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DIRECCIÓN GENERAL DE EDUCACIÓN MEDIA SUPERIOR

MANUAL DE PRÁCTICAS ANÁLISIS CLÍNICOS III

Elaborado por: QFB. EMILIA ELIZABETH BOLIO SALAZAR

Aprobado por la Academia Estatal de Análisis Clínicos III

QFB. ISABEL RUIZ SANCHEZ QFB. ALBERTO RODRIGUEZ MOYA

QFB. MYRNA FATIMA RAMIREZ GARCIA QFB. EMILIA ELIZABETH BOLIO SALAZAR

SUPERVISADO POR: LICDA. LAURA ARACELI JIMÉNEZ COBIÁN

LICDA. SILVIA LUZ LÓPEZ ALCARAZ

FEBRERO DEL 2009

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Práctica 1 Conocimiento y esterilización de los medios de cultivo …………………………….….…5

Práctica 2 Técnicas de cultivo……………………………………………………………………………………….….8

Práctica 3 Cultivo faríngeo…………………………………………………………………………………………..…12

Práctica 4 Tinción de Gram…………………………………………………………………………………………….15

Práctica 5 Identificación de Staphylococcus aureus………………………………………………….……18

Práctica 6 Antiestreptolisinas…………………………………………………………………………………….…..22

Práctica 7 Determinación de Factor Reumatoide………………………………………………………….26

Práctica 8 Proteína C reactiva ………………………………………………………………………………………29

Práctica 9 Reacciones febriles……………………………………………………………………………………….32

Práctica 10. Coprocultivo………………………………………………………………………………………………….36

Práctica 11. Identificación de Enterobacterias a través de

Pruebas bioquímicas (IMVIC)……………………………………………………………………………………………......39

Práctica 12. Urocultivo……………………………………………………………………………………………………..43

Práctica 13. Tinción de Ziehl- Neelsen……………………………………………………………………………...46

Práctica 14. Diagnóstico de Paludismo……………………………………………………………………………..49

Práctica 15 Examen Coproparasitoscópico, técnica directa……………………………………………..56

Práctica 16. Examen Coproparasitoscópico, técnica de concentración de Faust………….…...63

INDICE

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REGLAMENTO GENERAL DE LABORATORIO

ANTES DE INICIAR SU PRÁCTICA:

I. La asistencia a la práctica es obligatoria. II. La tolerancia para entrar al laboratorio será la que rige el reglamento escolar.

III. Acatar las instrucciones indicadas en el Reglamento General de Laboratorios de los Planteles del Nivel Medio Superior de la Universidad de Colima.

IV. No dejar abrigos, carpetas u otros objetos sobre las mesas de trabajo. Cuando más despejado este el lugar de trabajo mejor se desarrollará el experimento y menos peligro existirá para nosotros y para nuestras cosas.

V. Es obligatorio llevar bata para evitar manchas y quemaduras. También es aconsejable traer un trapo de algodón para poder agarrar los recipientes calientes o limpiarlos y secarlos.

VI. Se deben seguir a todo momento las indicaciones del profesor. No se comenzara a trabajar hasta haber recibido las instrucciones necesarias. Consultar las dudas y dificultades.

VII. Es imprescindible leer por lo menos una vez la práctica antes de comenzar. VIII. Comprobar que esta todo el material necesario y en las condiciones adecuadas de

conservación y limpieza. Comunicar cualquier anomalía al profesor. Cada grupo será responsable de material asignado.

IX. Por seguridad está terminantemente prohibido fumar dentro del laboratorio, así como ingerir alimentos y bebidas.

DURANTE EL TRABAJO: I. No debe probarse ninguna sustancia y debe evitarse el contacto con la piel. En caso de que

algún producto corrosivo caiga en la piel, se eliminará con abundante agua fría. II. Extremar los cuidados al trabajar con sustancias inflamables, tóxicas o corrosivas. III. Comunicar cualquier accidente, quemadura o corte, a tu profesor de laboratorio. IV. La manipulación de productos sólidos se hará con ayuda de una espátula o cucharilla y para

transvasar líquidos se utilizara una varilla de vidrio en los casos que sean necesarios. V. Nunca viertas el ácido sulfúrico concentrado al agua, debes hacerlo de manera inversa pero

con cuidado. VI. Tener cuidado al manejar ácidos y bases principalmente concentrados. VII. Para oler algún producto no debe acercarse la cara al recipiente, si no que se arrastrará el

vaso hacia la nariz pasando la mano por encima de él. VIII. Con el fin de evitar contaminaciones, nunca se devolverá al frasco los restos de productos

no utilizados. IX. El material de vidrio es muy frágil, por lo que se evitara los golpes y cambios bruscos de

temperatura. Se deberá anotar en una hoja o cuaderno el material que se rompa y comunicarlo al profesor de laboratorio.

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X. Cualquier experimento en el que se desprenda gas tóxico o inflamables en el que se utilicen reactivos potencialmente nocivos deberá llevarse a cabo en las campanas extractoras del laboratorio.

XI. Los restos sólidos no metálicos deben tirarse en cestos de basura, nunca en las fregaderas. Los residuos metálicos se almacenarán en un recipiente especial. Los residuos acuosos se verterán en los fregaderos grandes, con abundante agua antes, durante y después del vertido. En cuanto a los líquidos y disolventes orgánicos, se echaran en un recipiente de plástico, para su posterior eliminación.

AL TERMINAR: I. El lugar y el material de trabajo debe quedar limpio y ordenado, también se deben apagar y

desenchufar los aparatos. II. Lavarse las manos perfectamente para evitar intoxicaciones con algunos reactivos. III. Entregar para su revisión el reporte de la práctica elaborada. IV. Hasta que el profesor no de su autorización no se considerara finalizada la práctica y por lo

tanto, no podrás salir de laboratorio. Recomendaciones generales.

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Práctica no.1

NOMBRE DE LA PRÁCTICA: Conocimiento y esterilización de los medios de cultivo. COMPETENCIA: Conoce el uso y aplicación de algunos medios de cultivo útiles para el cultivo de microorganismos, así como la técnica para su esterilización. MATERIAL: Diversos medios de cultivo. Matraces erlenmeyer de 500 ml. Espátulas Balanza granataria o analítica Vidrio de reloj Algodón Cinta testigo Papel aluminio o de estraza Agua destilada Olla de presión para esterilizar Mechero fisher Tripie o soporte universal Aro metálico Tela de alambre con asbesto Guantes con asbesto INTRODUCCIÓN Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones nutritivas necesarias para el desarrollo de los microorganismos. La diversidad metabólica de los microorganismos es enorme; por ello, la variedad de medios de cultivo es también grande, no existiendo un medio de cultivo universal adecuado para todos ellos. En la actualidad, la mayoría de los medios de cultivo se encuentran comercializados, normalmente bajo la forma de liofilizados que es preciso rehidratar. En general, la preparación de un medio de cultivo se reduce simplemente a pesar la cantidad deseada del mismo y redisolverla en agua destilada siguiendo las instrucciones del fabricante para posteriormente esterilizarlos. Antes de su esterilización, los medios de cultivo ya hidratados se distribuyen en los recipientes adecuados (tubos o matraces; según se trate de caldos o agares). Existen diferentes medios de cultivo. De acuerdo a su consistencia tenemos: 1.- Medios líquidos: habitualmente nombrados caldos, y que están contenidos en tubos de cultivo. 2.- Medios sólidos o generalmente llamados agares; precisamente por contener este componente que se utiliza como agente gelificante (alrededor del 5%), para dar la solidez a ese tipo de medios de cultivo. Generalmente contenidos en cajas de petri. 3.- Medios semisólidos: que contienen también agar (alrededor del 1%), y este les da una consistencia como natilla. Generalmente contenidos en tubos de cultivo.

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De acuerdo a su utilidad tenemos: 1.- Medios generales: permiten el desarrollo de una gran variedad de microorganismos. 2.- Medios de enriquecimiento: favorecen el crecimiento de un determinado tipo de microorganismo, sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento del resto. 3.- Medios selectivos: permiten el crecimiento de un tipo de microorganismos determinado, inhibiendo el desarrollo de los demás. 4.- Medios diferenciales: son aquellos en los que se ponen de relieve propiedades que un determinado tipo de microorganismos posee. DESARROLLO 1.- Proporcionarle a los alumnos diversos medios de cultivo para que primero anoten los siguientes datos: Nombre del medio de cultivo, tipo de medio de cultivo de acuerdo a su consistencia y utilidad, para qué tipo de microorganismos se utiliza o qué pruebas se pueden realizar en el etc. 2.- Posteriormente que procedan a preparar algunos de los medios de cultivo que necesitaran para las siguientes prácticas de laboratorio: a.- Pesar la cantidad necesaria del medio de cultivo y disolverlo en el volumen adecuado de agua destilada, en un matraz erlenmeyer (en el frasco del medio de cultivo viene la relación de polvo a pesar según la cantidad de medio que se quiera preparar). b.- Calentar cuidadosamente el medio de cultivo hasta su disolución completa, tener cuidado de agitar constantemente para evitar que se forme demasiadas burbujas que provoquen derrames y puedan producir quemaduras. c.- Si el medio de cultivo es un caldo, se distribuye en tubos de cultivo con tapón de rosca (baquelita) o tubos de ensaye grandes a los que les fabriques tapones de algodón (deben quedar bien fijos) para estilizarlos luego. Una vez esterilizados y fríos se guardan a temperatura ambiente en un lugar fresco y seco o en el refrigerador; según sea lo adecuado al medio preparado. d.- Si el medio de cultivo es un agar, se puede dejar en el matraz erlenmeyer, se le fabrica un tapón con algodón bien apretado en la boca del matraz y se cubre con un pedazo de papel aluminio o de papel de estraza. (Tu maestro te indicará la manera de hacerlo) y está listo para ser esterilizado. Si requieren medios para técnicas de tubo inclinado o para picadura, el agar se distribuye en tubos. Se esterilizan con calor húmedo (15lb de presión/121°C/15-20 minutos). e.- Una vez esterilizados y no muy calientes, los medios de agar se vacían (en condiciones estériles) a cajas de petri estériles y una vez que solidifiquen y enfríen se guardan en refrigeración (en posición invertida de preferencia) para su posterior uso. Si el agar es para tubo inclinado se coloca en esa posición hasta que solidifique y una vez fríos se almacenan en un lugar fresco y seco o en el refrigerador.

