Cromatografía

Objetivos: Separar componentes químicos de una sustancia para determinar las cantidades de dichos componentes.

Introducción:

La cromatografía es una técnica efectiva muy versátil que se aplica para la separación, detección y cuantificación de una amplia variedad de sustancias coloreadas e incoloras como: gases, iones inorgánicos, aminoácidos, azúcares, lípidos, drogas, esteroides, proteínas, polisacáridos, ácidos nucleicos, etc. La cromatografía es un término general aplicado a una amplia variedad de técnicas de separación basadas en el fraccionamiento de una muestra entre una fase móvil, que puede ser un gas o un líquido y una fase estacionaria que puede ser un líquido o un sólido.

FASE MÓVIL + FASE ESTACIONARIA + MUESTRA = SISTEMA CROMATOGRÁFICO

El método consiste en depositar la muestra a analizar o separar, en un lugar de la fase estacionaria (siembra o punteo). El flujo de la fase móvil sobre el sorbente se denomina desarrollo. Luego que las sustancias han sido separadas sobre la fase estacionaria pueden ser detectadas o visualizadas como zonas que constituyen el cromatograma.

TIPOS DE CROMATOGRAFÍA

Según el fenómeno físico y el estado físico de las fases que intervienen existen:

Cromatografía de Absorción

Cuando la fase estacionaria es un sólido la separación o desplazamiento de las sustancias depende del equilibrio adsorción – desorción. Para que dos o más sustancias de una mezcla se separen por cromatografía intervienen varios factores: estructura química, solubilidad en el solvente, etc.

Cromatografía de Partición

El adsorbente o fase estacionaria es líquido que es muy poco miscible con la fase móvil.

Cromatografía de Intercambio Iónico

Se lleva a cabo con capas delgadas de columnas rellenas con resinas. Esta técnica depende del intercambio de iones entre la fase móvil y los iones de la fase estacionaria. La fase estacionaria es un sólido insoluble el cual puede intercambiar reversiblemente cationes y aniones con una solución. Una mezcla de iones es sorbida en la fase estacionaria y desarrollada con una fase móvil iónica, los iones son atraídos mediante fuerzas electrostáticas. Hay dos tipos de resinas de intercambio iónico: catiónicas y aniónicas.

TÉCNICAS DE CROMATOGRAFÍA

Cromatografía en Columna

En este tipo de cromatografía se aplica una capa uniforme de adsorbente inerte, ejemplo sílica o alúmina sobre una placa o soporte de vidrio, aluminio o plástico y se seca en condiciones estándar (activación de la placa). La muestra en solución se aplica en un solvente volátil como una pequeña mancha cerca de un borde de la placa, luego el solvente es el eliminado dirigiendo una corriente de aire caliente sobre la mancha. Luego seca se coloca la placa dentro de una cuba adecuada (cuba de desarrollo) con el borde inferior sumergido en la fase móvil seleccionada.

El nivel del solvente dentro de la cuba de desarrollo debe estar por debajo de la zona donde se aplicó la muestra. La fase móvil ascenderá por capilaridad resolviendo la mezcla. Al final se retira la placa, se marca el frente del solvente, se lleva la placa para evaporar el solvente y luego se localiza e identifican las manchas.

Cromatografía en Papel

En cuanto a su operación es muy similar. La fase estacionaria es una capa de agua sobre las fibras de papel. El procedimiento general consiste en colocar una gota de solución de la mezcla a separar cerca del borde inferior de una hoja o una tira de papel filtro (Watman N°1). Cuando la mancha está seca el papel se coloca en un recipiente adecuado (cuba de desarrollo). Se tapa. El papel debe estar sumergido en el solvente o fase móvil pero sin tocar la zona donde se aplicó la muestra. El desarrollo puede ser ascendente o descendente. Por capilaridad, la fase móvil se desplazará a lo largo del appel y desplazará a los componentes de la mezcla. Los componentes de la mezcla que son separados pueden ser detectados por varios métodos físicos o químicos, dependiendo de la naturaleza de la sustancia.

