ACTIVIDAD ENZIMATICAI. INTRODUCCIONLos enzimas son biomolculas especializadas en la catlisis de las reacciones qumicas que tienen lugar en la clula. Son muy eficaces como catalizadores ya que son capaces de aumentar la velocidad de las reacciones qumicas mucho ms que cualquier catalizador artificial conocido, y adems son altamente especficos ya que cada uno de ellos induce la transformacin de un slo tipo de sustancia y no de otras que se puedan encontrar en el medio de reaccin. (Blanco, 2008)Las enzimas son los catalizadores de los sistemas biolgicos y se caracterizan por tres importantes propiedades: incrementan grandemente las velocidades de reaccin, tienen una elevada especificidad y pueden ser reguladas por diferentes metabolitos, los cuales aumentan o disminuyen su actividad de acuerdo a las necesidades del proceso (Dugas, 1996; Labdi, 2009).

Para clasificar a las enzimas se emplea el sufijo asa, que identifica a la mayora de las enzimas con excepcin de algunas, como la tripsina, amilopsina, quimiotripsina, etc.; que por tradicin siguen manteniendo su nomenclatura. Se han asignado, por la Comisin Internacional de Enzimas, 6 clases:

1. Oxido-reductasas: participan en reacciones de xido-reduccin. En estas reacciones se transfiere un electrn ( un H+) de un donante a un receptor. Caso del NADH+ que entrega electrones a complejo I en la membrana interna de la mitocondria. 2. Transferasas: transfieren grupos de un donante a un aceptor. Los grupos transferidos con ms frecuencia son el metilo, glucosdico y fosfato. Caso de la glucosiltransferasa (transfiere un monosacrido) y protena quinasa (transfiere un fosfato).3. Hidrolasas: participan en reacciones de hidrlisis, es decir, rompimiento de enlaces como C-O, C-N y C-C por adicin de agua. Caso de los enlaces glucosdicos (entre monosacridos) y peptdicos (entre aminocidos).4. Liasas: producen dobles enlaces al romper uniones C-O, C-C y C-N.Tambin pueden romper dobles enlaces agregando grupos. Caso de la piruvato descarboxilasa que elimina un CO2 al piruvato.5. Isomerasas: catalizan una redistribucin de tomos de los grupos qumicos dentro de la misma molcula. Caso de la alanina racemasa que convierte L-alanina en D-alanina. Ambos son ismeros.6. Ligasas: catalizan la unin de 2 molculas por hidrlisis de ATP u otro trifosfato (GTP, por ejemplo).

Por otro lado las enzimas se clasifican de acuerdo a su complejidad las cuales pueden simples las cuales estn formadas por una o ms cadenas polipeptdicas o conjugadas que contiene un grupo no proteico enlazado a la cadena polipeptdica estando conformada por la apoenzima que es la parte polipeptdica de la enzima y el cofactor que es la parte no proteica y la unin de estos dos ltimos forman la holoenzima. (Kimball, 1986).