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NOTAS: + No olvides rotular los medios de cultivo con su nombre o siglas para poder identificarlos y de preferencia también la fecha de elaboración. + Colocar un tira pequeña de cinta testigo a los tubos y matraces de los medios, antes de meter a esterilizar. CUESTIONARIO 1.- ¿Por qué se deben almacenar los medios de cultivo en posición invertida? ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 2.- ¿Para qué sirve la cinta testigo? ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 3.- ¿Por qué se tapan los tubos y matraces que contienen los medios para esterilizar? ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 4.- ¿Cómo creas área estéril para vaciar los medios de cultivo ya esterilizados a las cajas de petri? ¿Y por qué es necesario? ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Conclusiones. __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Nombre del alumno:___________________________________6to sem.gpo.____ Fecha de realización:__________________________________

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Vo.Bo. del maestro

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Práctica no.2

NOMBRE DE LA PRÁCTICA: Técnicas de cultivo. COMPETENCIA: Realiza algunas de las técnicas de cultivo utilizadas en el laboratorio de bacteriología: estrías, picadura y agitación. MATERIAL: Cultivos bacterianos en agares y caldos (pueden ser cultivos mixtos o de alguna especie bacteriana en particular, que hayan aislado previamente). Medios de cultivo estériles (en placa, tubo inclinado, caldo y tubo vertical). Asa bacteriana y aguja de inoculación. Mechero Fisher. INTRODUCCIÓN La utilización de cultivos es fundamental para determinar las características físicas, químicas y bioquímicas de los microorganismos; en este caso, principalmente de las bacterias. Para ellos contamos con un gran número y tipo de ellos, así como diversas técnicas de cultivo que nos facilitan el trabajo. El médico, con base en un examen cuidadoso del paciente, puede sospechar que hay una enfermedad infecciosa. Entonces se recolectan muestras de los tejidos o de los líquidos infectados para análisis microbiológico entre otros estudios. Hay un gran interés en la importancia de identificar con precisión el patógeno, para el tratamiento apropiado de la enfermedad infecciosa. Generalmente los laboratorios clínicos son capaces de aislar, identificar y determinar la sensibilidad a antibióticos de la mayor parte de las bacterias patógenas encontradas rutinariamente dentro de las 48 horas de haber tomado la muestra. DESARROLLO 1.- Prende el mechero fisher para crear un área estéril y así evitar que te contamines o se contaminen los medios de cultivo. Coloca las placas en posición invertida sobre la mesa de trabajo para que se facilite manipularlas mejor. TECNICA POR ESTRÍAS EN PLACA 2.- Esteriliza el filamento del asa de siembra y toma la parte de la caja de petri que contiene el medio de cultivo sembrado. Cerca del mechero espera que se enfríe el asa y toma una colonia de la placa. Regresa la caja a su tapadera. 3.- Ahora, toma una placa con agar estéril (donde vayas a sembrar) y con cuidado de no romper el agar, inocula la muestra en un extremo de la placa y con el asa en posición ligeramente horizontal realiza las estrías (muy juntas), oscilando el asa de siembra sobre la superficie de una porción pequeña del agar; mediante un balanceo sucesivo y rápido de la muñeca.

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4.- Esteriliza el asa de nuevo y déjala enfriar. Rozar una vez con el asa de siembra las estrías sembradas la primera vez y realiza sobre una porción virgen del agar una segunda tanda de estrías que no toque la primera. 5.- Repetir exactamente la operación descrita en el punto anterior, pero rozando al empezar la segunda tanda de estrías, hasta completar 3 o 4. No hagas más presión sobre el agar que la debida al propio peso del asa y su mango. Es importante emplear un asa de siembra en buen estado, pues una rota o deteriorada rasgará el agar. 6.- Lleva a la incubadora y deja en posición invertida 24 horas al término de las cuales se puede observar ya el desarrollo de colonias aisladas. SEMBRADO POR ESTRÍAS EN TUBO INCLINADO 1.- Esteriliza el filamento del asa de siembra y toma la parte de la caja de petri que contiene el medio de cultivo sembrado. Cerca del mechero espera que se enfríe el asa y toma una colonia de la placa. Regresa la caja a su tapadera. 2.- Ahora toma el tubo de agar en pico de flauta (agar inclinado) y cerca del mechero retira el tapón de algodón ayudándote con los dedos meñique y anular y flamea la boca del tubo. 3.- Introduce el asa con la muestra (cuidando de no tocar las paredes del tubo) y empezando en el área del fondo del agar realiza una estría hacia fuera hasta terminar en la punta del agar. Retira el asa. 4.- Flamea la boca del tubo de nuevo y coloca el tapón de algodón bien firme. Esteriliza el asa y déjala enfriar. 5.- Lleva a incubar y observa el desarrollo a las 24 o 48 horas después de la siembra. SEMBRADO POR AGITACIÓN EN CALDO 1.- Esteriliza el filamento del asa de siembra y toma la parte de la caja de petri que contiene el medio de cultivo sembrado. Cerca del mechero espera que se enfríe el asa y toma una colonia de la placa. Regresa la caja a su tapadera. 2.- Ahora toma el tubo con el caldo estéril y cerca del mechero retira el tapón de algodón ayudándote con los dedos meñique y anular, flamea la boca del tubo. 3.- Introduce el asa con la muestra (cuidando de no tocar las paredes del tubo) y por agitación dentro del caldo, siembra el inóculo. Retira el asa y flamea de nuevo la boca del tubo y coloca el tapón de algodón firmemente. Esteriliza el asa y déjala enfriar. 4.- Lleva a incubar y observa el desarrollo a las 24 o 48 horas después de la siembra. SEMBRADO EN PICADURA EN TUBO VERTICAL 1.- Esteriliza el filamento de la aguja de inoculación y toma la parte de la caja de petri que contiene el medio de cultivo sembrado. Cerca del mechero espera que se enfríe la aguja de inoculación y toma una colonia de la placa. Regresa la caja a su tapadera.

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2.- Ahora toma el tubo con el medio de cultivo y cerca del mechero retira el tapón de algodón ayudándote con los dedos meñique y anular, flamea la boca del tubo. 3.- Introduce la aguja con el inóculo y sin tocar las paredes del tubo, inocula en el centro del medio de cultivo sin llegar hasta el fondo del tubo. Retira la aguja de inoculación en la misma dirección de la siembra. Retira el asa y flamea de nuevo la boca del tubo y coloca el tapón de algodón firmemente. Esteriliza el asa y déjala enfriar. 4.- Lleva a incubar y observa las características del desarrollo a las 24 o 48 horas después de la siembra. CUESTIONARIO 1.- Menciona en qué casos se utilizan cada una de las técnicas que desarrollaste e indica las ventajas y desventajas de cada uno de los cultivos. ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 2.- ¿Cuáles son las medidas de seguridad que debes manejar durante el proceso de éste tipo de técnicas? ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Conclusiones: __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

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Nombre del alumno:___________________________________6to sem.gpo.____ Fecha de realización:__________________________________

_____________________________ Vo.Bo. del maestro

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Práctica no.3 NOMBRE DE LA PRÁCTICA: Cultivo faríngeo COMPETENCIA: Identifica algunas especies que conforman la flora patógena que se pueden desarrollar en la región faríngea. MATERIAL: Placa de agar sangre Placa de agar eosina azul de metileno Placas de agar salado manitol Hisopos estériles Asa bacteriológica Mechero fisher Abate lenguas estériles

INTRODUCCIÓN

Los cultivos de garganta se obtienen principalmente para detectar estreptococos beta-hemolíticos del grupo A. Clínicamente puede sospecharse una faringitis estreptocócica si se observa una mucosa difusamente enrojecida en un paciente que experimenta dolor y dificultad para deglutir. La flora comensal está compuesta por una variedad de bacterias facultativas y ciertas levaduras. Normalmente, en la orofaringe se hallan combinaciones y concentraciones variables de estreptococos alfa-hemolíticos, especies de Neisserias (no N. gonorrhoeae), estafilococos coagulasa negativos, ciertas enterobacterias etc.

DESARROLLO 1.- Prende el mechero fisher para crear un área estéril y así evitar que se contaminen los medios de cultivo. Coloca las placas de agares estériles en posición invertida sobre la mesa de trabajo para que se te facilite manipularlas. 2.- Es muy importante el método apropiado para obtener una muestra de la garganta: 3.- Con una luz brillante desde por encima del hombro de la persona que obtiene la muestra debe enfocarse en la cavidad oral abierta para guiar el hisopo hacia la parte posterior de la faringe. Se instruye al paciente para que respire profundamente y se deprime la lengua con suavidad con un abate lenguas. 4.- Luego se extiende el hisopo entre los pilares amigdalinos y detrás de la úvula. Debe tenerse la precaución de no tocar las paredes laterales de la cavidad oral.

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5.- Hacer que el paciente diga “ah” sirve para levantar la úvula y ayudar a reducir el reflejo de arcadas (asco). El hisopo debe moverse hacia atrás y hacia delante a través de la parte posterior de la faringe para obtener una muestra adecuada. 6.- Tomar un segundo hisopo siguiendo las mismas instrucciones y toma la parte de la caja de petri que contiene el medio de cultivo. 7.- Inocula en un extremo de cada uno de los medios de cultivo (AS, EMB y ASM) con los hisopos impregnados con la muestra faríngea (recuerda hacer todo el proceso cercas de la llama del mechero) y coloca los hisopos en un medio de transporte como caldo estreptocel o Stuart, y resérvalo. 8.- Esteriliza el filamento del asa de siembra en la llama del mechero y déjala enfriar. Con el asa en posición ligeramente horizontal realiza las estrías (muy juntas), oscilando el asa de siembra sobre la superficie de una porción pequeña del agar; mediante un balanceo sucesivo y rápido de la muñeca. 9.- Esteriliza el asa de nuevo y déjala enfriar. Rozar una vez con el asa de siembra las estrías sembradas la primera vez y realiza sobre una porción virgen del agar una segunda tanda de estrías que no toque la primera. 10.- Repetir exactamente la operación descrita en el punto anterior, pero rozando al empezar la segunda tanda de estrías, hasta completar 3 o 4. No hagas más presión sobre el agar que la debida al propio peso del asa y su mango. Es importante emplear un asa de siembra en buen estado, pues una rota o deteriorada rasgará el agar. 11.- Lleva a la incubadora y deja en posición invertida 24 horas al término de las cuales se puede observar ya el desarrollo de colonias aisladas. Con ayuda de tu profesor trata de identificar las colonias bacterianas desarrolladas en cada uno de los medios de cultivo. CUESTIONARIO 1.- ¿Por qué es tan importante la detección de estreptococos beta-hemolíticos en cultivos faríngeos? ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 2.- Escribe los nombres de las bacterias de la flora normal de la garganta, así como de la flora patógena, indicando en este último caso el tipo de enfermedad o complicación para el paciente infectado. ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

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____________________________________________________________________________________________________________________________________ Conclusiones. __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Nombre del alumno:___________________________________6to sem.gpo.____ Fecha de realización:__________________________________

_________________________________ Vo.Bo. del maestro

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Práctica no.4 NOMBRE DE LA PRÁCTICA: Tinción de Gram COMPETENCIA: Realiza la técnica de tinción de Gram para clasificar las bacterias. MATERIAL: Cultivo bacteriano de 24 horas Asa bacteriana Colorante cristal violeta o violeta de genciana Solución de yodo-lugol o yodo gram Alcohol-acetona (1:1) Colorante de safranina INTRODUCCIÓN Esta coloración, ideada por Hans Chistian Gram a fines del siglo XIX, permite dividir a las especies bacterianas en dos grandes grupos: aquellas que toman el colorante básico, cristal violeta (gram positivas) y aquellas que son decoloradas por el alcohol-acetona (gramnegativas). El procedimiento clásico de la coloración de Gram incluye la fijación del material, ya sea por calor en la llama del mechero o por acción del alcohol. Luego de la fijación, el primer paso de la coloración de Gram es la aplicación del cristal violeta; a continuación se agrega como mordiente la solución de yodo de Gram que fija químicamente el colorante alcalino a la pared bacteriana. La etapa de decoloración permite distinguir los gérmenes Gram positivos de los Gram negativos. Es probable que por el mayor contenido en lípidos de las paredes celulares de las bacterias gram negativas, el alcohol o la acetona aumenten la permeabilidad de la pared y el colorante sea eliminado. Además, la presencia de un mayor número de residuos de ácido teicoíco con uniones cruzadas en las bacterias Gram positivas es posible que aumente la fijación del cristal violeta. Los microorganismos gram positivos que han perdido la integridad de su pared celular debido a un tratamiento con antibióticos, envejecimiento o acción de enzimas auto líticas también permiten el escape del cristal violeta en la etapa de la decoloración. A esta altura de la coloración, los organismos gram positivos retienen el cristal violeta mientras que las gram negativas permanecen sin teñir. El agregado de un colorante de contraste como safranina teñirá a estos microorganismos y células (leucocitos y eritrocitos) de un color rosado o rojo. Las levaduras también son gram positivas, aunque el micelio de los hongos toma la coloración de Gram en forma variable. DESARROLLO 1.- Sobre un portaobjetos limpio y seco, se coloca una gota de solución salina fisiológica o una gota de agua.

