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UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIAFACULTAD DE CIENCIAS

DEPARTAMENTO DE QUÍMICALABORATORIO DE QUÍMICA ORGÁNICA I (1000035)

RESUMEN:

Seminario de la Historia de la Cromatografía.

Introducción

La cromatografía es una de las operaciones fundamentales de la química gracias a su versatilidad y simplicidad para separar mezclas que no se pueden resolver por métodos tradicionales como la destilación o la filtración, es gracias a las diferencias en propiedades diferentes a la solubilidad o el punto de ebullición que esta técnica logra segregar componentes con propiedades físicas o químicas muy similares, o, que se presentan en cantidades mínimas. Entonces, los métodos cromatográficos se basan en características tales como la capacidad de adsorción, el peso molecular y la disposición para intercambiar iones, además, también tiene como principio el colocar en contacto dos fases mutuamente inmiscibles denominadas la fase estacionaria y la fase móvil.

En fundamento a las propiedades que utiliza la cromatografía hace que se pueda clasificar en: cromatografía de adsorción, de reparto, de intercambio iónico, o, por exclusión de tamaño, además, la cromatografía también se puede dividir según la técnica empleada, por ejemplo: cromatografía en columna liquida, en papel, en capa delgada o de gases; en todas ellas predominan alguno de los fenómenos descritos y es debido al alto grado de repetición de dicho proceso a través de la fase denominada estacionaria que los métodos cromatográficos son tan eficientes. En el presente resumen se propone una breve contextualización de la historia de la cromatografía así como una muestra de la terminología usada en dicho procedimiento.

Glosario de los términos más usados en cromatografía

Absorción: Proceso que consiste en la retención de un fluido (gas o líquido) dentro del cuerpo o la masa de un material sólido o líquido.

Adsorción: Proceso en el cual el fluido es retenido sobre la superficie del material sólido, durante un tiempo corto pero suficiente para que se establezca el equilibrio dinámico entre la fase adsorbida (partículas adsorbidas) y el resto el fluido (partículas no adsorbidas).Activación de las placas: Es la operación de calentamiento de las placas con la cual se obtiene un material libre de la película del líquido que impediría una adsorción eficiente de los compuestos.

Altura equivalente del plato teórico (AEPT): Longitud correspondiente a un plato teórico.

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Cámara: Recipiente, generalmente de vidrio, cuya tapa cierra herméticamente, en donde se desarrolla el cromatograma.

Capa: Sorbente extendido homogéneamente sobre el soporte.

Cocromatografía: Cromatografía de la mezcla de sustancia problema y patrón probable, en diferentes sistemas, con el fin de verificar la identidad de la sustancia problema.

Cromatografía: Es un método de fraccionamiento y separación de los componentes de mezclas, basado en la migración diferencial de los componentes transportados en una fase móvil que migra a través de una fase estacionaria.

Cromatografía analítica: Es el proceso que permite separar los compuestos de una mezcla con el objeto de detectar y/o cuantificar las sustancias que constituyen una mezcla.

Cromatografía preparativa: Es el proceso cuyo objetivo es aislar compuestos de una mezcla en una cantidad suficiente para un estudio posterior o uso comercial.

Cromatografía de afinidad o adsorción bioespecífica: Se basa en la formación de complejos estables entre dos compuestos que interactúan específicamente. Se usa para separar sustancias que tienen actividad biológica.

Cromatografía de capa delgada de alta eficiencia (HPTLC): Es la cromatografía de capa delgada en la cual se han optimizado las variables: Fase estacionaria, método de aplicación de la fase móvil, procedimiento para acondicionar las placas y sistema para adquirir y procesar los datos. Con lo anterior se logra una mayor eficiencia en la separación y mayor reproducibilidad y concordancia entre los datos teóricos y los resultados prácticos.

Cromatografía en fase reversa: Es el proceso cromatográfico que utiliza fase estacionaria impregnada o transformada con un compuesto menos polar que la fase móvil, al contrario de las cromatografías corrientes o en fase normal, en las cuales la fase estacionaria es más polar que la fase móvil.

