TRIÁNGULO DEL DIAGNÓSTICO

PACIENTE

MÉDICO

MÉDICO PATÓLOGO

CLÍNICO

MÉTODOS DIAGNOSTICOS ESPECIALES EN PATOLOGÍA

Avances médicos en el área de patologíaInmunofluorescencia directaInmunohistoquìmicaCitometría de flujoPatología molecular

INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA

Anticuerpo primario marcado con fluoresceína (C3, C4, C1q, IgM, IgG, IgA)Antígeno celularMicroscopio de fluorescencia.

INMUNOHISTOQUÍMICA

“La inmunohistoquìmica es un método que utiliza anticuerpos seleccionados para identificar antígenos específicos”

En el laboratorio se unen el anticuerpo con el antígeno en combinación con un marcador visual.

En las técnicas de inmunoperoxidasa se utilizan como marcadores enzimas capaces de hacer cambiar de color un sustrato incoloro. Por ejemplo, las enzimas más frecuentemente utilizadas son peroxidasa y fosfatasa alcalina y los sustratos diaminobenzidina (color pardo), aminoetilcarbazol (color rojo) y nitroazul de tetrazolio

(color azul). Estos marcadores pueden unirse (conjugarse) directamente al anticuerpo primario o bien indirectamente mediante otros anticuerpos (secundarios) o sustancias como biotina o proteína A.

FUNDAMENTOS DE LA INMUNOHISTOQUÍMICA

UTILIDAD

PASOS BÁSICOS

DesparafinarHidratarBloquear la actividad de peroxidasa endógenaProteína bloqueadoraReacción con anticuerpo primarioPoner a reaccionar con anticuerpo secundario biotilinadoColocar complejo estreptavidinaperoxidasaColocación del cromógenoTinción de contrasteDeshidratar, aclarar y montar

La disponibilidad de anticuerpos monoclonales ha facilitado enormemente la identificación de productos celulares y de marcadores superficie.

INMUNOHISTO-QUIMICA

APLICACIONES

TIPIFICACIÓN DE AGENTES

INFECCIOSOS

DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL EN

PATOLOGÍA ONCOLÓGICA

FACTORES PRONOSTICOS Y

PREDICTIVOS

TIPIFICACIÓN DE

AGENTE

S INFECCIOSOS

TOXOPLASMOSIS

HELICOBACTER PYLORI

PNEUMOCYSTIS CARINII

CITOMEGALOVIRUS

HERPESVIRUS DE

EPSTEIN-BARRHEPATITIS B

DIAGNOSTIC

O DIFERENCIAL EN

PATOLOGÍA ONCOLÓGICA

CITOMETRIA DE FLUJO

Se utiliza para medir:

Tamaño de la célulaComplejidad de la membranaCantidad de DNA de la célulaPloidia y aneuploidiaProliferación celularClasificación de Leucemias y Linfomas

PATOLOGÍA MOLECULAR

Se utiliza:

Dx de neoplasias malignas.Neoplasias hematotopoyéticas asociadas a translocaciones específicas.Pronostico de neoplasias malignasDetección de enfermedad mínima residual.

FACTORES

PRONÓSTICOS Y PREDICTIVOS

CARCINOMA DE MAMA

CARCINOMA DE COLON

CARCINOMA DE VEJIGA

URINARIACARCINOMA DE

PROSTATAGIST

Dx de la predisposición hereditaria de cáncerAnálisis de micromatrices de DNA y proteómica.

TÉCNICAS DE ANÁLISIS DE DNA DIAGNOSTICAS1. Southern Blott (SBH)2. Northern Blott3. Hibridización in situ (FISH)4. PCR (reacción en cadena de polimerasa) o Amplificación5. Secuencia

SOUTHERN BLOTTPara la detección de genes específicos en el ADN celular. El ADN problema es digerido por una endonucleasa de restricciónLos fragmentos obtenidos se separan por electroforesisSe transfieren los fragmentos de ADN a un gel Se incuba posteriormente con una sonda marcada que hibrida los fragmentos de ADN

que contiene la secuencia complementaria.Los fragmentos se visualizan tras la exposición del filtro a una película radiográfica.