(Principios de Bioqumica Lenhinger, 2011)Algunos enzimas necesitan para llevar a cabo su actividad cataltica de la concurrencia de una o ms sustancias de naturaleza no proteica que reciben el nombre de cofactores. No debe entenderse que los cofactores son sustancias que meramente potencian la actividad enzimtica sino que, en determinados enzimas, son absolutamente imprescindibles para que sta se realice. En ausencia de cofactor el enzima resulta catalticamente inactivo y recibe el nombre de apoenzima; la combinacin de apoenzima y cofactor da el holoenzima catalticamente activo. Existen dos tipos de cofactores enzimticos: los iones metlicos y las coenzimas. Los iones metlicos que actan como cofactores enzimticos son generalmente cationes mono o divalentes. Pueden actuar de varias maneras: 1) En algunos enzimas el ion metlico constituye el verdadero centro cataltico; en estos casos el ion suele presentar por s solo una cierta actividad cataltica, que se ve incrementada cuando forma parte del enzima. 2) En otros enzimas el ion metlico constituye un grupo puente para unir el sustrato al centro activo. 3) A veces el ion metlico no forma parte del centro activo sino que se encuentra en un lugar del enzima muy alejado del mismo, actuando como agente estabilizador de la conformacin nativa del enzima. (Muoz, 1979)Cuando el cofactor es una sustancia orgnica de naturaleza no proteica recibe el nombre de coenzima. Las coenzimas actan generalmente como transportadores intermediarios de grupos funcionales, de determinados tomos o de electrones, los cuales son transferidos de una sustancia a otra en la reaccin enzimtica global. A veces las coenzimas se hallan ntimamente unidas a la molcula proteica constituyendo un verdadero grupo prosttico. En otros casos la unin es dbil y la coenzima acta en realidad como si de un sustrato ms del enzima se tratase. Cuando se analiza la estructura qumica de muchos coenzimas se comprueba que tienen formando parte de ella a alguna de las sustancias conocidas como vitaminas.A diferencia de otros catalizadores las enzimas presentan una regin llamada centro activo en la que se acopla el sustrato y suele tener forma de hendidura o bolsillo, rodeada por cadenas laterales de aminocidos que facilitan la unin del sustrato y por otras cadenas laterales que intervienen en la catlisis. La compleja estructura terciaria de las enzimas hace posible que en este bolsillo se ajuste el sustrato de manera muy estrecha lo que explica la extraordinaria especificidad de la catlisis enzimtica. . Las enzimas se mueven ms lentamente que los sustratos y la velocidad de encuentro va a depender de la concentracin de sustrato presente. Los aminocidos que constituyen el centro activo pertenecen a zonas muy distantes de la cadena y representan una pequea fraccin del nmero total de aminocidos de la protena. El resto de la molcula es necesaria para mantener la molcula en posicin correcta y para suministrar lugares de unin adicionales con funcin reguladora (centros reguladores). (Nelson, 2000)

La hiptesis del complejo enzima-sustrato explica de modo satisfactorio el efecto de saturacin del enzima por el sustrato observado en los estudios de cintica enzimtica: cuando la concentracin de sustrato es muy superior a la concentracin del enzima en el medio de reaccin, todos los centros activos de las molculas de enzima se hallan ocupados en un momento dado por molculas de sustrato, con lo que aumentos posteriores de la concentracin de ste no se traducen en aumentos en la velocidad de reaccin. (Stryer, 2003)

Las enzimas poseen varias caractersticas en este aspecto tiene una gran influencia los factores externos que permiten que se den. Las enzimas se inactivan por el calor esto sucede ya que por ser protenas pueden desnaturalizarse completamente si se someten a temperaturas altas, otra de las caractersticas es que las enzimas funcionan ms eficientemente, a ciertas temperaturas optimas, es decir, a ciertas temperaturas las enzimas realizan una actividad catalizadora, de tal manera que permiten la continuacin de la reaccin catalizada a la mayor velocidad. A temperaturas por encima o por debajo de la temperatura ptima para la actividad de la enzima esta disminuye o se detiene. De esta manera la enzima trabaja con mayor eficiencia a una temperatura de 37C (Baker, 1972). Cada enzima funciona de una manera ms efectiva a cierta temperatura y pH y, como consecuencia, su actividad disminuye cuando alcanza valores por encima o por debajo de dichos puntos. Los enlaces de hidrogeno son fcilmente destruidos por el aumento de la temperatura lo cual, a su vez, puede perjudicar la estructura terciaria de la enzima que son de gran importancia para la unin con el sustrato. Los cambios de pH alteran el estado de ionizacin de los aminocidos con carga elctrica. (Tymoczko. 2003)De esta manera las enzimas adems de que necesitan ciertas condiciones ambientales, como la temperatura adecuada, el pH, de la concentracin de la enzima que aumenta la velocidad enzimtica hacia cierto lmite, la concentracin del sustrato se obtiene la velocidad mxima. Tambin necesitan de la presencia de otras ciertas sustancias antes de poder actuar; un ejemplo claro es la amilasa salivar solo podr actuar sobre la amilasa si estn presentes iones de cloro (Kimball, 1986).Sin enzimas, no sera posible la vida que conocemos. Igual que la biocatlisis que regula la velocidad a la cual tienen lugar los procesos fisiolgicos, las enzimas llevan a cabo funciones definitivas relacionadas con salud y la enfermedad. En tanto que, en la salud todos los procesos fisiolgicos ocurren de una manera ordenada y se conserva la homeostasis durante los estados patolgicos, esta ltima puede ser perturbada de manera profunda.II OBJETIVOS Reconocer la accin de una enzima, en esta ocasin la amilasa y algunos factores que afectan la actividad enzimtica de esta. Estudiar algunos factores que afectan la actividad enzimtica: Temperatura, Ph, as como su especificidad.