Cromatografía por filtración en gel o exclusión de tamaño: Es el proceso que permite la separación de los componentes de mezclas según su peso molecular y su consecuente capacidad diferencial para difundirse en el interior de geles no iónicos. Se utiliza principalmente en bioquímica para la separación de macromoléculas.

Cromatografía de gases: Es la cromatografía cuya fase móvil es gaseosa, por lo cual se requiere aparatos especiales. Permite separaciones rápidas y muy eficientes. Se subdivide en cromatografías gas-líquido y gas-sólido.

Cromatografía de gota en contracorriente (DCC): Es una cromatografía basada en la diferencia de los coeficientes de reparto de los componentes de la mezcla. Se realiza en un aparato formado por un gran número de tubos conectados, por los cuales fluyen en contracorriente dos solventes inmiscibles en forma de gotas. Se emplea para separaciones cualitativas y cuantitativas de mezclas a escala micro y semimicro.

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Cromatografía de intercambio iónico: Es la cromatografía en la cual la migración diferencial de los componentes de la mezcla en la forma iónica (fase móvil), depende de las afinidades relativas de los iones por el intercambiador (fase estacionaria). Los iones de una fase desplazan estequiométricamente los iones de la otra fase.

Cromatografía líquida de alta eficiencia: Es una cromatografía que utiliza columnas cuyo material de empaque tiene partículas tan pequeñas (ℳm) que permite separaciones eficientes, pero al mismo tiempo ofrecen resistencia al flujo de la fase móvil, por lo cual es necesario emplear sistemas de bombeo de alta presión (mayor a 20 atm). Con esta cromatografía se logran separaciones rápidas y reproducibles.

Cromatograma: Papel o placa en donde se registra o se realiza la separación de los componentes de una mezcla.

Desarrollo: Es la migración de la fase móvil a través de la fase estacionaria, con el objeto de separar una mezcla. De acuerdo con la dirección en que se realice es ascendente, descendente u horizontal; según la técnica puede ser sencillo, múltiple, continuo, circular, en cuña o bidimensional.

Desorción: Es el proceso inverso a la sorción, es decir, la liberación de los componentes de la muestra de la fase estacionaria.

Eficiencia: Medida empleada para evaluar la separación en una columna. Se expresa en número de platos teóricos.

Elución: Es la remoción de un compuesto de la fase estacionaria por acción del eluyente.

Eluyente: Es el nombre que se le da al solvente.

Fase estacionaria: La fase estacionaria es un líquido o sólido de partículas finas y homogéneas, el cual permanece fijo en el soporte mientras se realiza la cromatografía.

Fase móvil: Llamada también solvente o eluyente; es un líquido o un gas inmiscible con la fase estacionaria, el cual fluye a través de ésta, de manera que estén en contacto en una gran interfase. Es, además, la que transporta y eluye los compuestos de la mezcla.

Frente del solvente: Línea que señala el fin de la migración de la fase móvil.

Mancha: sitio de la fase estacionaria, en donde se haya localizado cada compuesto de la mezcla, después de efectuados el desarrollo y el revelado.

Número de platos teóricos: Indica las veces que se establece el equilibrio dinámico del soluto entre la fase sorbida y la fase móvil, para una determinada migración cromatográfica.

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Origen: Sitio en donde se aplica o siembra la muestra.

Patrón de referencia: Compuesto cromatográfico puro que se aplica simultáneamente con el problema, para ayudar a su identificación, por comparación de los valores de Rf.

Placa: Es el conjunto de soporte y sorbente extendido éste sobre aquél.

Reparto: Distribución de un soluto entre dos o más solventes inmiscibles de acuerdo con su solubilidad.

Resolución: Es el grado de separación entre dos sustancias. En cromatografía líquida está afectada por tres factores independientes: Selectividad, eficiencia y capacidad.

Revelador: Agente físico o químico que permite localizar cada compuesto en el cromatograma.

Selectividad: En cromatografía líquida es uno de los factores que afecta la resolución de una mezcla. A mayor selectividad, mayor separación de las dos sustancias adyacentes. En cromatografía de intercambio iónico es el grado de preferencia que tiene una resina por un ión con relación a otro.

