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UNIVERSIDAD DE CHILE Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas
POLIMORFISMOS EN EL GEN DE LA
DESHIDROGENASA ALCOHÓLICA 1C ( ADH1C)
AUMENTAN EL RIESGO DE ALCOHOLISMO
EN LA POBLACIÓN CHILENA
MEMORIA PARA OPTAR AL TÍTULO DE
QUÍMICO FARMACÉUTICO
JAVIER HUMBERTO WOLNITZKY WENK
Directores de Memoria Prof. Dr. Yedy Israel Jacard Dra. Amalia Sapag Muñoz de la Peña
Patrocinante Prof. Dr. Yedy Israel Jacard
Lugar de realización Laboratorio de Farmacoterapia Génica
Departamento de Química Farmacológica y Toxicológica Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas
Universidad de Chile
Santiago, Chile 2008
Esta memoria de título se realizó con el financiamiento del Instituto Milenio de
Dinámica Celular y Biotecnología (ICM P05-001-F) y, a la fecha, ha dado origen a las
siguientes comunicaciones:
Wolnitzky J, Sapag A, González MI, Herrera L, Israel Y.
El genotipo de la deshidrogenasa alcohólica (ADH1C) modifica el riesgo de
alcoholismo en la población chilena y predice la respuesta aversiva de la reacción
alcohol-disulfiram (Panel)
V Taller de Jóvenes Científicos de la Iniciativa Científica Milenio
El Quisco, Chile, 27-29 de Agosto de 2008
Wolnitzky J, Sapag A, González MI, Israel Y.
Polimorfismos de la deshidrogenasa alcohólica predicen efecto aversivo de la reacción
alcohol-disulfiram (Panel)
IX Jornadas de Investigación en Ciencia y Tecnología
Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Universidad de Chile.
Santiago, Chile, 22 de Abril de 2008
Wolnitzky J, Sapag A, González MI, Herrera L, Israel Y.
El alelo ADH1C*1 de la deshidrogenasa alcohólica es protector contra el alcoholismo
en la población chilena (Panel)
XXX Reunión Anual de la Sociedad de Bioquímica y Biología Molecular de Chile
Chillán, Chile, 25-28 de Septiembre de 2007
Libro de resúmenes, pág. 61, Nº 67.
Wolnitzky J, Sapag A, González MI, Herrera L, Israel Y.
Estudio de las frecuencias alélicas del gen de la deshidrogenasa alcohólica ADH1C
codificante de isoenzimas rápidas y lentas en la población chilena: Protección contra el
alcoholismo (Panel)
VIII Jornadas de Investigación en Ciencia y Tecnología
Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Universidad de Chile.
Santiago, Chile, 03 de Abril de 2007
...“si extraje la miel o la hiel de las cosas,
fue porque en ellas puse hiel o mieles sabrosas:
cuando planté rosales, coseché siempre rosas”...
Amado Nervo
En paz (fragmento)
AGRADECIMIENTOS
Quiero agradecer en primer lugar a mi mamá, Elisabeth Wenk Wehmeyer, y a mi papá,
Humberto Wolnitzky Reyes, por su apoyo incondicional, su paciencia y amor infinitos.
Espero hacerlos sentir orgullosos. Quiero agradecer a mi hermana Isabel (“Chabe”) por
ser siempre un gran apoyo, por ser mi primer equipo y ayudarme a formar mi carácter.
Agradezco a mis directores de memoria, Prof. Dr. Yedy Israel Jacard y Dra. Amalia
Sapag Muñoz de la Peña, por aceptarme como memorista en su laboratorio, por su
dedicación, por tenerme paciencia y fe, y por la formación invaluable que me han dado.
Lo que he aprendido y vivido junto a Uds. lo atesoraré siempre con mucho cariño.
Le agradezco a mi polola, Yanina Castro Sariego, por el amor y ternura que me
entrega día a día y por el inmenso apoyo que ha significado para mí durante este
ajetreado período como memorista. Gracias por ayudarme siempre a ver las cosas
desde otro punto de vista. Te amo.
Quiero agradecer a mis grandes amigos de la vida: Cristián Guiñez, Jorge Clarke,
Pablo Marambio y, en especial, a mi mejor amigo Ignacio Beros Contreras. No saben lo
importantes que son para mí.
Agradezco a mis compañeros y amigos de carrera y facultad: Daniel “Grem” Vásquez,
Catalina “Cata” González, Andrea Cardona, Daniela Bracchitta, Johann “Johita”
Kosche, Francisco “Pancho” González, Esteban “Daño” Jeldres, Rodrigo ”Ruli” Gil,
Cristián Poblete, Jaime “Versuit” Salazar, Andrés “Oso” Jeanmarie, Joaquín
“Sanguchero” Prieto y Octavio “Huevo” Farías. Gracias por compartir conmigo
momentos tan gratos durante todos estos años. Su apoyo y compañía han sido
fundamentales en mi carrera y en mi vida.
Agradezco muy especialmente a mis compañeros y amigos de laboratorio, que han
llegado a ser mi segunda familia: Ginez González, Gonzalo Encina, Mario Rivera,
Robel Vásquez, Gabriel Cortínez, Lorena Lobos, Paula Ocaranza, Daniella Maureira,
Tamara García, Thergiory Irrazábal, Benjamín Erranz, Giugliana Campos, Casilda
Mura y Fernando Ezquer. Gracias por acompañarme tan gratamente en el diario vivir y
por constituir un gran aporte a mi formación como científico.
Quiero agradecer especialmente a mi profesor de química y biología de la educación
media, Guillermo Calderón López, por despertar en mí un profundo interés y pasión por
la ciencia y por jugar un rol determinante en mi elección profesional y, finalmente, en mi
futuro.
Finalmente, y no por eso menos importante, quiero agradecer a la música y, en
particular, a las bandas que integré durante el período de mi carrera: Latir y Sangre
Aborigen. Gracias por permitirme mantener mi salud mental y emocional. Sin la música
simplemente no podría vivir.
i
ÍNDICE GENERAL página
ÍNDICE GENERAL .................................................................................................... i ÍNDICE DE TABLAS ............................................................................................... iv ÍNDICE DE FIGURAS ..............................................................................................v ABREVIATURAS .................................................................................................... vi RESUMEN.............................................................................................................. vii SUMMARY .............................................................................................................. ix
1. INTRODUCCIÓN......................................................................................................1 1.1. Deshidrogenasa alcohólica (ADH) ............................................................................3 1.2. Distribución poblacional ............................................................................................6 1.3. Métodos de genotipificación .....................................................................................8 1.4. Polimorfismos adicionales en los genes ADH1C y ADH1B .......................................9 2. HIPÓTESIS ............................................................................................................10 3. OBJETIVOS ...........................................................................................................10 3.1. Objetivo general .....................................................................................................10 3.2. Objetivos específicos..............................................................................................10 4. MATERIALES ........................................................................................................11 4.1. Población alcohólica ...............................................................................................11 4.2. Consentimiento informado ......................................................................................11 4.3. Población chilena general.......................................................................................11 4.4. Sangre de pacientes alcohólicos ............................................................................12 4.5. DNA de la muestra de población chilena general....................................................12 4.6. Oligonucleótidos .....................................................................................................12 4.7. Enzimas..................................................................................................................15 4.8. Reactivos y materiales generales ...........................................................................15 4.9. Soluciones para electroforesis ................................................................................16 4.10. Soluciones para extracción de DNA........................................................................16
5. MÉTODOS .............................................................................................................17 5.1. Purificación de DNA nuclear de sangre humana.....................................................17 5.2. Genotipificación de las muestras ............................................................................18
5.2.1. Comprobación de la identidad de los amplicones de PCR ..........................19 5.3. Determinación del genotipo de la ADH1C mediante PCR-RFLP.............................23
5.3.1. Determinación de la identidad del nt 11939 (aa 271) del gen ADH1C (exón 6).......................................................................................................24
5.3.2. Determinación de la identidad del nt 15115 (aa 349) del gen ADH1C (exón 8).......................................................................................................25
5.4. Determinación del genotipo de la ADH1B mediante PCR-RFLP.............................25 5.4.1. Determinación de la identidad del nt 5191 (aa 47) del gen ADH1B
(exón 3).......................................................................................................27 5.4.2. Determinación de la identidad del nt 15494 (aa 369) del gen ADH1B
(exón 9).......................................................................................................27
ii
5.5. Análisis estadístico .................................................................................................28 5.6. Estudios Adicionales: otros polimorfismos en el exón 8 del gen ADH1C ................29
5.6.1. Determinación de la identidad del nt 15057 del gen ADH1C .......................30 5.6.2. Determinación de la identidad T del nt 15115 (aa 349) del gen ADH1C ......30 5.6.3. Determinación de la identidad del nt 15121 (aa 351) del gen ADH1C .........31
5.7. Estudios Adicionales: otros polimorfismos en el exón 3 del gen ADH1B.................32 5.7.1. Determinación de la identidad del nt 5219 (aa 56) del gen ADH1B .............32 5.7.2. Determinación de la identidad del nt 5226 (aa 59) del gen ADH1B .............32
5.8. Secuenciación ........................................................................................................33 5.9. Análisis de secuencias............................................................................................34
6. RESULTADOS .......................................................................................................35 6.1. Obtención de DNA de sangre de pacientes alcohólicos..........................................35 6.2. Diseño del método de genotipificación....................................................................35
6.2.1. Diseño de partidores de PCR......................................................................36 6.2.2. Enzimas utilizadas en la genotipificación mediante PCR-RFLP...................41
6.3. Determinación del genotipo de la ADH1C mediante PCR-RFLP.............................41 6.3.1. Identidad del nucleótido 11939 (aa 271) del gen ADH1C (exón 6) ..............42 6.3.2. Identidad del nucleótido 15115 (aa 349) del gen ADH1C (exón 8) ..............46
6.4. Determinación del genotipo de la ADH1B mediante PCR-RFLP.............................46 6.4.1. Identidad del nucleótido 5191 (aa 47) del gen ADH1B (exón 3) ..................47 6.4.2. Identidad del nucleótido 15494 (aa 369) del gen ADH1B (exón 9) ..............47
6.5. Análisis estadístico de la comparación entre pacientes alcohólicos y población chilena general .......................................................................................................49 6.5.1. Frecuencias de los alelos ADH1C*1 y ADH1C*2.........................................49 6.5.2. Frecuencias alélicas del gen ADH1B...........................................................50 6.5.3. Frecuencias genotípicas del gen ADH1C ....................................................50 6.5.4. Modelos de dominancia y recesividad para los alelos del gen ADH1C........52
6.6. Comparación de frecuencias alélicas de los genes ADH1C y ADH1B con otras poblaciones....................................................................................................53
6.7. Determinaciones nucleotídicas adicionales en el exón 8 del gen ADH1C ...............53 6.7.1. Identidad del nucleótido 15057 del gen ADH1C ..........................................55 6.7.2. Identidad T del nucleótido 15115 (aa 329) del gen ADH1C .........................55 6.7.3. Identidad del nucleótido 15121 (aa 351) del gen ADH1C ............................55 6.7.4. Análisis estadístico del efecto en el riesgo de alcoholismo del
polimorfismo exclusivo de población nativa de América ..............................58 6.8. Determinaciones nucleotídicas adicionales en el exón 3 del gen ADH1B ...............61
6.8.1. Identidad del nucleótido 5219 (aa 56) del gen ADH1B ................................61 6.8.2. Identidad del nucleótido 5226 (aa 59) del gen ADH1B ................................61 6.8.3. Nueva mutación encontrada en el nucleótido 15490 (aa 367) del
gen ADH1B (exón 9) ...................................................................................63 6.9. Genotipos combinados de los genes ADH1C y ADH1B..........................................65 6.10. Secuenciación ........................................................................................................65
