OBTENCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LA OLEORRESINA DEL AJO

OBTENCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LA OLEORESINA DEL AJO

(Allium sativum)

LEONARDO CARDONA PAREJA

PAULA ANDREA GONZÁLEZ PATIÑO

DIRECTOR:

MELVIN AROLDO DURÁN

ASESOR:

GLORIA EDITH GUERRERO

UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA

FACULTAD DE TECNOLOGÍA

ESCUELA DE QUÍMICA


(Allium sativum)

TRABAJO DE GRADO

Requisito final para optar al titulo de tecnólogo químico

Presentado por:



DIRECTOR:

MELVIN AROLDO DURÁN

UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA

FACULTAD DE TECNOLOGÍA

ESCUELA DE QUÍMICA

NOTA DE ACEPTACIÓN DE TRABAJO DE GRADO


(Allium sativum)

Presentado por:



Los suscritos director y jurado del presente trabajo de grado, una vez realizada

la versión escrita y presenciado la sustentación oral, decidimos otorgar:

La nota de ________________________________

Con la connotación: _________________________________

Para constancia firmamos en la ciudad de Pereira hoy:

Director:

Melvin Aroldo Durán _________________________________

Jurado:

Firma: _________________________________

Jurado:

Firma: _________________________________

DEDICATORIA

Dedicado a nuestras familias por su esmero en formarnos como

seres integrales, a nuestros más especiales y queridos amigos

quienes nos acompañaron en este proceso.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos a todas aquellas personas que intervinieron en la realización de

este trabajo de grado, entre ellos el personal administrativo y docente, el

personal encargado de la sala de reactivos, almacén y demás dependencias de

la escuela de química, a los jurados por su disposición al calificar este trabajo

de grado, a nuestros amigos y compañeros, al grupo de investigación de

Oleoquímica, a nuestro director Melvin Aroldo Durán y muy especialmente a

nuestra asesora la doctora Gloria Guerrero.

CONTENIDO

Pág.

ÍNDICE DE TABLAS 8

ÍNDICE DE FIGURAS 9

RESUMEN 10

JUSTIFICACIÓN 12

OBJETIVOS 14

1. MARCO TEÓRICO 15

1.1 Generalidades del Ajo (Allium Sativum) 15

1.2 Química del ajo 17

1.3 Bioquímica del ajo 22

1.4 Metodologías de análisis 26

1.4.1 Análisis fisicoquímicos 26

1.4.2 Análisis microbiológicos 28

1.5 Métodos de extracción 30

1.5.1 Extracción soxhlet 30

1.5.2 Extracción en frío 31

1.6 Análisis instrumental 31

1.6.1 Métodos de separación cromatográfica 31

1.6.2 Espectrometría de masas 32

1.6.3 Cromatografia/Espectrometria de masas GC/MS 33

2. MARCO DE REFERENCIA 34

2.1 Las oleorresinas 34

2.1.1 Oleorresina de ajo 37

3. SECCIÓN EXPERIMENTAL 39

3.1 Material vegetal 39

3.2 Preparación de la muestra 39

3.3 Solventes utilizados 39

3.4 Extracción 39

3.5 Separación del extracto 40

3.6 Análisis fisicoquímicos 40

3.6.1 Materia seca 40

3.6.2 Cenizas 40

3.6.3 Índice de refracción 41

3.6.4 Índice de acidez 41

3.7 ANALISIS GC/MS 41

3.7.1 Preparación de la muestra 41

3.7.2 Condiciones de análisis 41

3.8 Análisis microbiológicos 42

3.8.1 Determinación de Mesófilos aerobios viables 42

3.8.2 Determinación de Mohos y Levaduras 43

3.8.3 Determinación de Coliformes totales 43

3.8.4 Determinación de Coliformes fecales 43

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 44

4.1 Extracción de la oleorresina 44

4.2 Análisis fisicoquímicos 49

4.2.1 Índice de acidez 49

4.2.2 Materia seca 49

4.2.3 Cenizas 50

4.2.4 Índice de refracción 51

4.3 ANÁLISIS GC/MS 51

4.4 Análisis microbiológicos 56

4.4.1 Analisis de Mesofilos, mohos y levaduras 56

4.4.2 Determinación de coliformes totales y coliformes fecales E-coli 57

5. CONCLUSIONES 61

6. RECOMENDACIONES 63

7. BIBLIOGRAFÍA 64

8. ANEXOS 69

8.1 Cromatograma de gases de volátiles en la oleorresina 69

8.2 Fragmentogramas de masas de las sustancias separadas por GC 70

8

ÍNDICE DE TABLAS

Pág.

Tabla No. 1: Composición nutritiva del ajo 20

Tabla No. 2: Compuestos azufrados del ajo 24

Tabla No. 3: Compuestos no azufrados del ajo 25

Tabla No. 4: Parámetros microbiológicos de las especias y sus derivados 36

Tabla No. 5: Extracción en frío con ajo blanco 47

Tabla No. 6: Extracción en frío con ajo rojo 47

TablaNo.7: Extracción soxhlet con ajo blanco 48

Tabla No. 8: Extracción soxhlet con ajo rojo 48

Tabla No. 9: Índice de acidez 49

Tabla No. 10: Materia seca 50

Tabla No. 11: Cenizas 50

Tabla No. 12: Índice de refracción y grados Brix 51

Tabla No. 13: Características de los picos cromatográficos 52

Tabla No. 14: Interpretación de los principales fragmentos de los

espectrode masas de cada una de las sustancias presentes en

el cromatograma 53

Tabla No. 15: Recuento de mohos y levaduras 56

Tabla No. 16: Recuento de mesófilos aerobios viables 57

Tabla No. 17: Determinación de Coliformes totales, prueba presuntiva

(sin desinfección previa del material vegetal) 58

Tabla No. 18: Determinación de Coliformes fecales (sin desinfección previa

del material vegetal) 59

Tabla No. 19: Determinación de Coliformes fecales, prueba presuntiva (con

desinfección previa del material vegetal) 59

Tabla No. 20: Determinación de Coliformes fecales (con desinfección previa

del material vegetal) 60

9

ÍNDICE DE FIGURAS

Pág.

Figura No. 1: Descomposición de la alicina en ajoenos 17

Figura No. 2: Efectos del procesado en la formación de diferentes

compuestos bioactivos del ajo 19

Figura No. 3: Diagrama de flujo de la extracción de la oleorresina 46

Figura No. 4: Degradación de la alicina en Ditiinas 56

10

RESUMEN

En los últimos años se ha incrementado la demanda de oleorresinas a nivel

mundial, a pesar de esto, en nuestro país la mayoría de especias se consumen

en forma molida a sin ningún tratamiento previo; desaprovechando las múltiples

ventajas que brindan las oleorresinas.

Por esta razón se desarrollo un método de extracción eficaz y eficiente para la

especia del ajo (Allium sativum). Eligiendo esta especia principalmente por su

fuerte demanda como condimento, por su rico aporte a nivel medicinal, como

nutriente y como agente antimicrobiano.

Para desarrollar el método se realizaron comparaciones entre dos tipos de

extracción:

-Extracción soxhlet: consiste en un método de extracción sólido-liquido, que

se utiliza generalmente para aislar los componentes lipídicos de una muestra,

por medio de un solvente apolar.

-Extracción en frío con agitación: consiste en un método de extracción

sólido-liquido, en el que ambas fases (sólida y liquida) se encuentran en

contacto directo, por lo que los componentes del sólido que son afines al

solvente quedaran disueltos en el mismo.

Se compararon el ajo morado y ajo blanco, así como tres clases de solvente

extractor: etanol 75%, hexano, y etanol 95%: hexano (1:1). Los solventes

fueron elegidos con el fin de probar el nivel de extracción de componentes del

ajo a diferentes polaridades. El único tratamiento previo que sufrió la muestra

fue la maceración y el volumen de solvente que se utilizó para cada ensayo fue

de 100 mL. Cada ensayo se hizo por triplicado y bajo las condiciones más

uniformemente posibles.

11

Para purificar la oleorresina extraída, el solvente fue evaporado en

rotaevaporador.

En conclusión el extracto que presentó las mejores características físicas y

mayor rendimiento es el obtenidos de la extracción en frió con agitación usando

como solvente etanol al 75% y como material vegetativo ajo blanco. Este

método de extracción mostró buena precisión.

Sobre esta oleorresina se aplicaron análisis posteriores para realizar una

caracterización química, estos fueron: Índice de refracción (ntD), materia seca,

cenizas y acidez. Se utilizo la cromatografía/espectrometría de masas GC/MS

para realizar el análisis de volátiles, encontrándose sustancias azufradas

importantes características del ajo, y para asegurar que cumpliera con la

resolución 4241 de 1991 del ministerio de salud pública colombiana se

realizaron las pruebas microbiológicas correspondientes a alimentos y

aplicables a oleorresinas, de esta se tienen: recuento de mohos y levaduras,

recuento de mesófilos aerobios viables, determinación de coliformes totales y

Determinación de Coliformes fecales.

Según los resultados obtenidos en la extracción de la oleorresina, las

características encontradas guardan consistencia con los reportes

bibliográficos, garantizando poder condimentante uniforme, las características

fisicoquímicas, microbiológicas adecuadas y fuerte esencia característica del

ajo.

El método de extracción de la oleorresina proporciona buen rendimiento en

extracto, lo que puede favorecer su implementación en la industria alimentaria.

12

JUSTIFICACIÓN

En Colombia el comercio de oleorresinas no ha tenido una amplia explotación a

pesar de contar con una gran y diversa gama de productos agrícolas, de los

cuales se podría tener un mejor aprovechamiento extrayendo este tipo de

derivados; caso contrario ha ocurrido en otros países tales como Estados

Unidos, Canadá, Reino Unido, Alemania, Francia, y Japón (1).

Las oleorresinas tomaron gran importancia a nivel industrial como especia para

alimentos a partir de 1960, desde entonces, este mercado ha evolucionado

ampliamente dándoles mayor uso y aumentando la variedad de oleorresinas

extraídas (1).

En nuestro país el comercio de las especias es poco tecnificado ya que estas

se consumen casi en su totalidad en forma molida o sin ningún tratamiento

previo, un ejemplo de esta situación es el ajo (Allium sativum) que a pesar de

tener un alto consumo, su producción se realiza con baja tecnificación y en no

muy amplias extensiones de terreno, debido en parte a que sus condiciones de

cultivo exigen temperaturas optimas promedio de 14 a 20 ºC y con baja

humedad relativa(2), lo que restringe en gran medida su producción en muchas

zonas del país, razón por la cual es necesario realizar grandes importaciones

de este producto, desde países pioneros en producción tecnificada que ofrecen

buenas ofertas de costos y un producto con características de alta calidad

física.