III MATERIALES Y METODOSMateriales

Mtodos

1) Especificidad EnzimticaTubo N/Reactivo1A21B

Sol de Almidn3 ml-------3ml

Sol de Sacarosa--------3ml------

Amilasa Salival2ml2ml2ml

Cloruro de Sodio0,5 ml0,5 ml0,5 ml

Bao Mara por 20 min a 37C

Lugol5 gotas---

Reactivo de Fehling-----2ml2ml

2) Efecto de la T sobre la actividad enzimticaTubo N/Reactivo123

Buffer pH 6.52ml2ml2ml

Cloruro de Sodio0,5 ml0,5 ml0,5 ml

Amilasa Salival1ml1ml1ml

Sol de Almidn3ml3ml3ml

3) Efecto del pH sobre la actividad enzimticaTubo N/Reactivo123

Buffer 3,82ml---------

Buffer 6,8----2ml----

Buffer 8,9-------2ml

NaCl0,5 ml0,5 ml0,5 ml

Almidn3ml3ml3ml

Amilasa salival1ml1ml1ml

Mezclar e incubar por 20 en Bao Mara a 37C

Lugol5 gotas5 gotas5 gotas

4) Identificacin del cofactor e inhibidor de la amilasa salival

Tubo N/Reactivo12

Cloruro de Sodio2ml-----

Sulfato Cprico-----2ml

Buffer 6,80,5ml0,5ml

Sol de Almidn3ml3ml

Amilasa Salival1ml1ml

Mezclar e incubar por 20 en Bao Mara a 37C

Lugol5 gotas5 gotas

IV. RESULTADOS1) Especificidad EnzimticaDespus de someter a los dos tubos en un bao Mara por 20 min a una temperatura de 37C se pudo apreciar que en el tubo 1, la solucin torna un color amarillento y en el tubo 2 la solucin tiene un color celeste.

2) Efecto de la T sobre la actividad enzimtica En el tubo 1 se presenta un color amarillento En el tubo 2 se presenta un color violeta oscuro En el tubo 3 se presenta tambin un color violeta oscuro

3) Efecto del pH sobre la actividad enzimtica En el tubo numero 1 se observa un color azul oscuro casi negro En el tubo numero 2 se observa un color amarillento En el tubo numero 3 tambin se observa un color azul oscuro casi negro

4) Identificacin del cofactor e inhibidor de la amilasa salival En el tubo 1 se observa un color amarillento En el tubo 2 un color violeta oscuro

V. DiscusinLas enzimas presentan propiedades y caractersticas que ningn otro catalizador las tiene, y una de ellas es la especificidad. La especificidad est determinada por el sitio activo de la enzima, es decir, un sector de la molcula que contiene los grupos funcionales particulares que le permiten unirse especficamente con el sustrato. Por ejemplo, la quimiotripsina posee una cadena polipeptdica conformada por 245 aminocidos de los cuales los nmeros 57 (histidina), 102 (cido asprtico) y 195 (serina) constituyen el sitio activo. El plegamiento (estructura terciaria) de la cadena provoca el acercamiento de estos 3 aminocidos en una estrecha regin: este es el sitio activo de la enzima. (Whistler, 1999)

Las enzimas aceleran las reacciones alterando la conformacin de sus sustratos para que logren llegar al estado de transicin. El modelo ms simple para entender esta interaccin enzimasustrato es el modelo de la llave y la cerradura, en el cual el sustrato encaja perfectamente en el sitio activo de la enzima.En muchos casos, las conformaciones tanto de la enzima como del sustrato son modificadas cuando logran unirse: es el llamado modelo de encaje inducido. Esta alteracin de las conformaciones hace que logren llegar ms rpido al estado de transicin. (Becker, 2007)

