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Agosto 2017
Dr. Juan Mateo Anchordoquy
Laboratorio de Nutrición Mineral y Fisiología de la Reproducción
(FCV-UNLP)
Importancia del zinc en la reproducción bovina
Introducción General
El Zinc (Zn) es un mineral traza esencial.
(Bray y Bettger, 1990; Powell SR, 2000 Prasad, 1998, 2003; Prasad y Kucuk, 2002)
El Zn forma parte funcional y/o estructural “metaloproteínas”.
En todos los casos, la ausencia de zinc en su sitio de acción puede llevar a la pérdida de actividad de la “metaloproteína”.
Deficiencia de Zn (provocada por una carencia nutricional)
Disminución en la actividad metaloproteínas
Manifestaciones subclínicas y clínicas de la deficiencia
HipoZn. Moderada
89 - 40 µg/dl 40 µg/dl
Normozincemia
> 90 µg/dl 90 µg/dl
HipoZn. Severa
< 40 µg/dl 0 µg/dl
Zn-plasma
Diagnóstico serológico
Evolución de la carencia Kincaid (1999) y Underwood y Sutlle (1999)
Las consecuencias
Clínicas
Subclínicas
Menores ganancias de peso
Menor resistencia a infecciones
Menor eficiencia reproductiva
• Retraso de la maduración sexual
• Retención placentaria
• Alteración del ciclo estral
• Aumenta el riesgo de aborto espontáneo
(Grahn y col., 1994, 2001; Falchuk y Montorzi, 2001)
Consecuencias reproductivas de la deficiencia de Zn:
Zn++
Maduración del ovocito Desarrollo embrionario temprano
Concentración de Zn
Plasma 1,32 µg/ml ± 0,22a
Licor folicular (FG) 1,49 µg/ml ± 0,37a
Licor folicular (FP) 1,55 µg/ml ± 0,33a
TCM 199 + 10% SFB 0,3 µg/ml ± 0,02b
Los valores con distintas letras dentro de cada columna son estadísticamente diferentes (p < 0,01)
Se establecieron cuatro condiciones de maduración:
Control (TCM 199 + 10% SFB): 0,3 μg/ml Zn
Zn1: 0,7 μg/ml Zn
Zn2: 1,1 μg/ml Zn
Zn3: 1,5 μg/ml Zn Estatus en bovino Zn en plasma μg/ml
Deficiente 0,2 a 0,39
Deficiente marginal 0,4 a 0,89
Adecuado 0,9 a 1,9 Kincaid, 1999
Maduración del ovocito
Maduración nuclear
Maduración citoplasmática
Tasa de apoptosis en CC
Integridad del ADN de CC
Concentración intracelular de GSH
Actividad SOD del COC
Nivel de ROS del COC
Concentración intracelular de GSH/GSSG en ovocitos y células del cúmulus bovinos maduradas con diferentes
concentraciones de Zinc.
(p < 0,001)
Control Zn1 Zn2 Zn3
GSH-GSSG en ovocito
(pmol/ovocitos) 3,0 ± 0,9a 1,8 ± 0,5b 3,7 ± 0,4a 4,0 ± 0,5a
GSH-GSSG en cúmulus
(nmol/106 células) 0,3 ± 0,05a 0,2 ± 0,02b 0,5 ± 0,04c 0,5 ± 0,04c
Se maduraron 800 COC, colectados en días diferentes (n= 4 repeticiones), 200 COC por día (50/tratamiento).
Actividad SOD del complejo ovocito-cúmulus luego de la MIV
con y sin el agregado de zinc.
0
1
2
3
4
5
6
7
Control Zn3
Un
idad
es
SOD
/CO
C 1
0-3
b
a
Nivel de ERO de CC luego de la MIV con y sin el agregado de zinc
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
Control Zn3N
ivel
ERO
s (in
tens
idad
fluo
resc
enci
a)
a
b
Olive Tail Moment (OTM) en células del cúmulus.