7. DISCUSIÓN............................................................................................................68 7.1. De los resultados obtenidos....................................................................................68 7.2. De los métodos utilizados .......................................................................................69 7.3. De las enzimas utilizadas en la genotipificación mediante PCR-RFLP ...................71
iii
7.4. De las muestras utilizadas ......................................................................................72 7.5. Del análisis estadístico ...........................................................................................72 7.6. De las posiciones nucleotídicas analizadas adicionalmente ...................................74 7.7. De las bases de datos consultadas.........................................................................76 7.8. De las proyecciones ...............................................................................................77 8. CONCLUSIONES ...................................................................................................79 9. REFERENCIAS ......................................................................................................80 10. ANEXO Consentimiento informado ........................................................................87
iv
ÍNDICE DE TABLAS página
Tabla 1 Isoenzimas de la ADH humana.................................................................4 Tabla 2 Polimorfismos codificantes en los genes ADH1C y ADH1B analizados
en esta memoria.......................................................................................5 Tabla 3 Amplicones del gDNA de ADH1C y oligonucleótidos usados en su
generación .............................................................................................13 Tabla 4 Amplicones del gDNA de ADH1B y oligonucleótidos usados en su
generación .............................................................................................14 Tabla 5 Enzimas de restricción utilizadas en la identificación de amplicones del
gen ADH1C ............................................................................................20 Tabla 6 Enzimas de restricción utilizadas en la identificación de amplicones del
gen ADH1B ............................................................................................21 Tabla 7 Partidores de PCR descritos en la literatura para la amplificación del
exón 8 del gen ADH1C...........................................................................38 Tabla 8 Partidores de PCR descritos en la literatura para la amplificación del
exón 3 del gen ADH1B ...........................................................................39 Tabla 9 Partidores de PCR descritos en la literatura para la amplificación del
exón 9 del gen ADH1B ...........................................................................40 Tabla 10 Alelos de los genes ADH1C y ADH1B en pacientes alcohólicos y
población general ...................................................................................43 Tabla 11 Genotipos de la ADH1C y la ADH1B de pacientes alcohólicos y
población general ...................................................................................44 Tabla 12 Diferencias significativas en las frecuencias genotípicas del gen
ADH1C entre pacientes alcohólicos y población general........................51 Tabla 13 Alelos de los genes ADH1C y ADH1B en pacientes alcohólicos y
población general incluyendo posiciones nucleotídicas analizadas adicionalmente .......................................................................................56
Tabla 14 Genotipos de la ADH1C y la ADH1B de pacientes alcohólicos y
población general detallando alelos no convencionales .........................57 Tabla 15 Análisis estadístico del efecto del alelo ADH1C*2Thr351 .......................60 Tabla 16 Genotipos combinados de la ADH1C y la ADH1B de pacientes
alcohólicos y población general detallando alelos no convencionales ....66 Tabla 17 Genotipos combinados de la ADH1B y la ADH1C de pacientes
alcohólicos y población general detallando alelos no convencionales ....67
v
ÍNDICE DE FIGURAS página
Figura 1 Identificación de los amplicones del gen ADH1C..................................20 Figura 2 Identificación de los amplicones del gen ADH1B ..................................21 Figura 3 Identidades de los nucleótidos 11939 (exón 6) y 15115 (exón 8) del
gen ADH1C ..........................................................................................45 Figura 4 Identidades de los nucleótidos 5191 (exón 3) y 15494 (exón 9) del
gen ADH1B ..........................................................................................48 Figura 5 Identidades de los nucleótidos 15057, 15115 y 15121 del gen ADH1C
(adicionales) .........................................................................................54 Figura 6 Identidades de los nucleótidos 5219 y 5226 del gen ADH1B
(adicionales) .........................................................................................62 Figura 7 Nueva mutación encontrada en la posición 15490 del gen ADH1B ......64
vi
ABREVIATURAS
aa: aminoácido
ADH: deshidrogenasa alcohólica
ALDH2: deshidrogenasa aldehídica mitocondrial
BSA: seroalbúmina bovina (del inglés “bovine serum albumin”)
DNA: ácido desoxirribonucleico (del inglés “deoxyribonucleic acid”)
EDTA: etilendiaminotetraacetato
gDNA: ácido desoxirribonucleico genómico
IC: intervalo de confianza
Km: constante de Michaelis-Menten
NAD+: nicotinamida adenina dinucleótico (cofactor oxidado)
NADH: nicotinamida adenina dinucleótido (cofactor reducido)
nt: nucleótido
OR: razón de proporciones (del inglés “odds ratio”)
pb: pares de bases
PCR: reacción en cadena de la polimerasa (del inglés “polymerase chain reaction”)
RFLP: polimorfismo de largo de fragmento de restricción (del inglés “restriction
fragment length polymorphism”)
SNP: polimorfismo de un nucleótido (del inglés “single nucleotide polymorphism”)
TAE: tampón para electroforesis (Tris-acetato-EDTA)
TBE: tampón para electroforesis (Tris-borato-EDTA)
TE: tampón para disolución y almacenamiento de DNA (Tris-EDTA)
TKM1: tampón para extracción de sangre (Tris-K-Mg-EDTA)
TKM2: tampón salino para extracción de sangre (Tris-K-Mg-EDTA-NaCl)
Tm: temperatura media de apareamiento
vii
RESUMEN
El riesgo individual de alcoholismo tiene un componente hereditario de 40 a 60%. Los
únicos factores genéticos bien establecidos para una susceptibilidad diferenciada al
alcoholismo son polimorfismos en los genes de las principales enzimas del
metabolismo del etanol, la deshidrogenasa alcohólica (ADH) y la deshidrogenasa
aldehídica mitocondrial (ALDH2). Las variantes polimórficas de estas enzimas difieren
en sus propiedades catalíticas y en sus distribuciones étnicas.
El etanol es metabolizado en el hígado a acetaldehído por la ADH y luego a acetato por
la ALDH2. En portadores de una ALDH2 inactiva (ALDH2*2) el acetaldehído, en lugar
de degradarse, se acumula en el cuerpo produciendo reacciones desagradables que
evitan una ingesta excesiva de alcohol. Se postula que los portadores de las variantes
rápidas de la ADH (ADH1C1, ADH1B2) también experimentan un alza de acetaldehído
corporal luego de consumir etanol, teniendo así una protección genética contra el
alcoholismo. En contraste, los portadores de las ADHs lentas (ADH1C2 o ADH1B1) o
de la ALDH2 de gran actividad (ALDH2*1) tienen un mayor riesgo de alcoholismo.
La variante inactiva de la ALDH2 (ALDH2*2) es exclusiva de la población del este de
Asia (40%), que tiene además frecuencias altas de los alelos protectores ADH1C*1
(90%) y ADH1B*2 (70%), mientras que las poblaciones caucásicas tienen frecuencias
menores de estos alelos (50% y 5%, respectivamente).
Para determinar si los alelos ADH1C*2 o ADH1B*1 de la deshidrogenasa alcohólica
(ADHs lentas) aumentan el riesgo de alcoholismo en la población chilena se
determinaron los genotipos de la ADH1C y la ADH1B en pacientes alcohólicos (n = 30)
y población chilena general (n = 105). Se amplificaron segmentos específicos de estos
genes utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se analizaron las
variaciones codificantes de cambios aminoacídicos mediante digestión con enzimas de
restricción, separando los fragmentos resultantes por tamaño mediante electroforesis
(RFLP). Se evaluó la significación estadística de las diferencias encontradas entre los
grupos en las frecuencias alélicas y genotípicas de los genes ADH1C y ADH1B.
viii
La frecuencia del alelo ADH1C*2 es significativamente mayor (p < 0,04) en pacientes
alcohólicos (0,40) que en la población general (0,26), aumentando casi al doble el
riesgo de alcoholismo (OR = 1,96) respecto del alelo ADH1C*1. La frecuencia
genotípica de los homocigotos ADH1C*2/*2 es también mayor (p < 0,05) en pacientes
alcohólicos (0,14) que en la población general (0,07), teniendo estos individuos un
riesgo de alcoholismo casi cuatro veces mayor (OR = 3,85) que los homocigotos
ADH1C*1/*1. Las frecuencias del alelo ADH1B*1 son prácticamente idénticas en
ambos grupos (alrededor de 0,95), haciendo imposible determinar si éste aumenta el
riesgo de alcoholismo en la población chilena, dado el tamaño muestral empleado.
Se analizaron cinco variaciones nucleotídicas adicionales, lo que permitió encontrar en
la población chilena una variante del alelo ADH1C*2 exclusiva de la población nativa
de América (ADH1C*2Thr351) y describir por primera vez la existencia de dos
variantes nuevas del alelo ADH1B*1. La variante ADH1B*1Ser59 incorpora un
polimorfismo (A5226T) antes reportado aisladamente y la variante ADH1B*1Arg367
incorpora una mutación encontrada aquí (T15490G). No se encontró evidencia de que
estas variantes modifiquen el riesgo de alcoholismo en la población chilena, pero sí se
encontró una tendencia hacia un riesgo aumentado de alcoholismo para el alelo
ADH1C*2Thr351, al compararlo con los alelos ADH1C*1 y ADH1C*2 en conjunto.
A partir de los resultados de esta memoria se pueden emitir tres conclusiones. (I) El
alelo ADH1C*2 y el genotipo ADH1C*2/*2 aumentan el riesgo de alcoholismo en la
población chilena respecto del alelo ADH1C*1 y el genotipo ADH1C*1/*1. (II) El
genotipo de la ADH1C se puede determinar analizando sólo la posición nucleotídica
11939 (aa 271) y no la posición 15115 (aa 349), ya que sus identidades están
perfectamente asociadas (11939A / 15115G y 11939G / 15115A) y porque el análisis
de la posición nucleotídica 11939 tiene una mayor fortaleza en su diseño experimental
por a) tener reacciones positivas para las dos identidades nucleotídicas (A y G) de esta
posición y b) determinar un cambio aminoacídico de mayor importancia por
encontrarse en el sitio activo de la enzima. (III) El genotipo de la ADH1B puede ser
excluido del análisis del aumento del riesgo de alcoholismo conferido por las variantes
lentas de la ADH en la población chilena porque su diferencia entre grupos es mínima.
ix
SUMMARY
“Polymorphisms in the alcohol dehydrogenase 1C gene (ADH1C) increase the
risk of alcoholism in the Chilean population” The individual risk of alcoholism has a hereditary component of 40 to 60%. The only
well established genetic factors determining a differential susceptibility to alcoholism are
polymorphisms in the genes of the two main enzymes of ethanol metabolism, alcohol
dehydrogenase (ADH) and mitochondrial aldehyde dehydrogenase (ALDH2). The
polymorphic variants of these enzymes differ in their catalytic properties and in their
ethnic distributions.
Ethanol is metabolized in the liver into acetaldehyde by ADH and subsequently to
acetate by ALDH2. In individuals carrying an inactive ALDH2 (ALDH2*2) acetaldehyde
accumulates in the body, instead of being degraded, and produces unpleasant
reactions avoiding an excessive ethanol intake. It has been postulated that carriers of
the fast ADH variants (ADH1C1, ADH1B2) also experience an acetaldehyde increase
after consuming ethanol, having therefore a genetic protection against alcoholism. In
contrast, individuals carrying the slow ADHs (ADH1C2 or ADH1B1) or the highly active
ALDH2 (ALDH2*1) have a higher risk of alcoholism.
The inactive variant of the ALDH2 (ALDH2*2) is found exclusively in the East Asian
population (40%), which has high frequencies of the protective alleles ADH1C*1 (90%)
and ADH1B*2 (70%), while Caucasian populations have lower frequencies of these
alleles (50% and 5%, respectively).
To determine if alleles ADH1C*2 or ADH1B*1 of ADH genes (slow enzymes) increase
the risk of alcoholism in the Chilean population, the ADH1C and ADH1B genotypes
were determined in alcoholic patients (n = 30) and in the Chilean general population
(n = 105). Specific segments of these genes were amplified by the polymerase chain
reaction (PCR) and the nucleotide variations encoding amino acid changes were
analyzed by digestion with restriction enzymes, separating the resulting fragments by
electrophoresis (RFLP). The statistical significance of the differences between groups
was evaluated for the allelic and genotypic frequencies of ADH1C and ADH1B.
x
The ADH1C*2 allele has a significantly higher frequency (p < 0.04) in alcoholic patients
(0.40) than in the general population (0.26), increasing to nearly double the risk of
alcoholism (OR = 1.96) when compared to the ADH1C*1 allele. The genotypic
frequency of homozygous ADH1C*2/*2 is also higher (p < 0.05) in alcoholic patients
(0.14) than in the general population (0.07), having these individuals a risk of
alcoholism almost four times higher (OR = 3.85) than ADH1C*1/*1 homozygotes. The
ADH1B*1 allele has virtually identical frequencies between groups (about 0.95), making
it impossible to determine if it increases the risk of alcoholism in the Chilean population,
given the sample size used.