A nivel local, en Risaralda no existe producción agrícola de ajo; el producto

consumido en esta región proviene de dos fuentes: una es la producción

nacional (especialmente de ajo morado), la otra de importaciones

13

(especialmente de ajo blanco) de países con grandes producciones como la

China.

Teniendo en cuenta estos aspectos se observa la oportunidad de realizar un

mayor aprovechamiento a la cantidad importada y producida nacionalmente

mediante la extracción de su oleorresina, ya que este tipo de derivados ofrece

múltiples ventajas tales como ser 100% naturales, libres de residuos de

solventes y de residuos de pesticidas, de impurezas y materia extraña, exentos

de bacterias y enzimas, con alta uniformidad en su composición y siendo la

característica más importante el rendimiento económico, ya que dependiendo

de la concentración de la oleorresina, puede sustituir hasta 100 Kg. de producto

en polvo por 1 a 2 Kg. de oleorresina, también asegura una mayor durabilidad

del producto (1,3).

De aquí la pertinencia e importancia de extraer y caracterizar éste producto que

podría tener intereses comerciales debido a su fuerte demanda.

14

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Obtener la oleorresina del ajo (Allium sativum).

OBJETIVOS ESPECIFICOS

Determinar una metodología eficaz de extracción para la oleorresina del

ajo (Allium sativum).

Realizar análisis fisicoquímicos para determinar las propiedades

generales de la oleorresina.

Realizar análisis microbiológicos para determinar la inocuidad de la

oleorresina.

15

1. MARCO TEORICO

1.1 GENERALIDADES DEL AJO (Allium sativum)

Vegetal perteneciente a la familia de las liliáceas y a la

subfamilia de las Allioideas , la planta esta provista de hojas

largas, estrechas y planas en su mitad inferior, sus flores son de

color blanco-verdoso en forma de sombrilla ubicadas en el

nacimiento de las hojas superiores, los bulbos crecen

subterráneamente en la base del tallo.

Los bulbos constituyen una raíz redondeada y su conjunto es conocido como

“cabeza de ajo”, los dientes de ajo son de color blanco o

amarillento y están recubiertos por una serie de capas

delgadas, las cuales pueden variar de color según el tipo de

ajo (4,5).

Su nombre botánico Allium sativum procede de la palabra celta all, que significa

caliente o ardiente y sativum, término latino que significa cultivado. Esta planta

es originaria de Asia Central, desde allí se extendió hacia el Este hasta

alcanzar la China y hacia el Oeste en dirección a Europa (5). El comercio

europeo facilitó su distribución, lo que hizo del ajo un condimento básico en

muchos alimentos. Los españoles introdujeron el ajo en el continente

americano a finales del siglo XIX (5).

Existen diversas variedades de este vegetal, las más comunes identificados por

su cubierta son (5):

-Ajo blanco o común: es de mayor tamaño que el ajo morado,

es resistente y carnoso, de buena productividad y

conservación, tiene un sabor marcado y aroma persistente.

16

-Ajo rosado o morado: no se conserva en buen estado por

largos periodos de tiempo y son más precoses que el ajo

blanco.

-Ajo rojo: al igual que el ajo morado el color de su cubierta le da su

nombre. Está constituido por un solo diente gigante. Se conoce como ajo

macho.

La variedad que prevalece en todos los países es el ajo blanco, pero existen

otras variedades tales como: la italiana, chilena, californiana, española y

mexicana (6).

El cultivo del ajo requiere un clima templado para lograr su mejor

desarrollo, soporta temperaturas mas bajas que la cebolla, y

durante la formación del bulbo las temperaturas requeridas van

de 0 a 10 grados centígrados, requiere humedad relativa del 60-

70 %, el suelo mas apropiado es el franco-arcilloso con muy buen

drenaje y con un moderado contenido de materia orgánica, el pH óptimo del

suelo esta entre 6.5 a 6.6 y requieren buenas cantidades de abono, el manejo

inadecuado del nitrógeno produce acebollamiento de la planta (los bulbos no

adquieren solidez). Los dientes de ajo que se siembran deben haber cumplido

un proceso de desinfección pertinente y una hiemación. La madurez del ajo se

logra en un periodo de aproximadamente 6 meses y su cosecha se inicia

cuando las hojas de la planta comienzan a marchitarse y el tallo palidece. Las

plagas que mas atacan el cultivo son el piojo o candelilla (Thrips Tabaci) ,

Sclerotium sp, nemátodo del tallo y trozadores (grillos, gusanos, ácaros,

pulgones y hormiga arriera). Dentro de las enfermedades más comunes están

las manchas en las hojas, royas y pudrición de bulbos causados por hongos (2,6).

En Colombia el ajo se debe cultiva en terrenos entre 1700-3000 m.s.n.m., con

temperaturas que oscilen entre los 12 y 18 grados centígrados. Cundinamarca,

Boyacá, y Nariño son los departamentos con mayor producción de ajo en

17

Colombia, mientras que Antioquia, Cesar, Santanderes y Cauca son

productores menores (2).

1.2 QUÍMICA DEL AJO

El análisis de la composición química de la parte comestible del ajo arroja una

riqueza importante en hidratos de carbono (cerca del 30%) y proteínas

(aproximadamente el 6%), su riqueza mineral esta constituida por potasio,

fósforo, magnesio, zinc, yodo, y dentro del contenido vitamínico se destacan las

vitaminas del grupo B, como la B1, B3, B6 y con cantidades pequeñas de

vitamina C y E. Además están contenidas sales de selenio, azucares, lípidos,

saponósidos, terpenos, enzimas, flavonoides y otros compuestos fenólicos. Sin

embargo el contenido energético y nutritivo es marginal, ya que se consume en

muy baja cantidad (7).

Las cualidades químicas características del ajo y sus propiedades salutíferas

se deben en realidad a compuestos azufrados, de los cuales se destaca la

aliina, la cual por si misma constituye hasta un 0.24% del peso global del ajo.

Esta sustancia es poco olorosa y con mínimos efectos terapéuticos, sin

embargo, cuando se corta o machaca el ajo, la aliina entra en contacto con la

enzima alinasa (alrededor del 1% del diente del ajo), y se descompone dando

lugar al ácido 2-propensulfénico. El ácido 2-propensulfénico se dimeriza a su

vez con otra molécula de ácido 2-propensulfénico, dando lugar a la alicina, la

cual proporciona el olor característico del ajo, la alicina es muy reactiva y

produce derivados químicos denominados ajoenos y ditiinas (8,9).

CH2

S+

SCH2

O-

S+

SCH2

CH2

O-

S+

S

CH2

CH2

O-

CH2

S+

SS

CH2

O-

SS

CH2CH2

S+

O-

Alicina

Trans-ajoeno

Cis-ajoeno

Figura No. 1: Descomposición de la alicina en ajoenos(8)

18

La alicina, de fórmula molecular C6H10OS2 y peso molecular de 162.27 g/mol,

es un liquido amarillo de densidad 1.112 g/ml e índice de refracción a 20oC y

con la línea D del sodio de 1.561; Su pH esta cerca de 6.5, tiene solubilidad en

agua a 10oC de alrededor de 2.5% m/m, también es soluble en alcohol, éter y

benceno. Presenta inestabilidad en álcali caliente, pero es estable a ácidos. En

general tiene estabilidad limitada en solución (10).

Otros componentes sobresalientes son la alicina –ajoeno, trans-ajoeno, z-

ajoeno, cis-ajoeno, disulfuro de alilo y sulfuro de alilo (8,9).

Las investigaciones hechas hasta el presente han identificado alrededor de 30

componentes en el ajo con algún efecto beneficioso a la salud con una amplia

gama de actividades metabólicas (9).

En los extractos de ajo, el tipo y concentración de sustancias extraídas,

depende de factores como: grado de madurez del ajo, prácticas de producción

y cultivo, localización de la planta y condiciones de procesamiento. Así, las

propiedades biológicas y las características fisico-químicas pueden variar de

acuerdo a condiciones de pH (la aliinasa se inactiva en pH ácido), solvente

(aumento o disminución de la vida media de la alicina), el almacenamiento

tiene influencia sobre el incremento de componentes azufrados, por la posible

formación de S-alk(en)il-L-cistein sulfóxidos a partir de precursores con g-

glutámico. En general los compuestos azufrados generan una gran cantidad de

reacciones químicas características, las cuales producen muchos de los

efectos metabólicos (7).

El aceite esencial de ajo que se obtiene por arrastre de vapor no posee

propiedades bactericidas o antitrombóticas, pero si propiedades antioxidantes

(7).

19

VAPOR

100 ºC

ALCOHOL ET ILICO Y AGUA

25ºC

ALCOHOL ETILICO

<0 ºC

SS

CH2CH2

S+

SCH2

CH2

O-

S+

NH2CH2

O-

H

OHO

Alicina

Aliina

Disulfuro de dialilo

Figura No. 2: Efectos del procesado en la formación de diferentes compuestos bioactivos

del ajo (7)

Es de notar que la mayoría de los componentes azufrados del ajo no se

encuentran como tal en las células intactas, sino que se generan a partir de

varios de los componentes azufrados que se liberan cuando el ajo es cortado,

partido o macerado. La gran cantidad de reacciones químicas de unos

componentes con otros, generan así mismo una variedad amplia de sustancias;

entre estas reacciones se encuentra la formación de diferentes tiosulfinatos y

compuestos derivados, relacionados con el ácido sulfónico a partir de la

reacción entre la enzima aliinasa y precursores volátiles (S-alkenilcisteina

sulfóxido y ácido sulfónico). La descomposición de sulfinatos puede ocurrir por

diferentes vías metabólicas, una de las cuales combina dos moléculas de

alicina para formar tres moléculas de ajoeno. Por medio de degradaciones no

enzimáticos se producen otros compuestos azufrados como los tiosulfinatos,

cepenos, mono, di, tri y tetrasulfuros , tioles, tiofenos y anhídrido sulfuroso , a

partir de tiosulfinatos (7,8).

Los componentes sulfurados del ajo se han estudiado con detalle en fracciones

volátiles extraídas por diferentes métodos, implementando GC-MS, para la

identificación de diversas sustancias; sin embargo a las condiciones del análisis

(especialmente la temperatura) pueden ocurrir muy diversas reacciones de

degradación, por lo que no se detectan las sustancias originales de la muestra

en su totalidad. Para ello se han implementado otros métodos utilizado HPLC y

20

GCMS criogénico, evitando así las múltiples degradaciones de dichos

compuestos azufrados (11).