Modelo de llave-cerradura Modelo de encaje inducido Cuando la enzima solo puede actuar sobre un tipo de substrato, se dice que la enzima muestra especificidad absoluta para el substrato. Ese es el caso de la deshidrogenasa succinica, que es especifica para el succinato, o la L-glutamico deshidrogenasa, especifica para el glutamato. Si la enzima puede actuar sobre substratos con estructuras muy similares, se dice que la enzima muestra especificidad relativa para el substrato. La L-aminocido oxidasa, por ejemplo, puede catalizar la oxidacin de diferentes aminocidos de la serie L. La a-amilasa es una enzima proteica que se encuentra en la saliva humana y cataliza la degradacin del almidn, que es un polisacrido de reserva vegetal. El almidn esta formado por dos tipos de molculas: la amilosa y la amilopectina, ambos polisacridos de glucosa. La amilosa se conforma por cadenas lineales de glucosas unidas por enlaces a- C1-C4, mientras que la amilopectina tiene, adems de estos ltimos enlaces, uniones C1 con C6, formando cadenas ramificadas. La a-amilasa rompe uniones C1-C4, tanto en la amilasa como en la amilopectina, dejando dextrinas lineales y ramificadas (oligosacaridos) como productos, as como maltosas. (Koolman, 2004)

Entonces, en los experimentos anteriores el tubo 1 se torna amarillento ya que la amilasa ha hidrolizado al almidn hasta convertirlo en maltosa y dextrina. Esto demuestra que la amilasa posee una especificidad absoluta para el substrato que en este caso es el almidn.En el tubo 2 la solucin es de color celeste debido al reactivo de Fehling, que est comprobando la presencia de un azcar no reductor, en este caso la sacarosa. Se puede observar que la amilasa no ha actuado sobre el almidn debido a su especificidad.

Efecto de la temperatura

Al igual que ocurre con la mayora de las reacciones qumicas, la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas se incrementa con la temperatura. La variacin de la actividad enzimtica con la temperatura es diferente de unos enzimas a otros en funcin de la barrera de energa de activacin de la reaccin catalizada. Considerando que las enzimas son protenas, estn expuestas a una desnaturalizacin (cambio en la estructura terciaria) por accin de altas temperaturas. As, puede producirse una inactivacin a causa del rompimiento de varios enlaces dbiles. Muchas enzimas se inactivan a 45 C y la mayora se desnaturalizan rpidamente desde los 55 C. Dado que no todas las enzimas son iguales, habr algunas que trabajen a temperaturas elevadas y otras a temperaturas ms fras. Por ejemplo, hay bacterias termfilas que viven en aguas termales calientes, alrededor de los 80 C. Sus sistemas enzimticos resisten la desnaturalizacin a altas temperaturas. (McKee, 2003)

En los experimentos anteriores del efecto de la temperatura, en el tubo 1, se torna de color amarillo debido a que la amilasa no ha actuado sobre el almidn, por el ende la reaccin del Lugol es negativa. Esto se debe a que se trabajo a una temperatura baja, y la amilasa trabaja a temperatura ambiente (37C)

En los tubos 2 y 3 el color es violeta debido a que la amilasa si ha actuado sobre el almidn, por eso la reaccin con el Lugol es positiva, en este caso si se trabajo a una temperatura adecuada

Efecto del Ph

La mayor parte de las enzimas opera dentro de un margen estrecho de pH: es el pH ptimo. La gran mayora de las enzimas tiene su pH ptimo dentro del rango fisiolgico de la clula (pH 6.5 a 7.2). Algunas enzimas, como la pepsina del estmago, poseen un pH ptimo en el rango cido (pH 1.0 a 2.0). Enzimas intestinales como la tripsina y lipasas, poseen un pH ptimo en rangos alcalinos, cercano a 10. Al ser los enzimas de naturaleza proteica, al igual que otras protenas, se desnaturalizan y pierden su actividad si el pH vara ms all de unos lmites estrechos. (Mathews, 2002)

Entonces, en los experimentos del efecto de Ph, en el tubo 1 se torna de color violeta debido a que la amilasa no hidroliza al almidn debido a que se reacciono a un pH de 3,8 (acido), entonces la amilasa se desnaturalizo y por eso la prueba de Lugol da positivo debido a que no se ha hidrolizado el almidn.

En el tubo numero 2, se torna de color amarillo debido a que la amilasa en este caso si hidroliza al almidn debido a que se trabajo con un pH de 6,8 (pH ptimo de la amilasa), hidrolizndola en maltosa, dando como resultado negativo en la prueba de Lugol.

