La sobrerregulación de VEGF durante la transdiferenciación de

células mesoteliales como mecanismo responsable del alto

transporte peritoneal de solutos en pacientes en DP

Hospital Univ. La Princesa. Madrid Hospital Univ. La Paz. Madrid.

Hospital Univ. GuadalajaraGrupo de Estudios Peritoneales de Madrid IRSIN-FRIAT

Introducción

• La DP induce cambios en la célula mesotelial (CM) que sufre un fenómeno de transdiferenciación perdiendo progresivamente su fenotipo epitelial y adquiriendo fenotipo de célula mesenquimal.

• Aparecen miofibroblastos estromales αSMA+ que expresan marcadores mesoteliales lo que sugiere que proceden de la CM a través de un fenómeno de transición epitelial-mesenquimal

ICAM-1ICAM-1

CytokeratinCytokeratin

-SMASubmesotelial

Mesotelial Virch Arch 2004

citokeratina-SMA Mismo paciente

Introducción

• La TEM ha sido demostrada “in vitro” (Yañez-

Mo, NEJM 348:403-413, 2003) e “in vivo” mediante la administración de un adenovirus que activa el gen de TGFβ en el peritoneo de la rata (Peter J. Margetts J Am Soc Nephrol 16: 425-436, 2005) lo que induce el desarrollo precoz de fibrosis y neoangiogénesis

JASN 12:2029, 2001JASN 12:2029, 2001

Day 4 after infection

Day 21

Day 7

Day 28

Day 21 after PBSDay 4 after control virus

Introducción

• El Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) está implicado en los fenómenos de neoangiogénesis y permeabilidad vascular.

• Aunque está demostrada la producción de VEGF por las CM in vitro, la fuente principal de VEGF en la DP y los mecanismos implicados en su regulación no están claros.

Objetivos

Determinar el papel de la CM-no epitelioide (transdiferenciada) – En la producción de VEGF

– En el desarrollo de neoangiogénesis

– En los cambios funcionales que conducen al fallo de UF

Pacientes

• 37 pacientes estables en DP– 18 DPCA y 27 DPA– Edad: 25-79 años (media: 61.7 ± 14.5)– Tiempo en DP: 12.6 ± 15.5 meses (rango 3-62).– Diabéticos: 5 – Soluciones: 29 lactato, 8 bicarbonato, (10 un

intercambio/día con icodextrina)– 6 con Hª de peritonitis (días de inflamación: 6.2 ± 5.54 días).– 32 recibían EPO

• Grupo control– 24 pac. en HD – 15 voluntarios sanos

Métodos Aislamiento y cultivo de las CM

Origen de las CM en cultivo – Pacientes: CM procedentes del efluente peritoneal del intercambio

nocturno – Controles: Omento de sujetos sanos sometidos a cirugía abdominal

(previo CI).– Cultivo en medio de Earle M199 y Biogro-2– Marcadores de CM: Citokeratina, ICAM-1 y calretinina)

– Fenotipos de CM en cultivo • Epitelial• No-epitelial

– Transicional – Fibroblastoide

– Se inducía EMT in vitro con TGFβ e IL-1– Los cultivos de CM no estaban contaminados con células endoteliales (F. von

Willebrand negativo)

Métodos

• Biopsias MP: Peritoneo parietal de la pared abdominal anterior durante cirugía o durante el Tx

– Muestras• 6 pacientes en DP con Cr-MTC>11 ml/min• 6 pacientes en DP con Cr-MTC<11 ml/min• 6 controles

– Histología e inmunohistoquímica (VEGF, citokeratinas, αSMA, FvW)

• Suero:– Simultanea con la recogida del efluente (DP) – Antes de la primera sesión de la semana (HD)

• Determinaciones– Western Blot Analysis del lisado del cultivo de CM– VEGF (ELISA): en el sobrenadante de las células a confluencia y en suero