Tabla No. 1: Composición nutritiva del ajo (7)

Componentes Medida Promedio (en

100g de porción

comestible).

Variación

Ingredientes

principales

Agua

Proteínas

Lípidos

Carbohidratos

(utilizables)

Minerales

g

g

g

g

g

64.00

6.05

0.12

28.41

1.42

63.00 - 64.60

5.30 - 6.76

0.06 - 0.20

_______________

1.40 - 1.44

Minerales y

elementos traza

Calcio

Manganeso

Hierro

Cobre

Zinc

Níquel

Molibdeno

Aluminio

Fósforo

mg

g

mg

g

g

g

g

g

mg

mg

38.00

460.00

1.40

149.00

575.00

10.00

70.00

1.80

134.000

30.000

2.70

_______________

_______________

37.00-260.00

150.00-1000.00

______________

______________

______________

______________

______________

______________

340.00-630.00

21

Cloro

Yodo

Boro

Selenio

g

g

g

440.00

5.69

4.40-28.00

Vitaminas

Vitamina E

otal tocoferol

TAlfa-tocoferol

Vitamina B1

Vitamina B2

Nicotinamida

Vitamina C

g

g

g

g

g

g

mg

10.90

100.00

10.00

90.00

200.00

80.00

600.00

14.00

______________

______________

______________

______________

180.00-210.00

______________

______________

9.00-18.00

Acidos

Acido salicilico

Acidos grasos

Acido laúrico

Acido palmítico

Acido esteárico

Acido oleico

Acido linoleico

Acido linolénico

g

!

!!!!! g

mg

mg

mg

mg

100.00

500.00

24.00

Trazas

3.00

62.00

5.50

______________

_______________

_______________

Trazas

_______________

_______________

_______________

22

1.3 BIOQUÍMICA DEL AJO

Los efectos antimicrobianos del ajo son conocidos desde la antigüedad. La

sustancia activa mas importante es la alicina la cual tiene efectos inhibitorios

potentes sobre ciertas enzimas como las cistein-proteinasas y alcohol-

deshidrogenasas, las cuales cumplen papeles importantes en las infecciones

por hongos, bacterias y virus. La aliina también inhibe ciertas enzimas con

grupos tioles (azufrados), que influyen en la biosíntesis de colesterol. Este

hecho podría explicar el postulado efecto hipocolesterolémico del ajo y sus

saludables efectos cardiovasculares (12).

Numerosas investigaciones (5,12) han revelado diversos efectos tales como:

-Potente depurativo: propiedades antisépticas, fungicidas, bactericidas y

depurativas. Se ha recomendado en casos de parásitos intestinales,

disenterías e infecciones gastrointestinales. También se le atribuyen

propiedades para el tratamiento de congestiones e infecciones respiratorias.

-Efectos cardiovasculares: disminución de los niveles de colesterol y

triglicéridos sanguíneos provenientes del consumo de grasas saturadas, poder

antioxidante, incremento de la actividad tibrinolitica y acción antiagregante

plaquetaria, efectos hipotensores (vasodilatador) y benéficos efectos sobre la

elasticidad vascular.

-Prevención de tumores: inhibición de la bacteria Helicobacter pylori cuya

acción esta asociada a la aparición de ulcera gastroduodenal y cáncer gástrico.

Así mismo otras investigaciones indican que el consumo de ajo reduce

notablemente los riesgos de padecer cáncer de estomago y cáncer de colon.

- Actúa como estimulante del apetito: estimula las mucosas gastrointestinales

Por las investigaciones realizadas in vitro e in vivo (en animales), se ha

revelado que el ajo fresco y muchos de sus preparados poseen efecto

antioxidante, ya que sus componentes presentan múltiples efectos frente a la

inactivación y control de los radicales libres. Al parecer todos los componentes

23

del ajo presentan actividad antioxidante, pero los componentes con mayor

capacidad podrían ser S-alil-cisteína y alicina (13).

Cabe señalar que en las investigaciones realizadas sobre los beneficios

médicos de la ingesta de ajo, se han encontrado resultados contradictorios o no

congruentes, debido a que las condiciones de los ensayos y la presentación del

ajo no son las mismas en todos los casos, lo que modifica el contenido en

sustancias activas. Por este hecho se ha recomendado realizar más estudios y

bajo condiciones rigurosamente uniformes para confirmar los efectos reales de

los compuestos azufrados (7).

Se han realizado ensayos diversos para utilizar extractos etanólicos y acuosos

de ajo como aditivos en alimentos, que además de otorgar sabor, cumplan un

papel como conservante frente a la acción de microorganismos. Estudios sobre

la inhibición de Escherichia coli y Listeria innocua usando dichos extractos,

muestran resultados efectivos con concentración mínima letal (CML) para E-

coli y Listeria innocua de 0.25g de ajo/ml agua y 0.125 g de ajo/ml agua

respectivamente; así mismo una concentración mínima inhibitoria (CMI) para

ambos microorganismos de 0.25g de ajo/ml etanol (14).

Otra serie de microorganismos que presentan sensibilidad a la alicina son las

especies bacterianas: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes,

Klebsiella pneunoniae, Shigella dysenteriae, Enterococcus. También inhibe la

acción de hongos de especies de Candida, Crytococcus, Trichophyton,

Epidermophytom y Microsporum. La acción antiparasitaria se da en:

Entamoeba histolytica, Giardia lambia, Leishmania major, Leptomonas

colosoma. Los virus que presentan sensibilidad al ajoeno son citomegalovirus

humano, influenza B, virus del herpes simple tipo I y tipo II, el parainfluenza, y

el de la estomatitis vesicular (9).

24

Tabla No. 2: Compuestos azufrados del ajo (7)

Compuesto Posible actividad biológica

Aliína

Ajoeno (ajocisteína)

Hipotensora, hipoglucemiante

Previene la formación de coágulos,

ayuda a disolverlos.

Anti-inflamatorio, vasodilatador,

hipotensor, antibiótico

Alicina y Tiosulfinatos

Alil mercaptano

Antibiótica, antifúngica, antiviral

Hipocolesterolemiante, previene la

aterosclerosis, antitumora,

antidiabética, hipotensora

Sulfuro de dialilo y afines Hipocolesterolemiante. Aumento la

producción de enzimas

desintoxicantes. Anticancerígeno.

Previene los daños químicos del

DNA.

S-alil-cisteína y compuestos al

–glutámico

Hipocolesterolemiantes,

antioxidantes, quimioprotectores

frente al cáncer. Favorecen la

acción desintoxicante del hígado

frente a sustancias químicas.

25

Tabla No. 3: Compuestos no azufrados del ajo (7)

Compuesto Posible actividad biológica

Adenosina

Vasodilatadora, hipotensora,

miorelajante. Estimula la síntesis

de hormonas esteroídicas

Estimula la liberación de

glucagón

Fructanos (Escorodosa)

Fracción proteica F-4

Efectos cardiorotectores

Estimula el sistema inmune por

medio de macrófagos y células

esplénicas

Quercitina Estabiliza los mastocitos. Ejerce

por tanto efectos beneficiosos en

el asma y la alergia

Saponinas (Gitonina F,

Eurobósico B) Escordina

Hipotensoras. La Gitonina F es

antivírica, el Erubósito B

antifúngico

Hipotensora en conejos y perros.

Factor de crecimiento en dosis

elevadas. Incrementa la

utilización de la vitamina B1.

Antibacteriana

Selenio

Ácidos fenólicos

Antioxidantes. Antiinflamatorios.

Antivíricos y antibacterianos

26

1.4 METODOLOGÍAS DE ANÁLISIS

1.4.1 Análisis Fisico-químicos: la amplia utilización de extractos, aceites

esenciales y oleorresinas provenientes de diversas fuentes, en algunas

industrias como es el caso de la alimentaria, exige que dichos materiales sean

caracterizados, para concluir sobre aspectos como su identidad, composición

(pureza, autenticidad) y calidad (frescura, vida útil) (15).

-Índice de refracción (ntD): se define como el cociente entre el seno del

ángulo de incidencia y el seno del ángulo de refracción de la luz

monocromática al pasar del aire a un medio ópticamente más denso. El índice

de refracción depende de la composición de la muestra, la temperatura y la

longitud de onda de la radiación utilizada. Generalmente se mide a 20, 25 o 40

grados centígrados, tomando como referencia la línea D del sodio (589 nm), y

se realizan como mínimo dos mediciones de donde se toma la media, por lo

general con cuatro cifras decimales. Su utilidad radica en casos como la

identificación y caracterización de líquidos puros, grasas y aceites,

comprobación de la pureza de diversos alimentos, determinación del contenido

de agua en miel o en extractos de alimentos ricos en sacarosa (confituras, miel,

jarabe de almidón, zumos, etc.). Se denota ntD

(15,16).

-Materia seca: en un alimento la materia seca esta constituida por todos

aquellos componentes no volátiles del mismo, tales como: lípidos,

carbohidratos, proteínas y minerales entre otros. La determinación se realiza

por la pérdida de humedad o sustancias volátiles (ácido carbónico, alcoholes,

aceites etéreos) por medio de la elevación de la temperatura y con la eventual

utilización de vacío. Dependiendo del alimento se pueden utilizar otras

metodologías en las que se mide índice de refracción o densidad. El contenido

de humedad o material volátil es de vital importancia en alimentos ya que este

parámetro determina muchas de las características físicas del producto,

además de que el contenido de humedad por encima de ciertos niveles, influye

27

en posibles degradaciones de los constituyentes químicos o desarrollo de

microorganismos. Se expresa en % m/m (15,16).

-Cenizas: son el residuo resultante de la incineración, a ciertas condiciones, de

todo el contenido de material orgánico en la muestra. La combustión es

completa y el residuo corresponde al contenido total en minerales. Las cenizas

normalmente no son las mismas sustancias inorgánicas presentes en la

muestra original, debido a las perdidas por volatilización o a las interacciones

químicas entre los constituyentes. El valor principal de la determinación de

cenizas es que supone un método sencillo para determinar la calidad de

muchos alimentos. Se expresa en % m/m (15,16).