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2.- Se esteriliza el filamento del asa de siembra a la llama del mechero y se deja enfriar. Se toma una pequeña cantidad de un cultivo bacteriano y se resuspende en la gota de agua o solución salina del portaobjetos. También puede ser utilizada una aguja de inoculación estéril para tomar la muestra bacteriana. 3.- Se deja secar al aire y luego se fija a la llama del mechero, pasándolo de 4 a 5 veces sobre esta; teniendo cuidado de no calentar demasiado pues el portaobjetos puede romperse (no es vidrio pyrex). Tener cuidado al fijar el frotis para evitar quemaduras. 4.- También se pueden realizar frotis del material directo de las muestras clínicas (exudados faríngeos, heridas). Se hace rodar el hisopo con que se tomó la muestra sobre el portaobjetos limpio y se fija con calor para proceder a la tinción. a.- Cubrir el frotis bacteriano con cristal violeta durante 1 minuto. Enjuagar con agua. b.- Aplicar el yodo gram y dejarlo reaccionar durante 1 minuto. Escurrir. c.- Ahora, decolorar con la solución de alcohol-acetona, agregando gota a gota en el portaobjetos inclinado sobre el fregador (o tarja), hasta que deje de salir colorante. Enjuague. d.- Finalmente cubrir el frotis con la solución de safranina y dejarla actuar durante 1 minuto. Lavar el exceso de colorante y dejar secar al aire. e.- Coloca aceite de inmersión al frotis seco y teñido para observarlo al microscopio, con el objetivo de 100X. f.- Realiza esquemas de lo observado e indica la forma, agrupación y característica tintorial de los microorganismos observados. CUESTIONARIO 1.- ¿Por qué es necesario fijar el frotis antes de teñirlo? ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 2.- ¿Puede una bacteria Gram positiva teñirse de Gram negativa? ¿Por qué? ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 3.- ¿Qué otras técnicas de tinción son utilizadas comúnmente en el laboratorio de bacteriología? ¿En qué casos se utilizan? __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

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Conclusiones. __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________ Nombre del alumno:___________________________________6to sem.gpo.____ Fecha de realización:__________________________________

_________________________________ Vo.Bo. del maestro

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Práctica no. 5 NOMBRE DE LA PRÁCTICA: Identificación de Staphylococcus aureus COMPETENCIA: Aplica las pruebas bioquímicas de la Coagulasa y Catalasa como medios para la identificación de S. aureus. MATERIAL: SUSTANCIAS: Portaobjetos peróxido de hidrógeno al 30% Aplicadores de madera Agua destilada Tubos de ensaye de 13x100 Solución salina estéril Pipetas graduadas plasma de conejo o humano Pipetas pasteur Asa bacteriológica Baño maría a 37°C Mechero Fisher o Bunsen Cultivo de S. aureus en placa o en tubo reciente.

INTRODUCCIÓN Catalasa: la catalasa es una enzima que descompone el peróxido de hidrógeno (H2O2) en oxígeno y agua. Químicamente la catalasa es una hemoproteína de estructura similar a la de la hemoglobina, excepto que los 4 átomos de hierro de la molécula están en estado oxidado (Fe+++) en lugar de reducido (Fe++). Excluyendo los estreptococos, la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas poseen actividad de catalasa. La mayoría de las bacterias anaerobias descomponen el H2O2 con peroxidasas semejantes a la catalasa, salvo que cada molécula contiene un solo ión férrico. El peróxido de hidrógeno se forma como uno de los productos finales del metabolismo oxidativo o aeróbico de los hidratos de carbono. Si se deja acumular, el peróxido de hidrógeno es letal para las células bacterianas. La catalasa transforma al peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno, como lo demuestra la siguiente reacción:

H2O2 H2O + O2 (burbujas de gas) La prueba de la catalasa, llevada a cabo en portaobjetos o en tubos, es muy comúnmente utilizada para diferenciar estreptococos (negativos) de estafilococos (positivos). Coagulasa: la coagulasa es una enzima proteíca de composición química desconocida, con actividad semejante a la protrombina, capaz de transformar el fibrinógeno en fibrina, provocando la formación de un coagulo visible en un sistema analítico adecuado. Se cree que la coagulasa funciona in vivo produciendo una barrera en el sitio de la infección estafilocócica. Esto puede servir para localizar los organismos in vivo, en abscesos. En el laboratorio, la prueba de

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la coagulasa se utiliza más comúnmente para diferenciar al S. aureus (coagulasa positivo) de otros estafilococos y micrococos. La coagulasa se halla en 2 formas, “libre” y “fija”, cada una de las cuales posee diferentes propiedades que requieren el uso de técnicas separadas: 1.- Coagulasa fija (prueba en portaobjetos): la coagulasa fija, conocida como “factor de aglutinación”, está unida a la pared celular bacteriana y no está presenten los filtrados de cultivos. Los hilos de fibrina formados entre las células bacterianas suspendidas en plasma (fibrinógeno) provocan su aglutinación, indicada por la presencia de agregados visibles en el portaobjetos. La actividad de la coagulasa fija no es inhibida por los anticuerpos formados contra la coagulasa libre. 2.- Coagulasa libre (prueba en tubos): la coagulasa libre es una sustancia semejante a la trombina, que se haya presente en los filtrados de cultivos. Cuando una suspensión de bacterias productoras de coagulasa se mezclan en partes iguales con una pequeña cantidad de plasma en un tubo de ensayo, se forma un coagulo visible como consecuencia de la utilización de los factores de la coagulación del plasma de manera similar a cuando se añade trombina. DESARROLLO a).- CATALASA: Prueba en portaobjetos: 1.- Con una aguja de punción o un aplicador de madera con la punta aguzada transferir células del centro de una colonia bien aislada a la superficie de un portaobjetos. 2.- Añadir 1 o 2 gotas de peróxido de hidrógeno al 3% (diluir la solución al 30% con agua destilada). Se recomienda no añadir el organismo al reactivo (invirtiendo el orden), especialmente si se utilizan agujas o asas que contienen hiero, ya que se pueden producir resultados falsos positivos. Prueba en tubos o placas de agar: 1.- Diluir 1:10 el peróxido de hidrógeno al 30% en agua destilada para obtener una solución al 3% 2.- Añadir unas gotas (aproximadamente 1 ml) del peróxido de hidrógeno al 3% directamente sobre la superficie del desarrollo de una placa o pico de agar. INTERPRETACIÓN: La rápida aparición y producción sostenida de burbujas de gas o efervescencia indica una reacción positiva. Dado que algunas bacterias pueden poseer enzimas distintas de la catalasa, capaces de descomponer el peróxido de hidrógeno, unas pocas burbujas diminutas formadas a los 20 a 30 segundos no se consideran una prueba positiva.

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Nota: es recomendable que el peróxido de hidrógeno se pruebe con organismos de control positivo y negativo, para garantizar su eficacia. b).-COAGULASA: Prueba en portaobjetos (coagulasa fija): 1.- Coloca una gota de agua destilada o solución salina fisiológica estéril sobre un portaobjetos. 2.- Emulsionar suavemente una suspensión del organismo en estudio en la gota de agua utilizando un asa o una varilla. 3.- Coloca una gota del plasma junto a la gota de la suspensión bacteriana. Mezclarlas bien. 4.- Inclinar el portaobjetos hacia uno y otro lado, observando la formación inmediata de un precipitado granular o de grumos blancos. INTERPRETACIÓN: Una reacción positiva se detecta usualmente en 15 a 20 segundos por la aparición de un precipitado granular o la formación de grumos blancos. La prueba se considera negativa si no se observa aglutinación en 2 o 3 minutos. Esta prueba solo se considera presuntiva y todos los cultivos que den resultados negativos o positivos tardíos deben verificarse mediante la prueba en tubos debido a que algunas cepas de S. aureus producen coagulasa libre que no reacciona en la prueba en portaobjetos. Prueba en tubos (coagulasa libre): 1.- Colocar asépticamente 0.5 ml de plasma de conejo reconstituido en el fondo de un tubo estéril. 2.- Añadir 0.5 ml de un cultivo puro de 18 a 24 horas en caldo del organismo por investigar (caldo BHI). 3.- Mezclar por rotación suave del tubo, evitando remover o agitar el contenido. 4.- Colocar el tubo en un baño de agua a 37°C. Observar la formación de un coagulo visible. INTERPRETACIÓN: La reacción se considera positiva ante cualquier grado de coagulación visible dentro del tubo. La reacción se observa mejor inclinando el tubo. Si es positiva, el coagulo o gel permanece en el fondo del tubo. Las bacterias fuertemente coagulasa positivas pueden producir un coagulo en 1 a 4 horas; por lo tanto, se recomienda observar el tubo a intervalos de 30 minutos durante las primeras 4 horas de la prueba. Algunas cepas de S. aureus pueden formar fuertes fibrinolisinas que disuelven el coagulo recién formado. Por consiguiente, pruebas positivas pueden pasar inadvertidas si no se observa el tubo a intervalos frecuentes. Otras cepas de S. aureus pueden producir sólo suficiente coagulasa como para dar una reacción positiva tardía luego de 18 a 24 horas de incubación; por lo tanto, todas las pruebas negativas a las 4 horas, deben observarse después de las 18 a 24 horas de incubación.