Rf = relación entre la distancia de la muestra sobre la distancia de migración del solvente

Rf= Frente de la muestra / Frente del solvente

Materiales y Métodos

Silicagel placas Bencina Acetona

Etanol Metanol Hojas de espinaca

NaOH 5% Anaranjado de Metilo Rojo de Metilo

Rojo Fenol Cristal Violeta Alúmina

Probetas o tubos de 20mm diámetro Tiras de papel Watman N°1

PARTE EXPERIMENTAL

A. Cromatografía en Capa Fina

1. A partir de un cromatofolio (Placa de Sílica-gel) de aluminio o plástico, cortamos una tira de 1.5x9.0cm. Trazamos con un lápiz de mina, una línea a 1cm de distancia de los extremos de la tira.

2. Trituramos en un mortero 5-8g de hojas de espinaca con etanol suficiente para obtener 0.5ml. de extracto de líquido. Filtramos el extracto.

Fase Estacionaria

Cortamos un pedazo del papel Watman N°1; trazamos con lápiz una línea en la parte superior e inferior.

En un mortero trituramos hojas de espinaca con etanol, luego filtramos el extracto.

3. Preparamos el solvente de desarrollo (Fase Móvil) benceno-acetona 4.5:0.5.

4. Colocamos en un cuba ó cámara de desarrollo 2 a 5ml. del solvente preparado en el paso anterior y tapamos.

5. Aspiramos con un capilar 0.5cm. del filtrado del extracto y depositamos una gota del mismo por encima de la línea del lápiz en un extremo de la tira de sílica gel (sembrar) y secamos la mancha con una fuente de calor.

En un cromatofolio colocamos aproximadamente 10ml. de bencina.

Fase Móvil

El capilar lo exponemos al mechero para poder obtener un extremo filudo lo cual facilita la absorción.

Aspiramos el extracto de espinaca con el capilar.

BENCINA

6. Repetimos el paso anterior depositando una segunda gota de extracto sobre la primera, secamos nuevamente y repetimos con una tercera gota de extracto si es necesario.

7. Colocamos la tira en la cámara de desarrollo en forma vertical. Cuidamos que el solvente no toque la mancha de siembra.

8. Observamos el desarrollo del cromatograma, cuando el frente del solvente que asciende llegue a la línea del lápiz en el extremo superior, retiramos la tira y secamos inmediatamente.

9. Marcamos con lápiz la ubicación de las manchas observadas bajo luz visible y a la luz ultravioleta. Calculamos los Rf.

Colocamos la tira de papel Watman N°1 dentro del cromatofolio en forma vertical.

Luego retiramos el papel cuando el disolvente llegue hasta la línea del lápiz en la parte superior, la cual ascendió por capilaridad.

Marcamos con lápiz la ubicación de las manchas observadas bajo luz visible.

Calculamos los Rf.

Frente del Solvente

Punto de Siembra

CÁLCULOS DEL Rf

Rf1

Rf1 = 1.4/8.7 Rf1 = 0.16

8.7cm

1.5cm1.4cm

4.1cm

Rf2

Rf2 = 1.5/8.7 Rf2 = 0.17

Rf3

Rf3 = 4.1/8.7 Rf3 = 0.47

El valor de Rf1 y Rf2 corresponden a la Clorofila A; y el valor de Rf3 corresponde a la Xantofila.

CUESTIONARIO

1. Características

Silica Gel:

El gel de sílice, también conocido como Silicagel, es un producto absorbente, catalogado como el de mayor capacidad de absorción de los que se conocen actualmente.

Es una sustancia química de aspecto cristalino, porosa, inerte, no tóxica e inodora, de fórmula química molecular SiO2 nH2 O, insoluble en agua ni en cualquier otro solvente, químicamente estable, sólo reacciona con el ácido fluorhídrico y el álcali.