La reacción química verificada en esta prueba corresponde a la oxidación de

hidrocarburos, que en forma general es:

CnH2n+2 + (3n+1)/2 + O2 ------------> nCO2 + (n+1)H2o + calor

-Acidez: es la medida del contenido de sustancias con carácter ácido en una

matriz determinada. Su utilidad radica en que sirve como indicativo de pureza y

en ocasiones se puede concluir a partir de este resultado el nivel de

degradación o tratamiento de la muestra. La acidez se puede expresar como

los mg de KOH que son necesarios para neutralizar los ácidos presentes

(minerales, ácidos grasos u orgánicos) o como la cantidad de ácido oleico en la

muestra (15).

La base de esta prueba es la reacción ácido-base, en la cual el cambio de pH

produce el viraje del indicador utilizado:

H+ + OH- -----------> H2O

28

1.4.2 Análisis microbiológicos (17,18): los microorganismos son seres

ampliamente extendidos por el medio ambiente, encontrándose en el aire, el

suelo y el agua; bajo diversas condiciones de presión, ph, temperatura, etc. En

la industria alimentaria, los microorganismos (especialmente las bacterias) se

constituyen en uno de los mas importantes problemas a enfrentar, ya que la

inocuidad del alimento es necesaria para un consumo seguro.

Dentro de los factores que influencian el crecimiento bacteriano están:

- Alimento: fuente de energía y materiales estructurales.

- Temperatura: factor que determina la velocidad de crecimiento y

reproducción, ya que influye en las reacciones químicas y la acción de las

enzimas.

- Humedad: agua disponible para favorecer el crecimiento microbiano

(actividad de agua)

- Oxigeno: su necesidad se ve restringida al tipo de microorganismo, y por esto

existen las clasificaciones de aerobios estrictos, anaerobios estrictos, aerobios

facultativos y microaerobios

- pH: es un factor decisivo en el desarrollo de microorganismos, y el rango

aceptable para el desarrollo de estos depende del tipo de microorganismo, sin

embargo existe la tendencia a pH desde 6.8 a 7.5.

- Sustancias inhibidoras: determinadas sustancias (originales del producto o

adicionadas) resultan tóxicas para los microorganismos, afectando su

crecimiento y reproducción.

Las determinaciones más generales realizadas en alimentos son:

-Mesófilos aerobios viables: Dentro de este grupo se incluyen todas las

bacterias, mohos y levaduras, que se desarrollan a 30o centígrados y debido a

que esta temperatura es optima para muchas formas de vida libre, están muy

difundidos en el medio ambiente, la mayoría de estos microorganismos se

encuentran en todos los productos. Los resultados de su recuento reflejan la

29

calidad sanitaria del producto examinado, sus condiciones de manipulación y

condiciones higiénicas de la materia prima.

En general no son recomendables recuentos elevados (excepto en productos

obtenidos por fermentación). Un recuento bajo no asegura ni implica la

ausencia de patógenos o sus toxinas, así mismo un recuento alto no implica la

presencia de flora patógena, sin embargo puede significar la contaminación de

la materia prima o del producto en proceso, la inmediata alteración del producto

o la presencia de mesófilos patógenos (17,18).

-Mohos y Levaduras: los hongos constituyen un grupo amplio de organismos

unicelulares y pluricelulares, los cuales se alimentan mediante la absorción

directa de nutrientes. Los hongos, además de las bacterias, son causantes de

la descomposición y putrefacción de la materia orgánica. En su mayoría, los

hongos están constituidos por hifas (finas fibras que contienen protoplasma), a

menudo divididas en tabiques denominados septos; así mismo, la proliferación

de hifas forman el micelio. Se reproducen generalmente por esporas, son

acompañantes muy comunes de toda forma de vida, en algunas ocasiones

como parásitos patógenos (17,18). Las levaduras son a menudo difíciles de

reconocer, pueden tener efectos beneficiosos y perjudiciales. Un ejemplo de

esto son las fermentaciones producidas por levaduras en la fabricación de

alimentos (pan, cerveza, queso), además, de obtención de enzimas. También

pueden producir alteraciones de zumos de frutas, almíbares, miel, entre otros.

Se desarrollan mejor en medios abundantes en agua y en condiciones

aerobias; el rango de temperaturas de crecimiento es similar al de los hongos,

con un optimo entre los 25-30oC y un máximo entre los 35-47oC. Algunos tipos

especiales pueden crecer a 0oC o menos. En general el crecimiento se ve

favorecido por pH próximos a 4 - 4.5, su desarrollo se dificulta en medios

alcalinos y es lento en condiciones anaerobias (levaduras fermentativas) (17,18).

-Coliformes totales: son un grupo constituido por bacilos aerobios estrictos o

aerobios facultativos, gram-negativos no esporulados, que tienen la capacidad

30

de fermentar lactosa con formación de gas. Los géneros que se incluyen en

este grupo son: Escherichia, Aerobacter, Klebsiella, Enterobacter y

Paracolobactrum, así mismo las dos especies mas importantes son:

Escherichia coli (principalmente de origen intestinal) y Aerobacter aerogenes

(principalmente de origen vegetal). Su recuento es importante ya que las

bacterias Coliformes son perjudiciales al organismo, y su presencia se

considera como signo de mala calidad de la higiene de los procesos o los

manipuladores y/o contaminación cruzada. Su crecimiento inutiliza los

alimentos (17,18).

-Coliformes fecales (E-coli): Se considera en este grupo al bacilo de la

especie Escherichia coli, el cual forma parte de la flora intestinal del hombre y

de animales de sangre caliente, de cuyo tracto intestinal se aísla dicho

microorganismo. Es gram-negativo, con temperatura optima de crecimiento de

37o C (existe multiplicación entre 10oC y 40oC), y pH optimo de 7 a 7.5

(soportando pH del rango de 4 a 8.5). Es muy perjudicial para la salud humana

fuera de su hábitat usual (intestino), y su presencia en alimentos indica una

contaminación de origen fecal. Se puede destruir por pasteurización. También

pertenecen a este grupo la Salmonella y la Shiguella (17,18).

1.5 METODOS DE EXTRACCIÓN

1.5.1 Extracción soxhlet: consiste en un método de extracción sólido-liquido,

que se utiliza generalmente para aislar los componentes lipídicos de una

muestra, por medio de un solvente apolar. Es un método de extracción directa,

aplicable a alimentos en general, aunque con excepción de aquellos en los que

la grasa esta recubierta (como los productos lácteos), y para la obtención de la

fracción de grasa libre de la muestra para su posterior caracterización. Los

solventes mas utilizados para extraer la grasa libre son el éter dietílico o el éter

de petróleo, y para fines de cuantificación de grasa se requiere una muestra

anhidra, para no extraer además azucares y otros compuestos. El equipo esta

31

integrado por un extractor, un condensador especial de tipo bulbo y un matraz (15).

1.5.2 Extracción en frío: consiste en un método de extracción sólido-liquido,

en el que ambas fases (sólida y liquida) se encuentran en un contacto directo,

por lo que los componentes del sólido que son afines al solvente quedaran

disueltos en el mismo. La polaridad del solvente depende del tipo de

compuestos que se requiere extraer, el material sólido se encuentra

generalmente macerado para obtener una mayor superficie de contacto y el

proceso se cumple a temperatura ambiente. Se puede realizar con agitación o

sin ella (denominado precolación).

1.6 ANALISIS INSTRUMENTAL

1.6.1 Métodos de separación cromatográfica (15): los procedimientos

cromatográfícos en general, son procesos de separación que consisten en

obligar a la sustancia problema a sufrir una migración diferencial entre dos

fases: fase móvil y fase estacionaria. Durante la separación, la fase móvil

atraviesa la fase estacionaria. La fase estacionaria es un sólido (adsorbente o

sorbente) o un líquido. La fase móvil es un gas insoluble o un líquido inmiscible

con la fase estacionaria. Existe también una nueva variante denominada gas

supercrítico (fluido).

Los procedimientos cromatográficos se clasifican de acuerdo a los siguientes

principios:

-Según la constitución física del soporte

-Según la combinación de los diferentes tipos de fases

-Según el tipo de separación.

-Cromatografía de Gases CG: Se constituye en un procedimiento para la

separación de compuestos volátiles, los cuales fluyen en una corriente gaseosa

32

sobre o a través de una fase estacionaria fijada en el interior de un tubo largo y

fino, la cual puede ser un sólido adsorbente de empaquetamiento, o un líquido

viscoso no volátil que recubre las paredes internas de la columna. El gas

portador es un gas inerte (nitrógeno, helio, hidrogeno, argón), y transporta una

muestra representativa de la sustancia inyectada. Los diversos componentes

son retenidos o retrazados por la fase estacionaria con mayor o menor fuerza y

alcanzaran correspondientemente el final de la columna donde se encuentra el

detector. Los tiempos de flujo del gas portador son relativamente largos.

La GC permite realizar análisis tanto cualitativos, como cuantitativos de

sustancias que se volatilizan a temperaturas elevadas sin degradarse o de las

cuales se obtienen derivados volátiles reproducibles. La elección del modo de

inyección de la muestra, la temperatura de la columna y el tipo de detector,

determinan los resultados del procedimiento.

1.6.2 Espectrometría de masas MS(19): la MS es de las herramientas

analíticas quizá la de mayor aplicación, ya que es capaz de proporcionar

información acerca de la composición elemental de las muestras, estructura de

las moléculas orgánicas, inorgánicas y biológicas, composición cualitativa y

cuantitativa de mezclas complejas, estructura y composición de superficies

sólidas y relaciones isotópicas de átomos en las muestras, etc. En forma

general, la MS consiste en introducir una pequeña cantidad de muestra (igual o

inferior a un micromol) por medio de un sistema de entrada, donde los

componentes se convierten en iones gaseosos (muestras sólidas o líquidas),

en un proceso llamado volatilización. Por medio de una fuente de iones, los

átomos se convierten en iones, normalmente positivos, acelerados hacia el

interior del analizador de masas. El analizador de masas mide la relación

masa/carga de los iones del analito, así mismo el detector convierte el haz de

iones en una señal eléctrica que puede ser procesada y almacenada en la

memoria de un ordenador, mostrada o registrada de diferentes maneras. El

espectro de masas de un compuesto particular proporciona diversos tipos de

datos que son útiles para su identificación; en primer lugar el peso molecular y

33

en segundo la fórmula molecular. Además, el estudio de los modelos de

fragmentación que se pone en manifiesto en el espectro de masas proporciona

a menudo información sobre la presencia o ausencia de grupos funcionales.

Así mismo la identidad real de un compuesto se puede establecer mediante la

comparación de su espectro de masas con los de compuestos conocidos hasta

llegar a una total o muy cercana coincidencia. Con excepción del procesador

de señal y el dispositivo de lectura, el equipo en su interior debe conservar

bajas presiones (10-8 a 10-4 torr), ya que las partículas cargadas, incluyendo los

electrones, interaccionan con los componentes de la atmósfera, siendo como

consecuencia destruidos.

