Cromatografía Líquida

Adsorción Partición Int. Iónico Exclusión

de tamaño

Mecanismos de retención

Sílica Alúmina

Permite gran carga de muestra

Menor poder catalítico de reacciones

Buena disponibilidad

Buena cantidad de referencias

Buena con isómeros de aromáticos

Levemente alcalina

Menos empleo que sílica

Líquido-

Sólido

Líquido-

Líquido

Grupos iónicos

fijos en F. Estac.

Retención de

acuerdo tamaño

Muy utilizada para: Clean-up y separación previa a CG,FTIR, etc.

Fases sólidas más utilizadas: Sílica-Gel, Alúmina, Sílica-Alúmina, Florisil.

Acidos Carboxílicos

Amidas

Sulfóxidos

Sulfonas

Alcoholes, Aminas

Aldehidos, cetonas y

esteres

Nitrocompuestos

Eteres

Sulfuros

HCs Aromáticos,

Halocompuestos

HCs Saturados k

-0,2

0

0,2

4

0,2

8

0,2

0,2

6

0,3

2 0,4

4

0,5

0,7

-0,2

5

0

0,2

6

0,3

2

0,4

0,4

2 0

,57

0,6

5

0,9

5

0,2

9

-0,3

-0,2

-0,1

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

F-a

lc

nC

5

Xil

Tol

Ben

c

HC

Cl3

H2C

Cl2

TH

F

Ace

t.N

itri

lo

Met

anol

Sílica

Alúmina

Permite separar compuestos de polaridad moderada e intermedia

Se emplean mezclas de dos o mas solventes con frecuencia para controlar FS

El contenido de H2O debe controlarse y la fase en equilibrio (activac. y conserv.)

Separaciones isocráticas (la fase demora en reequilibrarse después de cambio FM)

Fuerza del solvente (FS)

50 c

m

1 cm 1/3

Alú

min

a B

ási

ca

Bro

ckm

an

Gra

do 1

700 o

C, 2h

2/3

Síl

ica 7

0-2

30

400 o

C, 4h

MeOH 20 mL

F4

Polares

Cloroformo 20 mL

F3

Arom. 3 y + anillos

parte pol.

Eter 20 mL

F2

Arom. 1,2 anillos

parte 3 a.

nC6 20 ml

F1

HCs Sat

14 mL UV,CGEM

DCM

4 mL

Arom. Sup.

nC5:DCM(7:3)

4 mL

Arom.

Pentano

4mL

Pentano 4 mL

saturados

LV

LV

Al2

O3, 5 c

m (

1.1

5 g

)

Pipeta de Pasteur

Separación Clean-Up

Síl

ica 1

20

-230, 0.5

g

nC5

12 mL

Suministro

del solvente

Acondicionador

Bomba

Manipulación

de la muestra

Inyector Aut.

Inyector manual

Separación de

la muestra

Horno

Columna

Control del

Cromatógrafo

Detección

UV l fija

UV l variable

Arreglo de diodo

Electroquímico

Ind. Refracción

Colector

de fracciones

HPLC

Instrumentación

La columna

Cuidado de la columna: Filtre la muestra y los solventes; Use una columna

guardian; Consérvelas cubiertas; Guarde en condiciones adecuadas

Frita Cartucho

Los sistemas metálicos tienen problemas por la corrosión del metal (colas en los

picos, problemas con recobrado, por adsorción en lugares activos del metal).

Hoy: vidrios especiales y fluoropolímeros. Cartuchos listos para cambiar.

Las dimensiones de la columna y el hard afectan : La vida útil, capacidad,

eficiencia y velocidad del análisis.

El relleno determina la eficiencia por el tamaño de partícula. La resolución y

selectividad de la columna tienen que ver con la química de su superficie.

La fase móvil influye también en l;a selectividad y eficiencia.

Consiste en el relleno y el hardware (uniones, fritas, etc.)

La columna guardian: Protege a la columna analítica de material particulado que

puede estar en la fase móvil; Retiene solutos que pueden enlazarse de manera

irreversible con la fase; Previene el envejecimiento, suministrando a la fase móvil

con iones silicato a través de su hidrólisis constante. Bien seleccionada no afecta w.