Sembrar: Aplicar la muestra en la fase estacionaria.

Serie eluotrópica: Tabla en la cual se han colocado los eluyentes, en orden creciente de poder de elución, en fase normal.

Serie mixotrópica: Tabla en la cual se han colocado los eluyentes, en orden creciente de poder de elución, en fase normal.

Sistema cromatográfico: Es el conjunto de solvente o eluyente y fase estacionaria. Algunos autores incluyen, además, las condiciones de temperatura, concentración y pH en los cuales se realiza la cromatografía.

Soporte: Lámina de vidrio, plástico, metal o papel sobre la cual se coloca la fase estacionaria.

Sorbente: Este término comprende una gran variedad de sustancias empleadas como fase estacionaria. Entre ellas se tienen las que permiten las separaciones por adsorción, por reparto o por intercambio iónico; además, la superficie de cierto solventes no polares, por ejemplo en la cromatografía en fase invertida.

Sorción: Incluye todos los fenómenos en los cuales se basan las separaciones cromatográficas en los diferentes sorbentes, tales como retención superficial e interna, fuerzas electrostáticas, puentes de hidrógeno etc., que permiten regular separaciones por adsorción, reparto, intercambio iónico etc. Valor de Rf o relación de flujos: Se considera una constante de un compuesto en un sistema cromatográfico dado. Se determina en el cromatograma por la relación entre la distancia recorrida

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por el compuesto desde el origen al centro de la mancha, y la distancia desde el origen hasta el frente del solvente. El valor de Rf depende de varios factores.

Valor Rx: Es la relación Es la relación entre las distancias recorridas en el cromatograma por un compuesto y la recorrida por un patrón de referencia

Valor Rm: Es una constante característica del soluto en un sistema cromatográfico dado; éste parámetro es de naturaleza aditiva. El Rm de una molécula se considera como la suma de los Rm parciales de los grupos o átomos constituyentes de la molécula.

Valor Rm=log(1 /Rf−1)

Historia

“Cuando llegaron a Mara no pudieron beber las aguas de Mara porque eran amargas… Entonces Moisés clamó al SEÑOR, y el SEÑOR le mostró un árbol; y él lo echó en las aguas, y las aguas se volvieron dulces.” [1]

Aunque la cromatografía como técnica se describió por primera vez en 1903, desde tiempo atrás se observaron fenómenos relacionados con esta, ese fragmento de la biblia es tal vez la referencia más antigua para un intercambio iónico, propiedad de la materia presente en la naturaleza desde el origen de la misma, en la que se utiliza la celulosa como medio para purificar agua.

Se presume que Aristóteles observó propiedades adsorbentes de algunas tierras, en la purificación del agua de mar. Y Plinio el Viejo separó una mezcla que contenía sulfato ferroso, utilizando papiros. [2]

En el año 1850 dos científicos ingleses, H.S.M. Thompson y J.T. Way reconocieron e investigaron separadamente el fenómeno de intercambio iónico en suelos [3], el cual fue base para el desarrollo investigativo del intercambio iónico de sólidos. En 1855 el químico alemán F.F. Runge se aprovechó de la acción capilar del papel secante como medio para visualizar los cambios químicos, y en su libro “Bildungstrieb der Stoffe” describe técnicas que son las precursoras de la cromatografía en papel moderna. [4]

En el año 1876, Lemberg contribuyó grandemente al deducir la estequiometria y reversibilidad de las reacciones de intercambio iónico que se producen al transformar leucita en analcita [6].

Entre 1898 y 1903, el geólogo e ingeniero norteamericano David T. Day (Imagen N° 2),

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separó diversas fracciones de petróleo procedentes de Pensilvania. Principalmente le llamó la atención los colores que presentaban las muestras y sugirió que estas diferencias, al igual que las de viscosidad, peso específico, contenido de azufre. etc, habían sido causadas por un proceso de filtración fraccionada a gran escala geológica, fue entonces cuando reprodujo el experimento a escala de laboratorio de manera exitosa, haciendo pasar aceite crudo a través de una capa de tierra de batán. [7]

A pesar de todos los fenómenos relacionados con métodos cromatográficos descritos previamente, fue el botánico ruso Mikhail Tswett (Imagen N° 3) quien verdaderamente reconoció su importancia y desarrollo un verdadero procedimiento para llevarla a cabo.