1.6.3 Cromatografía/espectrometría de masas GC/MS (19): una de las

mejores herramientas para el análisis de mezclas orgánicas y bioquímicas

complejas es la cromatografía de gases/espectrometría de masas (GC/MS),

método de análisis acoplado en el cual se toma el espectro de masas de cada

uno de los compuestos que salen de la columna cromatográfica; siendo éstos

guardados en un ordenador para su subsiguiente procesado. Así mismo, la

espectrometría de masas se puede acoplar a la cromatografía liquida para el

análisis de muestras que contienen componentes no volátiles. Es importante el

desarrollo de métodos para la eliminación del eluente antes de la introducción

de la muestra en el espectrómetro de masas, ya que la muestra está muy

diluida por el líquido o el gas portador en el interior de la columna.

34

2. MARCO DE REFERECIA

2.1 LAS OLEORRESINAS

Las oleorresinas son extractos que se obtienen a partir de especias y otros

vegetales (plantas aromáticas) mediante la extracción con solventes orgánicos.

Estos extractos tienen naturaleza oleosa y las sustancias volátiles y no volátiles

extraídas proporcionan al producto las características concentradas de olor,

sabor y/o color de la especie vegetal. Por tal razón son productos

preferentemente utilizados como condimento en los alimentos (18). Están

constituidas en general por una mezcla entre resina (principios aromatizantes

no volátiles, aceites grasos, ingredientes picantes) y aceite esencial, el cual

contiene principios odoríferos volátiles. Las proporciones en la mezcla

dependen fuertemente de la forma de extracción y de la planta o fruto de donde

provienen. Las oleorresinas son de muy diversa composición, ya que al lado de

los aceites esenciales existen otras sustancias orgánicas y aceites grasos; los

extractos gozan de una mayor estabilidad ya que sus resinas preservan de la

autooxidación a los aceites grasos (18,21).

Cuando se realiza la extracción, se debe seleccionar un solvente,

generalmente de punto de ebullición bajo, lo cual permita volver a separarlo en

forma sencilla (21).

Son varias las ventajas que posen las oleorresinas frente a vegetales crudos,

cuando se utilizan en alimentos (3):

-Económicamente es rentable ya que sustituye sobradamente al vegetal, en

cuanto a características de olor y/o sabor

-Son uniformes en sus características

-Son naturales en el sentido de que no poseen rastros de solventes o trazas de

pesticidas

35

-Presentan una alta pureza

-La inocuidad del producto es confiable

Existen básicamente dos tipos de oleorresinas (3):

-Oleorresina liposoluble: la que se considera en estado puro y proviene

directamente del proceso de extracción con el solvente orgánico. Está

preparada para su uso con otras materias oleosas o grasas.

-Oleorresina hidrosoluble: se utiliza especialmente en la industria alimentaria

(sopas, bebidas, conservas), y se consigue por la incorporación a la oleorresina

liposoluble de un polisorbato vegetal, que la vuelve soluble en agua.

En la actualidad se pueden encontrar gran cantidad de oleorresinas de diversos

vegetales, como pimienta, cilantro, chile, apio, ají, ajo, nuez moscada, capullo

de clavo, cebolla, etc., las cuales se usan especialmente para la fabricación de

alimentos. Su éxito radica en que la industria alimentaria durante los últimos

años, ha aumentado la fabricación de productos cárnicos y platos preparados,

con lo cual, las oleorresinas o extractos de especias han alcanzado cada vez

más relevancia (21).

Las especias naturales así como la tecnología aplicada para la extracción,

cumplen un papel esencial para la evaluación de los extractos de especias. El

contenido de aceites esenciales, es el único criterio de aplicación general para

el análisis de dichos extractos, los cuales se obtienen del extracto por medio de

una destilación continua de vapor de agua (21).

Una de las oleorresinas mas conocidas es la proveniente del pimentón

(Capsicum annuuum L.), la cual se ha obtenido por medio de extracción

soxhlet, comparando los resultados al utilizar diversos solventes apolares así

como las variables en la preparación del material previo a la extracción.

36

Los reportes muestran que se han aplicado análisis fisico-químicos básicos

como son índice de refracción, índices de acidez, saponificación, yodo y

peróxidos. Los análisis instrumentales aplicados han sido la medida del color

(ASTA-20), cromatografía en capa fina (TLC), HPLC y espectrometría de

masas (MS) (22,23).

Además de sus conocidas ventajas para su utilización en alimentos como

condimento y/o agentes con poderes antioxidantes, se han estudiado otros

usos en industrias como la farmacéutica, y en la tinción de telas (22).

La resolución 4241 de 1991 del ministerio de salud publica colombiana (24),

define aspectos básicos de sanidad y calidad de las características de las

especias o condimentos vegetales, contemplando que las oleorresinas de

especias solo pueden ser extraídas de la especia con solventes grado

alimenticio, tales como el hexano y el dicloro-etileno.

En general las condiciones microbiológicas que deben cumplir las especias y

los productos hechos a base de ellas son:

Tabla No. 4: Parámetros microbiológicos de las especias y sus derivados(24).

n m M C

NMP coliformes fecales 3 4 40 1

Esporaz clostridium sulfito reductor/g. 3 100 1.000 1

B. cereus/g 3 100 1.000 1

Hongos y levaduras 3 3.000 5.000 1

Las convenciones utilizadas son:

n = Número de muestras a examinar.

m = índice máximo permisible para identificar nivel de buena calidad.

M = índice máximo permisible para identificar nivel aceptable de calidad.

c = Número máximo de muestras permisibles con resultados entre m y M.

37

Otras normas de generales calidad dictadas por la resolución son:

-Organolépticas: Las propias de cada especia o de sus mezclas.

-Genuinidad: En las especias puras y productos hechos a base de ellas, deberán identificarse los elementos histológicos característicos de cada una de ellas.

Para la incorporación de los extractos y oleorresinas se hace necesario diluirlas

previamente en una sustancia inocua formando emulsiones o dispersiones. Los

extractos se deben conservar protegidos del aire y la luz, así como de perdidas

de color y de procesos oxidativos (21).

Con la estandarización de extractos se puede asegurar un poder

condimentante uniforme, aunque existe la desventaja concerniente al cuidado

de los restos de solventes de extracción, como los hidrocarburos halogenados

que son muy tóxicos y no deben sobrepasar valores residuales de 30 ppm

(0.003%) (21).

2.1.1 LA OLEORRESINA DE AJO

La oleorresina de ajo se ofrece actualmente en el mercado de los derivados de

especias y condimentos. Los extractos de ajo tienen un modo de obtención un

poco diferente, ya que se realiza mediante extracción acuosa y se obtiene un

extracto consistente en azúcar, agua, sustancias minerales, nitrogenadas y

cierto contenido de aroma. El aroma proviene del aceite esencial, el cual se

encuentra en el bulbo de ajo en un 0.5%. Cuando se realiza una evaluación

objetiva del extracto, es importante tener en cuenta el contenido de agua,

azúcar y la composición de los azucares, así, como el contenido de sustancias

aromáticas y colorantes (21).

En los extractos de ajo, el contenido de aceites esenciales es en general muy

bajo, por lo cual la recuperación de dicho aceite por destilación de vapor de

agua y separación cromatográfica subsiguiente no resulta eficaz para su

38

estudio, como si lo es para los demás extractos. Aplicando modificaciones a

dicho método se pueden obtener resultados utilizables que permitan determinar

los componentes volátiles en su totalidad y los grupos individuales de

componentes en forma reproducible (21).

Referencias sobre la extracción de la oleorresina de ajo hablan de una

extracción sólido-liquido en frío, a 75% de etanol y agitación en el proceso,

con un tiempo total de 2 horas, obteniéndose de esta manera un rendimiento

promedio en oleorresina de 28.2% y un contenido en aceite volátil de 0.17%.

Así mismo, en este caso, se ha realizado una caracterización química y se

encontraron buenas propiedades sensoriales(25).

Por otra parte, ensayos de inhibición de microorganismos con componentes

activos del ajo, se han realizado con extractos etanólicos del mismo (14).

39

3. SECCIÓN EXPERIMENTAL

3.1 MATERIAL VEGETAL

Como materiales vegetales de ajo (Allium sativum) a utilizar, se seleccionaron

las variedades de ajo blanco y de ajo morado, por ser estas las mas

comúnmente encontradas en esta región. Los ajos utilizados fueron obtenidos

del comercio normal de vegetales, seleccionando frutos sanos, sin rastros de

plagas, con buen tamaño, dureza y humedad aparente adecuadas.

3.2 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

Los dientes de ajo fueron desligados de la cabeza de ajo, y se les fue retirada

la serie de capas envolventes. Después de esto se procedió al pesaje de 25 g

de dientes de ajo, los cuales fueron macerados y trasladados cuantitativamente

al proceso de extracción.

3.3 SOLVENTES UTILIZADOS

Para las extracciones se usaron los siguientes solventes:

- hexano: 100 mL para cada extracción

- etanol acuoso al 75%: 100 mL para cada extracción

- una mezcla monofásica de hexano: etanol de 95% en proporción 1:1 en

volumen (50 mL de etanol mas 50 mL de hexano).

3.4 EXTRACCIÓN

-Extracción soxhlet: la muestra macerada fue envuelta en papel filtro (110mm

de diámetro de poro), y dispuesta dentro del extractor de 100 mL de capacidad.

40

El condensador utilizado fue de tipo bulbo y el matraz de 250 mL, se utilizó una

manta eléctrica de calentamiento y agua corriente para el condensador.

-Extracción en frío: la muestra macerada y el solvente fueron dispuestos dentro

de un erlenmeyer de 250 ml. La boca de los erlenmeyers fue cubierta con papel

aluminio y se implemento agitación magnética.

Se realizaron todos los procesos extractivos por triplicado con un tiempo de dos

horas cada uno, conjugando las dos variedades de ajo, los tres tipos de

solventes y los dos montajes de extracción.

3.5 SEPARACIÓN DEL EXTRACTO

Al finalizar el tiempo de extracción se comprimió el material vegetal para

recuperar el solvente permeado, luego fue filtrado para retirar partículas

pequeñas arrastradas; el filtrado fue trasladado cuantitativamente a balones

previamente tarados y luego sometido a la separación del solvente y el extracto

por rotaevaporación, utilizando para el fin un equipo de marca HEIDOLPH.