Efecto de diferentes concentraciones de zinc sobre la tasa de apoptosis en células del cúmulus evaluado con Anexina V-FLUOS.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
Control Zn1 Zn2 Zn3
OTM
a
b
b b
Maduración del ovocito
Maduración nuclear
Maduración citoplasmática
Tasa de apoptosis en CC
Integridad del ADN de CC
Concentración intracelular de GSH
Actividad SOD del COC
Nivel de ROS del COC
Control Zn1 Zn2 Zn3
N° Ovocitos 313 339 309 304
% de Clivados 66,63a 71,46a 75,30a 73,08a
% Blastocistos/ovocitos 17,99a 21,28a 30,48b 31,37b
% Blastocistos/clivados 27,07a 28,99a 40,60b 42,97b
Capacidad de desarrollo de ovocitos bovinos madurados in vitro con diferentes concentraciones de zinc.
La tasa de blastocistos se incrementa un 26,4 % por cada aumento de 0,4 μg/ml Zn en el medio de MIV.
0
10
20
30
40
50
60
Control Zn1 Zn2 Zn3
% H
atch
ing
a
b b
c
Efecto del zinc en el medio de MIV sobre el porcentaje de blastocistos eclocionados
(hatching).
Número de células por blastocisto al Día 8 de cultivo.
0
20
40
60
80
100
120
140
Control Zn1 Zn2 Zn3
N°c
élul
as/b
last
ocis
to
aa
b b
Concentración de Zn
Plasma 1,32 µg/ml ± 0,22a
Licor folicular (FG) 1,49 µg/ml ± 0,37a
Licor folicular (FP) 1,55 µg/ml ± 0,33a
TCM 199 + 10% SFB 0,3 µg/ml ± 0,02b
Los valores con distintas letras dentro de cada columna son estadísticamente diferentes (p < 0,01)
0
50
100
150
200
250
300
350
400
0 50 100 150 200 250
Zn Plasma
Zn L
F (F
< 10
mm
) R2 ajustado 0.09 pendiente 0.43
intercepción 93.45
0
50
100
150
200
250
300
350
0 50 100 150 200 250
Zn L
F (F
> 10
mm
)
Zn Plasma
R2 ajustado 0.17 pendiente 0.52
intercepción 59.7
El objetivo fue estudiar el rol de las CC en el transporte de Zn entre el medio externo y el ovocito.
Material y Métodos
COC
Ovocito + CC
Ovocito
Control
Zn3
Maduración (24hs)
Rol de las CC durante la MIV de ovocitos bovinos en presencia de Zn sobre la capacidad de desarrollo posterior
a b
a b a
b
número de células por blastocisto al Día 8
60
80
100
120
140
COC DO+CC DO
N°c
élul
as/b
last
cist
o
Control
Zn3
b
c
d d
aa
Fecundación del ovocito
Seminal plasma zinc concentrations from infertile males are lower than those from normal controls
Zinc supplementation → ↑semen volume, sperm motility and % normal sperm morphology
Estabilización de la membrana celular
Estabilización de la cromatina
Propiedad antioxidante (SOD)
Participa en la capacitación (RZn- EGFR)
Actividad antibacteriana (semenogelin)
Participa en la RA (RZn- EGFR)
500 ml semen = Zn Volemia total
0 1 2 3
500 ml semen = Zn Volemia total Curvas de nivel plasmático
0 h 7 h 24h D7 D14 D 21 D28
Curvas de nivel plasmático
0 h 7 h 24h D7 D14 D 21 D28
Estudio Cinético (So4Zn)
• Efecto de concentraciones “Adecuadas” y deficientes de Zn sobre:
▫ Integridad de la membrana plasmática (eosina-nigrosina;
HOST).
▫ Motilidad progresiva (método subjetivo).
▫ Estatus acrosomal (Pisum sativum)
▫ Capacidad de unión a la zona pelúcida (Hoeschst 33342).