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Nota: la coagubilidad del plasma utilizado puede comprobarse añadiendo 1 gota de cloruro de calcio al 5% a 0.5 ml de plasma de conejo reconstituido. Se debe formar un coagulo en 10 o 15 seg. Cada ampolleta de plasma reconstituida debe ensayarse con organismos de control positivo (S. aureus coagulasa positiva) y una cepa coagulasa negativo (S. epidermidis). CUESTIONARIO 1.- ¿Por qué en la prueba de la catalasa es recomendable manipular la muestra con un aplicador de madera y no con un asa metálica? __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 2.- ¿Por qué en la prueba de la coagulasa no se recomienda utilizar plasma citratado? __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 3.- Indica 3 pruebas más que nos permitan la identificación plena de Staphylococcus aureus __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Conclusiones:______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Nombre del alumno:________________________________6to sem. gpo______ Fecha de realización:_______________________________ ___________________________

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Práctica no. 6

NOMBRE DE LA PRÁCTICA: Antiestreptolisinas COMPETENCIA: Determina los títulos de Antiestreptolisinas en el suero de un paciente, para detectar infecciones por estreptococos β-hemolíticos del grupo A. MATERIAL: Equipo de estreptolisina “O” de Beli Baño maría a 37°C Termómetro Sol. Amortiguadora de pH (6.5-6.7) Centrífuga Pipetas pasteur Pipetas graduadas de 2, 5 y 10 ml. Solución salina fisiológica Tubos de ensaye de 12x75 Gradilla Suspensión de glóbulos rojos lavados al 5% Sangre sin anticoagulante del paciente INTRODUCCIÓN Es importante que el estreptococo β- hemolítico del grupo A sea identificado correctamente en el laboratorio porque es necesario implementar un rápido tratamiento del paciente infectado, no sólo para controlar la infección primaria (faringitis aguda, Hypoderma, escarlatina, erisipela o celulitis), sino también para prevenir las complicaciones potenciales serias, como fiebre reumática, endocarditis y valvulitas reumática y glomerulonefritis aguda o crónica. Entre las pruebas para su detección tenemos el cultivo en agar sangre con la manifestación de la β-hemólisis, sensibilidad a la bacitracina, determinación serológica de Antiestreptolisinas, entre otras muchas. El estreptococo pyogenes (grupo A) produce diversas sustancias y toxinas extracelulares. Las dos hemolisinas, estreptolisina O y estreptolisina S, lábil y estable frente al oxígeno respectivamente, pueden lisar eritrocitos humanos y de otras especies así como las membranas celulares de los PMNS, plaquetas y otras células. La estreptolisina O es antigénica; es decir, estimula al paciente infectado la producción de anticuerpos, las Antiestreptolisinas, que determinadas en el laboratorio pueden ser de utilidad para diagnosticar infecciones por este microorganismo. DESARROLLO 1.- Extraer una muestra de sangre del paciente, recolectándola en un tubo seco (sin anticoagulante) y una vez bien coagulada la sangre, centrifugar para separar el suero. Es importante que evites que se hemolice la muestra. 2.- Obtener una muestra de sangre con anticoagulante (EDTA) y preparar la suspensión de glóbulos rojos lavados al 5% en sol. Amortiguadora. La sangre humana y la del conejo son igualmente satisfactorias. Una cantidad apropiada de sangre (desfibrinada o con anticoagulante) se centrifuga a 2000 rpm durante 5 min., el sobrenadante es descartado y el paquete de glóbulos se lava agregando solución salina al 0.85 %, centrifugándose nuevamente.

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Este procedimiento es repetido 3 veces, debiendo ser claro el sobrenadante en el último lavado. Lo contrario indicaría que los glóbulos rojos están frágiles y no deben ser usados. Los glóbulos rojos se suspenden en solución amortiguadora a una concentración final de 5 %. 3.- La estreptolisina “O” BELI se presenta en forma oxidada que es estable, pero no es activa MODO DE ACTIVARLA:

a) Se reconstituye con agua destilada con el volumen indicado en la etiqueta del frasco. b) Para cada 5 ml. De estreptolisina se adiciona el hidrosulfito de sodio

contenido en uno de los tubos capilares que se adjuntan. c) Se agita por inversión hasta que se disuelva, encontrándose ahora en su

forma activa. Una vez añadida el hidrosulfito de sodio la estreptolisina debe ser empleada se inmediato, ya que al reoxidarse esta se inactiva. La estreptolisina reconstituida mientras no sea reducida puede conservarse en congelación sin que su potencia se altere por periodos hasta de un mes.

4.- Las diluciones del suero problema y la suspensión de glóbulos rojos deben ser preparadas con solución amortiguadora de pH 6.5-6.7.

La solución amortiguadora puede prepararse disolviendo 7.4 grs. de NaCl, 3.7 grs. De KH2PO4 y 1.81 grs. De Na2HPO4 en 1000 ml de agua destilada ajustándose el pH a 6.5-6.7 con solución de NaOH 0.1 N.

Diluciones del suero: las soluciones siguientes se hacen usando solución amortiguadora como diluyente:

1:10 0.5ml de la solución 1:10 + 4.5 ml de solución amortiguadora 1:100 1.0 ml de suero + 9 ml de solución amortiguadora 1:500 2.0 ml de dilución 1:100 + 8.0 ml de solución amortiguadora

1. La prueba se monta de acuerdo con el siguiente protocolo:

DILUCIONES DEL SUERO PROBLEMA 1:10 1:100 1:500 Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Volumen de la disolución en ml

0.8 0.2 1. 0.8 0.6 0.4 0.3 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0

Volumen de la solución salina amortiguada en ml

0.2 0.8 0.0 0.2 0.4 0.6 0.7 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.5 1.0

AGITAR LOS TUBOS

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Volumen de estreptolisina en ml

0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.0 0.5

AGITAR E INCUBAR A 37º C DURANTE 15 MINUTOS Volumen de la suspensión de glóbulos rojos en ml.

0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

AGITAR E INCUBAR A37º C DURANTE 45 MIN TENIENDO CUIDADO DE AGITAR LOS TUBOS DURANTE ESTE TIEMPO CADA 15 MINUTOS. CENTRIFUGAR LOS TUBOS DURANTE 1 MINUTO A 1500 RPM

Titulo en unidades Todd

12 50 100 125 166 250 333 500 625 833 1250 2500

INTERPRETACION: el título de Antiestreptolisinas “O”, se expresa en unidades Todd. Estas unidades son la recíproca de la dilución más alta del suero que neutraliza completamente la estreptolisina “O”. Así, un suero que no representa hemólisis de los tubos 1 a 4, huellas de hemólisis en el tubo 5 hemólisis completa en todos los demás, es reportado como 125 unidades Todd. Patrón de Antiestreptolisinas.- el patrón de Antiestreptolisinas es suero o gama globulina estandarizada para ser usada como control. Después de haber sido diluida 1:5 con solución amortiguadora, debe ser usado como la dilución 1: 100 del suero, en el rango de 100 a 333 en tubos 3 a 7 como se muestra en el cuadro. Debe ser un punto final equivalente a 166 unidades Todd por ml., o sea, ausencia de hemólisis en los tubos 3, 4 y 5 y hemólisis en los tubos 6 y 7. Después de reconstituido el producto debe ser usado el mismo día. CUESTIONARIO 1.- Elabora un diagrama de flujo donde indiques el proceso completo (técnicas y pruebas) necesario para la identificación de una infección de estreptococo β-hemolíticos desde que el paciente se presenta al laboratorio. ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 2.- Explica ¿por qué cuando se requiere aislar estreptococo pyogenes β-hemolítico en agar sangre, es necesario ranurar el medio? __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

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3.- Explica ¿en qué consiste la enfermedad de la fiebre reumática y cuáles pueden ser sus complicaciones si no se controla? __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Conclusiones:______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Nombre del alumno:________________________________6to sem. gpo______ Fecha de realización:_______________________________

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Práctica no. 7 NOMBRE DE LA PRÁCTICA: Determinación de Factor Reumatoide COMPETENCIA: Realiza la determinación del Factor Reumatoide, como una prueba más para la detección de infecciones reumáticas, como la artritis reumatoide. MATERIAL: Un equipo de Reumaclin de sanofi o similar que contiene los siguientes reactivos: REACTIVOS: 1 Reactivo de látex sensibilizado (almacenar a Temp. De +2 a +8º

C) 2 Frascos con 60 ml de solución amortiguadora 1 Frasco con suero control positivo 1 Frasco con reactivo control negativo Laminillas con 3 áreas marcadas, con fondo negro para realizar la prueba. Aplicadores de madera Jeringa, torundas con alcohol y torniquete Tubo rojo o con gel para la toma de sangre. Rotor Reloj o cronómetro INTRODUCCIÓN

FACTOR REUMATOIDE

Definición: Inmunoglobulina presente en el suero del 50-95 por ciento de los adultos que tienen artritis reumatoide y que sirve para diagnosticar e investigar la enfermedad. El factor reumatoide (FR) es una prueba que mide la presencia y nivel de la IgM específica contra las inmunoglobulinas IgG anormales, producidas por los linfocitos de la membrana sinovial, de las articulaciones de personas afectadas por la artritis reumatoide. La artritis reumatoide es una enfermedad crónica, que produce la inflamación de las articulaciones principalmente de manos y pies. Cuando se originan estas inmunoglobulinas IgG y se fija la IgM, se forman inmunocomplejos IgG-IgM que activan el complemento y otros factores inflamatorios que producen secundariamente la destrucción de las articulaciones afectadas. Por ello se le llama una enfermedad autoinmune, ya que es el sistema inmunitario del individuo el que destruye tejidos del propio cuerpo. Varias pruebas para ponerlos en evidencia se basan en provocar la reacción antigeno-anticuerpo, de modo que el suero del enfermo aglutine partículas –

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hematíes, látex, bentonita, etc. A las que se ha fijado una capa de globulina gamma No es un análisis específico de esta enfermedad, aparece positivo en el 80% de los pacientes con artritis reumatoide, pero puede aparecer negativo. Inclusive puede aparecer positivo en otras enfermedades no relacionadas (Lupus Eritematoso Sistémico, Leucemia, Síndrome Nefrótico etc.) En personas de la tercera edad pueden aparecer niveles elevados sin repercusión clínica. DESARROLLO METODO CUALITATIVO EN PLACA

1. Dejar que los reactivos y muestras alcancen la temperatura ambiente. 2. Preparar una dilución 1:20 del suero problema; diluyendo 0.1 ml del suero

con 1.9 ml de solución amortiguadora. 3. Poner 1 gota (aproximada mente 0.05 ml) del suero diluido en las áreas

marcadas en la laminilla 4. Colocar una gota del suero control (+) y (-) en las áreas marcadas del la

laminilla. 5. Mezclar el reactivo de látex Reumaclin hasta obtener una suspensión

homogénea y añadir 1 gota de reactivo de látex a cada uno de los sueros controles.

6. Mezclar con aplicadores diferentes por cada área 7. Mover en un ángulo de 45º la laminilla por 2 minutos 8. Observar inmediatamente la aglutinación utilizando una fuente de luz

directa, comparar las reacciones del suero y de los controles. INTERPRETACION La aglutinación de las partículas de látex indica una reacción positiva (+). Si es así, realizar la prueba cuantitativa. La no aglutinación o una ligera aparición de granulosidad que no exceda a la observada en el control (-), indica un resultado (-). Nota: la sensibilidad del reactivo de látex es 3UI/ml. CUESTIONARIO

1. Define qué es el factor reumatoide: ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

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2. ¿Por qué no es aconsejable trabajar con sueros con alto contenido de lípidos, o que el plasma tenga fibrina?

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

3. ¿Por qué la artritis reumatoide se considera una enfermedad autoinmune?. ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CONCLUSIONES:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Nombre del alumno:________________________________6to sem. gpo______ Fecha de realización:_______________________________

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Práctica no. 8

NOMBRE DE LA PRÁCTICA: Proteína C reactiva COMPETENCIA: Determina y cuantifica la proteína C reactiva en suero sanguíneo humano que cursa con un proceso inflamatorio o necrótico. REACTIVOS: Un equipo para PCR que contiene los siguientes reactivos:

un Látex anti proteína C reactiva (conservar entre 2 y 8 ºC) un Suero control positivo Un Suero control negativo

MATERIAL:

Laminillas con 3 áreas marcadas, con fondo negro para realizar la prueba. Aplicadores de madera Jeringa, torundas con alcohol y torniquete Tubo rojo o con gel para la toma de sangre. Rotor Reloj o cronómetro Centrífuga Pipeta pasteur Pipetas graduadas de 5 ml Pipetas pistón de 100 y 500 micro litros Perilla de tres vías

INTRODUCCIÓN

La proteína C-reactiva es un tipo especial de proteína producida por el hígado que sólo está presente durante episodios de inflamación aguda. El aspecto más importante de la PCR es su interacción con el sistema del complemento, el cual es uno de los mecanismos de defensa contra elementos extraños.