Bajo diferentes métodos de fabricación, se consiguen diferentes tipos de gel de sílice con diversas estructuras del poro, pudiendo llegar algunos a absorber hasta un 40% de su propio peso en agua.

Gracias a su composición química única y a su estructura física, el gel de sílice posee unas características incomparables con otros materiales similares, por ejemplo la alta absorción, funcionamiento termal estable, característica física estable, fuerza mecánica relativamente alta, etc...

Según el diámetro del poro se categoriza el gel de sílice como de poro fino o macro poroso, cada uno de ellos con una capacidad diferente de absorción en función de la humedad relativa, por lo que la elección del tipo debe ajustarse según las condiciones de utilización.

El gel de sílice también puede diferenciar la adsorción de diferentes moléculas actuando como un absorbente selectivo.

Es un producto que se puede regenerar, una vez saturado si se somete a una temperatura de entre 120-180 Cº(el gel de sílice azul no debe pasar de 120 Cº) desprenderá la humedad que haya absorbido por lo que puede reutilizarse una y otra vez sin que ello afecte a la capacidad de absorción, ésta solo se verá afectada por los contaminantes que posea el fluido absorbido.

Rf:

Frente de Solvente:

La máxima altura (h) alcanzada por el disolvente en su avance, se denomina frente del disolvente, y sea dA la distancia recorrida por la sustancia A.Se define Rf como el cociente entre la distancia recorrida por una sustancia desde el origen (d) y la distancia del origen al frente del disolvente (h). Para la sustancia A: RfA = dA/h

El valor máximo que puede tener el Rf es 1, aunque a veces se multiplica por 100 para expresarlo como porcentaje.

El Rf es una cifra útil porque es constante cuando se reproduce el experimento en todas las condiciones y es tan característico y descriptivo de un compuesto como puede serlo el punto de fusión. Por supuesto, el Rf de un compuesto dado será diferente para distintos disolventes, pero ello constituye una ventaja, puesto que así es posible caracterizar a un compuesto más específicamente registrando sus Rfs en varios disolventes. Algunos factores que afectan al Rf son: el grado de pureza del adsorbente, la concentración del ambiente de la cámara y la temperatura.

Eluyente:

Revelador:

2. Clorofila

Definición : Las clorofilas son un grupo de pigmentos que se encuentran en diversos eucariotas que poseen cloroplastos (plantas, algas) y algunosprocariotas: bacterias (cianobacterias, bacterias verdes y púrpuras), las cuales no poseen cloroplastos, por lo tanto, sus pigmentos se encuentran en Sistemas de membrana Internos: (Vesículas, Lamelas, Cromatóforos) y se encuentran en el dominio eubacteria y eucarya.

Tipos: Las distintas formas de la clorofila se distribuyen desigualmente en la diversidad de los fotosintetizadores oxigénicos. La tabla siguiente presenta las diferentes formas de la clorofila y resumen su distribución sistemática.

Clorofila a Clorofila b Clorofila c1 Clorofila c2 Clorofila d

Fórmula empírica

C55H72O5N4

MgC55H70O6N4Mg C35H30O5N4Mg C35H28O5N4Mg

C54H70O6N4

Mg

Grupo C3

-CH=CH2 -CH=CH2 -CH=CH2 -CH=CH2 -CHO

Grupo C7

-CH3 -CHO -CH3 -CH3 -CH3

Grupo C8

-CH2CH3 -CH2CH3 -CH2CH3 -CH=CH2 -CH2CH3

Grupo C17

-CH2CH2COO-Fitil

-CH2CH2COO-Fitil

-CH=CHCOOH -CH=CHCOOH-CH2CH2COO-Phytyl

Enlace C17-C18

Simple Simple Doble Doble Simple

Distribución

Universal

Sobre todo Plantae y algas verdes (1)

Cromoalveolados y algas rojas (2)

Cromoalveolados y algas rojas (2)

Algún alga roja(3)

1. La clorofila a se encuentra en todos los casos, vinculada al centro activo de los complejos moleculares, llamados fotosistemas, que absorben la luz durante la fotosíntesis, difiere de la clorofila b en que el radical de la posición 3 del grupo tetrapirrólico es -CH3(metilo) en lugar de -CHO (grupo funcional de los aldehídos).