La temperatura de eliminación de solvente estuvo en el rango de 40oC a 45oC,

y las presiones de vacío dependieron del solvente a retirar. Después del

proceso de rotaevaporación, se secaron externamente los balones y

seguidamente fueron pesados junto con el extracto.

3.6 ANÁLISIS FISICO-QUÍMICOS

3.6.1 Materia seca: se utilizo el método gravimétrico, midiendo la masa del

residuo remanente de someter al calor seco de una estufa a 110oC, una masa

pesada de la muestra en una cápsula de porcelana previamente tarada, y

posteriormente la determinación del % de material seco.

3.6.2 Cenizas: Se realizo la cuantificación por el método gravimétrico del

contenido mineral, sometiendo una cantidad de muestra pesada a calcinación

41

controlada en una mufla, a una temperatura de 550ºC, utilizando un crisol con

tapa previamente tarado. El pesaje del residuo permite obtener el % de material

mineral presente en la muestra

3.6.3 Índice de refracción: realizado según Norma ICONTEC 289

3.6.4 Índice de acidez: realizado según la Norma ICONTEC 218, reportando

los resultados como % de ácido oleico

3.7 ANÁLISIS GC/MS

3.7.1 Preparación de la muestra: una muestra de dientes de ajo macerados

se colocó en contacto con etanol al 75% por un tiempo total de una hora,

aplicando agitación. Después de dicho periodo se realizó una filtración del

etanol, tomando una parte del mismo (alrededor de 25 mL), con los cuales se

realizaron extracciones sucesivas liquido-liquido con éter etílico (alrededor de

15 mL). Al final del proceso de extracción se seco el éter etílico con sulfato de

sodio anhidro, y con dicha muestra se realizó el análisis por GC-MS en el

equipo marca SHIMADZU modelo GCMS QP2010.

3.7.2 Condiciones de análisis:

" Temperatura del inyector: 250 oC

" Modo de inyección: Split

" Radio del Split: 1:10

" Temperatura inicial del horno de la columna: 35oC/5 min.

" Rata de cambio de temperatura en el horno: 10oC/min.

" Temperatura final del horno de la columna: 280oC/5 min.

" Gas portador: Helio

" Flujo total: 9.1mL/min.

" Tiempo de análisis: 34 min.

" Detector: espectrómetro de masas

" Modo de ionización: impacto electrónico (70ev)

42

3.8 ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS (24,25)

Las metodologías de análisis para el estudio microbiológico de la oleorresina

de ajo, se basaron en los procedimientos indicados para determinaciones en

alimentos. La oleorresina, aunque fue extraída con un solvente de una

polaridad menor que la del agua, presenta una solubilidad adecuada en dicho

solvente, necesaria para poder realizar los análisis.

La muestra analizada se tomó directa e inmediatamente del balón, después de

terminada la rotaevaporación. Se pesó 1g de la oleorresina y se añadieron

9 mL de agua peptonada estéril (APE), y a partir de esta dilución 10-1 se

prepararon diluciones 10-2, 10-3 y 10-4 para los diferentes análisis.

Los ensayos se realizaron por triplicado y en cámara de flujo laminar que

garantiza un ambiente estéril, así mismo se realizó un control del medio de

cultivo, para observar posibles contaminaciones del mismo. Dentro de los

procesos de preparación de los medios de cultivo y extracción de la

oleorresina, se tomaron las medidas pertinentes para evitar posibles

contaminaciones, como la desinfección del material de vidrio con hipoclorito de

sodio y uso de guantes para la manipulación. No se realizó desinfección de los

dientes de ajo a usar.

3.8.1 Determinación de Mesófilos aerobios viables: se utilizó el método

estándar de recuento en placa y siembra por profundidad. El medio de cultivo

utilizado fue el Agar Nutritivo Standadrd Plate Count (APHA), y la siembra se

realizó tomando 1 mL de cada una de las diluciones (10-1, 10-2, 10-3, 10-4),

vertiéndola en el fondo de la caja de petri y adicionando sobre esta el agar tibio

y líquido con una temperatura de 37oC. Se obtuvo una mezcla homogénea del

agar y la dilución con un movimiento leve en forma de 8. Cumplida la

solidificación del medio, se incubaron las cajas invertidas a 37oC por 24 horas

(incluyendo los controles del medio).

43

3.8.2 Determinación de Mohos y Levaduras: se realizó la preparación de

placas con Agar Saboraud. Se tomaron 0.1 mL de cada dilución (10-1, 10-2, 10-3

y 10-4), y se extendieron por medio de una varilla de jockey (rastrillo), sobre el

Agar solidificado. La incubación se cumplió a 25oC (temperatura ambiente),

por un tiempo de 8 días.

3.8.3 Determinación de Coliformes totales:

" Prueba presuntiva: para el análisis se utilizó el método del número más

probable empleando el medio líquido fluorocult. La siembra se realizó en

tubos de ensayo tapa rosca, en cuyo interior se dispuso una campana

invertida, adicionando a cada tubo 1 mL de las diluciones (10-1, 10-2,

10-3, 10-4). Los tubos se incubaron a 37oC por 24 horas, al final de las

cuales se observó la acumulación o no de gas (CO2) en el interior de la

campana.

" Prueba confirmativa: esta prueba se realizó, cuando los resultados de

la prueba presuntiva dieron positivo, con la acumulación de gas en la

campana. Se tomó 0.1 mL del tubo, y se sembró por superficie sobre el

agar Eosina Azul de Metileno (EMB), y la incubación de las cajas

invertidas se llevó a cabo a 37oC por 24 horas.

3.8.4 Determinación de Coliformes fecales: la presencia de E-coli se

determinó observando los tubos de la prueba presuntiva de coliformes totales,

a la luz UV. La presencia de fluorescencia azul indica que la bacteria está

presente. La fluorescencia se debe a que el cultivo microbiológico contiene el

sustrato fluorógeno 4-metilumbeliferil-#-D-glucurónido (MUG), el cual es

degradado por la enzima #- D- glucuronidaza altamente específica para E- coli;

Se libera el compuesto 4-metilumbeliferona, con fluorescencia azul verdosa al

ser iluminado con luz UV de 366 nm. (18)

44

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1 EXTRACCIÓN DE LA OLEORRESINA

Se llevó a cabo la extracción de la oleorresina utilizando por separado el ajo

morado y el ajo blanco; los dos tipos de extracción: soxhlet y en frío con

agitación; y las tres clases de solvente extractor: etanol 75%, hexano, y la

mezcla etanol 95%-hexano (1:1). Las condiciones de extracción fueron

uniformes, para lograr obtener resultados precisos.

Los solventes fueron elegidos con el fin de probar el nivel de extracción de

componentes del ajo a diferentes polaridades, siendo el menos polar el hexano,

con polaridad media la mezcla de etanol-hexano, y polaridad mayor el etanol al

75%. Aunque la literatura habla de extracciones acuosas de la oleorresina (21),

no se consideraron como solvente extractor el agua o soluciones etanólicas

mas diluidas, ya que la eliminación del solvente es mas difícil (21).

Analizando en primer lugar las diferencias entre las formas de extracción en

cuanto a porcentaje de rendimiento, se observa que en las extracciones

realizadas en frío con agitación el mayor porcentaje se obtuvo con el ajo blanco

con un valor de 31.1774 % (tabla No. 5), en el caso de la extracción en soxhlet

el mayor porcentaje se presentó con el ajo morado con un valor de 14.3678 %

(tabla No. 8).

Respecto a los solventes de extracción, se nota que existe un aumento en el

porcentaje de rendimiento directamente proporcional al aumento de la

polaridad del solvente. En general se observan significativas diferencias entre

los porcentajes de rendimiento obtenidos con etanol al 75 % (polar) y los

obtenidos con hexano (apolar). Los porcentajes obtenidos con la mezcla

45

etanol-hexano tendieron a ocupar valores intermedios. Las mayores diferencias

de rendimientos se presentan en la tabla No.5, en donde el etanol al 75%

extrajo 29,0818 % más que el hexano, y 19,6098 % más que la mezcla etanol-

hexano.

Comparando las dos variedades de ajo, se observa que el ajo blanco presentó

un mejor rendimiento en la extracción en frío que en soxhlet, superándola en

17,5280 %, diferencia tomada entre los mayores porcentajes obtenidos en frío

(tabla No. 5) y en soxhlet (tabla No. 7). Caso contrario ocurrió con el ajo

morado, con el cual se obtuvo un mayor rendimiento en la extracción en

soxhlet, con un incremento en el porcentaje de 4,5322 % respecto a la mejor

extracción en frío (tabla No. 6). Se presentó una significativa diferencia entre

las mayores extracciones a nivel general comparando las dos variedades de

ajo, siendo la mejor para el ajo blanco de 31.1774 % (tabla No. 5) con

extracción en frío y para el ajo morado de 14.3678 % (tabla No. 8) con

extracción soxhlet.

Las características de los extractos fueron muy diferentes, con hexano solo se

recupero un extracto fluido traslucido, con la mezcla hexano-etanol el extracto

era más viscoso y opaco, pero con el etanol al 75% se recuperó un extracto

con una viscosidad mayor que el anterior y completamente opaco. Todos los

extractos presentaron coloraciones amarillas y el olor característico fue mayor

en el extracto en hexano, y muy similar ente los demás extractos.

Por cuestiones de tiempo y disponibilidad de recursos, el único parámetro

válido medible que se tomó en cuenta para la selección de la oleorresina a

analizar fue el porcentaje de rendimiento en extracto; las características físicas

aparentes y el aroma particular a ajo, fueron tomados como factores

secundarios complementarios de diferenciación cualitativa, pero no fueron

definitivos ya que no se realizó análisis alguno de estos aspectos en los

extractos por separado. Además, no se observaron las posibilidades de utilizar

otros solventes de extracción que presentaran inconvenientes de mayor

46

toxicidad como los organoclorados, con costos más elevados o que no

estuvieran reglamentados como solventes de grado alimenticio.

Teniendo en cuenta los anteriores aspectos, la oleorresina seleccionada para

los análisis de caracterización, fue la obtenida del ajo blanco, en frío y con

etanol al 75% como solvente extractor, por presentar el mayor porcentaje de

rendimiento (31.1774 %), buenas características físicas (viscosidad, aroma) y

precisión del método con una baja desviación estándar entre las extracciones

(0.1906).

En la figura siguiente se ilustra el proceso de extracción de dicha oleorresina:

ajo fresco pesaje de 25 g. de dientes maceración de los

de ajo sin cubierta dientes de ajo

análisis de la oleorresina separación del solvente extracción con 100 ml de etanol

y pesaje de la oleorresina 75%, agitación magnética por

2 horas.