A pesar de que éste no es un examen específico, sí advierte de forma general sobre la presencia de un proceso inflamatorio agudo. El médico puede utilizar este examen para evaluar una exacerbación de artritis reumatoide o de fiebre reumática. El examen también puede ser útil para evaluar la respuesta a la terapia. La proteína C reactiva no se eleva de forma habitual en enfermedades producidas por virus.

La proteína C reactiva se eleva ante un problema infeccioso o inflamatorio antes que la VSG y comienza a disminuir ante la recuperación de la enfermedad.

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Si se trata la enfermedad con aspirina o antiinflamatorios desaparece su elevación. La proteína C reactiva aparece elevada en el infarto de miocardio. También puede ser de ayuda tras una intervención de cirugía, ya que aparece elevada durante 3 ó 4 días, para luego disminuir, si persiste elevada es que hay alguna infección o complicación post-quirúrgica. PROCEDIMIENTO PRUEBA CUALITATIVA

1. Extraiga sangre sin anticoagulante, Centrifuga durante 5 minutos a 2000 rpm y separe el suero.

2. Diluya el suero a probar (1:40) con solución salina amortiguadora: 2 gotas (0.1 ml) del suero en 3.9 ml de solución salina amortiguadora.

3. Coloque una gota de la solución anterior en una de las divisiones de la placa de vidrio, en las otras áreas coloca una gota de suero control negativo y suero control positivo.

4. Añada una gota de látex anti proteína C reactiva a cada una de las muestras.

5. Oscile suavemente la placa durante 2 minutos y observe si se presenta aglutinación macroscópica.

INTERPRETACION Positivo: Aglutinación visible con formación de grandes agregados y fondo claro comparable al control positivo. Si la prueba de suero sale positiva se deberá realizar la prueba cuantitativa. Negativo: Suspensión uniforme sin aglutinación visible, comparable al control negativo. En ocasiones se pueden apreciar finas granulaciones que no exceden a las observadas con el control negativo, por lo que este fenómeno no deberá interpretarse como aglutinación. PRUEBA CUANTITATIVA:

1. Prepare diluciones del suero problema en solución salina de la siguiente manera:

Coloque 5 tubos de ensayo en una gradilla, deposite 0.5 ml de solución salina en cada uno de los tubos.

Añada0.5 ml del suero diluido1:40 (ver prueba cualitativo) al primer tubo. mezcle bien y transfiera 0.5 ml de la dilución anterior al segundo tubo.

Continúe efectuando la misma operación hasta terminar con el tubo No.5.

TUBO 1 1/80 2 1/160

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3 1/320 4 1/640

5 1/1280

2. Utilizando un capilar o gotero, ponga una gota de cada dilución en las divisiones de la placa de vidrio previamente marcadas.

3. Añada una gota de látex anti proteína C reactiva a cada división. 4. Mezcle con un aplicador, desde la dilución más elevada hasta la más baja y

extienda por toda el área del ovalo 5. Oscile suavemente la placa durante 2 minutos y observe si se presenta

aglutinación macroscópica. INTERPRETACION La dilución más elevada del suero que muestre aglutinación visible, se considera como el titulo de proteína C reactiva en el suero plasma. CUESTIONARIO 1.- ¿Para qué se realiza la determinación de la proteína C reactiva? __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 2.- ¿En qué casos pueden elevarse los niveles de PCR?: ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 3.- ¿Cuáles son los niveles normales de PCR?: ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CONCLUSIONES:_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Nombre del alumno:________________________________6to sem. gpo______ Fecha de realización:_______________________________

____________________________ Vo.Bo. del maestro

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Práctica no. 9 NOMBRE DE LA PRÁCTICA: Reacciones febriles COMPETENCIA: Determina y cuantifica a través de pruebas serológicas, los títulos de anticuerpos contra antígenos bacterianos para evaluar la presencia de enfermedades como fiebre tifoidea, brucelosis, entre otras; que se caracterizan por provocar en el paciente un síndrome febril. REACTIVOS: Un equipo para Reacciones Febriles que contiene los siguientes antígenos:

1. Tífico “O” (antígeno somático) 2. Tífico “H” (antígeno flagelar) 3. Paratífico “A” (antígeno flagelar) 4. Paratífico “B” (antígeno flagelar) 5. Brucella abortus 6. Proteus OX-19 7. Suero control positivo 8. Suero control negativo

MATERIAL:

Placa de vidrio con excavaciones para serología. Aplicadores de madera. Jeringa, torundas con alcohol y torniquete. Tubo rojo o con gel para la toma de sangre. Rotor. Reloj o cronómetro. Centrífuga. Pipeta pasteur. Pipeta pistón de 40, 20, 10 y 5 micro litros.

INTRODUCCIÓN

Esta prueba representa un método de laboratorio útil para seguir la secuencia de ciertas infecciones con acceso febril, causadas por bacterias. Son reacciones de aglutinación entre los antígenos de Salmonella, Brucella y Proteus y los anticuerpos contra estos antígenos presentes en el suero del paciente.

La técnica comprende:

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1. - Reacción de Widal para diagnóstico de la fiebre tifoidea, entérica y ondulante. La reacción mide el título de anticuerpos (aglutininas) en el suero contra una suspensión de antígenos conocidos de Salmonella typi, S.paratyphi A y S.paratyphi B.

2.- Reacción de Huddleson para la brucelosis (Brucella abortus, B.suis o B. melitensis).

3.- Reacción de Weil-Felix para el tifo. Las especies de Rickettsias que causan tifo, tienen componentes antigénicos idénticos a Proteus (cepas OX-19, OX-2 y OX- K). En esta prueba se utilizan antígenos de Proteus para diagnóstico de tifo.

PROCEDIMIENTO

1. Extraiga sangre sin anticoagulante y una vez que se coagule bien, centrifugar 5 minutos a 3000 rev/ minuto.

2. Con ayuda de una pipeta pasteur transfiera el suero a un tubo limpio y procede de la siguiente manera:

EXCAVACIÓN SUERO (ml) ANTIGENO (1 gota ) Títulos 1 0.08 Tífico “O” 1:20 2 0.08 Tífico “H” 1:20 3 0.08 Paratífico “A” 1:20 4 0.08 Paratífico “B” 1:20 5 0.08 Brucella abortus 1:20 6 0.08 Proteus OX-19 1:20 7 0.02 Suero control positivo 1:20 8 0.02 Suero control negativo 1:20

3. Mezclar con aplicadores de madera y poner en el rotor por 7 min. Verificar

que prueba te da positiva; es decir cual prueba manifiesta franca glutinación. Realiza la observación al microscopio con objetivo seco débil para determinar la aglutinación.

4. Una vez que establezcas que antígenos dan positivo, solo a estos les realizaras las pruebas con los siguientes volúmenes de suero. Por ejemplo, si te dieron positivo los antígenos “O” y “H” :

SUERO Tífico “O” SUERO (ml) Tífico “H” TITULOS 0.04 1 gota 0.04 1 gota 1:40 0.02 1 gota 0.02 1 gota 1:80 0.01 1 gota 0.01 1 gota 1:160 0.005 1 gota 0.005 1 gota 1:320

5. Mezclar con aplicadores de madera, agitar por 7 minutos en el rotor y verificar hasta que títulos manifiesta franca aglutinación, para que reportes

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el resultado final de cada prueba. Recuerda verificar la aglutinación al microscopio con objetivo seco débil.

6. La siguiente tabla te ayudara a realizar la interpretación de los resultados y los controles precisamente te ayudaran para verificar el equipo y además, como se debe ver una prueba positiva (aglutinada) de una negativa (no aglutinada).

SUERO PROBLEMA (ml)

ANTÍGENO TÍTULOS

0.08 1 gota 1:20 0.04 1 gota 1:40 0.02 1 gota 1:80 0.02 1 gota 1:160 0.005 1 gota 1:320 0.02 de suero control positivo

1 gota 1:80

0.02 de suero control negativo

1 gota NO AGLUTINA

CUESTIONARIO

1. Describe brevemente las enfermedades: fiebre tifoidea, paratifoidea, brucelosis, infección por Rickettsias. ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

2. ¿Por qué se dice que las reacciones febriles son poco específicas? ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

3. ¿Cómo podemos determinar si la infección esta activa o es por la presencia de anticuerpos de memoria?

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__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

4. ¿Qué resultados se espera en las pruebas si un paciente?

a. Padeció anteriormente una infección por tifoidea, ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

b. Recibió tratamiento con antibióticos ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

c. O fue vacunado anteriormente. _________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

5. ¿Qué otras pruebas se puede realizar en el paciente para verificar estas enfermedades, y que además sean pruebas más específicas?

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CONCLUSIONES:_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Nombre del alumno:________________________________6to sem. gpo_______ Fecha de realización:_______________________________

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Práctica no. 10 NOMBRE DE LA PRÁCTICA: Coprocultivo COMPETENCIA: Identifica Enterobacterias por medio del coprocultivo. MATERIAL: Asa bacteriológica Mechero Fisher Estufa de incubación a 37ºC Agares estériles de SS, EMB, Mc Conkey, Caldo tetrationato, agar sulfito bismuto Agar verde brillante. Una muestra de heces recolectada en frasco estéril Hisopos estériles INTRODUCCIÓN Las Enterobacterias representan la mayor parte de la flora microbiana del tracto intestinal del hombre. En ella se incluyen gérmenes comensales (Proteus y bacilos coliformes), así como patógenos del género Salmonella y Shigella. El vibrión colérico puede ser aislado de casos de cólera. Durante las infecciones entéricas, cuando se presentan patógenos tales como Salmonella y Shigella, el bacteriólogo debe distinguir entre los habitantes normales del intestino y los agentes etiológicos de enfermedad. Es importante destacar que las bacterias intestinales toman parte en los procesos digestivos tanto del hombre como de los animales. Ellos ayudan a la síntesis de vitaminas del complejo B y de la vitamina K. La materia fecal evacuada debe ser reciente y deben cultivarse lo más pronto posible después de haber sido recolectada. Las muestras deberán obtenerse al inicio del cuadro clínico, antes de iniciar el tratamiento antimicrobiano. Las muestras de heces se pueden tomar directamente en un frasco limpio de boca ancha y con tapa hermética, de preferencia estéril. Si la muestra se toma en el mismo laboratorio donde se va a realizar el aislamiento, no es necesario usar medio de transporte y hay que sembrar de inmediato. En estudios de campo o cuando el laboratorio no esté cercano, la muestra se toma con un hisopo, el cual debe quedar bien impregnado de materia fecal. El hisopo se coloca en un medio de transporte como el Cary-blair. PROCEDIMIENTO

1. Introducir un hisopo estéril en varios puntos de la muestra. 2. Descargar la muestra en un área pequeña de los medios de cultivo: SS, Mc

Conkey y EMB y realizar el estriado. 3. Incubar las cajas a 37ºC durante 24 o 48 horas 4. Observar las características morfológicas de las colonias desarrolladas

indicando si existen cambios en el medio, pigmentos en la colonia etc.

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5. Tratar de identificar si existe crecimiento de Salmonella o Shigella que se manifiestan como colonias de color blanco en Mc Conkey e incoloras en EMB.

6. Al mismo tiempo que las placas, con la muestra fecal se inocula un medio de enriquecimiento como el caldo tetrationato, colocando el hisopo impregnado con la muestra en el caldo al cual se le agregó previamente 0.2 ml de yodo por gramo de materia fecal.

