VI IBEROLAB
GUIA PARA LA VERIFICACION DE ESPECTOFOTOMETROS UV-VISIBLE
UTILIZADOS EN EL ANALISIS DE SUELO Y AGUA.
Azcarate M.P.(1); Kloster N.S. (2) ; Ostinelli M. (3); Carreira
D. (3)1
Laboratorio de Anlisis Agronmicos. E.E.A. Chubut. INTA. Ex Ruta
25 Km 1480. (9100) Trelew. Chubut. Argentina. EMail:
[email protected] 2 Laboratorio de Suelo y Agua. E.E.A.
Anguil, INTA. RN N5 km 580. (6326) Anguil. La Pampa. Argentina.
E-Mail: [email protected] 3 Laboratorio de Suelos.
Instituto de Suelos. INTA Castelar. Las Cabaas y De Los Reseros s/n
(1712) Villa Udaondo. Castelar. Buenos Aires. Argentina. E-Mail:
[email protected]; [email protected].
REA TEMTICA. (Marque una opcin) REQUISITOS TCNICOS 3. Campo de
aplicacin RESUMEN. La espectrofotometra es una tcnica ampliamente
utilizada en los laboratorios para el anlisis cuantitativo de
numerosos compuestos, debido principalmente a su sencillez
operativa y a la rapidez en el anlisis. La concentracin de una
sustancia puede ser calculada a partir de la cantidad de luz
absorbida por una muestra, en el rango del espectro del
ultravioleta (UV) y visible (Vis) aplicando la ley de Lambert-Beer.
Por ello, para generar datos confiables es de gran importancia la
verificacin previa del funcionamiento del espectrofotmetro. Los
principales parmetros a controlar en estos equipos son: la
exactitud de la longitud de onda, la exactitud y precisin
fotomtrica, la linealidad fotomtrica y la verificacin de la luz
difusa o parsita. PALABRAS CLAVE. Espectrofotmetro. UV-Vis.
Verificacin. Suelo. Agua Espectrofotmetros UV-Vis utilizados para
el anlisis de muestras de suelo y agua para uso agropecuario. 4.
Fundamentos 4.1. Equipamiento La mayora de los instrumentos
espectroscpicos, como el espectrofotmetro, estn constituidos por
cinco componentes: lmpara o fuente luminosa, selector de longitud
de onda , celda para alojar la muestra, detector de radiacin, y
amplificador de seal con medidor o registrador. 4.2. Teora Desde
hace muchos aos se han utilizado las propiedades de la luz y su
interaccin con las sustancias para identificarlas y determinar la
concentracin de las mismas. Estos estudios se basan en la estrecha
relacin que existe entre la absorcin de la radiacin electromagntica
de las sustancias, tanto en la zona del espectro visible como en el
ultravioleta e infrarrojo, y su concentracin. Si un haz de luz
monocromtico paralelo (I0) atraviesa una cubeta de b cm de paso
ptico, conteniendo una solucin con una concentracin (c) de una
especie absorbente. A causa de la interaccin de la luz y de las
partculas absorbentes la intensidad del haz se atena de I0 a I. La
transmitancia (T) de la solucin es entonces la fraccin de la
radiacin incidente transmitida por la solucin: T = I / I0 (1)
Tambin puede expresarse en forma porcentual: T (%) = I / I0 x 100
(2)
1. Introduccin En el anlisis de muestras de suelo y agua, el
espectrofotmetro constituye una herramienta fundamental para la
cuantificacin de nutrientes y contaminantes. Del correcto desempeo
de este instrumento depender en gran medida la calidad de los
resultados obtenidos, por lo que se considera un equipo crtico en
los ensayos de laboratorio y que necesariamente deber ser
verificado peridicamente. 2. Objetivos El objetivo de sta gua es
proporcionar informacin til para verificar el correcto
funcionamiento de los espectrofotmetros UV-Vis del laboratorio.