Percoll Medio FIV 2 x10⁶ esp/ml
Control 40 µg/dl 80 µg/dl
120 µg/dl
Evaluaciones
0 Hs. 3 Hs. 6 Hs.
50,0
55,0
60,0
65,0
70,0
75,0
80,0
85,0
90,0
0hs 3hs 6hs
control
0.4
0.8
1.2
a a a a
bc bc b b
c cd de
e
Viability (%)
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
45,00
0 hs 3 hs 6 hs
Control
0.4
0.8
1.2
a a a a
b bc
c
b b
c
bc bc
HOST positive (%)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 hs 3 hs 6 hs
Control
0.4
0.8
1.2
a a a a
b b
c c
d d d e
Progressive Motility (%)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 hs 3 hs 6 hs
Control
0.4
0.8
1.2
a a a a
b c
d
c
b b b b
Acrosomal status (acrosome integrity)
Sperm-zona pellucid binding
0
10
20
30
40
50
60
Control 0.4 0.8 1.2
Espe
rmat
ozoi
des/
zona
pel
úcid
a
a
b
c
a b
• Efecto del Zn durante la FIV sobre la formación de pronúcleos.
MIV 24 Hs.
FIV 18 Hs.
Control 40 µg/dl 80 µg/dl 120 µg/dl
S/F 1P 2P 2P+ DegControl 23.1 15.4 53.8 2.6 5.11.2 Zn 22.2 6.3 65.1 0.0 6.3
%
↑ Viabilidad ↑ Mot. Progr. ↑ unión E-ZP ↑ FECUNDACIÓN
ACTIVACIÒN
Desarrollo Temprano Zinc supplementation (µg/mL Zn)
0 0.4 0.8 1.2
No. Oocytes 97 87 89 87
Cleaved (%) 58,9 ± 4,3 64,6 ± 4,3 67,4 ± 4,3 70,0 ± 4,3
Blastocyst/oocyte (%) 15,6 ± 4,5 20,7 ± 4,5 21,7 ± 4,5 17,4 ± 4,5
Hatched (%) 42,6 ± 7,3 29,2 ± 7,3 22,4 ± 7,3 33,4 ± 7,3
Homeostasis del zinc
FSH, LH, E2 E2 y P4
Resultados preliminares
Tipo celular
T=0 de maduración
Suplementación hormonal
Sin suplementación hormonal
Con Zn Sin Zn Con Zn Sin Zn Zip6 Ovocitos + - + + +
Cúmulus - - - - - Znt3 Ovocitos - - - - -
Cúmulus - + - + - Znt7 Ovocitos - - - - -
Cúmulus - - - - - Znt9 Ovocitos - - - + +
Cúmulus - + - - -
Expresión génica de transportadores de zinc en el complejo ovocito-cúmulus bovino: influencia de tres hormonas reproductivas
Concentración de zinc “libre” en el ovocito bovino luego de MIV
Rol antioxidante del zinc en el sistema reproductor bovino: efecto de tres hormonas reproductivas en las células del cúmulus
A) Control -H -Zn
B) -H +Zn
C) 3H -Zn
D) 3H +Zn B) Niv
eles
de
ERO
s (in
tens
idad
rela
tiva
de
fluor
esce
ncia
)
C) D) A)
a a
b
c
Relevamiento del estatus de Zn en rodeos de la CDS
1) Conocer el nivel de Prevalencia de la carencia de zinc en la CDS
• Cuatro estaciones • 3 Establ. (un partido) • Medición de Zn en el suelo,
forraje y hembras en edad reproductiva.
Relación suelo-planta-animal
Causa ↓Zn
• Toma de muestra • 2 mg BE
Establecer el riesgo de pérdidas reproductivas.
DIB (1g P4)
• 150 μg d-cloprostenol • 0.5 mg CE IATF
7 días 52-56 Hs.
Diagnóstico de preñez a los 40 días.
Consecuencias reproductivas de la carencia de Zn
2025303540455055606570
< 110 110-139 140-169 170-199 200-300
Preñ
ez (%
)
140 - 169 > 170
140 - 169 < 139
Categorías