7. Incubar este medio de enriquecimiento por 12 o 18 horas a 37ºC 8. A partir del caldo tetrationato se siembran placas con medios inhibitorios

como el agar verde brillante y el agar sulfito de bismuto, este último si se está buscando S. typhi. Después de incubar a 37ºC durante 24 horas la placa de verde brillante y 48 horas la de sulfito bismuto, se revisan cuidadosamente en busca de colonias sospechosas. En el verde brillante Salmonella crece como colonias rojas y en sulfito de bismuto como colonias negras.

9. Para mayor seguridad en la identificación de Enterobacterias es necesario realizar pruebas bioquímicas a las cepas aisladas en los medios de cultivo. Las más comunes son IMVIC

En el siguiente cuadro indica las características morfológicas de las diferentes bacterias en cada uno de los medios de cultivo: MEDIO DE CULTIVO

Escherichia coli Salmonella Shigella

EMB

Agar SS

Agar sulfito bismuto

Agar verde brillante

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CUESTIONARIO 1.- ¿Cuáles son las principales bacterias patógenas que pueden ser aisladas por medio del coprocultivo? ¿Qué enfermedades producen cada una de éstas? __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 2.- Investiga el protocolo para el aislamiento e identificación del vibrión cholerae: __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 3.- Explica brevemente en qué consisten las pruebas de Indol, Rojo de Metilo, Voges-Proskauer y Citrato (IMVIC): ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CONCLUSIONES:_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Nombre del alumno:________________________________6to sem. gpo______ Fecha de realización:_______________________________

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Práctica no. 11 NOMBRE DE LA PRÁCTICA: Identifica Enterobacterias a través de pruebas bioquímicas (IMVIC) COMPETENCIA: Realiza la prueba bioquímica del Indol, rojo de metilo, vogues-proskauer y citrato para la diferenciación de Enterobacterias, especialmente de Escherichia coli. MATERIAL: Caldo triptófano (MIO o SIM) Reactivo de Kovac Reactivo de Ehrlich Cepa reciente del organismo en estudio. Caldo RM/VP Indicador de pH de rojo de metilo Medio de Citrato Simmons Cloroformo Reactivo de alfa-naftol al 5% KOH al 40% Tubos de ensaye de 13x100 Pipetas graduadas de 5 ml Pipetas pasteur Incubadora INTRODUCCIÓN El indol, es un bencilpirrol, es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptófano. Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptófano con producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco. La producción de indol es una característica importante para la identificación de muchas especies de microorganismos, siendo especialmente útil para diferenciar Escherichia coli (positiva) de miembros del grupo Klebsiella-Enterobacter (la mayoría negativos). La prueba de indol está basada en la formación de un complejo de color rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehído. Este es el principio activo de los reactivos de Kovac y ehrlich. Se debe utilizar un medio rico en triptófano. En la práctica se emplean medios combinados tales como sulfuro-indol-movilidad (SIM), movilidad-indol-ornitina (MIO) o indol-nitrato. La prueba de rojo de metilo es cuantitativa para la producción de ácido y requiere organismos positivos que produzcan ácidos fuertes (láctico, acético, fórmico) a partir de glucosa, por la vía de la fermentación ácida mixta. Dado que son muchas las especies de Enterobacterias que pueden producir cantidades suficientes de ácidos fuertes detectables con el indicador rojo de metilo durante la fase inicial de la incubación, sólo se consideran rojo de metilo positivos aquellos organismos que pueden mantener este pH bajo luego de una incubación prolongada (48 a 72 horas), contrarrestando el sistema estabilizador de pH del medio.

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La reacción de Voges-proskauer: el ácido pirúvico, componente fundamental formado en la degradación fermentativa de la glucosa, es metabolizado luego a través de varias vías, de acuerdo con los sistemas enzimáticos que poseen las diferentes bacterias. Una de dichas vías lleva a la producción de acetoína (acetilmetilcarbinol), un subproducto de reacción neutra. Los organismos tales como los miembros del grupo Klebsiella-Enterobacter producen acetoína como principal subproducto del metabolismo de la glucosa y forman cantidades menores de “ácidos mixtos”. En presencia de oxígeno atmosférico y de hidróxido de potasio al 40%, la acetoína se convierte en diacetil y el alfa-naftol actúa como catalizador para revelar un complejo color rojo. Citrato: la utilización de citrato por una bacteria se detecta en un medio con citrato mediante la formación de subproductos alcalinos. El medio incluye citrato de sodio, un anión como única fuente de carbono y fosfato de amonio como única fuente de nitrógeno. Las bacterias que pueden utilizar citrato también pueden extraer nitrógeno de la sal de amonio, con producción de amoníaco (NH3

+) alcalinizando el medio por conversión del amoniaco en hidróxido de amonio (NH4OH). El azul de bromotimol, amarillo a pH menor a 6 y azul a pH mayor de 7.6 es el indicador. DESARROLLO a.- Prueba de Indol 1.- Inocular caldo triptófano (u otro medio con indol) con el organismo en estudio e incubar a 35-37°C. 2.- Al finalizar este período, añadir 5 gotas de reactivo por la pared interior del tubo. Si se emplea reactivo de Ehrlich, este paso debe ser precedido por la adición de 1 ml de cloroformo. Esto no es necesario con el reactivo de Kovac. INTERPRETACIÓN El desarrollo de un vivo color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el caldo (o en la capa de cloroformo) segundos después de añadir el reactivo indica la presencia de indol y una prueba positiva. NOTA: Es aconsejable probar los reactivos con controles positivos (Escherichia coli) y negativos (Klebsiella pneumoniae). b.- Prueba de Rojo de Metilo 1.- Inocular el caldo RM/VP con un cultivo puro del organismo en estudio. Incubar a 35°C durante 48 a 72 horas (no menos de 48 horas). Finalizado este período, añadir directamente al caldo 5 gotas de reactivo de rojo de metilo.

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INTERPRETACIÓN: El desarrollo de un color rojo estable en la superficie del medio indica que la producción de ácido es suficiente como para bajar el pH a 4.4 y es una prueba positiva. Dado que otros organismos pueden producir cantidades menores de ácido a partir del sustrato, es posible el desarrollo de un color naranja intermedio entre el amarillo y el rojo. Esto no indica una prueba positiva. Nota: no olvidar probar medios y reactivos con controles positivos y negativos. c.- Prueba de Voges-proskauer 1.- Inocular un tubo de caldo RM/VP con un cultivo puro del organismo en estudio. Incubar durante 24 horas a 35°C. Al finalizar este periodo, transferir 1 ml de caldo a un tubo de ensayo limpio. Añadir 0.6 ml de alfa-naftol al 5% y 0.2 ml de KOH al 40%. Es esencial adicionar los reactivos en ese orden. Agitar el tubo cuidadosamente para exponer el medio al oxígeno atmosférico y dejarlo reposar durante 10 o 15 minutos. INTERPRETACIÓN: Una prueba positiva está indicada por el desarrollo de un color rojo a los 15 minutos de añadir los reactivos, revelando la presencia de diacetilo, producto de oxidación de la acetoína. Las pruebas no deben leerse luego de más de 1 hora, ya que cultivos de voges-proskauer negativos pueden producir un color cobrizo, con la consecuente posibilidad de una interpretación falsa positiva. d.- Prueba de Citrato 1.- Tomar una colonia bien aislada de la superficie de un medio de aislamiento primario e inocularla en una sola estría en el pico de agar citrato de Simmons. Incubar a 35°C durante 24 a 48 horas. INTERPRETACIÓN: El desarrollo de un color azul intenso en 24 a 48 horas indica una prueba positiva y revela que el organismo en estudio ha sido capaz de utilizar el citrato contenido en el medio, con la formación de productos alcalinos. CUESTIONARIO 1. ¿Por qué es importante que las cepas de los organismos en estudio sean recientes para estas pruebas? ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

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2.- ¿En la prueba de Indol, por qué utilizas cloroformo cuando usas el reactivo de Ehrlich? __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 3.- ¿Por qué se recomienda la utilización de controles para cada una de las pruebas? ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Conclusiones:________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Nombre del alumno:______________________________ 6to sem. Gpo._______ Fecha de realización:______________________________________

____________________________ Vo.Bo. del maestro

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Práctica no.12

NOMBRE DE LA PRÁCTICA: Urocultivo COMPETENCIA: Identifica la diferente flora patógena que puede desarrollarse en el tracto urinario. MATERIAL: SUSTANCIAS: Muestra de orina tomada en frasco estéril Asa bacteriológica Agar EMB Porta objetos Agar sangre Cubre objetos Agar Mc Conkey Centrífuga Agar Salado manitol Microscopio Agar nutritivo Incubadora Mechero Fisher Cajas de Petri estériles Pipetas de 1ml estériles Tubos de ensayo conteniendo 9 ml de agua peptonada, estériles INTRODUCCIÓN Las infecciones urinarias pertenecen al grupo de los procesos infecciosos más frecuentes de la patología médica. Su importancia radica en el daño que pueden ocasionar sobre la función renal. Las vías urinarias normalmente son estériles por encima del nivel de la uretra distal. Los microorganismos que infectan las vías urinarias altas son comensales localizados en áreas vecinas. En esta colonización intervienen varios factores predisponentes que pueden ser de origen local o general. Los primeros incluyen la contaminación fecal del meato urinario, el cateterismo, la patología urinaria congénita o adquirida y el reflujo vesical. Entre los factores generales están la diabetes mellitus, el embarazo y la terapia con fármacos de amplio espectro. Las bacterias que con mayor frecuencia se aíslan de la orina de pacientes ambulatorios con infección urinaria son: Escherichia coli, Staphylococcus saprophyticcus, Proteus sp, Klebsiella sp, Enterococcus faecalis etc. Para lograr que el cultivo de orina realmente sea veraz, requiere que las muestras sean obtenidas en condiciones óptimas. PROCEDIMIENTO El Urocultivo incluye:

1) Aislamiento e identificación de microorganismos 2) Cuenta viable 3) Antibiograma para los gérmenes patógenos aislados e identificados

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1) Aislamiento e identificación de los microorganismos

a) Mezclar perfectamente el frasco con la muestra de orina y depositar aproximadamente entre 5 y 10 ml de orina en un tubo.

b) Centrifugarla durante 5 minutos a 3500 r.p.m. c) Se desecha el sobrenadante dejando solo unas gotas de orina

residual para emulsionar el sedimento. d) Con la suspensión del sedimento se lleva a cabo el estudio

microscópico directo, tomando una gota del sedimento que se deposita en un portaobjetos, colocándole un cubreobjetos.

e) Observarlo al microscopio con el objetivo seco fuerte, e identificar lo observado.

f) Mediante un asa de platino se hacen siembras por aislamiento en estrías del sedimento, obtenido al centrifugar una muestra de la orina colocada en tubo estéril y centrifugada. La siembra se realiza en los siguientes medios de cultivo. AS, Mc Conkey, ASM y EMB

g) Los medios inoculados se incuban a 37°C entre 24 y 48 horas. h) Observar las características de cultivo de las colonias desarrolladas

en los diversos medios. Si es necesario, realizar pruebas bioquímicas para confirmación de la especie bacteriana.

i) Preparar frotis para realizar una tinción de Gram para el estudio de morfología microscópica.