The analysis of five additional nucleotide positions allowed the identification, in the
Chilean population, of a variant of the ADH1C*2 allele found only in Native Americans
(ADH1C*2Thr351) and led to the finding, for the first time, of two new variants of the
ADH1B*1 allele. The ADH1B*1Ser59 variant incorporates a polymorphism (A5226)
previously reported without any association and the ADH1B*1Arg367 variant
incorporates a new mutation found here (T15490G). No evidence was found of these
variations modifying the risk of alcoholism in the Chilean population, but a trend of
increased risk of alcoholism conferred by the ADH1C*2Thr351 allele was found when
this allele was compared against the ADH1C*1 and ADH1C*2 alleles grouped together.
Three conclusions may be drawn based on the findings of this work. (I) The ADH1C*2
allele and the ADH1C*2/*2 genotype increase the risk of alcoholism in the Chilean
population when compared with the ADH1C*1 allele and the ADH1C*1/*1 genotype.
(II) The ADH1C genotype can be determined by analysing only nucleotide 11939
(aa 271) and not position 15115 (aa 349), as their identities are perfectly linked
(11939A / 15115G and 11939G / 15115A) and because the analysis of nucleotide
11939 has a more robust experimental design due to a) having positive reactions for
the two nucleotide identities (A and G) at this position and b) determining an amino acid
change of greater importance for being located at the enzyme active site. (III) The
ADH1B genotype may be excluded from the analysis of an increased risk of alcoholism
conferred by the slow ADH variants in the Chilean population given that its difference
between groups is minimal.
1
1. INTRODUCCIÓN
El alcoholismo es un término general para referirse a la dependencia alcohólica. En el
Manual Diagnóstico y Estadístico de los Desórdenes Mentales (DSM-IV, American
Psychiatric Association, 2000) la dependencia alcohólica se define como un patrón
desadaptativo de consumo de alcohol, acompañado de un deterioro o malestar
clínicamente significativo, que se extiende por un período mayor a un año, se asocia a
tolerancia y síntomas de abstinencia y se caracteriza por un consumo elevado y
prolongado de alcohol a pesar de las consecuencias físicas, sociales, laborales o
legales y por deseos persistentes e infructuosos de controlar o interrumpir el consumo.
En Chile, alrededor de 600 mil personas, un 12% de la población entre 12 y 64 años,
presentan dependencia alcohólica, afectando tres veces más a los hombres que a las
mujeres (CONACE, 2003). En cuanto al abuso de alcohol, sin dependencia, se estima
que el 24% de los usuarios habituales de alcohol son bebedores problema (CONACE,
2003). En las Américas el consumo per cápita de alcohol es un 50% mayor en
promedio que en el resto del mundo, siendo responsable de un 4,8% de las muertes y
del 9,7% de la pérdida de años de vida ajustados por discapacidad (AVAD), que
corresponde a la suma de los años de vida perdidos por mortalidad prematura y los
años de vida perdidos por discapacidad (Rehm y Monteiro, 2005).
El riesgo individual de alcoholismo tiene un componente hereditario de 40 a 60%
(Radel y Goldman, 2001, Schuckit, 2000), lo que se ha demostrado en estudios de
adopción (Cloninger et al., 1986) y de seguimiento de gemelos en población caucásica
(Prescott y Kendler, 1999). El porcentaje restante del riesgo corresponde a la
contribución medioambiental: factores económicos, culturales y sociales. El riesgo de
cada individuo al alcoholismo queda entonces definido por la combinación de sus
factores genéticos y ambientales.
Aunque hay gran evidencia de la predisposición genética al alcoholismo, los únicos
factores genéticos bien establecidos para una susceptibilidad diferenciada son los
polimorfismos en los genes de las dos enzimas principales del metabolismo del etanol:
la deshidrogenasa alcohólica (ADH) y la deshidrogenasa aldehídica mitocondrial
(ALDH2) (Zakhari y Li, 2007).
2
En humanos, más del 90% del etanol ingerido es eliminado en el hígado mediante
metabolismo oxidativo (Wallgren y Barry, 1970). El etanol es inicialmente metabolizado
a acetaldehído principalmente por la ADH y el acetaldehído producido es luego oxidado
a acetato por la ALDH2 (Zakhari, 2006), utilizando ambas enzimas el cofactor
nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+).
Existe una gran variación interindividual en el metabolismo del etanol debida
mayormente a variaciones genéticas en la ADH y la ALDH2 (Agarwal, 2001). Estas
variaciones polimórficas determinan también los niveles de acumulación corporal de
acetaldehído. En teoría, si una persona genera acetaldehído rápidamente por tener
una enzima ADH rápida (ADH1C1, ADH1B2 o ADH1B3) o no es capaz de degradarlo
por tener una ALDH2 inactiva (ALDH2*2) tenderá a acumular acetaldehído al consumir
alcohol. Una acumulación periférica de acetaldehído desencadena reacciones
disfóricas que, al ser asociadas al alcohol, producen aversión a su consumo,
reduciendo la susceptibilidad del individuo al alcoholismo (Quertemont, 2004, Radel y
Goldman, 2001). De manera opuesta, los portadores de las enzimas ADH lentas
(ADH1C2 o ADH1B1) o de la ALDH2 activa (ALDH2*1) no experimentan un alza en los
niveles de acetaldehído corporal y tienen un mayor riesgo de alcoholismo. La
distribución de las variantes polimórficas de la ADH y la ALDH2 varía en las distintas
etnias alrededor del mundo.
La población del este de Asia cuenta con la mayor protección genética contra el
alcoholismo, no sólo porque tiene las mayores frecuencias de polimorfismos que
generan una ADH catalíticamente más rápida (Li et al., 2007, Goedde et al., 1992),
sino porque tiene además la variante inactiva de la ALDH2 (ALDH2*2) (Goedde et al.,
1992), cuyos portadores homocigotos son virtualmente abstemios (Thomasson et al.,
1991). Los individuos portadores de estos polimorfismos en los genes de la ADH y la
ALDH2 tienen un menor riesgo de alcoholismo (Chen et al., 1999, Shen et al., 1997,
Chao et al., 1997, Chen et al., 1996, Nakamura et al., 1996, Tanaka et al., 1996,
Thomasson et al., 1994) y es aceptado universalmente que acumulan acetaldehído
luego del consumo de alcohol (Edenberg, 2007). El efecto de los polimorfismos en
ambas enzimas es aditivo y se manifiesta en que los portadores homocigotos de una
3
ADH rápida que son portadores heterocigotos de la ALDH2 inactiva tienen un riesgo de
alcoholismo aún menor (Chen et al., 1999). Habiéndose demostrado que las variantes
alélicas de la ADH modifican el riesgo de alcoholismo, se puede hablar de variantes
protectoras (enzimas ADH rápidas) y variantes permisivas (enzimas ADH lentas).
1.1. Deshidrogenasa alcohólica (ADH)
La deshidrogenasa alcohólica es una metaloenzima citosólica dependiente de cinc (Zn)
que utiliza NAD+ como cofactor. Tiene una estructura dimérica, pudiendo estar
compuesta por dos monómeros iguales (homodimérica) o diferentes (heterodimérica).
Los distintos monómeros pueden estar codificados en diferentes alelos de un mismo
gen, o en distintos genes de la misma clase de ADHs, que comparten gran identidad
de secuencia. La familia de las ADHs se divide en cinco clases de las cuales la clase I
posee la menor Km para el etanol (<5 mM), por lo que es responsable de la mayor parte
de su metabolismo (Tabla 1). Las ADHs de la clase I están codificadas en el brazo
largo del cromosoma 4 en tres genes contiguos: ADH1A, ADH1B y ADH1C.
El gen ADH1A se expresa tempranamente en tejido hepático fetal, mientras que los
otros lo hacen en el hígado adulto (van Ooij et al., 1992). La ADH1B cuenta con tres
variantes polimórficas (ADH1B1, ADH1B2 y ADH1B3), mientras que la ADH1C con
sólo dos (ADH1C1 y ADH1C2). Estas variantes son producidas por sustituciones
puntuales en los genes que generan cambios aminoacídicos. Estas variaciones
nucleotídicas son las analizadas en los estudios de genotipificación disponibles en la
literatura, así como también en esta memoria (Tabla 2). Los cambios aminoacídicos
entre las variantes generan a su vez diferencias en las propiedades catalíticas de estas
enzimas (Tabla 1). Esto resulta en diferentes velocidades de oxidación del etanol y, por
lo tanto, de producción inicial de acetaldehído. Se ha propuesto que estas diferencias
en la producción del acetaldehído se manifiestan principalmente en condiciones en que
el NADH es bajo, lo que sucede al comenzar el metabolismo del etanol (Quintanilla et
al., 2007).
4
Tabla 1 Isoenzimas de la ADH humana Se detallan las nomenclaturas actual y antigua para nombrar los distintos genes ADH y sus respectivas proteínas, las características cinéticas (Km y Vmáx) en la oxidación del etanol y los tejidos en que se expresan estos genes.
notación del gen notación de la proteína clase
actual antigua actual antigua Km (mM)* Vmax min -1 tejido
I ADH1A ADH1 ADH1A α 4,0 20 hígado fetal
ADH1B*1 ADH2*1 ADH1B1 β1 0,05 4,0
ADH1B*2 ADH2*2 ADH1B2 β2 0,9 350
ADH1B*3 ADH2*3 ADH1B3 β3 40,0 300
hígado, pulmón
ADH1C*1 ADH3*1 ADH1C1 γ1 1,0 90
ADH1C*2 ADH3*2 ADH1C2 γ2 0,6 40
hígado, estómago
II ADH2 ADH4 ADH2 π 30,0 20 hígado, córnea
III ADH3 ADH5 ADH3 χ >1000 100 mayoría de los
tejidos
IV ADH4 ADH7 ADH4 σ ó µ 30,0 1800 estómago
V ADH5 ADH6 ADH5 ¿? ¿? ¿? hígado,
estómago
Adaptado de Hurley et al. (2002) y Duester et al. (1999). *Nota: El consumo de 150 mL de vino (14 g etanol) por una persona de 70 kg logra una concentración máxima de 0,033 g/dL, equivalente a 7 mM de etanol en la sangre.
5
Tabla 2 Polimorfismos codificantes en los genes ADH1C y ADH1B analizados en esta memoria Se listan los principales polimorfismos en las regiones codificantes de los genes ADH1C y ADH1B, determinantes de los cambios aminoacídicos entre sus variantes. Se detallan para cada uno de éstos el exón en que se encuentran, el nucleótido que varía según GenBank (DQ088981 para ADH1C o DQ017646 para ADH1B), su identidad nucleotídica y el aminoácido que codifica cada variación. Además se informa en qué estudios en la literatura se ha analizado cada una de las posiciones nucleotídicas especificadas.
Alelos del gen ADH1C y posiciones nucleotídicas analizadas en esta memo ria
exón 6 exón 8 Alelo (enzima)
nt 11939 (1) aa 271 nt 15115 (2) aa 349
ADH1C*1 (rápida) G Arg A Ile
ADH1C*2 (lenta) A Gln G Val
Alelos del gen ADH1B y posiciones nucleotídicas analizadas en esta memo ria
exón 3 exón 9 Alelo (enzima)
nt 5191 (3) aa 47 nt 15494 (4) aa 369
ADH1B*1 (lenta) G Arg C Arg
ADH1B*2 (rápida) A His C Arg
ADH1B*3 (rápida) G Arg T Cys
(1) Ningún trabajo en la literatura ha analizado esta posición nucleotídica. (2) Posición nucleotídica en el exón 8 analizada por Konishi et al., 2004, Neumark et al., 2004,
Vidal et al., 2004, Mulligan et al., 2003, Wall et al., 2003, Chambers et al., 2002, Frenzer et al., 2002, Osier et al., 2002a, Hines et al., 2001, Lee et al., 2001, Borràs et al., 2000, Chao et al., 2000, Chen et al., 1999, Grove et al., 1998, Chen et al., 1997, Espinós et al., 1997, Shen et al., 1997, Higuchi et al., 1996, Nakamura et al., 1996, Thomasson et al., 1994, Gilder et al., 1993 y Day et al., 1991.
(3) Posición nucleotídica en el exón 3 analizada por Tanaka et al., 1996, Goedde et al., 1992 y todos los enumerados en (1), excepto por Hines et al., 2001 y Grove et al., 1998.