En su trabajo en 1903 permitió la separación de pigmentos de plantas, cuyo extracto preparado en éter de petróleo percoló a través de una columna de vidrio, empacada con sulfato de calcio pulverizado.

La mezcla se adsorbió en la parte superior de la columna (Imagen N° 4) y, al lavalarla con el solvente presentó una serie de zonas coloreadas, lo que indica la separación de

dichos pigmentos a lo largo de la columna, es gracias a dichas zonas coloreadas que Tsweet llamó al proceso “Cromatografía”. [8]

Imagen N° 3: Mikhail Tswett. Imagen N° 3: Mikhail Tswett. Imagen N° 3: Mikhail Tswett. Imagen N° 3: Mikhail Tswett. Imagen N° 3: Mikhail Tswett. Imagen N° 3: Mikhail Tswett. Imagen N° 3: Mikhail Tswett. Imagen N° 3: Mikhail Tswett.

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Aunque el descubrimiento de la cromatografía por absorción era un trabajo prometedor, se empleó solo a partir de 1931 gracias al trabajo titulado “Über α- und β- Carotin” por R. Kuhn y E. Lederer, quienes en compañía con A. Winterstein no solo pudieron separar los componentes de la mezcla del caroteno, sino que además, detallaron la composición de los distintos isómeros y con sus técnicas de espectroscopia avanzada demostraron propiedades ópticas que aportaron significativamente una facilidad para identificar moléculas [9].

B.A. Adams y E.L. Holmes obtuvieron las primeras resinas sintéticas de intercambio iónico en 1935, y en 1952 A.J.P. Martin y R.L.M. Synge recibieron el premio Nobel por su trabajo pionero sobre cromatografía de reparto líquido-líquido de 1941 [10], trabajo que mediante el empleo de columnas de silica-gel y con cantidades variadas de agua se adsorbían los compuestos en la sección inicial.

Paralelamente a los trabajos de Martin y Synge, dos científicos rusos Izmailiov y Schraiber prepararon en láminas de vidrio películas adhesivas de alúmina, depositando gotas de extractos alcohólicos de plantas sobre la capa y por goteo gradual de alcohol sobre el centro del ensayo lograron separaciones espectaculares (1938). [11]

En 1944 Consden, Gorden y Martin sustituyeron el soporte de silica-gel por tira de papel y aplicaron el método al análisis de proteínas para la separación de sus componentes moleculares (aminoácidos), trabajo con el cual obtuvieron el premio Nobel de química en 1952. El primer trabajo en el que se hace pasar una fase móvil gaseosa a través de una columna data de 1951, dando lugar a la técnica conocida como cromatografía de gases. Esta técnica, descrita por Martin y James en 1952, es en la actualidad en método usado ampliamente para la separación de los componentes volátiles y semivolátiles de una muestra. [12]

En la Universidad de Chicago en 1953, Lernan logró aislar una enzima de una mezcla de ellas, haciendo pasar dicha mezcla por una columna empacada con un inhibidor de la enzima, a partir de ese acontecimiento se de desarrollo la cromatografía de afinidad o adsorción bioespecífica, utilizada para aislar proteínas. [13]

El principio fundamental de la cromatografía en capa fina ya había sido establecido en 1938, pero no alcanzó una amplia aplicación práctica hasta que Stahl (1956) consiguió estandarizar este nuevo proceso de separación y resultó un método fiable de trabajo en el laboratorio [14]. En 1959 J. Porath y P. Flodin describieron en su trabajo “Gel filtration: a method for desalting and group separation” el cual describe la cromatografía por exclusión de tamaños. [15]