HPLCParámetro C.Columna

Analítica A.Vel. Microcol. Prep.

dP, m 100 5 3 5 3

L, cm 100 25 5 15 25d.i., mm 20 4.6 4.6 1.0 21.2

N 1000 15000 6000 6000 15000

Vpico,mL,k=1 40 0.1 0.04 0.006 3Vpico,mL,k=10 220 0.7 0.23 0.034 16

SP,ent.col.,atm 0.01-0.1 50-200 100-200 50-150 50-200T anal., k=5 1000 10 1.2 6 15

Características de algunos tipos de columnas

Cromatografía normal:Se utiliza la sílica base. Se pasa la sustancia, disuelta

en un solvente organic, y se ve sometida a la acción de los grupos silanol. Más

polar, más retención.

Fase reversa: Unidades no polares orgánicas enlazadas. Se crea superficie

hidrofóbica. La fase móvil es polar (mezcla agua-solvente orgánico generalm.

Es la más difundida pues: muchas de las sust. De interés son solubles en agua;

De acuerdo al grado de modificación, se puede hacer un análisis a la medida;

Se pueden lograr efectos modificando pH, adicionando solventes orgánicos, etc.

La fase estacionaria.

La sílica: Ideal para HPLC, pues resiste bien a diferentes fases móviles y sus

cambios; Se puede derivatizar con facilidad; es rígida lo que permite altos

flujos y presiones. Se emplean generalmente las esféricas. Cuidado con pH;<8

> 2-3.5 de acuerdo a la fase enlazada.

Tamaño de partícula: Mientras menor más eficiencia debido a más S y mejor

Def. Normalmente 5 m, hay 3 mm. Atención menor dP mayor DP.

Tamaño de poro:De él depende As. A menor, mayor As. Tener en cuenta que

poro muy pequeño impide acceso de analitos. Normalmente 100 A, para biom.

300 A.

Fases enlazadas

Si-

OH

+C

l-S

i(R

)3

Si-

O-S

i(R

)3

R

CH3(C1)- En FR para comp. de alta MM

C8 - Intermedio entre C1 y C18. Sep. Orientat.

C18(ODS)- Amplio uso, muy selectiva a homol. Si

mucha ret. Bajar a C8. No polares FR.

Fenil- Menos selectiva a homól. Buena para Ar

(CH2)3NH2-En FR, para ácidos. No C=O ald. Cet.

(CH2)3CN -Polares y no polares en FN

Sílica - Moderadamente polares en Adsorción.

El solvente Requisitos:

•Disolver la muestra

•Compatible con el detector

•No reaccionar

•Pureza (grado HPLC)

•Baja viscosidad

•Seguro

•Miscible

•Dar la K y a de interés

Débil nC6

isoC8

Tolueno

Cloroformo

DCM

THF

Eter

Ac.Etilo

Acetona

Acetonitrilo

Isopropanol

Metanol

Agua

Metanol

Isopropanol

Acetonitrilo

Acetona

Ac.Etilo

Eter

THF

DCM

Cloroformo

Tolueno

isoC8

nC6 FN

FR

Elución con gradiente:

Una resolución general óptima

Tiempos de análisis más cortos

Anchos de los picos iguales

S = F1S1+F2S2

Requisitos del sistema del solvente:

V0 pequeño

Fácil de usar y arreglar

Flujos adecuados:

en rangos amplios

A alta P

Repetible y suavemente

Con muchos solventes diferentes

Detectores

Mide propiedad de la solución: (D en prop. físicas del soluto y el solv.):

Indice de refracción ; Conductividad

Mide propiedades del soluto:

Opticos: UV-VIS, IR, Fluorescencia; Electroquímicos; Radiométricos

Absorb. I.Ref. Fluoresc. Electroq. Conduct.

Gradiente Si No Si No No

Selectividad Alta Baja Muy alta Muy Alta Baja

Sensibilidad 10-10

10-7

10-11

10-12

10-8g/mL

Derivatización

Se utiliza cuando no se tiene un detector suficientemente sensible y selectivo.

La reacción postcolumna tiene la ventaja de ganar en sensibilidad sin afectar

las propiedades cromatográficas de los compuestos separados.

Aplicaciones

Clorofenoles - octil, 254 nm

metanol, agua, acético, grad.

Nitro y clorofenoles - metil, 254 nm

Metanol, agua, ac. Acético, grad.

Ftalatos - Sílica, 254 nm, CC6+DCM

isocrático.

Aminas aromáticas - Ciano, 254 nm

Isopropanol-C6, isocrático.

Herbicidas fenoxi- Metil, 254 nm

CH3CN,agua,ac. Acético, isocrático

Carbamatos - Amino, UV 254,

Isopropanol C6, isocrático

Derivados del petróleo:

Separación por tipos de HCs