Figura No. 3: Extracción de la oleorresina

47

Los resultados obtenidos fueron los siguientes:

Tabla No. 5: Extracción en frío con ajo blanco

Tabla No. 6: Extracción en frío con ajo morado.

Solvente Ensayos

Masa ajo

(g)

Masa

oleorresina

(g)

Rendimiento

(%)

Promedio

(%)

Desviación

estándar

Etanol 75% 1 25,4682 7,8901 30,9802

2 25,1953 7,9014 31,3606 31,1774 0,1906

3 25,1740 7,8521 31,1913

Etanol:Hexano 1 25,4155 3,0798 12,1178

2 25,3341 2,8287 11,1656 11,5676 0,4931

3 25,1931 2,8769 11,4194

Hexano 1 24,9686 0,4982 1,9953

2 25,4780 0,5068 1,9892 2,0956 0,1791

3 24,8485 0,5721 2,3024

Solvente Ensayos

Masa ajo

(g)

Masa

oleorresina

(g)

Rendimiento

(%)

Promedio

(%)

Desviación

estándar

Etanol 75% 1 25,1055 2,4495 9,7568

2 25,6028 2,5642 10,0153 9,8356 0,1560

3 25,1915 2,4523 9,7346

Etanol:Hexano 1 25,2842 1,5205 6,0136

2 25,1436 1,8275 7,2683 7,4869 1,5938

3 25,1069 2,3045 9,1788

Hexano 1 25,2160 0,7409 2,9382

2 25,0345 0,7262 2,9008 2,8066 0,1964

3 25,1508 0,6491 2,5808

48

Tabla No. 7: Extracción soxhlet con ajo blanco

Tabla No. 8: Extracción soxhlet con ajo morado.

Solvente Ensayos

Masa ajo

(g)

Masa

oleorresina

(g)

Rendimiento

(%)

Promedio

(%)

Desviación

estándar

Etanol 75% 1 25,3795 3,5037 13,8052

2 25,3423 3,4569 13,6408 13,6494 0,1517

3 25,3181 3,4185 13,5022

Etanol:Hexano 1 25,2407 1,5559 6,1643

2 25,3108 1,3464 5,3195 5,5980 0,4904

3 25,0869 1,3322 5,3103

Hexano 1 25,0666 0,8344 3,3287

2 25,6245 0,6529 2,5480 2,8768 0,4047

3 25,3660 0,6985 2,7537

Solvente Ensayos

Masa ajo

(g)

Masa

oleorresina

(g)

Rendimiento

(%)

Promedio

(%)

Desviación

estándar

Etanol 75% 1 25,1211 3,6003 14,3318

2 25,3423 3,6554 14,4241 14,3678 0,0494

3 25,3181 3,6325 14,3474

Etanol:Hexano 1 25,0979 1,6305 6,4966

2 25,3675 1,3593 5,3584 6,5883 1,2782

3 25,0735 1,9833 7,9099

Hexano 1 25,1425 0,7373 2,9325

2 25,1732 0,7209 2,8638 2,8633 0,0694

3 25,1964 0,7039 2,7937

49

4.2 ANÁLISIS FISICO-QUÍMICOS

Como caracterización fisico-química general se aplicaron análisis básicos sobre

algunos aspectos del producto. Estos análisis fueron realizados teniendo en

cuenta los reportes existentes sobre evaluaciones objetivas de extractos de ajo

(21), exceptuando el índice de acidez y el índice de refracción.

4.2.1 Índice de acidez: acidez evaluada en esta prueba no se toma como un

indicativo de degradación como sucede con las sustancias de naturaleza

lipídica (grasas y aceites), sino como la presencia de sustancias que producen

acidez y que provienen específicamente del ajo. Posiblemente los

responsables de dicha acidez sean los glucolípidos, fosfolípidos y ácidos

sulfénicos, reportados en estudios de la composición en sustancias azufradas y

ácidos grasos en el ajo (26), y que en parte pueden alcanzar a estar presentes

dentro de la composición química de la oleorresina, ya que estas sustancias

pueden tener una solubilidad parcial en etanol al 75%, a las condiciones de

extracción.

Tabla No. 9: Índice de acidez

4.2.2 Materia seca: los sólidos totales dentro de la composición de la

oleorresina reflejan el grado alto de concentración de material sólido soluble o

en suspensión, que presentaron polaridad suficiente para quedar retenidos en

Ensayos % m/m ácido oleico

1 0,4700

2 0,4730

3 0,4650

Promedio 0,4690

Desviación estándar 0,0040

50

el solvente. Compuestos como, sustancias azufradas, carbohidratos, minerales,

son los que en forma mayoritaria se encuentran formando parte del material

seco total de la oleorresina. Así mismo, la pérdida de peso de debe a la

presencia de un muy buen contenido de sustancias volátiles, además del agua

de hidratación de compuestos, que no alcanza a ser extraída por rota-

evaporación,

Tabla No. 10: Materia seca

4.2.3 Cenizas: la determinación de cenizas en la oleorresina, muestra que bajo

las condiciones de extracción, el solvente es capaz de extraer una importante

cantidad de minerales presentes en el ajo, ya que este vegetal contiene dentro

de su composición de diversos minerales como fósforo y potasio.

Tabla No. 11: Cenizas

Ensayos % m/m Materia seca

1 80,5740

2 80,9260

3 80,9670

Promedio 80,8220


Ensayos % m/m Cenizas

1 3,2210

2 3,2580

3 3,2590

Promedio 3,2460


51

4.2.4 Índice de refracción: el índice de refracción se tomó como un parámetro

físico de caracterización de la oleorresina a la temperatura dada. Así mismo la

medida de los grados Brix (Brix refractométrico) representa la medida del % de

sólidos solubles en la muestra. Con estos parámetros se puede controlar en

forma sencilla la uniformidad alcanzada al obtener la oleorresina.

Tabla No. 12: Índice de refracción y grados Brix

Para los resultados obtenidos en estos análisis no se tienen patrones

cuantitativos de comparación, ya que no se encontraron reportes específicos

sobre el tema, solo los nombres de determinaciones generales aplicables de

acuerdo a la composición química. Tampoco se conoce de normas vigentes

para este tipo de derivados que regulen la caracterización fisico-química

realizada.

4.3 ANÁLISIS GC/MS

El análisis cromatográfico de los compuestos solubles en éter etílico, arrojó el

cromatograma de gases (anexo No. 1), en el cual se observa la presencia de 7

compuestos principales con picos bien definidos, siendo los picos mayoritarios

el tercero (tr =14.678) y cuarto (tr =14.984). Los espectros de masas de cada

sustancia (anexo No. 2) fueron comparados automáticamente con la biblioteca

de espectros de la base de datos del equipo. Los compuestos identificados de

esta manera con sus respectivos % de coincidencia de las rutas son los

Ensayos nD24 Brix

1 1,4755 74,00%

2 1,4755 74,00%

3 1,4750 73,90%

Promedio 1,4753 73,97%

Desviación estándar 0.236*10-3 0.0433

52

siguientes: Disulfuro de dialilo (84%), Trimetil Tiourea (77%), 3-vinil-[4H]-1,2-

Ditiina (91%), 2-vinil-[4H]-1,3-Ditiina (90%), Trisulfuro de dialilo (94%) y 4-metil-

2,6-di-ter-butil fenol (93%). El Tiopentanal no fue identificado por comparación

con la base de datos, ya que el % de coincidencia de la ruta fue de apenas un

67%, por lo que la interpretación de su fragmentograma de masas se llevo a

cabo comparándolo con sustancias anteriormente identificadas en estudios

similares previos de la composición química de volátiles en el ajo (11). Los

tiempos de retención se especifican en la tabla No. 13. La interpretación de los

fragmentos que justifican las sustancias propuestas se describen el la tabla No.

14.

Tabla No. 13: Características de los picos cromatográficos

Compuesto Pico tr Área % de área

Disulfuro de dialilo 1 12.88 1223021 4.95

Trimetil Tiourea 2 13.21 2871109 11.61

3-vinil-[4H]-1,2-Ditiina 3 14.68 2871109 21.19

2-vinil-[4H]-1,3-Ditiina 4 14.98 11337822 45.86

Tiopentanal 5 15.92 735053 2.97

Trisulfuro de dialilo 6 16.03 2150657 8.70

4-metil-2,6-di-ter-butil

fenol 7 18.66 1167049 4.72

! 24722777 ! 100

53

Tabla No. 14: Interpretación de los principales fragmentos de los espectros de masas de cada una de las sustancias presentes en el cromatograma

Pico Catión Radical m/z

% abun

d Fragmento

Pérdida

1

disulfuro de dialilo

113 51

S+

$ HS %.

CH2S

S

CH2

+.

105 37 S+

CH2S

$C3H5 %.

m/z=146 (20%) % coincidencia de ruta: 84% 81 100

SH2+

S

CH3

$C5H5 %.

2 Trimetil Tiourea 103 21CH3

NH NH+

CH2

S

$CH3 %.

NH NCH3CH3

S

CH3 +.

85 16

CH3N

C+

NCH3

CH3

$ HS %.


CH2N S

+

$H2N(CH3)2%.

3 3-vinil-[4H]-1,2-Ditiina 111 100

S

+

$ HS %.

97 61

S+

$ CH2SH %.

SS

CH2

+.


S+

CH2

$ C3H3S %.

54

4 2-vinil-[4H]-1,3-Ditiina 111 46CH2

S+

$ HS %.

S

SCH2

+.

97 17

S+

$ CH2SH %.


SCH2

+

$ C3H4S %.

5

Tiopentanal

CH3S

+.

103 8

CH3SH

+

$ OH %.

OH2

72 100CH2 S

+

$ H2O %.

+

$ C2H6 %.

CH3SH

OH

+.

m/z=120 (90%) 55 35

+CH2C

+CH3

$ H2 %.

+ $H2SCOH%.

6

Trisulfuro de dialilo

CH2

S

SS

CH2 +.

113 67

CH3

S

SSH2

+

$ C5H5 %.


S+

CH2H

$ C3H5S2 %.

55

7 4-metil-2,6-diterbutil fenol 205 100

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

OH

CH3

$ CH3 %.

OH

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

+.

91 5

C+

H

$ C8H17O %.


CH2O

+H

$ C12H19 %.