NORTHERN BLOTTVariante de la técnica de tranferencia de Southern.Detección de ARN en vez de ADN.La totalidad del ARN celular es extraída y fraccionada por electroforesis de gel.Los ARN se transfieren a un filtro y se detectan por hibridación con una sonda

radioactiva. (Similar al Southern)

HIBRIDACIÓN IN SITU (FISH)

El método de hibridación In Situ por fluorescencia se basa en la detección y localización de secuencia específicas de ADN o ARN dentro de las células de los tejidos. Consiste en colocar la sonda directamente sobre el espécimen que tiene la secuencia del ADN inmovilizada. El tejido es tratado con una enzima que permite el acceso de la sonda al ADN nuclear, el que ha sido previamente desnaturalizado por calor.La sonda se agrega para la hibridación y esta ocurre si está presente el ADN blanco complementario de la sonda. La sonda viene ligada a una sustancia fluorescente, que es observada mediante microscopio de fluorescencia.

HIBRIDIZACIÓN DEL ADN

la hibridización permite la localiación de ciertas secuencias de ADN in situ (FISH)

PCR (REACCIÓN EN CADENA DE POLIMERASA)

Es un método para conseguir un gran número de fragmentos de material genético a partir de una copia de ADN.

Una molécula de ADN sometida a 30 ciclos de amplificación da mil millones de copias. Esta técnica consiste en crear copias adicionales de la secuencia deseada o segmento

especifico de ADN. Se realiza a través de ciclos repetidos de desnaturalización, hibridación y extensión.

PASO 1

Desnaturalización con calor para abrir las hebras de ADN y permitir hibridización con oligonulétidos (“primer) (secuencia corta de pares de bases) iniciadores específicos.

PASO 2

La temperatura controla la tasa de fijación

A 55ºC, bajo la condiciones forman uniones de hidrógeno con el molde de ADN

PASO 3

Gracias a la estabilidad de la polimerasa aislada de bacterias que viven a altas temperaturas, la extensión se hace a una temperatura mayor a la de la fijación, asegurando especificidad.

RESULTADO

La secuencia entre los oligonucléotidos es copiada exponencialmente.

INMUNOHISTOQUIMICA EN NEOPLASIAS MALIGNAS INDIFERENCIADAS

Antígeno común leucocitario (linfomas)Melan A-HMB45 (melanoma)Citoqueratinas (pancitoqueratinas) y antígeno de membrana epitelial (carcinomas)CD99 (MYC2) (tumor neuroectodermico primitivo)Cromogranina-sinaptofisina (tumores neuroendocrinos)Vimentina (sarcomas)Proteína acido glial fibrilar (gliomas)

INMUNOHISTOQUIMICA EN NEOPLASIAS MALIGNAS INDIFERENCIADAS

Antígeno común leucocitario CD45 (linfomas)

CD20 (células B)CD3 (células T)CD4CD8CD30 (HODGKIN)CD15 (HODGKIN)Otros CD

INMUNOHISTOQUIMICA E NEOPLASIAS MALIGNAS INDIFERENCIADASMelanoma

-HMB45-MELAN A-S 100-VIMENTINACitoqueratinas (pancitoqueratinas) y antígeno de membrana epitelial (carcinomas)-CITOQUERATINA 20-CITOQUERATINA 7

*negativo para los dos anticuerpos (carcinoma renal)*positivo para citoqueratina 20 (cáncer de colon)*positivo para citoqueratina 7 (cáncer de pulmón)* positivo para ambas (cáncer de estomago)

CD99 (MYC2) (TUMOR NEUROECTODERMICO PRIMITIVO)Cromogranina – sinaptofisina (tumores neuroendócrinos).-CARCINOIDES-PARAGANGLIOMAS-CARCINOMAS NEUROENDOCRINOSTumores del estroma gastrointestinal (GIST) CD117 (c-Kit)Vimentina (sarcomas)-TUMORES DE MUSCULO LISO

*DESMINA*ACTINA DE MUSCULO LISO

-TUMORES DE MUSCULO ESTRIADO*DESMINA *MIOGENINA*MYO D1