2) Cuenta viable a) Realizar diluciones de la orina de la siguiente manera:

Colocar 5 tubos estériles conteniendo 9 ml. de agua peptonada. La cantidad de tubos utilizada dependerá de la carga bacteriana observada en el examen microscópico del sedimento urinario

Tomar 1ml. de la orina problema con una pipeta estéril, y agregarlo al tubo No.1. (dil. 1:10), agitar el tubo y tomar de este 1ml. para pasarlo al tubo No.2, (dil 1:100) realizar el mismo paso las veces que sea necesario rotulando el tubo con la dilución correspondiente. Recuerda que el número de diluciones dependerá de la carga bacteriana.

b) Colocar 1ml de cada dilución en diferentes cajas de Petri estériles y

rotularlas con la correspondiente dilución. c) Vaciar en estas cajas de 15 a 20 ml de Agar nutritivo fundido a Baño

María previamente enfriado hasta que alcance una temperatura que soporte la piel de tu mano (debes evitar que solidifique).

d) Mezclar perfectamente por rotación suave este agar con la dilución y dejar que solidifique. Incubar las cajas a 37°C durante 24 a 48 horas

e) Contar el número de colonias desarrolladas, para esto seleccionar para su lectura, la placa que muestre entre 30 a 300 colonias.

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f) Reportar la cuenta bacteriana de la siguiente manera: Número de colonias contadas X el factor de dilución de la caja en la que se observa y cuentan las colonias bacterianas = Unidades Formadoras de Colonias por ml. (UFC/ml). CUESTIONARIO 1.- Realiza un diagrama de flujo que indique los pasos a seguir para el Urocultivo: ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 2.- ¿Cuáles son las principales bacterias que pueden presentarse infectando las vías urinarias? ¿Por qué? ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 3.- Explica detalladamente las técnicas de recolección de muestras de orinas para Urocultivo, tanto en adultos como en lactantes. ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CONCLUSIONES:_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Nombre del alumno:________________________________6to sem. gpo______ Fecha de realización:_______________________________

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Vo.Bo. del maestro

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Práctica no.13

NOMBRE DE LA PRÁCTICA: Tinción de Ziehl- Neelsen COMPETENCIA: Identifica las Bacterias Alcohol Acido resistentes (BAAR), como las del Género Mycobacterium, utilizando la tinción de Ziehl-Neelsen. MATERIAL: Aplicadores de madera Colorante de carbolfucsina o Mechero Fisher Fucsina fenicada Papel de estraza Alcohol ácido Portaobjetos nuevos Colorante de azul de metileno Muestra de expectoración Fenol INTRODUCCIÓN La propiedad tintorial que presentan numerosas bacterias de resistir la decoloración con ácidos fuertes, después de teñirlas con soluciones de fucsina caliente, permite reunirlas bajo la denominación general de bacterias acidorresistentes o alcohol acidorresistentes. Es característica del género Mycobacterium, junto con su tamaño y forma característica, constituyen una ayuda valiosa para la detección temprana de infecciones y para el control del tratamiento de enfermedades micobacterianas. La presencia de bacilos ácido-alcohol resistentes en el esputo, en combinación con antecedentes de tos, pérdida de peso y una radiografía de tórax que muestra un infiltrado pulmonar, todavía es evidencia presuntiva de tuberculosis. Se ha estimado que cuando se emplean las técnicas de concentración estándar, se necesitan aproximadamente 10,000 bacilos ácido-alcohol-resistentes por mililitro de esputo para ser detectados microscópicamente. Los pacientes con enfermedad extensa albergan gran número de micobacterias con una buena correlación entre frotis positivos y cultivos positivos puede ser sólo de 25% a 40%. Los extendidos con esta coloración también son útiles para seguir la respuesta del paciente al tratamiento. Después de comenzar con las drogas antimicobacterianas, los cultivos se tornan negativos antes que los extendidos, lo que sugiere que los microorganismos no son capaces de replicarse pero pueden unirse al colorante. Con tratamiento continuado, más microorganismos son destruidos y muy pocos permanecen de modo que evaluando el número de microorganismos en el esputo durante el tratamiento se puede tener una medida objetiva de la respuesta. Si después de iniciado el tratamiento el número de microorganismos no disminuyera, deberá considerarse la posibilidad de resistencia a la droga, caso en el cual habrá que realizar cultivos adicionales y estudios de susceptibilidad.

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PROCEDIMIENTO 1.- Colocar papel de estraza sobre la mesa para trabajar. Colocar un frasco con fenol al 5% para desechar aplicadores usados. 2.- Usar guantes y cubre bocas 3.- Prender el mechero Fisher y tomar el frasco que contiene la muestra. Abrir el frasco y pasar la boca por la llama del mechero. Es importante trabajar siempre atrás de la llama del mechero. 4.- Romper la punta de un aplicador de madera y con la punta aguzada tomar muestra del esputo. 5.- Descargar la muestra sobre un portaobjetos nuevo, realizando un frotis cuyas dimensiones sean de 20 mm de largo por 10 mm de ancho. Preferentemente en el centro del portaobjetos. 6.- Desechar el aplicador contaminado en el frasco con fenol al 5%. Recuerda la importancia de trabajar por atrás del mechero. 7.- Dejar secar el frotis al aire y fijar con la llama del mechero. Proceder a teñir con la técnica de Ziehl-Neelsen de acuerdo al siguiente protocolo:

a. Cubrir el frotis con fucsina fenicada y calentar 5 minutos a emisión de vapores con ayuda de hisopos de algodón y gasa con alcohol.

b. Agregar más colorante si este empieza a secarse. Es importante evitar la ebullición

c. En forma inclinada lavar con agua destilada el frotis y decolorar agregando alcohol ácido de 1 a 2 minutos, dependiendo del grueso del frotis.

d. Lavar nuevamente, y quitar el exceso de agua e. Colorear con azul de metileno por 1 minuto. f. Volver a lavar y dejar secar a temperatura ambiente. g. Leer con objetivo de inmersión, en el sentido de las manecillas del reloj 100

campos y contar los BAAR por campo. h. Los bacilos aparecen como bastoncillos delgados, ligeramente curvos,

teñidos de rojo, generalmente con gránulos más coloreados en su interior, aislados, en parejas o en grupos, sobre el azul claro de la tinción de contraste.

REPORTE DE RESULTADOS NEGATIVO No se encontraron bacilos ácido-alcohol

resistentes en 100 campos observados 1-9 BAAR Informar el número de bacilos observados

en 100 campos POSITIVO (+) Menos de 1 bacilo por campo en promedio,

en 100 campos observados POSITIVO (++) MÀS DE 100 De 1 a 10 bacilos por campo en promedio,

en 50 campos observados POSITIVO (+++) Más de 10 bacilos por campo en 20 campos

observados

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CUESTIONARIO 1. ¿Qué microorganismos pueden ser detectados por la técnica de tinción de Ziehl-Neelsen? ¿Qué enfermedades producen? ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 2. ¿Por qué es importante trabajar atrás del mechero durante todo el proceso? __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 3. ¿Por qué es poco práctico el aislamiento y cultivo del bacilo de la tuberculosis? __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Conclusiones. ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Nombre del alumno:___________________________________6to sem.gpo.____ Fecha de realización:__________________________________

___________________ Vo.Bo. del maestro

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Práctica no.14 NOMBRE DE LA PRÁCTICA: Diagnóstico de Paludismo COMPETENCIA: Realiza las técnicas de gota gruesa y frotis delgado de sangre para búsqueda e identificación de parásitos sanguíneos, como el Plasmodium, que causa el paludismo en el hombre. MATERIAL: Lancetas estériles Colorante de Giemsa al 10% Portaobjetos nuevos Alcohol metílico Agua tamponada a pH de 7.2 Microscopio Portaobjetos nuevos Aceite de inmersión Piseta INTRODUCCIÓN

El paludismo, también conocido como malaria, es la principal enfermedad parasitaria causante de anemia en el hombre, la más frecuente dentro de las enfermedades transmitidas por artrópodos y un constante flagelo del hombre en su historia. En México, principalmente el agente etiológico del paludismo es P. vivax y alrededor del 1% es causada por P. falciparum. El diagnóstico por el laboratorio no es una tarea fácil, ya que las parasitemias que se alcanzan son pobres, lo que dificulta su hallazgo. Sin embargo, existen metodologías como la gota gruesa que favorecen su hallazgo. La diferenciación de las dos especies más frecuentes en México se basa en la presencia de granulaciones, alteraciones al eritrocito parasitado y características morfológicas.

ANTECEDENTES HISTÓRICOS

Malaria, paludismo, fiebres palúdicas, fiebres intermitentes, fiebres veraniegas, son nombres distintos para una misma enfermedad. El nombre de Malaria fue dado en Italia en 1847 por Torti, porque se creía que era causada por el “aire malo” (en italiano, mal aria) o “miasmas” que se desprendían de las aguas estancadas y de los terrenos pantanosos; y el de Paludismo o fiebres palúdicas, porque las fiebres predominaban entre los pobladores de las zonas cercanas a pantanos, cuyo nombre en italiano es “palude” y en latín “palus”.

Livio, Galeno, Celso, Varrón, Vitrubio y Columela describieron perfectamente la enfermedad desde la más remota antigüedad, e Hipócrates se refiere en sus escritos a las fiebres palúdicas (aún no se le conocían con este nombre) clasificándolas en tres grupos: cotidianas, ternarias y cuaternarias, reconociendo la influencia de las estaciones, las lluvias y las aguas estancadas en la proximidad de los pueblos. Platón, 184 años A.C., hace referencia del bazo abultado de los

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enfermos de malaria. El parásito productor del paludismo fue descubierto con la ayuda del microscopio por el médico francés Charles Louis Alphonse Laverán en el hospital militar de Constantine (Argelia) el día 6 de noviembre de 1880. Al principio creyó que se trataba de un alga a la que llamó Oscillaria malariae, sin embargo rectificó luego denominando al parásito hematozoario.

Laverán marchó a Italia y convenció de su descubrimiento a los malariólogos Marchiafava y Celli, quienes erigieron el género Plasmodium.

En 1897, Welch descubrió el Plasmodium falciparum productor de la forma tropical y en 1922, Stephens encontró el Plasmodium ovale en el África Oriental. El ciclo evolutivo se descubrió gracias a Sir Ronald Ross (1857-1932) médico inglés quien en 1898 demostró el papel del mosquito intermediario (no lo ubicó taxonómicamente) en el ciclo del paludismo en aves (gorriones y alondras), obteniendo el premio Nóbel en 1902 por sus descubrimientos; sin embargo fue el zoólogo italiano Gian Batista Grassi quien demostró el papel del mosquito como transmisor de la malaria en los humanos, señalando que el insecto del género Anopheles es el único vector del paludismo.

Anopheles

PROCEDIMIENTO La gota gruesa permite analizar una mayor cantidad de sangre, facilitando la detección de parasitemias bajas y un ahorro de tiempo en el examen, aunque al romperse los eritrocitos resulta difícil la identificación de la especie. 1.- Realización del frotis y de la gota gruesa. La toma de muestra se realiza mediante la punción con una lanceta estéril, normalmente en la yema del dedo. Se recoge una gota de sangre en un portaobjetos y con otro se realiza la extensión en capa fina.

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2.- Para la gota gruesa se recogen 3 o 4 gotas sobre un portaobjetos y con la esquina de otro de unen en movimientos rápidos, extendiéndose en una capa gruesa y uniforme; hasta formar una gota gruesa de 1 cm de lado o de diámetro. La sangre no debe ser excesivamente revuelta, es suficiente con 3 a 6 movimientos. De preferencia, realizar el homogeneizado de la muestra en una sola dirección, en forma concéntrica (de adentro hacia fuera o viceversa).