(4) Posición nucleotídica en el exón 9 analizada por Wall et al., 2003, Chambers et al., 2002, Frenzer et al., 2002, Osier et al., 2002a, Ehlers et al., 2001, Lee et al., 2001, Espinós et al., 1997, Shen et al., 1997, Nakamura et al., 1996, Thomasson et al., 1994 y Day et al., 1991.
6
1.2. Distribución poblacional
Los polimorfismos de la ADH se encuentran distribuidos de forma diferente en distintas
etnias (Osier et al., 2002a, Goedde et al., 1992). El alelo predominante del gen ADH1B
en la mayoría de las poblaciones estudiadas (∼90%) es el ADH1B*1 (permisivo),
mientras que el alelo ADH1B*2 (protector) predomina en poblaciones del este de Asia
(∼70%). El alelo ADH1B*3 (protector) se encuentra en poblaciones de origen africano
(∼20%), pero es muy raro en otras etnias. Respecto del gen ADH1C, el alelo ADH1C*1
(protector) predomina en poblaciones del este de Asia (∼90%), mientras que en
caucásicos este alelo es igual de frecuente que el alelo ADH1C*2 (permisivo) (Chen
et al., 1999).
Así como se ha descrito que las variantes lentas de la ADH (ADH1C2 y ADH1B1)
aumentan el riesgo de alcoholismo en la población asiática, se ha descrito también que
estas variantes aumentan el riesgo de alcoholismo en las poblaciones caucásica
(Borràs et al., 2000, Neumark et al., 1998), africana (Ehlers et al., 2001) y nativa de
América (Konishi et al., 2004, Mulligan et al., 2003, Wall et al., 2003).
La población mexicana, que podría considerarse genéticamente similar a la chilena por
su origen mestizo entre caucásico español y amerindio, posee frecuencias altas del
alelo permisivo ADH1B*1 (95%), al igual que las poblaciones caucásicas (Konishi et al.,
2003a), pero una frecuencia alélica de 34% para el alelo permisivo del gen ADH1C
(ADH1C*2), que es menor que la frecuencia que presentan las poblaciones caucásicas
para este alelo (40-50%).
Existe cierta divergencia respecto del efecto de los polimorfismos del gen ADH1C
sobre el riesgo de alcoholismo. Algunos estudios han informado que no existe relación
entre el alelo ADH1C*2 (permisivo) y un riesgo aumentado de alcoholismo: Vidal et al.
(2004) en españoles, Borràs et al. (2000) en distintas poblaciones europeas, Neumark
et al. (1998) en israelíes y Gilder et al., 1993 en británicos. Hay otros estudios que sí
demuestran que el alelo ADH1C*2 aumenta el riesgo de alcoholismo: Konishi et al.
(2003b) en mexicanos, Mulligan et al. (2003) en nativos norteamericanos y Whitfield
7
et al. (1998) en australianos caucásicos. Estas divergencias podrían deberse a las
diferencias étnicas de las poblaciones estudiadas, a los tamaños de muestra
empleados por los distintos investigadores, o al análisis de resultados considerando los
genotipos de la ADH1B y de la ADH1C separadamente, ya que no se heredan
independientemente debido a su cercanía en el cromosoma 4 (Osier et al., 2002a,
Chen et al., 1999, Osier et al., 1999). Por ejemplo, en poblaciones orientales ambos
ADH1C*1 y ADH1B*2, propuestos como protectores, se encuentran asociados. Es
importante, entonces, genotipificar ambos genes para concluir sobre el efecto de éstos
por separado. En el caso del estudio de Konishi et al., (2003b) en población mexicana
se encontró una frecuencia significativamente mayor de portadores del alelo ADH1C*2
en alcohólicos que en controles, en una población que tiene frecuencias altas del alelo
permisivo ADH1B*1 y con un contexto genético de mestizaje similar al chileno.
El efecto permisivo del alelo ADH1C*2 está especialmente respaldado por el trabajo de
Chen et al. (1996), en el que se demuestra que el efecto del gen ADH1C es
independiente del efecto del gen ADH1B al hacer un análisis por subgrupos en la
población china. Adicionalmente, Zintzaras et al. (2006) establecen en su metaanálisis
una razón de proporciones (OR, del inglés “odds ratio”) de 1,32 para el alelo ADH1C*2,
indicando que un individuo de cualquier etnia portador del alelo ADH1C*2 (lento) tiene
una probabilidad 32% mayor de ser alcohólico que uno que no es portador.
Es probable que en la población chilena exista una frecuencia muy alta del alelo
ADH1B*1, así como lo reportado por Konishi et al. (2003a) para la población mexicana,
que no permita determinar si este alelo aumenta el riesgo de alcoholismo. Sin
embargo, se espera que la distribución de los alelos del gen ADH1C sí permita
establecer una relación de permisividad al alcoholismo para el alelo ADH1C*2. Debido
a que en Chile el grado de mestizaje es diferente en los distintos estratos
socioeconómicos (Valenzuela et al., 1987) es también probable que tanto la frecuencia
del alelo ADH1C*2 como el grado de permisividad al alcoholismo que éste pueda
conferir fluctúen según el estrato socioeconómico.
La determinación del grado de variación genética en la población chilena en los genes
8
de la ADH y la vulnerabilidad al alcoholismo asociada a determinadas variantes de
estos genes es importante no sólo en el desarrollo de nuevas políticas de prevención,
sino también en el enfoque de los tratamientos existentes para el alcoholismo.
Actualmente el fármaco más utilizado para el tratamiento del alcoholismo es el
disulfiram que, a pesar de ser más eficaz que otras alternativas farmacológicas como el
acamprosato (de Sousa y de Sousa, 2005) y la naltrexona (de Sousa y de Sousa,
2004), tiene una eficacia muy variable entre sujetos (Brewer, 1984). La acción del
disulfiram se basa en la inhibición irreversible de la ALDH2 (Deitrich y Erwin, 1971),
impidiendo la degradación del acetaldehído y generando, por consiguiente, una
acumulación de acetaldehído al consumir alcohol, de manera análoga a lo
experimentado por los individuos portadores de la ALDH2 inactiva (ALDH2*2). Dicha
acumulación genera en el individuo, como se dijo anteriormente, reacciones
desagradables que limitan su ingesta de alcohol. Puede esperarse que la rapidez con
que se alcanza dicha acumulación esté determinada por el genotipo de la ADH1C y/o
de la ADH1B del paciente. La influencia del efecto del genotipo de la ADH1C sobre la
respuesta de pacientes alcohólicos en Chile al tratamiento farmacológico con disulfiram
será determinada en estudios subsiguientes.
1.3. Métodos de genotipificación
Los métodos de genotipificación de los genes de la ADH datan de 1988 en adelante
(Ballo et al., 2003, Walzer et al., 1993, Groppi et al., 1990, Xu et al. 1988, Gennari et
al., 1988) y desde entonces han variado muy poco. Todos ellos se basan en determinar
las variaciones nucleotídicas codificantes de los cambios aminoacídicos entre las
variantes de la ADH1C y la ADH1B (Tabla 2). A pesar de la gran expansión que ha
experimentado la información genética disponible durante estos años, los métodos de
los estudios que analizan el genotipo de la ADH1C o de la ADH1B se enfocan sólo en
unas pocas variaciones nucleotídicas. Los métodos utilizados en la literatura por otros
autores se detallarán más adelante y en contexto dentro de Resultados (Sección 6.2.).
9
1.4. Polimorfismos adicionales en los genes ADH1C y ADH1B
En las bases de datos genéticas GenBank y SNPs, ambas del National Center for
Biotechnology Information (NCBI), se encuentra un gran número de variaciones
nucleotídicas reportadas en los genes ADH1C y ADH1B que no han sido estudiadas en
relación al alcoholismo y que son adicionales a las que definen los alelos de estos
genes, cuyo efecto sobre el alcoholismo sí ha sido estudiado (Tabla 2). Algunas de
estas variaciones adicionales están en los exones amplificados en esta memoria para
la determinación de los genotipos de la ADH1C y de la ADH1B, por lo que se
analizaron en la población chilena para determinar sus frecuencias, encontrar las
posibles asociaciones entre sus identidades y las de los nucleótidos que definen los
alelos de los genes ADH1C y ADH1B y estudiar si estas variaciones adicionales
guardan relación con la vulnerabilidad al alcoholismo. Debe, sin embargo, indicarse
que el propósito principal de esta memoria fue determinar si los alelos del gen ADH1C,
definidos como lo han hecho estudios anteriores (Tabla 2), influencian el riesgo de
alcoholismo en la población chilena.
10
2. HIPÓTESIS
El alelo ADH1C*2 y el genotipo ADH1C*2/*2 aumentan el riesgo de alcoholismo en la
población chilena.
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo general
Establecer si el alelo ADH1C*2 y/o el genotipo ADH1C*2/*2 de la deshidrogenasa
alcohólica se encuentran en frecuencias significativamente mayores en individuos
alcohólicos que en población general.
3.2. Objetivos específicos
a) Determinar, a partir de muestras de sangre, el genotipo de la ADH1C y de la ADH1B
en individuos alcohólicos e individuos de la población general chilena mediante
técnicas de biología molecular (PCR-RFLP).
b) Determinar las frecuencias alélicas y genotípicas de los genes ADH1C y ADH1B en las
muestras de individuos alcohólicos y de la población general chilena.
c) Determinar si existe una diferencia estadísticamente significativa en las frecuencias
alélicas y genotípicas del gen ADH1C (alelos ADH1C*1 y ADH1C*2) entre individuos
alcohólicos e individuos de la población general chilena, tomando en cuenta la posible
influencia de los alelos ADH1B*2 y ADH1B*3 del gen ADH1B sobre este análisis.
d) Determinar adicionalmente la identidad de los nucleótidos descritos como polimórficos
que están presentes en los segmentos a amplificar en la determinación de los
genotipos de la ADH1C y de la ADH1B de los individuos alcohólicos y de la población
general.
e) Determinar si existe una diferencia estadísticamente significativa entre individuos
alcohólicos e individuos de la población general chilena en las frecuencias de las
variaciones nucleotídicas adicionalmente analizadas.
11
4. MATERIALES
4.1. Población alcohólica
Entre las fechas 25 de Abril de 2006 y 4 de Mayo de 2007 se reclutaron 30 pacientes
alcohólicos en tratamiento en la Clínica Psiquiátrica Universitaria del Hospital Clínico
de la Universidad de Chile con la colaboración de la Dra. María Isabel González de la
Unidad de Dependencias de la misma clínica. El grupo de pacientes está conformado
por 3 mujeres y 27 hombres con un rango etario de 39 a 55 años las mujeres
(promedio = 48,0; desviación estándar = 8,2) y de 16 a 55 años los hombres (promedio
= 36,8; desviación estándar = 11,4). A cada paciente se le tomó una muestra de sangre
después de haber leído, completado y firmado un consentimiento informado.
4.2. Consentimiento informado
Se redactó una carta de consentimiento informado (ver Anexo) en conjunto con la Dra.
María Isabel González siguiendo las pautas dictadas por la Organización Mundial de la
Salud (Lolas et al., 2006).
4.3. Población chilena general
El grupo de población chilena general corresponde a 105 personas no emparentadas
(56 hombres y 49 mujeres) reclutadas en el banco de sangre del Hospital Sótero del
Río, Santiago, Chile. Todos eran mayores de edad (19 – 59 años; promedio = 34,43;
desviación estándar = 9,23). El grado de mestizaje entre población europea y
amerindia de la muestra poblacional (0,457) (Dra. Luisa Herrera, comunicación
personal), determinado en base al grupo sanguíneo ABO y al factor Rh, es congruente
con el origen chileno de la población y el nivel socioeconómico de dónde se tomaron
las muestras. En Chile, el componente amerindio se correlaciona con el nivel
socioeconómico; es bajo (<10%) en los estratos más altos, pero es mayor en los
estratos bajos (aproximadamente de un 40%) (Valenzuela et al., 1987).
12
4.4. Sangre de pacientes alcohólicos
Se utilizaron 5 mL de sangre venosa de cada paciente alcohólico para extraer el DNA
de linfocitos. La muestra de sangre se tomó en un tubo Vacutainer con EDTA (Becton
Dickinson). Las muestras de sangre se almacenaron a 4ºC, durante un máximo de
cuatro días, hasta la extracción del DNA, que se hizo mediante una variación del
método de Lahiri y Nurnberger (1991). El método utilizado se detalla más adelante.