En estudios realizados de los componentes del aroma en el ajo (11), aparecen

reportados los compuestos: Disulfuro de Dialilo, 3-vinil-[4H]-1,2-Ditiina, 2-vinil-

[4H]-1,3-Ditiina y Trisulfuro de dialilo. En dicho estudio también aparece

reportado el tiopropanal, pero no el tipoentanal encontrado en la muestra.

Por otro lado no se han encontrado reportes exactos sobre la composición en

fenoles y sustancias nitrogenadas (14,22) diferentes a los aminoácidos en el ajo,

pero en la muestra se identificaron la trimetil tiourea y el 4-metil-2,6-di-ter-butil

fenol. Es de resaltar que la alicina, componente azufrado mas importante, no

se detectó en el análisis de forma directa; sin embargo, como en estudios

anteriores, se detectaron las sustancias: 3-vinil-[4H]-1,2-Ditiina, 2-vinil-[4H]-1,3-

Ditiina en altas proporciones y otros compuestos azufrados, los cuales son el

resultado de una rápida degradación de la alicina a las condiciones del GC (11).

56

S+

SC H 2

CH 2

O-

H

SCH 2 O H

+

S

C H 2

S+

SC H 2

CH 2

O-

HS

O HCH 2

+ +

+S

C H 2

OH 2S

C H 2

OH

SCH 2

H

S

SC H 2

AlicinaÁcido 2 -propenosulfénico

Tioacroleina

SS

CH 2

2 -v in y l -4 H -1 ,3 -d i th i in e3 -v in y l -3 ,4 -d ih y d ro -1 ,2 -d i th i in e

Figura No. 4: Degradación de la alicina en Ditiinas(8)

4.4 ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS

Los análisis microbiológicos básicos aplicados a la oleorresina de ajo, son los

que se realizan en forma general sobre alimentos para evaluar su inocuidad.

Se consideraron adecuados ya que la aplicación principal de la oleorresina de

ajo es como agente natural de sabor y/o olor en la industria alimentaria. Los

análisis fueron llevados a cabo bajo procedimientos estándar y con oleorresina

recién extraída. Las diluciones se llevaron desde 100 hasta 10-4 por la

incertidumbre en el nivel de contaminación de la muestra.

4.4.1 Análisis de Mesófilos, mohos y levaduras: como se observa en las

tablas No. 15 y 16, los resultados no muestran la presencia en la oleorresina

fresca de microorganismos mesófilos, mohos o levaduras.

Tabla No. 15: Recuento de mohos y levaduras:

Recuento (Ensayos)

Dilución 1 2 3

Recuento estándar en placa UFC/g

Pura 0 0 0 0

10-1 0 0 0 0

10-2 0 0 0 0

10-3 0 0 0 0

10-4 0 0 0 0

57

Tabla No. 16: Recuento de mesófilos aerobios viables

4.4.2 Determinación de coliformes totales y coliformes fecales E-coli: al

realizar el análisis de coliformes totales, en la prueba presuntiva, la

acumulación de gas en la campana invertida en casi todas las diluciones,

evidenció una alta contaminación en la oleorresina (tabla No. 17), razón

suficiente para obviar la prueba confirmativa. La determinación de coliformes

fecales-E-coli por fluorescencia UV, mostró un nivel importante de

contaminación de la oleorresina en todas las diluciones (tabla No. 18). El

recuento microbiológico para las dos pruebas anteriores se llevó a cabo de

acuerdo a la tabla estadística de número más probable (NMP) estandarizada (29), arrojó valores de recuento mayor a 1100, valor que sobrepasó la

normatividad vigente (24).

Esta alta contaminación se presentó, debido a que el material vegetal no fue

desinfectado en forma previa a la extracción, y su contaminación provino de su

forma propia de cultivo, almacenamiento, transporte y/o manipulación antes de

ser elegidos y tratados para el proceso de extracción. Teniendo presente que

el ajo no tiene propiedades bactericidas, sino propiedades bacteriostáticas, es

decir, no elimina los microorganismos sino que impide su crecimiento, la alta

contaminación indica que la carga contaminante superó el poder inhibitorio de

los componentes en la oleorresina. Este hecho no es evidencia de pérdida de

Recuento (Ensayos)

Dilución 1 2 3

Recuento estándar en placa UFC/g

Pura 0 0 0 0

10-1 0 0 0 0

10-2 0 0 0 0

10-3 0 0 0 0

10-4 0 0 0 0

58

poder inhibitorio en la oleorresina, ya que esto ocurre normalmente cuando

existe una desproporción en la relación carga contaminante y concentración de

compuestos inhibitorios en cualquier tipo de compuesto con estas propiedades.

Se procedió entonces a realizar un segundo análisis de coliformes, añadiendo

una desinfección de los dientes de ajo sin cubierta, utilizando una solución de

hipoclorito de sodio con un aporte de concentración de cloro disponible como

Cl2 de 150 ppm, por aproximadamente 5 minutos en tiempo de contacto (27,28) y

enjuague con agua destilada antes de realizar el proceso de extracción, y

conservando las mismas medidas higiénicas en los procedimientos de

extracción y sembrado de los anteriores análisis. En este caso, los resultados

mostraron una total eliminación de la contaminación en la oleorresina, al

presentarse una resultado negativo de presencia de coliformes en la prueba

presuntiva tanto a las 24 como al las 48 horas (tabla No. 19). Así mismo, no se

detectaron coliformes fecales a las 24 horas de la siembra microbiológica (tabla

No. 20). Bajo el método del NMP, el recuento arrojó un valor menor a 3, con lo

que se cumple la normatividad (24).

Tabla No. 17: Prueba presuntiva (sin desinfección previa del material vegetal)

Acumulación de gas

(Ensayos)

Dilución 1 2 3

Pura

10-1

10-2

10-3

10-4 x x

Recuento NMP >1100

59

Tabla No. 18: Determinación de Coliformes fecales (sin desinfección previa del material

vegetal)

Tabla No. 19: Prueba presuntiva (con desinfección previa del material vegetal)

Fluorescencia azul al UV (Ensayos)

Dilución 1 2 3

Pura

10-1

10-2

10-3

10-4

Recuento NMP >1100

Acumulación de gas

(Ensayos) Dilución 1 2 3

Pura x x x

10-1 x x x

10-2 x x x

10-3 x x x

10-4 x x x

Recuento NMP <3

60

Tabla No. 20: Determinación de Coliformes fecales (con desinfección previa del material

vegetal)

Fluorescencia azul al UV (Ensayos)

Dilución 1 2 3

Pura x x x

10-1 x x x

10-2 x x x

10-3 x x x

10-4 x x x

Recuento NMP <3

61

5. CONCLUSIONES

1. De acuerdo con la comparación de los resultados de las extracciones

efectuadas a diferentes condiciones, se encontró que el mayor

rendimiento de extracción de la oleorresina, se obtuvo en la realizada en

frío, con etanol al 75% y ajo blanco, con un rendimiento promedio de

31.18% y desviación de 0.1906, por lo cual el método presenta un buen

nivel de extracción, comparado con rendimientos en anteriores estudios

de extracción con etanol al 95% (25), además de buena precisión,

haciéndolo adecuado para próximos estudios de estandarización y

posibles aplicaciones industriales.

2. Siendo la oleorresina una mezcla compleja; el tipo y cantidad de análisis

a realizar se ven restringidos a determinaciones generales aplicadas a

alimentos. En este caso se determinaron la acidez con un valor de

0.469% en ácido oleico, 80.82% en materia seca, 3.25% en cenizas,

índice de refracción nD24 =1.4753 y grados brix (sólidos totales) de

73.97%, valores que sirven como referencia de sus características

físicas y químicas medibles en forma directa, los cuales pueden ser

tomados como referencia para posteriores estandarizaciones.

3. El análisis por GC-MS de la fracción volátil soluble en etanol al 75% y

separada en éter etílico, muestra la presencia, entre otros, de

importantes compuestos azufrados como los alil-sulfuros y las ditiinas,

compuestos responsables de la mayoría de las propiedades salutíferas

y organolépticas del ajo. Como es de suponer, la oleorresina contiene en

forma concentrada las sustancias de verdadero interés del ajo, por lo

que una pequeña fracción reemplaza ampliamente una cantidad

proporcionalmente mayor de dientes de ajo sin procesar, ofreciendo

62

ventajas en la rapidez al momento de su uso, mayor durabilidad y por su

completa dispersión no genera residuos sólidos insolubles. Teniendo en

cuenta lo anterior y conociendo que su extracción es razonablemente

económica, la relación costo-beneficio hace viable su obtención.

4. La evaluación de la inocuidad de la oleorresina recién extraída, muestra

importantes resultados al no presentar evidencia de microorganismos

mesófilos, mohos o levaduras, que puedan alterar fácilmente la

oleorresina. Por otro lado, la desinfección adecuada del material vegetal

garantiza la no presencia de coliformes totales y fecales. Estos

resultados aseguran que la oleorresina puede ser usada para el

consumo en forma segura.

5. En general, el método de extracción de la oleorresina proporciona un

buen rendimiento en extracto y no presenta grandes inconvenientes en

la manipulación, además, tiene características fisico-químicas,

microbiológicas y fuerte esencia característica del ajo, que pueden

favorecer su implementación en la industria alimentaria.

63

6. RECOMENDACIONES

1. Evaluar la composición y proporción de los azúcares presentes en la

oleorresina, mediante métodos adecuados, teniendo en cuenta a

complejidad química de la oleorresina.

2. Evaluar la posible presencia de sustancias lipídicas o aceite esencial en

la oleorresina de ajo.

3. Analizar fracciones de la oleorresina solubles en solventes de diversa

polaridad, para detectar más componentes químicos extraídos del ajo,

incluyendo sustancias minerales y compuestos azufrados.

4. Al realizar la extracción de la oleorresina con fines de obtener un

producto adecuado para su utilización en alimentos, se recomienda,

realizar una desinfección previa al material vegetal a utilizar, por su alta

exposición a las contaminaciones microbianas, tomando precauciones

respecto a la concentración del desinfectante y el tiempo de contacto,

con el fin de prevenir su absorción por parte del material vegetal.

5. Implementar un diseño de experimento en posteriores ensayos de

extracción, que garantice un mayor control matemático de las

condiciones de ensayo y de los valores obtenidos, lo cual permita tomar

determinaciones basados en varios parámetros medibles.

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8. ANEXOS

8.1 CROMATOGRAMA DE GASES DE VOLÁTILES EN LA OLEORRESINA.

70

8.2 FRAGMENTOGRAMAS DE MASAS DE LAS SUSTANCIAS SEPARADAS

POR GC.

71

72

73

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OBTENCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LA OLEORRESINA DEL AJO