3.- Secar la lámina con la gota gruesa en una superficie plana y protegida de polvo, calor e insectos. COLORACIÓN DE LAS MUESTRAS “Antes de proceder a la coloración de la gota gruesa, fije el frotis sumergiéndolo en metanol, por tres segundos y déjelo secar, la gota gruesa no la fijes con metanol”. Secas ambas preparaciones procedes a teñirlas PROCEDIMIENTO a. Coloque las varillas de vidrio sobre un lavatorio o recipiente de tal forma que facilite la eliminación de los líquidos que se usarán en la coloración y coloque las láminas que debe colorear sobre las varillas, espaciándola de tal forma que pueda manipularlas con seguridad. b. Vierta colorante de Giemsa al 10% sobre ambas preparaciones (gota gruesa y frotis delgado), cubriéndolas por completo. Haga esto suavemente, a una distancia corta de la lámina y deje actuar el colorante por 30 minutos. La experiencia le puede indicar la necesidad de modificar este tiempo de espera. c. Descarte el exceso de colorante diluido y lave la lámina con agua corriente, usando una piseta, hasta que el agua no desprenda colorante. Se recomienda utilizar agua tamponada a pH de 7.2 (tanto en la dilución del colorante como en los lavados) para facilitar la observación de los gránulos de Schuffner, tan importantes para la diferenciación de especies

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d. Acomode las láminas en una gradilla, de modo que queden inclinadas y con la gota gruesa hacia abajo. Deje secar las láminas en esta posición. EXAMEN DE RUTINA DE LA GOTA GRUESA Y DEL FROTIS

El examen de la gota gruesa es recomendable para detectar la presencia de los parásitos de malaria, mientras que el frotis sirve como herramienta auxiliar para determinar la especie de Plasmodium en caso de que no sea posible hacerlo en la gota gruesa. Examen de la gota gruesa

El examen de rutina de la gota gruesa requiere observar 100 campos microscópicos óptimos a un aumento final de 1000x, con lente de inmersión. Una lámina puede declararse como negativa, sólo después de observar 100 campos microscópicos sin haber encontrado parásitos. Si se encuentran parásitos, deben examinarse también los 100 campos microscópicos; esto asegura detectar la posibilidad de infección mixta (más de una especie presente en una muestra de sangre). En lo posible, debe identificarse la(s) especie(s) a la(s) que pertenecen los parásitos.

Examen del frotis de sangre Este examen requiere mayor tiempo de observación en comparación con la gota gruesa, debido a que la concentración de los elementos sanguíneos es mucho menor. Examinar el mayor número de campos microscópicos (300) para determinar si la muestra de sangre es positiva o negativa para malaria. Si el diagnóstico es dudoso deberá examinar de 400 a 500 campos microscópicos

RECORRIDO DE LA GOTA GRUESA DURANTE SU OBSERVACIÓN AL MICROSCOPIO

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4.- Realiza dibujos de lo observado

FROTIS DE SANGRE PARASITADO CON PLASMODIUM

RECORRIDO DEL FROTIS DURANTE SU OBSERVACIÓN AL MICROSCOPIO

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CUESTIONARIO 1.- ¿Además de el diagnostico del Plasmodium, qué otros parásitos pueden ser diagnosticados con estas técnicas? Indica además del parásito, la enfermedad que producen. __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 2.- ¿Qué ventajas y desventajas tienen las técnicas de gota gruesa y frotis delgado para el diagnostico de parásitos hemáticos? Explica. ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 3.- ¿Por qué se sugiere utilizar agua tamponada con pH 7.2 en vez de agua de la llave al preparar la dilución del colorante de Giemsa y lavar las preparaciones al teñirlas? ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 4.- ¿Qué otras tinciones pueden ser utilizadas con el mismo fin? ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Conclusiones. __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

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Práctica no.15 NOMBRE DE LA PRÁCTICA: Examen Coproparasitoscópico, técnica directa COMPETENCIA: Realiza un examen Coproparasitoscópico (cps), a una muestra de heces con el fin de buscar e identificar formas parasitarias. MATERIAL: Aplicadores de madera Papel de estraza Portaobjetos cubreobjetos Solución de lugol tubos de ensaye de 13x100 Microscopio sol. Salina fisiológica INTRODUCCIÓN Un examen Coproparasitoscópico es el estudio de la materia fecal para la búsqueda e identificación de formas parasitarias. Los métodos Coproparasitoscópico, se pueden dividir en: cualitativos y cuantitativos; los primeros se usan para saber que formas parasitarias existen y los segundos en qué numero se encuentran; estos últimos se utilizan sobre todo en las helmintiasis Los métodos cualitativos pueden ser de dos tipos: los métodos de concentración y el examen directo. El examen directo es el más antiguo que se conoce por los datos históricos que se tienen en relación a los primeros microscopios, probablemente Antonio Van Leewenhoek en el siglo XVIII, fue de los primeros en utilizarlo, al encontrar y observar en sus propias heces fecales trofozoítos de Giardia lamblia. El método tiene entre sus características, la sencillez y rapidez para llevarlo a cabo, además de lo económico que resulta realizarlo, pues es el que requiere menos material Ha sido el método indicado como excelente para la búsqueda de trofozoítos. En la práctica ha demostrado su eficacia cuando se utiliza lugol, para la búsqueda e identificación de quistes, huevecillos y larvas. Pero tiene una limitante: la muestra utilizada es tan pequeña, que es poco representativa. PROCEDIMIENTO

1. En un portaobjetos se colocan, separadamente (en cada extremo), una gota de solución salina fisiológica y otra de lugol.

2. Con uno o dos aplicadores de madera, se toma una muestra de 1 a 4 mg de

heces y se mezcla con la solución salina, haciendo una suspensión homogénea.

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3. Con el mismo aplicador se retiran las fibras y otros fragmentos gruesos. 4. Se coloca el cubreobjetos. 5. Se efectúa la misma operación en la gota de lugol. 6. Se observa al microscopio, primero con objetivo seco débil y después con el

seco fuerte. 7. La preparación con solución salina, sirve para identificar y reportar el

hallazgo de trofozoítos. La preparación con lugol sirve para reportar el hallazgo de quistes, huevos y larvas.

8. Realiza el dibujo de lo observado. 9. RECUERDA: la materia fecal es potencialmente infectante, por lo que se

tendrán los cuidados necesarios para su manejo que garanticen la correspondiente bioseguridad.

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CUESTIONARIO

1. Explica que son los protozoarios, estadios que presentan y cuáles son las especies patógenas más comunes para el hombre

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5. ¿A qué se refiere cuando decimos que el inconveniente de esta técnica es que es poco representativa? Explica e indica cómo podemos disminuirla

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

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Conclusiones. ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Nombre del alumno:___________________________________6to sem.gpo.____ Fecha de realización:__________________________________

___________________ Vo.Bo. del maestro

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Práctica no.16 NOMBRE DE LA PRÁCTICA: Examen Coproparasitoscópico, técnica de concentración de Faust COMPETENCIA: Realiza un examen Coproparasitoscópico (cps), de concentración utilizando la técnica de Faust; con el fin de buscar e identificar formas parasitarias, en una muestra de heces. MATERIAL: Aplicadores de madera Papel de estraza Portaobjetos cubreobjetos Solución de lugol tubos de ensaye de 13x100 Microscopio agua de la llave Asa bacteriológica vaso de precipitados de 100 ml Gasas gradilla Centrifuga mechero bunsen o Fisher Embudo densímetro de 1.100 a 1.200 Sulfato de zinc con densidad 1.18 (aprox. 33%) INTRODUCCIÓN Desde 1938 cuando fue descrito este método, fue bien recibido, es uno de los más utilizados en todo el mundo. Es parecido al que describió Lane en 1924, aunque él utilizó solución saturada de cloruro de sodio, como este método es poco eficaz para quistes; se utiliza más el de Faust que es muy eficaz para estas formas parasitarias. La técnica de Faust, hace una buena concentración de quistes, huevos y larvas; es la técnica preferida por la generalidad de los laboratorios. Las formas parasitarias son encontradas con facilidad pues las preparaciones quedan con pocos artefactos.

Su limitación es que es poco eficaz para huevos pesados como los de Taenia spp; Faciola hepática y de Ascaris lumbricoides. Este método se utiliza solución de Zinc, cuya densidad específica es de 1.180g/ml (33%), que conforma un medio de densidad más alta que la de los huevos: Necator 1.055 g/ml, Tricocéfalo 1.150 g/ml, Ascaris fértil 1.110 g/ml y facilita que los huevos livianos de estos helmintos, con menor peso específico que la solución, se concentren y floten.

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La concentración adecuada aconsejada es la que usa como reactivo una solución acuosa de sulfato Zinc al 33% con una densidad al 1.180 g/ml. El agua utilizada diluye y lava la materia fecal. El filtrado con gasa doblada y evita que los detritos gruesos traspasen las paredes, la centrifugación enriquece en delgada película la superficie del líquido centrifugado con los huevos livianos de algunos helmintos.

PROCEDIMIENTO 1) Mezclar bien una porción de materia fecal para preparar una suspensión homogénea con 1 a 2 g de materia fecal en 10 ml de agua destilada. 2) Filtrar la suspensión a través de una gasa doblada en cuatro, sobre un tubo de centrífuga, ayudándose con un embudo pequeño. 3) Centrifugar el filtrado a 2500 rpm por 1 min. 4) Decantar el líquido sobrenadante y completar con agua hasta igualar la medida anterior, centrifugar nuevamente. Resuspender el sedimento. 5) Repetir el procedimiento 2 veces hasta que el líquido sobrenadante esté listo.

6) Decantar nuevamente el líquido sobrenadante reemplazándolo por igual cantidad de solución de sulfato de Zinc al 33%. Mezclar bien la solución con el sedimento. Centrifugar durante 1 minuto a 1500 rpm. 7) Tomar 3 a 4 gotas de las partículas que flotan en la superficie del líquido. Colocarlas en portaobjeto y mezclarla con 1-2 gotas de lugol, colocar cubre-objeto. (Te puedes ayudar con el asa limpia o flameada, para recoge la muestra de la película superficial, durante 2 o 3 ocasiones sucesivas y se deposita en el portaobjetos) 8) Examinar al microscopio y reporte sus resultados.

9) Realiza el dibujo de lo observado. 10) Para ayudarte a identificar a los parásitos que puedas encontrar; recurre a

los dibujos de los diversos parásitos mostrados en las gráficas de la practica anterior.

NOTA: Recuerda, la materia fecal es potencialmente infectante, por lo que se tendrán los cuidados necesarios para su manejo, que garanticen la correspondiente bioseguridad.

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CUESTIONARIO 1.- ¿Por qué es importante cuidar la preparación del sulfato de zinc y checar su densidad cada vez que se utilice? ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 2.- ¿Esta técnica de flotación me permite ver a todos los huevos de helmintos? Y a los trofozoítos de amibas? ¿Por qué? ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 3.- ¿En todo examen de heces es importante realizar una evaluación física de la muestra. ¿Qué fin tiene este? ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Conclusiones: __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Nombre del alumno: ___________________________________6to sem.gpo.____ Fecha de realización: __________________________________

___________________ Vo.Bo. del maestro

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Manual de Prácticas de laboratorio de Análisis Clínicos III, fue aprobado por la Academia Estatal de Análisis Clínicos III, con la participación de los profesores titulares de la materia: QFB. Isabel Ruiz Sánchez, QFB. Emilia Elizabeth Bolio Salazar, QFB. Myrna Fátima Ramírez García y QFB. Alberto Rodríguez Moya. Supervisado por la Licda. Silvia Luz López Alcaraz y Licda. Laura Araceli Jiménez Cobián. Vigente a partir de febrero de 2009.