4.5. DNA la de muestra de la población chilena gene ral
Se utilizó DNA de las muestras de la población chilena general, proporcionado por la
Dra. Luisa Herrera del Programa de Genética Humana del Instituto de Ciencias
Biomédicas perteneciente a la Facultad de Medicina de la Universidad de Chile. El
DNA total fue obtenido de linfocitos (Lahiri y Nurnberger, 1991) a partir de muestras de
sangre colectadas en tubos con EDTA.
4.6. Oligonucleótidos
Se utilizaron oligonucleótidos de DNA para la amplificación mediante PCR de
segmentos específicos del gDNA de los genes ADH1C (Tabla 3) y ADH1B (Tabla 4) de
la deshidrogenasa alcohólica humana. Los oligonucleótidos se diseñaron en base a las
secuencias de los respectivos genes (GenBank DQ017646 para ADH1B y DQ088981
para ADH1C). En su diseño se utilizó el programa ClustalW (Thompson et al., 1994)
(www.ebi.ac.uk/clustalw/), con el que se alinearon los segmentos de interés de las
secuencias de los genes ADH1A (GenBank AY948115), ADH1B y ADH1C que
comparten un alto grado de identidad, para posicionar los partidores en zonas que
contuviesen la mayor cantidad posible de diferencias entre el gen que se deseaba
amplificar y los otros dos. Además se evitó, en la medida de lo posible, diseñar
partidores que se anclasen en sitios que contuviesen variaciones nucleotídicas (SNPs,
del inglés “single nucleotide polymorphisms”) descritas en GenBank o en la base de
datos de polimorfismos de un nucleótido (dbSNP; data base for Single Nucleotide
Polymorphisms) del National Center for Biotechnology Information (NCBI). Todos los
oligonucleótidos se sintetizaron en el Centro de Equipamiento y Servicios de Apoyo
Tecnológico (CESAT) de la Facultad de Medicina Norte de la Universidad de Chile.
13
Tabla 3 Amplicones del gDNA de ADH1C y oligonucleótidos usados en su generación A. Características de los amplicones generados a partir del gDNA del gen ADH1C: los partidores utilizados en la generación de cada amplicón, el tamaño del amplicón y las concentraciones de magnesio utilizadas en su obtención. Todos los amplicones se obtuvieron con una temperatura de apareamiento de 60ºC en el programa de termociclado. B. Características de cada partidor: nombre, largo, secuencia, posición de anclaje dentro del gen ADH1C (GenBank DQ088981) y orientación (sentido > o antisentido <). Todos los oligonucleótidos tienen una temperatura media de apareamiento (Tm) de 62ºC, calculada según la fórmula Tm = 4 × (CG) + 2 × (AT). Los partidores están agrupados en las parejas utilizadas para generar los amplicones respectivos. El oligonucleótido TG-352 es degenerado para anclarse en un sitio polimórfico. Los partidores TG-341 y TG-342 se utilizaron en un principio en la amplificación del exón 8 del gen ADH1C, pero se reemplazaron por los partidores TG-374 y TG-375 porque los primeros sólo amplifican el alelo ADH1C*1.
A gen exón partidor sentido partidor antisentido amplicón (pb) [MgCl 2] mM
6 TG-351 TG-352 585 1,6 ADH1C
8 TG-374 TG-375 307 2,0
B partidor largo (nt) secuencia 5’-3’ posición orientación
TG-351 24 AAG CTT AAG CAA TTT CTA ACA AAC 11631-11654 intrón 5 >
TG-352 21 AAG CAT W TT TGT AGT GGC TGT G 12215-12194 intrón 6 <
TG-374 24 CTG TAA AAG CAT ATT GAA GTA CTC 14873-14896 intrón 7 >
TG-375 22 AAA ATC TAC CTC TTT CCA GAG C 15179-15158 i8 / e8 <
TG-341 25 TTG TTT ATC TGT GAT TTT TTT TGT G 14842-14866 intrón 7 >
TG-342 22 CGC TAC TGT AGA ATA CAA AGC A 15218-15197 intrón 8 <
W = A o T
14
Tabla 4 Amplicones del gDNA de ADH1B y oligonucleótidos usados en su generación A. Características de los amplicones generados a partir del gDNA del gen ADH1B: los partidores utilizados en la generación de cada amplicón, el tamaño del amplicón y las concentraciones de magnesio utilizadas en su obtención. Todos los amplicones se obtuvieron con una temperatura de apareamiento de 60ºC en el programa de termociclado. B. Características de cada partidor: nombre, largo, secuencia, posición de anclaje dentro del gen ADH1B (GenBank DQ017646) y orientación (sentido > o antisentido <). Todos los oligonucleótidos tienen una temperatura media de apareamiento (Tm) de 62ºC, calculada según la fórmula Tm = 4 × (CG) + 2 × (AT), excepto el partidor TG-330 que tiene una Tm de 66ºC. Los partidores están agrupados en las parejas utilizadas para generar los amplicones respectivos.
A gen exón partidor sentido partidor antisentido amplicón (pb) [MgCl 2] mM
3 TG-330 TG-331 249 1,2 ADH1B
9 TG-349 TG-350 290 2,4
B partidor largo (nt) secuencia 5’-3’ posición orientación
TG-330 24 CAA TCT TTT CTG AAT CTG AAC AGC 5128-5151 intrón 2 >
TG-331 20 GTT TCC TTA TCC AGG CTG GG 5376-5355 intrón 3 <
TG-349 20 GCT CCT TGG ACT CTC ACA AC 15417-15436 intrón 8 >
TG-350 25 TTC TCA CTT GAA TTT TAA ATT TTC C 15706-15682 exón 9 <
15
4.7. Enzimas
Se utilizaron la enzima DNA polimerasa Taq de Promega (Madison, WI, EE.UU.) y las
enzimas de restricción AluI, BfuI, Bsh1285I, BstXI, CaiI, MvaI, RsaI, SspI, TasI y Tru1I
de Fermentas (Glen Burnie, MD, EE.UU.), BglII, FokI, SfaNI y SnaBI de New England
Biolabs (Ipswich, MA, EE.UU.) y MaeIII de Roche Applied Sciences (Penzberg,
Alemania).
4.8. Reactivos y materiales generales
Axygen (Union City, CA, EE.UU.): microtubos de 0,6 y 1,5 mL.
Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, EE.UU.): tubos de vidrio de 5 mL Vacutainer
Hemogard con tapa lila que contienen 0,056 mL de K3EDTA 15% (8,4 mg), agujas
múltiples 21 G × 1 ½.
Fermentas (Glen Burnie, MD, EE.UU.): tampones de enzimas de restricción B (10X),
G (10X), O (10X), R (10X), Tango (10X) y tampón para BfuI (10X).
Gibco BRL (Grand Island, NY, EE.UU.): dodecil sulfato de sodio (SDS).
Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.): agarosa ultrapura, DNAzol.
Mallinckrodt (Xalostoc, DF, México): cloruro de sodio.
Merck (Darmstadt, Alemania): ácido acético glacial, cloruro de potasio, etanol absoluto,
glicerol.
New England Biolabs (Ipswich, MA, EE.UU.): estándar de DNA de bajo peso
molecular “LMW ladder”, tampones de enzimas de restricción NEBuffer 3 (10X) y
NEBuffer 4 (10X).
Polaroid (St. Albans, Hertfordshire, Inglaterra): película fotográfica instantánea blanco
y negro 667.
Promega (Madison, WI, EE.UU.): dATP 100 mM, dCTP 100 mM, dGTP 100 mM,
dTTP 100 mM, cloruro de magnesio 25 mM, estándar de peso molecular de DNA
“100 bp DNA ladder”, estándar de peso molecular de DNA “Benchtop 100 bp DNA
ladder”, estándar de peso molecular de DNA “1 kb DNA ladder”, sistema de purificación
de DNA “Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System”, tampón (10X) de enzima
DNA polimerasa Taq.
16
Roche Applied Sciences (Penzberg, Alemania): tampón para MaeIII (2X).
Sigma (St. Louis, MO, EE.UU.): aceite mineral, acetato de sodio anhidro, ácido bórico,
ácido clorhídrico, acrilamida, azul de bromofenol (BPB), bromuro de etidio, cloruro de
magnesio hexahidratado, etilendiaminotetraacetato (EDTA) sódico dihidrato, hidróxido
de sodio, N,N’-metilén-bis-acrilamida, N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamina (TEMED),
persulfato de amonio (APS), Triton X-100, Trizma base.
Se utilizó agua destilada que se desionizó (18 MΩ) en el laboratorio con un equipo
Barnstead NANOpure Infinity D8982-33 (Dubuque, IA, EE.UU.).
4.9. Soluciones para electroforesis
Tampón TAE: Trizma base 40 mM, ácido acético glacial 40 mM, EDTA 1 mM (pH 8,0).
Tampón TBE: Trizma base 90 mM, ácido bórico 90 mM, EDTA 2 mM (pH 8,0).
4.10. Soluciones para extracción de DNA
TKM1: Tris-HCl 10 mM (pH 7,6), KCl 10 mM, MgCl2 10 mM, EDTA 2 mM.
TKM2: Tris-HCl 10 mM (pH 7,6), KCl 10 mM, MgCl2 10 mM, NaCl 0,4 M, EDTA 2 mM.
TE (pH 8,0): Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0.
NaCl saturado (aprox. 5,37 M)
SDS 10%
17
5. MÉTODOS
5.1. Purificación de DNA nuclear de sangre humana
El DNA nuclear se purificó a partir de 5 mL de sangre de los pacientes alcohólicos
mediante una variación del método de Lahiri y Nurnberger (1991). Este método se
basa en la lisis de las células sanguíneas, el aislamiento de los núcleos mediante
centrifugación y su disolución, para luego precipitar las proteínas, obtener el DNA y
lavarlo. Este método tiene las ventajas de no utilizar solventes orgánicos y no requerir
digestiones enzimáticas.
Las células sanguíneas se lisaron disolviendo las membranas plasmáticas con el
detergente Triton. Los 5 mL de sangre contenidos en un tubo Vacutainer con EDTA se
mezclaron suavemente mediante inversión y se vertieron lentamente en un tubo de
centrífuga plástico de 15 mL estéril que contenía 5 mL de tampón TKM1 y 125 µL de
Triton X-100 (puro) no disuelto. El Triton se disolvió invirtiendo suave y constantemente
el tubo, entibiándolo con la mano, durante 10 minutos.
Para aislar los núcleos celulares se centrifugó durante 10 minutos a 950 × g en una
centrífuga clínica de ángulo batiente Clay-Adams Dynac II 420106 (Sparks, MD,
EE.UU.). El sobrenadante se transfirió suavemente a otro tubo de plástico de 15 mL,
que se desechó en una bolsa autoclavable para material biológico peligroso, cuidando
de no desprender la pequeña pella nuclear del fondo del tubo. La pella se lavó con 5
mL de TKM1, se centrifugó durante 5 minutos a 950 × g y se desechó el sobrenadante.
Para disolver los núcleos se agregaron 0,8 mL de TKM2 sobre la pella nuclear, se
transfirió a un microtubo de 1,5 mL con una pipeta pasteur corta y se agregaron 50 µL
de dodecil sulfato de sodio (SDS) al 10%. La pella se disolvió invirtiendo suave y
regularmente el tubo durante aproximadamente 10 minutos a temperatura ambiente y
luego se incubó a 60ºC durante 10 a 20 minutos para completar la disolución.
Se precipitaron las proteínas agregando 0,3 mL de NaCl saturado (aproximadamente
5,37 M) y se mezcló bien hasta observar la formación de un precipitado. Se centrifugó
durante 5 minutos a 11600 × g (12000 rpm) en una centrífuga Eppendorf 5415C
18
(Hamburgo, Alemania) y se distribuyó el sobrenadante en dos microtubos
(aproximadamente 500 µL en cada tubo).
