, G. P., Lund, M. S., y Guldbrandtsen, B., 2013. Novel
harmful recessive haplotypes identified for fertility traits in nordic Holstein
cattle. PLoS One, 8(12), e82909.
Schneider, A., Corrêa, M. N., y Butler, W. R., 2013. Association between growth hormone
receptor AluI polymorphism and fertility of Holstein cows. Theriogenology, 80(9),
1061-1066.
Smith, P., 0, W. S., Corrigan, K. A., Smith, T., Lundy, T., Davis, G. H., y McNatty, K. P.,
1997. Ovarian Morphology and Endocrine Characteristics of Female Sheep Fetuses
that are Heterozygous or Homozygous for the Inverdale Prolificacy Gene. Biology
of Reproduction, 57(5), 1183-1192.
Tanaka, T., Arai, M., Ohtani, S., Uemura, S., Kuroiwa, T., Kim, S., y Kamomae, H., 2008.
Influence of parity on follicular dynamics and resumption of ovarian cycle in
postpartum dairy cows. Animal Reproduction Science, 108(1-2), 134-143.
Veerkamp, R. F., Beerda, B., y Van der Lende, T., 2003. Effects of genetic selection for
milk yield on energy balance, levels of hormones, and metabolites in lactating
cattle, and possible links to reduced fertility. Livestock Production Science, 83(2),
257-275.
Wathes, D. C., Fenwick, M., Cheng, Z., Bourne, N., Llewellyn, S., Morris, D. G., Jenny,
D., Murphy, J. y Fitzpatrick, R., 2007. Influence of negative energy balance on
cyclicity and fertility in the high producing dairy cow. Theriogenology, 68, S232-
S241.
Wall, E., Brotherstone, S., Woolliams, J. A., Banos, G., y Coffey, M. P., 2003. Genetic
evaluation of fertility using direct and correlated traits. Journal of Dairy
Science, 86(12), 4093-4102.