• Cálculos funcionales: MTC-urea y MTC-Cr por métodos standard

Resultados

Fenotipos de CM obtenida de efluente peritoneal

Niveles de VEGF en el sobrenadante del cultivo de CM

Inducción de TEM y VEGF en el sobrenadante

Fenotipo y VEGF en suero

Niveles en suero y sobrenadante

Características basales y diferencias en los pacientes según fenotipo de CM en los cultivos procedentes de efluentes peritoneales

________________________________________________________________________ Fenotipo de la CM

(n=37) Epitelioide (n=23) No-epitelioide (n=14) P______________________________________________________________________________________

Edad (años) 62 14.5 60.6 13.8 64.3 16 NS

Meses DP) 12.8 15.4 10.52 15 16.6 15.8 NS

EPO (U/kg/sem) 94.6 94.8 83.9 99.1 112.3 88.1 NS

Días inflamación 0.83 2.83 0.4 1.3 1.57 4.3 NS

Carga de glucosa (Kg) 54.9 34.2 45.2 32.6 64.5 34.8 NS

Urea-MTC (ml/min) 19.8 4.9 17.8 2.8 23.1 5.8 <0.01

Cr-MTC (ml/min) 9.3 2.7 7.94 1.65 11.46 2.6 <0.001

UF 3.86% (ml)* 640 242.3 786.2 117** 508.5 184.1 <0.05

CCr (ml/min) 4.9 3.3 5.37 3.41 4.33 3.14 NS

VEGF suero (pg/ml) 544.8 489 4331.7 190. 4894.8 624.3 <0.01

VEGFsobrenad (pg/µg) 1773.6 2793. 2377 224.5 4068 3521.36 <0.001

Correlación VEGF en sobrenadante y transporte peritoneal

VEGF en suero y transporte peritoneal

VEGF según el transporte peritoneal

Fenotipo CM Epitelial-like No-epitelioide p

Cr-MTC<11

(ml/min)

23 4 P<0.05

Cr-MTC>11

(ml/min)

0 10 <0.001

N=10

P <0.001

N=23

NS

N=14

Total 37

Distribución del fenotipo de CM según Cr-MTc

• Correlación positiva

– Meses en DP y VEGF en suero (r=0.39, p<0.05)

– Días de inflamación peritoneal (peritonitis) y VEFG en suero (r=0.41, p<0.05)

Expresión de VEGF en biopsia peritoneal

Conclusiones

• La agresión peritoneal induce cambios en la CM que sufre un proceso de transdiferenciación, migra al submesotelio y adquiere un fenotipo fibroblastoide

• La celula no-epitelioide sobrerregula VEGF y se demuestran niveles elevados de VEGF en sobrenadante de los cúltivos de CM, efluente peritoneal y suero.

• La sobrerregulación de VEGF puede ser la responsable del fenómeno de neoangiogénesis observado en los pacientes en DP.

• Los cambios en el MTC-Cr están relacionados con el nivel de VEGF en sobrenadante del cultivo de CM y en menor medida con los niveles en efluente y en suero

• La intervención terapeútica debe ir dirigida a prevenir la TEM de la CM que está en el inicio de la fibrosis y la neoangiogénesis peritoneal.

Peritoneal cavity

PeritonitisHemoperitoneoPD Fluids: Glucose (AGEs, GDPs) Lactate, Acid pH

E-CadherinCytokeratins

Snail

MC released toPD Effluent

PeritonealMembrane

αSMA-positveMyofibroblast

Neo-Angiogenesis

ECM Synthesis

UF Failure

SubmesothelialThickness

Epithelial to mesenchymal transition

.RAGE. ..TFG

VEGF

Fibrosis

Conclusión final

Las células fibroblasto-like que aparecen en el submesotelio de la membrana

peritoneal procedentes de la TEM de la CM pueden contribuir no solo al desarrollo de fibrosis sino también a la aparición de

neoangiogénesis e incremento de la permeabilidad peritoneal a través de la

sobrerregulación de VEGF.