A partir del año 1956 se han modificado las técnicas cromatográficas con el principal objetivo de un análisis más eficaz, se desarrolló la cromatografía con aplicación de presión lo que dio origen la cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC); también, se desarrolló la técnica cromatográfica centrifuga en capa delgada con el fin de superar los inconvenientes presentados [16]; en 1973 A. Zlatkis y R.E. Kaiser describieron una mejora de la cromatografía en capa delgada en su trabajo: “High performance thin layer cromatography”, que entre otras ventajas resulto en el empleo de menor cantidad de muestra y menor tiempo de desarrollo. [17]

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M.R. Berman y R.N. Zare publicaron en 1975 el artículo “Laser Fluorescence Analysis of Chromatograms: Sub-Nanogram - Detection of Aflatoxins” por medio del cual se fortalece la posibilidad de hacer determinaciones cuantitativas por fotorreacciones ya que la ventaja de la técnica radica en que la luz láser produce más fotones que la luz natural [18]. En 1976, los japoneses Y. Ogihara y O. Inove desarrollaron un método para la investigación de productos naturales en cromatografía de gota en contracorriente (DCCC), en donde las separaciones se realizan gracias a las diferencias en los coeficientes de reparto de la mezcla en las fases liquido-liquido, y es un procedimiento útil para hacer determinaciones en pequeña o mini escala. [19]

En la actualidad se utilizan básicamente los mismos métodos, añadiendo técnicas mejoradas para determinar los valores y haciendo uso de microprocesadores que pueden registrar los datos de las placas cromatográficas, donde dichos datos pueden ser leídas y procesadas por computadoras para su análisis.

Bibliografía

[1]. Éxodo, antiguo testamento, 15: 23-25.

[2]. Torres de Young, S., “Introducción a la cromatografía”, eun, Colombia, 1994, p. 20.

[3]. Weber, W.J., “Control de la calidad del agua: Procesos fisicoquímicos”, Reverté, España, 1979, p. 275

[4]. Schewenk E.F., “Friedlieb Runge and his capillary desings”, Bull. Hist. Chem., Volumen 30, numero 1, Alemania, 2005, p. 30.

[5]. E. Merck Ag. Darmstadt, “Chromatographie”, Tafel 1.

[6]. [3].

[7]. Heftmann E., “Chormatography”, Reinhold publishing corporation, Estados Unidos de America, 1961, p. 3.

[8]. [2] p.20-21.

[9]. http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/themes/medicine/states/richard-kuhn.html ., Richard Kuhn and the Chemical Institute: Double Bonds and Biological Mechanisms, (01/12/2013, 7:09 p.m.)

[10]. Harris D.C., “Análisis químico cuantitativo” Sexta edición, Reverté, España, 2003, p.556.

[11]. Areal R., Bessa J., “La cromatografía de capa fina y sus aplicaciones al campo textil”, Universidad politécnica de Cataluña, Boletín Intexter del Instituto de Investigación Textil y de Cooperación Industrial, número 25, artículo 2, España, 1996 p.8.

[12]. Gutierrez M.C., Droguet M., “La cromatografía de gases y la espectrometría de masas: identificación de compuestos causantes de mal olor”, Universidad politécnica de Cataluña, Boletín Intexter del Instituto de Investigación Textil y de Cooperación Industrial, número 130, artículo 5, España, 2002, p.1.

[13]. [2] p.22.

[14]. Beyer H., Walter W., “Manual de química orgánica”, Reverté, España, 1987, p. 9

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[15]. Porath J., Flodin P., “Gel filtration: a method for desalting and group separation”, Suecia, 1959.

[16]. [2] p.22.

[17]. Zlatkis A., Kaiser R.E., “High performance thin layer chromatography”, Elsevier Scientific Publishing Company, numero 211, Estados Unidos de America, p.226.

[18]. M.R. Berman, R.N. Zare, “Laser Fluorescence Analysis of Chromatograms: Sub-Nanogram - Detection of Aflatoxins”, Department of Chemistry Columbia University New York, NY 10027, Analitical Chemistry 47, 1975, p.1200.

[19]. Ogihara Y., Inove O., “Droplet counter-current chromatography for the separation of plant products”, Journal of Chromatography, numero 128, 1976, p. 218.