El DNA se precipitó agregando a cada tubo 0,85 mL de etanol absoluto y mezclando
suavemente. Se centrifugó durante 5 minutos a 11600 × g y se desechó el
sobrenadante. La pella de DNA resultante en cada tubo se lavó con 0,5 mL de etanol
70% frío en hielo. El etanol del lavado se eliminó luego de centrifugar a 11600 × g
durante 5 minutos. El DNA se secó al vacío durante 5 minutos, se resuspendió el
contenido de cada tubo en 250 µL de tampón TE pH 8,0 (500 µL en total) y se incubó a
65ºC durante 10 minutos. El DNA en solución se almacenó a -20ºC. Se obtuvieron
rendimientos de 30 a 40 µg de DNA de alto peso molecular a partir de 5 mL de sangre
estimados en base a electroforesis en geles de agarosa al 0,8% en TAE.
5.2. Genotipificación de las muestras
La genotipificación de las muestras se realizó amplificando segmentos específicos de
la secuencia de los genes ADH1C y ADH1B mediante PCR y digiriendo los amplicones
generados con enzimas de restricción específicas para cada variación nucleotídica
analizada (PCR-RFLP). Los segmentos amplificados corresponden, para cada gen, a
los exones que contienen las variaciones nucleotídicas codificantes de los cambios
aminoacídicos entre las variantes alélicas de estas enzimas (Tabla 2). Estas
variaciones definen, por lo tanto, los respectivos alelos y se encuentran en los exones
6 y 8 del gen ADH1C y en los exones 3 y 9 del gen ADH1B.
Todas las amplificaciones se realizaron en un termociclador MJ Research PTC-100
(Watertown, MA, EE.UU.) con el mismo programa de temperaturas y tiempos de
termociclado y en iguales condiciones de reacción (como se describe a continuación),
exceptuando la concentración de magnesio y los partidores utilizados. Para la
obtención de cada amplicón se hizo un barrido de magnesio (de 1,2 a 2,4 mM).
Las mezclas de reacción se hicieron utilizando aproximadamente 100 ng de DNA, 2 µM
de cada partidor específico para cada reacción (Tablas 3 y 4), la correspondiente
concentración de magnesio, 0,5 U de DNA polimerasa Taq, desoxirribonucleótidos
19
trifosfato (dNTPs) 2,5 mM cada uno, Tris-HCl 10 mM pH 9,0 a 25ºC, KCl 50 mM y
Triton X-100 al 0,1% (se usó el tampón 10X de enzima DNA polimerasa Taq de
Promega), agregando agua hasta un volumen final de 25 µL. A cada tubo se le agregó
una gota de aceite mineral. Las mezclas de reacción se sometieron a una etapa inicial
de desnaturación a 94ºC durante tres minutos, luego a 35 ciclos de amplificación que
constaron de una etapa de desnaturación a 94ºC de un minuto, una etapa de
apareamiento de 1,5 minutos a 60ºC y una etapa de elongación de 1,5 minutos a 72ºC
y, finalmente, se sometieron a una etapa de elongación de diez minutos a 72ºC.
Los productos de PCR se analizaron mediante electroforesis. Se tomaron 4 µL de la
reacción y se mezclaron con 3,5 µL de agua y 1,5 µL de una solución de glicerol
al 30% y azul de bromofenol al 0,025%. Se efectuó una electroforesis horizontal en un
gel de agarosa al 2% en tampón TAE y tinción con bromuro de etidio (0,2 µg/mL de
gel) a 120 V durante 40 minutos en cámaras de electroforesis CBS Scientific (Del Mar,
CA, EE.UU.), utilizando una fuente de poder Bio-Rad PowerPac 200 (Hercules, CA,
EE.UU.) o VWR EC 105 (Holbrook, NY, EE.UU.). Para distinguir el tamaño de las
bandas de DNA generadas en la PCR se utilizó en cada electroforesis un patrón tipo
escalera de distintos tamaños conocidos de DNA “100 bp DNA ladder” o “Benchtop 100
bp DNA ladder” de Promega (Madison, WI, EE.UU.). Al finalizar la electroforesis, los
productos de PCR se analizaron visualmente al colocar el gel de electroforesis en un
transiluminador ultravioleta (302 nm) UVP TFM-20 (Upland, CA, EE.UU.). Los
resultados se registraron fotográficamente utilizando una cámara Polaroid (St. Albans,
Hertfordshire, Inglaterra) con una película fotográfica instantánea blanco y negro
Polaroid 667 (St. Albans, Hertfordshire, Inglaterra).
5.2.1. Comprobación de la identidad de los amplicon es de PCR
Se comprobó que se hubiesen amplificado los genes de interés, y no alguno de los
otros dos genes de la deshidrogenasa alcohólica de la clase I, utilizando enzimas de
restricción para distinguir entre ellos. Estas digestiones permitieron comprobar que los
partidores diseñados y las condiciones de reacción utilizadas son específicos para los
genes respectivos. En las Tablas 5 y 6 se muestran los tamaños de los fragmentos
obtenidos del corte con las enzimas elegidas, respecto de los que se hubiesen
20
Tabla 5 Enzimas de restricción utilizadas en la identificac ión de amplicones del gen ADH1C Se muestran los fragmentos que produciría cada enzima al cortar un amplicón generado de manera inespecífica en la PCR. En negrita se destacan los tamaños de los fragmentos que, de haber sido encontrados, indicarían que la pareja de partidores y las condiciones utilizadas en la PCR amplifican un gen distinto del gen ADH1C.
amplicón/exón enzima ADH1A ADH1B ADH1C obtenido conclusión
exón 6 Sna BI 565 586 394 + 191 394 + 191
Sfa NI 142 + 92 + 72 215 + 92 215 + 92 215 + 92 exón 8
Mva I 122 + 184 307 123 + 184 123 + 184
ADH1C
Figura 1 Identificación de los amplicones del gen ADH1C Se muestran los resultados de las digestiones realizadas para identificar los amplicones de los exones 6 (izquierda) y 8 (derecha) del gen ADH1C. Se informan los carriles correspondientes al estándar (std) o al amplicón sin digerir (sinE). Los tamaños de las bandas informados para los cortes enzimáticos coinciden con los entregados en la tabla superior como “obtenido”, indicando que el segmento amplificado corresponde al gen ADH1C y no a los genes ADH1A ni ADH1B.
700600
400500
585
191
pbpb
std sinEnzSnaBI
394
300
200
SnaBITAC/GTA
200
150
100
75
50
92
pb
pb
std sinEnzSfaNI MvaI
215184
123
307
/SfaNIGCATC(5/9)
Mva ICC/WGG
700700600600
400400500500
585585
191191
pbpb
std sinEnzSnaBI
394394
300300
200200
SnaBITAC/GTA
SnaBITAC/GTA
200200
150150
100100
7575
5050
9292
pb
pb
std sinEnzSfaNI MvaI
215215184184
123123
307307
/SfaNIGCATC(5/9)
Mva ICC/WGG
/SfaNIGCATC(5/9)
Mva ICC/WGG
21
Tabla 6 Enzimas de restricción utilizadas en la identificac ión de amplicones del gen ADH1B Se muestran los fragmentos que produciría cada enzima al cortar un amplicón generado de manera inespecífica en la PCR. En negrita se destacan los tamaños de los fragmentos que, de haber sido encontrados, indicarían que la pareja de partidores y las condiciones utilizadas en la PCR amplifican un gen distinto del gen ADH1B.
amplicón/exón enzima ADH1A ADH1B ADH1C obtenido conclusión
Rsa I 93 + 83 + 67 182 + 67 182 + 69 182 + 67 exón 3
Fok I 197 + 46 204 + 45 251 204 + 45
exón 9 Bgl II 286 151 + 139 293 151 + 139
ADH1B
Figura 2 Identificación de los amplicones del gen ADH1B Se muestran los resultados de las digestiones realizadas para identificar los amplicones de los exones 3 (izquierda y centro) y 9 (derecha) del gen ADH1B. Se informan los carriles correspondientes al estándar (std) o al amplicón sin digerir (sinE). Los tamaños de las bandas informados para los cortes enzimáticos coinciden con los entregados en la tabla superior como “obtenido”, indicando que el segmento amplificado corresponde al gen ADH1B y no a los genes ADH1A ni ADH1C.
500
400
300
200
290
151
pb
pb
std sinEnz BglII
500300200 249
204
pb
pb
std sinEnzFokI
500300
200249
67
pb
pb
std sinEnzRsaI
182
Rsa IGT/AC)
Fok IGGATG(9/13)
Bgl IIA/GATCT)
500
400
300
200
290
151
pb
pb
std sinEnz BglII
500300200 249
204
pb
pb
std sinEnzFokI
500300
200249
67
pb
pb
std sinEnzRsaI
182182
Rsa IGT/AC)Rsa IGT/AC)
Fok IGGATG(9/13)Fok I
GGATG(9/13)Bgl IIA/GATCT)Bgl IIA/GATCT)
22
obtenido de haber amplificado un gen distinto al de interés. Esta técnica también fue
utilizada por Xu et al. (1988) con la enzima BglII para asegurar la identidad del
amplicón del exón 9 del gen ADH1B.
En la identificación del amplicón del exón 6 del gen ADH1C se utilizó la enzima SnaBI
(Figura 1), porque posee un sitio de corte en el segmento amplificado del gen ADH1C,
pero no posee sitios de corte en los respectivos segmentos de los genes ADH1A o
ADH1B, por lo que al obtener una digestión completa se asegura que ninguno de estos
dos últimos genes se amplificó bajo las condiciones utilizadas. En la identificación del
amplicón del exón 8 del gen ADH1C se utilizaron las enzimas SfaNI y MvaI (Figura 1),
porque permiten diferenciar el amplicón producido de los genes ADH1A y ADH1B,
respectivamente. La digestión con SfaNI permite asegurar que no se amplificó el gen
ADH1A, que posee dos sitios de corte para SfaNI en este segmento (a diferencia de
los genes ADH1C y ADH1B que sólo poseen uno) y que, de amplificarse, habría
originado dos fragmentos característicos de 142 y 72 pb que no se obtuvieron. El
resultado de la digestión con MvaI permitió asegurar que tampoco se amplificó el gen
ADH1B que no posee sitios de corte para MvaI en este segmento, a diferencia de los
genes ADH1C y ADH1A que poseen ambos un sitio para esta enzima.
La identificación del amplicón del exón 3 del gen ADH1B se realizó con las enzimas
RsaI y FokI (Figura 2), porque permiten diferenciar el amplicón producido de los genes
ADH1A y ADH1C, respectivamente. La digestión con RsaI permite asegurar que no se
amplificó el gen ADH1A, que posee dos sitios de corte en este segmento (a diferencia
de los genes ADH1B y ADH1C que sólo poseen uno) y que, de haberse amplificado,
habría originado dos fragmentos característicos de 93 y 83 pb que no se obtuvieron. El
resultado de la digestión con FokI permitió asegurar que tampoco se amplificó el gen
ADH1C, ya que éste no posee sitios de corte para FokI en este segmento, a diferencia
de los genes ADH1B y ADH1A que poseen ambos un sitio para esta enzima. En la
identificación del amplicón del exón 9 del gen ADH1B se utilizó la enzima BglII (Xu et
al., 1988) (Figura 2), que posee un sitio de corte en el segmento amplificado del gen
ADH1B, pero no posee sitios de corte en los respectivos segmentos de los genes
ADH1A o ADH1C, por lo que al obtener una digestión completa se asegura que
ninguno de estos dos últimos genes se amplificó bajo las condiciones utilizadas.
23
5.3. Determinación del genotipo de la ADH1C mediant e PCR-RFLP
Se determinó el genotipo de la ADH1C de las muestras de pacientes alcohólicos y
población chilena general. Este gen presenta variaciones en todas las poblaciones del
mundo (Osier et al., 2002a), a diferencia del gen ADH1B, cuyas variaciones son casi
exclusivas de ciertos grupos étnicos. Las variantes de la deshidrogenasa alcohólica
ADH1C tienen distintas actividades catalíticas, asociándose la variante lenta (ADH1C2)
a un mayor riesgo de alcoholismo en gran parte del mundo.
Las enzimas ADH1C1 (Arg271, Ile349) y ADH1C2 (Gln271, Val349) se diferencian
entre sí en los aminoácidos 271 y 349 que están codificados en los exones 6 y 8,
respectivamente. Los nucleótidos codificantes de estos cambios aminoacídicos son el
11939 para el aminoácido 271 y el 15115 para el aminoácido 349 (GenBank
DQ088981), teniendo el alelo ADH1C*1 las identidades 11939 G y 15115 A y el alelo
ADH1C*2 las identidades 11939 A y 15115 G (Tabla 2).