2. La clorofila b caracteriza a los plastos de las algas verdes y de sus descendientes las plantas terrestres (reino Plantae). Esos plastos, y los organismos que los portan, son de color verde. También se encuentran plastos verdes en algunos grupos de protistas que han asimilado algas verdes unicelulares endosimbiontes adquiriendo así plastos secundarios. Podemos citar a las euglenas, a los cloraracniófitos y a algunos dinoflagelados, como Gymnodinium viride. También se encuentra en algunas cianobacterias (lascloroxibacterias), que por ello son de color verde planta en vez de azuladas; hace algún tiempo se les atribuyó por este rasgo el carácter de antepasados de los plastos verdes, pero luego se ha comprobado que es un carácter adquirido independientemente en varias líneas separadas.

3. Las clorofilas c1 y c2 son características de un extenso y diverso clado de protistas que coincide más o menos con el superfiloChromista y que incluye grupos tan importantes como las algas pardas, las diatomeas o los haptófitos.

4. La clorofila d sólo se ha conocido durante decenios por una observación aislada y no repetida en un alga roja. Luego se ha encontrado en una cianobacteria (Acaryochloris marina), que parece especialmente apta para explotar luz roja cuando crece bajo ciertas ascidias. No debe en todo caso interpretarse de la tabla que su presencia es una característica común de las algas rojas.

También se encuentran clorofilas en animales que albergan dentro de sus células o entre ellas algas unicelulares (zooclorelas y zooxantelas). Gracias a esta simbiosis la fotosíntesis contribuye de manera significativa a la nutrición de corales, tridacnas, nudibranquios y otros animales marinos.

No todos los organismos fotosintetizadores tienen clorofilas. Las bacterias que no son cianobacterias tienen pigmentos muy distintos llamados bacterioclorofilas.

Estructura: La estructura de la moléculas de clorofila tiene dos partes: un anillo de porfirina (sustituida con pequeños grupos enlazados,sustituyentes) y una cadena larga

llamada fitol. es un tetrapirrol, con cuatro anillos pentagonales de pirrol enlazados para formar un anillo mayor que es la porfirina. La hemoglobina de la sangre y otras proteínas contienen también una porfirina, que en ese otro caso constituye lo principal de un grupo 'hemo'; y también se encuentra porfirina en la estructura de la vitamina B12. El grupo hemo contiene un átomo de hierro (Fe); la porfirina de la clorofila lleva en lugar equivalente un átomo de magnesio (Mg2+). La absorción de determinados picos del espectro de radiación (ver gráfica más abajo) es una propiedad de aquellas moléculas orgánicas que contienen dobles enlaces conjugados (dobles enlaces alternando con enlaces simples); puede verse en las fórmulas desarrolladas contiguas que el anillo porfirínico es rico en tales enlaces.

El fitilo (o resto de fitol; llamamos resto o residuo a la parte de una molécula incorporada a la estructura de otra mayor) es una cadena hidrocarbonada con restos de metilo (-CH3) a lo largo. Tiene, como todas las cadenas orgánicas basadas sólo en C e H, un carácter “hidrófobo”; es decir, que repele al agua. La cadena del fitilo sirve para anclar la molécula de clorofila en la estructura anfipática de los complejos moleculares en que residen las clorofilas.

Conclusión

En este tema hemos conocido más sobre la cromatografía, la cual nos permite separar los componentes químicos de una sustancia y determinar las cantidades de dichos componentes.

Bibliografía

Química. R.Chang y otros. 9ª Edición, Editorial Mc Graw-Hill, 2002

Química. Mortimer. Editorial Iberoamérica, 2001