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A fin de obtener ecuaciones de ajuste lineal se utiliza su
transformada logartmica conocida como absorbancia (A) de una
solucin y definida por la ecuacin A = - log T = log I0/I (3) La
absorbancia de una solucin aumenta cuanto mayor es la atenuacin del
haz de luz, ocurriendo lo inverso en la transmitancia. La
absorbancia es directamente proporcional a la longitud b de la
trayectoria a travs de la solucin, y a la concentracin c de la
especie absorbente. Estas relaciones se expresan en la ley de
Lambert-Beer como: A = bc (4) = absortividad molar expresada en L
mol cm b = distancia recorrida a travs de la solucin (paso ptico)
expresada en cm c = concentracin de la solucin expresada en mol
L-1, 5. Desarrollo El Responsable del Sistema de Gestin de Calidad
del Laboratorio (SGC) deber definir el programa de verificacin del
equipamiento del laboratorio, en el cual incluir las actividades a
realizar, sus responsables y la periodicidad de los controles. Esta
ltima se define en funcin de las condiciones de uso y el registro
acumulado de funcionamiento de los equipos. Las principales pruebas
recomendadas en la bibliografa consultada, para verificar el
correcto funcionamiento de un espectrofotmetro incluyen: la
exactitud de la longitud de onda, la exactitud y precisin
fotomtrica, la linealidad fotomtrica y la verificacin de la luz
difusa o parsita. 5.1. Soluciones de calibracin Se encuentran
disponibles en el mercado, materiales de referencia certificados de
estas soluciones, aunque las mismas se pueden preparar en el
laboratorio a partir de reactivos de alta pureza y cuyas
propiedades fsicas y qumicas sean conocidas. Para materiales sin
evidencia formal de la trazabilidad (y su incertidumbre) es
responsabilidad de los laboratorios demostrar que los mismos son
aptos para el fin previsto. 5.1.1. Solucin de xido de holmio en
cido perclrico. Disolver en un vaso de precipitados 4,0 g de xido
de holmio (III) en 96,0 g de cido perclrico al 10% (v/v). Calentar
y agitar para facilitar su disolucin y luego dejar en reposo por 24
hs, a temperatura ambiente. 5.1.2. Solucin de sulfato de cobre en
cido sulfrico. Disolver en un vaso de precipitados 20,0 g de
sulfato de cobre pentahidratado, de una pureza mayor al 99,9%, en-1
-1
suficiente agua destilada. Adicionar, con cuidado, 10 ml de cido
sulfrico (d = 1,84 g cm-3), y trasvasar cuantitativamente la
solucin a un matraz aforado de 1 litro. Enrasar con agua destilada
y homogeneizar. 5.1.3. Solucin de cido sulfrico 0,005 mol L-1 Pesar
en un vaso de precipitados 0,49 g de cido sulfrico (d = 1,84 g
cm-3), diluir con agua destilada y trasvasar cuantitativamente a un
matraz de 1 litro. Enrasar con agua destilada y homogeneizar. 5.1.4
Soluciones de Dicromato de potasio a) Solucin de concentracin 0,10
g L-1 Secar aproximadamente 1 g de dicromato de potasio, de una
pureza mnima de 99,95%, en estufa a 105 C por 2 horas y enfriar en
desecador. Pesar 0,10 g y disolver en un vaso de precipitados con
la solucin de cido sulfrico 0,005 mol L-1. Trasvasar
cuantitativamente a un matraz de un litro, enrasar con la solucin
de cido sulfrico 0,005 mol L-1 y homogeneizar. b) Serie de
soluciones de Dicromato de potasio Preparar cuatro soluciones de
dicromato de potasio de diferente concentracin, requeridas para los
controles, a partir de la solucin de 0,10g L-1, tal como se indica
en la tabla 1, enrasando a un volumen final de 100 ml con cido
sulfrico 0,005 mol L-1. Tabla 1. Serie de soluciones de dicromato
de potasio.Concentracin (g L-1) 0,02 0,04 0,06 0,08 ml de solucin
de concentracin 0,10 g L-1 20 40 60 80
5.1.5. Solucin de Nitrito de sodio Secar aproximadamente 70 g de
nitrito de sodio en estufa a 105C por 2 horas y enfriar en
desecador. Pesar 50 g, disolver en un vaso de precipitados con agua
destilada y trasvasar cuantitativamente a un matraz de un litro.
Enrasar con agua destilada y homogeneizar. 5.2. Parmetros 5.2.1
Control de la exactitud de la longitud de onda La desviacin de la
longitud de onda puede causar errores en los resultados
cuantitativos de la lectura en el UV-Vis. En este control se
verifica el grado de concordancia entre la longitud de onda
seleccionada para la mxima absorbancia y la longitud de onda de
referencia. Con una misma cubeta, ajustar el cero (0) del
instrumento
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con la solucin de cido perclrico al 10%. Se recomienda medir
segn el rango espectral una longitud de onda para el espectro UV y
tres longitudes de onda para el espectro Vis. Dependiendo del ancho
de banda del equipo, la mxima absorcin de la solucin de xido de
holmio en cido perclrico se detectar a las longitudes de onda
indicadas en la tabla 2. Tabla 2. Longitudes de onda () de mxima
absorcin de la solucin de xido de Holmio en cido perclrico.Ancho de
banda (nm) 1 2 1 2 241,1 241,0 385,6 386,0 249,9 250,1 416,3 416,9
de mxima absorcin (nm) Rango UV 287,2 333,5 287,6 333,5 Rango Vis
467,8 485,2 468,1 485,2
valores y confrontndolos con los valores de referencia. 5.2.3.