En el tubo numero 3, el color de la solucin es violeta debido a que no se hidrolizo el almidn, debido a que se trabajo en un pH alcalino (impidiendo el correcto funcionamiento de la enzima), dando como resultado positivo a la prueba de Lugol

Inhibidor y cofactor

La inhibicin de la actividad enzimtica es el medio importante en el control de los sistemas biolgicos. La inhibicin puede ser reversible o irreversible. En el primer caso, el inhibidor no modifica las regiones funcionales de la enzima; en el segundo caso, el inhibidor modifica la molcula de enzima y se une tan fuertemente a ella que la disociacin de ambas es muy lenta o nula. Varios venenos que actan sobre el sistema nervioso, incluyendo insecticidas, lo hacen como inhibidores irreversibles de la actividad enzimtica. Un inhibidor no-competitivo es el que puede unirse a la enzima en un sitio diferente al sitio activo. As, tanto el sustrato como el inhibidor pueden unirse simultneamente a la molcula de enzima. La accin del inhibidor no-competitivo es disminuir el nmero de recambio de una enzima. La inhibicin reversible puede lograrse mediante 2 mecanismos: competitivo y no-competitivo. Un inhibidor competitivo es el que compite con el sustrato por el mismo sitio activo de la enzima, ya que el inhibidor y el sustrato poseen una estructura qumica similar. La velocidad de catlisis del sustrato se reduce dado que la cantidad de sustrato que se une a la enzima es menor. (Smith, 2005)

CofactorAlgunos enzimas necesitan para llevar a cabo su actividad cataltica de la concurrencia de una o ms sustancias de naturaleza no proteica que reciben el nombre de cofactores. No debe entenderse que los cofactores son sustancias que meramente potencian la actividad enzimtica sino que, en determinados enzimas, son absolutamente imprescindibles para que sta se realice.Cuando el cofactor es una sustancia orgnica de naturaleza no proteica recibe el nombre de coenzima. Las coenzimas actan generalmente como transportadores intermediarios de grupos funcionales, de determinados tomos o de electrones, los cuales son transferidos de una sustancia a otra en la reaccin enzimtica global. (Devlin, 2004)En los experimentos anteriores de identificacin de cofactor e inhibidor, el primer tubo tiene una coloracin amarilla por que la amilasa ha actuado correctamente sobre el almidn gracias a la ayuda de un cofactor (en este caso el cloruro de sodio) que activa la enzima y permite realizar la actividad enzimtica, dando negativo a la reaccin de Lugol.En el tubo numero 2, la solucin es de color azul oscuro debido a que la amilasa no ha actuado sobre el almidn debido a la presencia de un metal fuerte que actu como inhibidor e impidi la actividad enzimtica (sulfato de cobre), dando positivo a la reaccin de Lugol.

VI CONCLUSIONES Las enzimas necesitan una temperatura, un pH y un cofactor adecuado para que puedan realizar actividades enzimticas.VII BIBLIOGRAFIA Kimball, John. (1986). Biologa. Editorial: Addison - Wesley Iberoamericana, S. A. Cuarta Edicin. Blanco, Antonio. (2008) Qumica Biolgica 5ta edicin Ed. Mdica Panamericana Baker, J. y Allen, G. (1972) Materia, Energa y Vida. Editorial: Fondo Educativo Interamericano S.A. Muos, E. (1979) Biologa Celular y Molecular. Editorial: H. Blume Ediciones- Rosario, 17. Nelson, L. D. y M. M. Cox. 2000. Lenhinger Principios de Bioqumica. Ediciones Omega, S. A., Barcelona, Esp. Stryer, L., J. M. Berg y J. L. Tymoczko. 2003. Bioqumica, 5a edicin. Editorial Reverte, S. A. Barcelona, Esp. Whistler, R. L. y J. N. BeMiller. 1999. Chemistry for Food Scientists. Eagan Press, St. Paul, Minnesota, USA. Becker, Wayne M. El mundo de la clula, Madrid Pearson Educacin 2007. Mathews, C.K., Van Holde, K.E. y Ahern KG (2002). Bioqumica. 3 edicin. Ed. Addison Wesley/Pearson Education. Madrid. McKee, T. y McKee J. R. (2003). Bioqumica. La base molecular de la vida. 3 edicin. Ed. McGraw-Hill Koolman, J. y Rohn, KH (2004). Bioqumica. Texto y atlas. 3 edicin. Ed. Mdica Panamericana

Smith, C., Marks, A.D., Lieberman, M. (2005). Bioqumica bsica de Marks. Un enfoque clnico. 2 edicin. Ed. McGraw-Hill Devlin, T. M. (2004). Bioqumica. Un texto con aplicaciones clnicas. 4 edicin. Ed. Reverte.