La determinación del genotipo de la ADH1C se basa en la amplificación mediante PCR
los exones 6 y 8, la digestión de los amplicones producidos con enzimas de restricción
específicas para determinar la identidad de los nucleótidos 11939 y 15115, codificantes
de los cambios aminoacídicos entre las isoenzimas de la ADH1C, y el análisis del
patrón de migración electroforética de los fragmentos de DNA generados. Se
analizaron adicionalmente tres variaciones nucleotídicas descritas en el exón 8; estas
determinaciones se detallan después del análisis estadístico.
La amplificación del exón 6 del gen ADH1C se realizó utilizando los partidores TG-351
y TG-352 (Tabla 3) con una concentración de magnesio de 1,6 mM. El tamaño del
amplicón es de 585 pb con un rendimiento de reacción de aproximadamente 940 ng
(37,5 ng/µL). Por otro lado, la amplificación del exón 8 se produjo con una
concentración de magnesio de 2,0 mM y los partidores TG-374 y TG-375 (Tabla 3). El
amplicón del exón 8 tiene un tamaño de 307 pb. Esta reacción tiene un rendimiento
aproximado de 810 ng (32,5 ng/µL). Los amplicones del gen ADH1C se precipitaron
con acetato de sodio y etanol absoluto y se resuspendieron en 15 µL de agua.
24
5.3.1. Determinación de la identidad del nt 11939 ( aa 271) del gen ADH1C (exón 6)
La identidad del nucleótido 11939 se determinó mediante la digestión del amplicón del
exón 6 del gen ADH1C con las enzimas Bsh1285I y AluI, por separado (ver Figura 3 en
Resultados). La digestión con Bsh1285I requiere una guanina en la posición 11939 del
alelo ADH1C*1, mientras que la digestión con AluI requiere una adenina en esta misma
posición, característica del alelo ADH1C*2. El contar con enzimas que reconocen estas
dos variantes nucleotídicas permite tener resultados inequívocos, ya que si una enzima
cortó el amplicón en esa posición de manera completa, la otra no lo debe cortar y
viceversa; si el corte con una de estas enzimas es parcial debe serlo también con la
otra. La enzima AluI posee, adicionalmente, tres sitios de corte no polimórficos en este
amplicón, lo que permite evaluar si la digestión ha sido completa. Además, las bandas
de DNA generadas por sitios de corte que no cambian según el genotipo, o constantes,
ayudan a determinar el genotipo, ya que si un fragmento de DNA generado por un sitio
polimórfico tiene a la vez un tamaño mayor y una intensidad menor que la banda
constante, quiere decir que la banda de DNA generada por el sitio polimórfico proviene
sólo de un alelo del individuo analizado, ya que de provenir de ambos alelos su
intensidad debiese ser mayor, por tener un tamaño mayor pero un número igual de
copias.
Para cada digestión enzimática se tomaron 7,5 µL de la resuspensión del amplicón del
exón 6 del gen ADH1C (aprox. 470 ng). A la primera digestión se le agregaron 2
unidades de enzima AluI, Tris-acetato 33 mM (pH 7,9 a 37ºC), acetato de magnesio
10 mM, acetato de potasio 66 mM y seroalbúmina bovina (BSA) 0,1 mg/mL (se usó el
tampón Tango 10X de Fermentas). A la segunda se le agregaron 2 unidades de
enzima Bsh1285I, Tris-HCl 10 mM (pH 7,5 a 37ºC), MgCl2 10 mM, NaCl 50 mM y BSA
0,1 mg/mL (se usó el tampón G 10X de Fermentas). Ambas digestiones se realizaron
en un volumen final de 11 µL y se incubaron a 37ºC durante toda la noche
(aproximadamente 18 horas). Al término de la digestión enzimática se agregaron a la
reacción 1,5 µL de una solución de glicerol al 60% y azul de bromofenol al 0,05%. Esta
mezcla se cargó en un gel de poliacrilamida no desnaturante al 15%
(acrilamida:bisacrilamida 29:1 en peso) en tampón TBE y se sometió a una
electroforesis vertical a 15 W durante 1,5 horas en una cámara vertical ajustable
25
CBS Scientific (Del Mar, CA, EE.UU.) con una fuente de poder VWR EC3000P
(Holbrook, NY, EE.UU.). Al finalizar la electroforesis se tiñó el gel en una solución
diluida de bromuro de etidio y el resultado se analizó visualmente en un transiluminador
ultravioleta. Para la digestión con Bsh1285I se realizó una electroforesis horizontal en
gel de agarosa al 2% en TAE durante 40 minutos a 120 V. La identidad del nucleótido
11939 se determinó a partir de la comparación de los resultados de ambas digestiones.
5.3.2. Determinación de la identidad del nt 15115 ( aa 349) del gen ADH1C (exón 8)
La posición 15115 es la más analizada en la literatura para la determinación del
genotipo de la ADH1C (ver Tabla 2) y es generalmente analizada mediante PCR-RFLP
con la enzima de restricción SspI (Konishi et al., 2004, Vidal et al., 2004, Frenzer et al.,
2002, Hines et al., 2001, Lee et al., 2001, Borràs et al., 2000, Chao et al., 2000, Chen
et al., 1999, Grove et al., 1998, Chen et al., 1997, Nakamura et al., 1996). Esta enzima
reconoce la identidad 15115 A característica del alelo ADH1C*1, pero no la identidad G
del alelo ADH1C*2. En esta memoria la determinación de esta identidad también se
hizo mediante la digestión enzimática de un amplicón del exón 8 del gen ADH1C con
SspI (ver Figura 3 en Resultados).
La digestión con SspI se realizó con 7,5 µL de la resuspensión del amplicón del exón 8
(aprox. 405 ng), 2 unidades de SspI, Tris-HCl 10 mM (pH 7,5 a 37ºC), MgCl2 10 mM,
NaCl 50 mM, BSA 0,1 mg/mL (se usó el tampón G 10X de Fermentas) y agua hasta
12 µL. La reacción se incubó a 37ºC durante toda la noche y se analizó mediante
electroforesis en geles de agarosa al 2% en TAE durante 40 minutos a 120 V.
5.4. Determinación del genotipo de la ADH1B mediant e PCR-RFLP
Se determinó el genotipo de la ADH1B de todas las muestras analizadas para
identificar a aquellos individuos portadores de los alelos ADH1B*2 o ADH1B*3, ya que
estos alelos tienen efectos protectores mayores a los conferidos por el alelo ADH1C*1.
Si los alelos protectores del gen ADH1B están presentes, al hacer una comparación
26
entre grupos la interpretación de los resultados puede ser incorrecta. Además, se ha
demostrado que el alelo ADH1B*2 está asociado al alelo ADH1C*1, por lo que se
heredan en conjunto en la mayoría de las poblaciones del mundo estudiadas (Osier et
al., 2002a, Chen et al., 1999, Osier et al., 1999). Por consiguiente, si un individuo
posee ambos alelos (ADH1C*1 y ADH1B*2), se podría interpretar erróneamente que el
efecto protector está dado sólo por el genotipo de la ADH1C si no se conoce el
genotipo de la ADH1B y viceversa.
La enzima ADH1B1 (Arg47, Arg369) se diferencia de la ADH1B2 (His47, Arg369) en el
aminoácido 47 y de la ADH1B3 (Arg47, Cys369) en el aminoácido 369, los cuales se
encuentran codificados en los exones 3 y 9 del gen ADH1B, respectivamente (ver
Tabla 2). Los nucleótidos que determinan estos cambios aminoacídicos son el 5191
para el aminoácido 47 y el 15494 para el aminoácido 369 (GenBank DQ017646). El
alelo ADH1B*1 tiene las identidades 5191 G y 15494 C, el alelo ADH1B*2 tiene las
identidades 5191 A y 15494 C y el alelo ADH1B*3 tiene las identidades 5191 G y
15494 T. Se determinó la identidad de ambos nucleótidos (5191 y 15494) para poder
identificar inequívocamente las tres variantes alélicas.
La determinación del genotipo de la ADH1B se basa en amplificar mediante PCR los
exones 3 y 9 de este gen y analizar los tamaños de los fragmentos de DNA generados
a partir de digestiones con enzimas de restricción específicas para cada variación
nucleotídica. Todos los resultados obtenidos de las digestiones enzimáticas se
registraron fotográficamente. De manera adicional, se analizaron en este gen dos
variaciones nucleotídicas (5219 y 5226) del exón 3 que no están asociadas a ninguno
de los tres alelos conocidos. El método utilizado se detalla en las secciones 5.6.6. y
5.7.7.
La amplificación del exón 3 del gen ADH1B se realizó utilizando los partidores TG-330
y TG-331 (Tabla 4), con una concentración de magnesio de 1,2 mM. El tamaño del
amplicón es de 249 pb y el rendimiento de la reacción es de aproximadamente 875 ng
(35 ng/µL). La amplificación del exón 9 se realizó con una concentración de magnesio
de 2,4 mM y utilizando los partidores TG-349 y TG-350 (Tabla 4). El amplicón del
27
exón 9 tiene un tamaño de 290 pb y se obtuvo con un rendimiento aproximado de 406
ng (16 ng/µL). Los amplicones del gen ADH1B se precipitaron con acetato de sodio y
etanol absoluto y se resuspendieron en un volumen de agua de 12 µL para el exón 3 y
de 10 µL para el exón 9.
5.4.1. Determinación de la identidad del nt 5191 (a a 47) del gen ADH1B (exón 3)
La identidad del nucleótido 5191 (aa 47) se determinó digiriendo el amplicón del exón 3
del gen ADH1B con la enzima MaeIII (ver Figura 4 en Resultados). El nt 5191 (G/A)
permite distinguir los alelos ADH1B*1 y ADH1B*3 del alelo ADH1B*2 porque determina
el cambio del aminoácido 47 entre las respectivas variantes alélicas. La enzima MaeIII
posee dos sitios de reconocimiento adicional en este amplicón, uno polimórfico (nt
5226), cuya identidad se determinó adicionalmente y se describe más adelante, y otro
no polimórfico que da origen a una banda de 88 pb que permite determinar si la
digestión enzimática ha sido completa.
La digestión enzimática se realizó con 6 µL de la resuspensión del amplicón del exón 3
del gen ADH1B (aprox. 360 ng), 0,5 unidades de MaeIII, Tris-HCl 40 mM (pH 8,2 a
55ºC), NaCl 550 mM, MgCl2 12 mM y 2-mercaptoetanol 14 mM (se usó el tampón 2X
para MaeIII de Roche Applied Sciences) en un volumen final de 12,6 µL. Se agregó
una gota de aceite mineral y se incubó a 55ºC durante tres horas. Se realizó una
electroforesis vertical en un gel de poliacrilamida no desnaturante al 15% en tampón
TBE a 15 W durante 1,5 horas, se tiñó el gel con bromuro de etidio y el resultado de la
digestión enzimática se analizó visualmente en un transiluminador. La identidad del
nucleótido 5191 se asignó a partir del patrón resultante de bandas de DNA (ver
Figura 4 en Resultados).
5.4.2. Determinación de la identidad del nt 15494 ( aa 369) del gen ADH1B (exón 9)
La identidad del nucleótido 15494 (aa 369) se determinó mediante la digestión del
amplicón del exón 9 del gen ADH1B con las enzimas BfuI y CaiI, por separado (ver
28
Figura 4 en Resultados). La determinación de esta identidad nucleotídica permite
diferenciar el alelo ADH1B*3 de los alelos ADH1B*1 y ADH1B*2, ya que codifica el
cambio del aminoácido 369. La digestión de este amplicón con BfuI permite reconocer
una citosina en la posición 15494, presente en los alelos ADH1B*1 y ADH1B*2,
mientras que la digestión con CaiI requiere una timina en la misma posición,
característica del alelo ADH1B*3 (ver Figura 4). Ninguna de estas enzimas posee sitios
de reconocimiento adicionales dentro del amplicón, por lo que en el caso de que se
produzca un corte parcial con una de ellas, la otra también debe cortar el amplicón
parcialmente, reflejando la heterocigosidad de la muestra en cuestión y no una
reacción enzimática incompleta.