Control de la precisin fotomtrica Se denomina precisin fotomtrica a
la medida de la dispersin de una serie de mediciones de absorbancia
alrededor de la media, y se expresa como coeficiente de variacin
porcentual. Para la determinacin, utilizar los datos obtenidos en
la prueba de exactitud fotomtrica (5.2.2), con la solucin de
dicromato de potasio de 0,06 g L-1 a las siguientes longitudes de
onda: 235, 257, 313, 350 nm. 5.2.4. Control de la linealidad
fotomtrica
278,1 278,1 451,4 451,3
345,4 345,5 536,6 537,2
361,3 361,1 640,5 641,1
5.2.2. Control de la exactitud fotomtrica La exactitud
fotomtrica se determina comparando la absorbancia de una solucin de
referencia (Tabla 3) con la lectura de sta, obtenida en el
espectrofotmetro. Para cubrir satisfactoriamente el rango UV-Vis
del espectro, se utilizan dos soluciones diferentes: dicromato de
potasio, para el espectro UV y sulfato de cobre, para el espectro
Vis. Tabla 3. Absorbancias de referencia de las soluciones en el
rango UV-VisLongitud de onda (nm) 235 257 313 350 600 650 700 750
Absorbancia de Referencia 0,748 0,865 0,292 0,640 0,068 0,224 0,527
0,817
El estudio de la linealidad fotomtrica permite establecer el
rango de absorbancia en el que el instrumento tiene respuesta
proporcional a los cambios de concentracin. Para ello se determina
la respuesta del espectrofotmetro a diferentes concentraciones de
una sustancia que cumpla con la ley de Lambert-Beer. Se evala la
linealidad fotomtrica realizando lecturas de absorbancia de la
serie de soluciones de dicromato de potasio (0,02; 0,04; 0,06; 0,08
y 0,1 g L-1), utilizando la solucin de cido sulfrico 0,005 mol L-1
para realizar el ajuste a 0 de absorbancia del equipo. Las
longitudes de onda a que se realizan las lecturas sern: 235, 257,
313 y 350 nm. 5.2.5. Control de Luz difusa o parsita Se denomina as
a toda radiacin electromagntica de longitud de onda distinta a la
seleccionada por el monocromador, que alcanza el detector y por lo
tanto queda registrada por el instrumento. Este control se basa en
la medida del porcentaje de transmitancia de una solucin de nitrito
de sodio 50 g L-1. Esta sustancia tiene la propiedad de que sus
soluciones absorben toda la radiacin incidente de longitudes de
onda menores a los 390 nm, es decir, que es pticamente opaca a la
luz. Por lo tanto, la transmitancia a 340 nm de esta solucin debe
ser igual a cero, y toda transmitancia detectada corresponde a luz
parsita. El ajuste del equipo a 0 de transmitancia se realiza con
aire, luego se mide la transmitancia de la solucin de nitrito de
sodio a una longitud de onda de 340 nm. Realizar las lecturas por
triplicado. 6. Resultados En la tabla 4 se muestran los clculos y
los resultados aceptables en la verificacin del funcionamiento del
espectrofotmetro. Estos valores de aceptabilidad de los parmetros,
fueron tomados de bibliografa relacionada con la industria
farmacutica y de lineamientos de la farmacopea de diferentes
pases.
Rango UV Solucin de dicromato de potasio en cido sulfrico Rango
Vis Solucin de sulfato de cobre en cido sulfrico
Con una misma cubeta ajustar el 0 de absorbancia del instrumento
con la solucin de cido sulfrico de concentracin 0,005 mol L-1,
utilizada para preparar las soluciones de referencia. Control en el
rango UV: Realizar 6 lecturas consecutivas de la solucin de
dicromato de potasio en cido sulfrico de concentracin 0,06 g L-1 a
las longitudes de onda de 235, 257, 313 y 350 nm, registrando los
valores y confrontndolos con los valores de referencia. Control en
el rango Vis: Realizar 6 lecturas consecutivas de la solucin de
sulfato de cobre en cido sulfrico a las longitudes de onda de 600,
650, 700 y 750 nm, registrando los
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Tabla 4. Clculos y evaluacin de resultados de verificacin de
espectrofotmetros.Parmetros Exactitud de la longitud de onda
Exactitud fotomtrica Precisin fotomtrica Linealidad fotomtrica
Clculos E = m- ref %Error = Am Aref 100 Aref CV% = SD .100 x
Graficar Am vs Aref. Calcular con una regresin lineal el
coeficiente de regresin (r). Resultados Aceptable: UV 1 nm Vis 3 nm
Error entre 2% Optima Error entre 3% Aceptable CV%