Se sometió a digestión con la enzima BfuI la totalidad de este amplicón. La mezcla de
reacción se compuso de los 10 µL de la resuspensión del amplicón, 1 U de la enzima
BfuI, Tris-acetato 50 mM (pH 7,9 a 37ºC), acetato de magnesio 15 mM, acetato de
potasio 100 mM, BSA 0,1 mg/mL (se usó el tampón 10X para BfuI de Fermentas) y
agua hasta un volumen final de 15 µL. Se incubó a 37ºC durante toda la noche y luego
se sometió a una electroforesis horizontal en gel de agarosa al 2% en TAE durante 40
minutos a 120 V. De obtenerse una digestión parcial, o de no producirse en lo absoluto,
se amplificó nuevamente el exón 9 de la muestra y se digirió con la enzima CaiI. La
digestión con CaiI se realizó en 15 µL con la totalidad de la resuspensión del amplicón
(10 µL), 2 U de la enzima CaiI, Tris-acetato 33 mM (pH 7,9 a 37ºC), acetato de
magnesio 10 mM, acetato de potasio 66 mM, BSA 0,1 mg/mL (se usó el tampón Tango
10X de Fermentas). La reacción se incubó a 37ºC durante toda la noche y se sometió a
electroforesis vertical en geles de poliacrilamida no desnaturantes al 15% en TBE
durante 1,5 horas a 15 W. La identidad del nucleótido 15494 se asignó en base al
resultado de ambas digestiones.
5.5. Análisis estadístico
Se analizó la significación estadística de las diferencias en las frecuencias alélicas y
genotípicas entre los grupos de pacientes alcohólicos y de población general mediante
29
la prueba de chi cuadrado (χ2) de Pearson; se utilizó una tabla de contingencia de 2 por
2 de la página Simple Interactive Statistical Analysis (SISA) (http://www.quantitative
skills.com/sisa/). En los casos en que una celda contuviese un número menor a cinco
se utilizó el análisis exacto de Fisher de la misma página. Se consideraron como
estadísticamente significativos aquellos análisis en que se obtuvo un p < 0,05. En los
casos en que se encontró una diferencia significativa entre los grupos se calculó la
razón de proporciones (OR). Cuando no se encontró una diferencia significativa entre
los grupos se calculó el tamaño muestral requerido para poder encontrar tal diferencia
con el Researcher’s Toolkit (sample size calculator, percentages, two samples) de la
página de DSS Research (http://www.dssresearch.com/toolkit/default.asp). El tamaño
muestral para encontrar diferencias significativas se calculó mediante una prueba de
una cola (one-tail test) con un intervalo de confianza (IC) del 95% para obtener un
poder estadístico mínimo del 80%, valores convencionales en el cálculo de tamaños
muestrales (Chow et al., 2003). Se analizó también la significación estadística entre los
genotipos homocigotos y heterocigotos del gen ADH1C mediante la prueba exacta de
Fisher en una tabla de 2 por 3 de la página SISA.
5.6. Estudios adicionales: otros polimorfismos en e l exón 8 del gen ADH1C
En las bases de datos GenBank y SNP del NCBI se encontraron tres variaciones
nucleotídicas en el exón 8 del gen ADH1C adicionales a la variación A15115G
analizada en la determinación del genotipo de la ADH1C. La primera es una mutación
silente (C15057A) y las otras dos (A15115T y C15121A) son codificantes de cambios
aminoacídicos (Ile349Phe y Pro351Thr, respectivamente). La variación codificante del
cambio Pro351Thr (C15121A) es exclusiva de las poblaciones indígenas de América y
está asociada a la identidad nucleotídica 15115 G que define la Val349 de la ADH1C2
(Osier et al., 2002b). Se determinó la frecuencia de estas variaciones adicionales del
exón 8 (C15057A, A15115G/T y C15121A) en la población chilena para estimar su
posible contribución al riesgo de alcoholismo en sus portadores. No se encontraron
variaciones adicionales en las bases de datos en el exón 6 de este gen.
30
5.6.1. Determinación de la identidad del nucleótido 15057 del gen ADH1C
La identidad del nucleótido 15057 se determinó a partir de la digestión del amplicón del
exón 8 del gen ADH1C con la enzima de restricción BstXI (Figura 5). La variación
nucleotídica silente A15057C no ha sido asociada a las identidades de los nucleótidos
que definen los alelos del gen ADH1C (nt 11939 o nt 15115). BstXI requiere una
citosina en la posición 15057 y no es capaz de cortar si el nucleótido es adenina. No
hay otros sitios de reconocimiento para BstXI en este amplicón, ni se cuenta con una
enzima que requiera una adenina en la posición 15057, por lo que de obtener una
digestión parcial del amplicón con BstXI se asigna una adenina a la posición 15057 de
un alelo, aunque no se haya realizado una reacción que entregue de manera positiva
este resultado.
La digestión con BstXI se efectuó en 12 µL, utilizando 7,5 µL de la resuspensión del
amplicón del exón 8 del gen ADH1C (aprox. 405 ng), 2 unidades de la enzima BstXI,
Tris-HCl 50 mM (pH 7,5 a 37ºC), MgCl2 10 mM, NaCl 100 mM, BSA 0,1 mg/mL (se usó
el tampón O 10X de Fermentas) y una gota de aceite mineral. Las digestiones se
hicieron a 55ºC durante tres horas y se analizó su resultado mediante electroforesis
horizontal en geles de agarosa al 2% en TAE durante 40 minutos a 120 V. La identidad
del nucleótido 15057 se infirió del tamaño de las bandas de DNA generadas.
5.6.2. Determinación de la identidad T del nt 15115 (aa 349) del gen ADH1C
A pesar de que, en teoría, se pueden identificar los dos alelos del gen ADH1C al
analizar sólo una de las posiciones nucleotídicas codificantes de los cambios
aminoacídicos que diferencian las respectivas enzimas, nucleótidos 11939 y 15115, se
analizaron ambas, ya que en la base de datos de SNPs del NCBI (dbSNP) se encontró
una tercera identidad posible (T) para el nucleótido 15115, que codifica una fenilalanina
en el aminoácido 349, aparte de las otras dos identidades ya conocidas: 15115 A para
el alelo ADH1C*1 y 15115 G para el alelo ADH1C*2. Como se dijo anteriormente, esta
posición ha sido analizada en la mayor parte de la literatura utilizando la enzima SspI,
que corta cuando hay una adenina (A) y se le asigna constantemente una guanina (G)
31
a la reacción negativa, sin considerar posible la presencia de una timina (T), que
genera el mismo resultado en la reacción con SspI que la presencia de una guanina.
En esta memoria, para descartar que hubiera una timina en la posición 15115, se
utilizó la enzima de restricción TasI para digerir cada muestra (Figura 5). El amplicón
del exón 8 del gen ADH1C tiene un segundo sitio de reconocimiento para TasI que no
se encuentra sobre nucleótidos polimórficos, por lo que sirve de control interno de la
reacción.
La digestión con TasI se realizó en 15 µL, usando 7,5 µL de la resuspensión del
amplicón del exón 8 (aprox. 405 ng), 2 unidades de la enzima TasI, Tris-HCl 10 mM
(pH 7,5 a 37ºC), MgCl2 10 mM, BSA 0,1 mg/mL (se usó el tampón B 10X de
Fermentas) y una gota de aceite mineral. La mezcla de reacción se incubó a 65ºC
durante tres horas y se sometió a electroforesis vertical en geles de poliacrilamida no
desnaturantes al 15% en TBE durante 1,5 horas a 15 W.
5.6.3. Determinación de la identidad del nt 15121 ( aa 351) del gen ADH1C
La identidad del nucleótido 15121 se determinó digiriendo el amplicón del exón 8 del
gen ADH1C con la enzima Tru1I (Figura 5) que requiere una adenina en la posición
15121 (Thr351); no corta si en su lugar hay una citosina (Pro351). Tru1I cuenta con
dos sitios de corte adicionales en el amplicón. Estos sitios son constantes, por no
encontrarse sobre sitios polimórficos, sirviendo así de control interno de la reacción. No
se cuenta con una enzima que reconozca la identidad 15121 C, por lo que a la
reacción negativa con Tru1I se le asignó la identidad C.
La digestión se realizó en 15 µL, utilizando 7,5 µL de la resuspensión del amplicón del
exón 8 (aprox. 405 ng), 2 unidades de la enzima Tru1I, Tris-HCl 10 mM (pH 8,5 a
37ºC), MgCl2 10 mM, KCl 100 mM, BSA 0,1 mg/mL (se usó el tampón R 10X de
Fermentas) y una gota de aceite mineral. La reacción se incubó a 65ºC durante tres
horas y se sometió a electroforesis vertical en geles de poliacrilamida no desnaturantes
al 15% en TBE durante 1,5 horas a 15 W. La identidad del nucleótido 15121 se asignó
en base a los tamaños de las bandas de DNA obtenidas.
32
5.7. Estudios adicionales: otros polimorfismos en e l exón 3 del gen ADH1B
En las bases de datos GenBank y SNP del NCBI se encontraron dos variaciones
nucleotídicas en el exón 3 del gen ADH1B adicionales a la variación G5191A analizada
en la determinación del genotipo de la ADH1B (C5219A y A5226T), que son
codificantes de los cambios aminoacídicos Asn56Lys y Thr59Ser, respectivamente.
Ninguna de estas variaciones ha sido asociada a las identidades nucleotídicas que
definen los alelos del gen ADH1B (nucleótidos 5191 y 15494). La identidad de los
nucleótidos 5219 y 5226 se determinó para conocer la frecuencia de estas variaciones
en la población chilena, identificar las posibles asociaciones con las identidades de los
nucleótidos 5191 y 15494 y determinar su posible contribución al riesgo de alcoholismo
en sus portadores. No se encontraron variaciones adicionales en las bases de datos en
el exón 9 de este gen.
5.7.1. Determinación de la identidad del nt 5219 (a a 56) del gen ADH1B
La identidad del nucleótido 5219 se determinó digiriendo el amplicón del exón 3 del gen
ADH1B con la enzima de restricción MvaI. Esta enzima cuenta con cuatro sitios de
corte en este amplicón, pero sólo uno de ellos se encuentra sobre un sitio polimórfico
(nt 5219) (Figura 6). Los tres sitios restantes permiten asegurar que la digestión
enzimática ha sido completa.
La digestión se llevó a cabo en 12 µL, usando 6 µL de la resuspensión del amplicón del
exón 3 del gen ADH1B (aprox. 360 ng), 2 unidades de enzima de restricción MvaI, Tris-
HCl 10 mM (pH 8,5 a 37ºC), MgCl2 10 mM, KCl 100 mM, BSA 0,1 mg/mL (se utilizó el
tampón R 10X de Fermentas). La mezcla de reacción se incubó a 37ºC durante toda la
noche. El resultado se analizó mediante electroforesis vertical en geles de
poliacrilamida no desnaturantes al 15% en TBE durante 1,5 horas a 15 W.
5.7.2. Determinación de la identidad del nt 5226 (a a 59) del gen ADH1B
La identidad del nucleótido 5226 se determinó digiriendo el amplicón del exón 3 del gen
33
ADH1B con la enzima MaeIII (Figura 6) en la misma reacción que la determinación de
la identidad del nucleótido 5191 (aa 47), que permite identificar el alelo ADH1B*2
(Sección 5.4.1.) y que se realizó, por lo tanto, en la determinación del genotipo de la
ADH1B. El nucleótido 5226 es polimórfico (A/T), pero sus variantes no han sido
asociadas a las identidades de los nucleótidos que definen los alelos del gen ADH1B
(nt 5191 o nt 15494). La enzima MaeIII posee tres sitios de reconocimiento en el
amplicón del exón 3 del gen ADH1B: dos que contienen los nucleótidos polimórficos
5191 y 5226, ambos codificantes de cambios aminoacídicos (Arg47His y Asn56Lys,
respectivamente), y un tercer sitio no polimórfico que da origen a una banda de 88 pb
que permite determinar si la digestión enzimática ha sido completa (Figura 6).
5.8. Secuenciación
Se secuenció una muestra representativa de cada uno de los genotipos encontrados,
incluyendo heterocigotos y ambas posibilidades de homocigotos, cuando se
encontraron, además de las distintas combinaciones encontradas cuando se analizó
más de un nucleótido dentro de un mismo exón. Los amplicones se generaron en
condiciones idénticas a lo descrito para la genotipificación de cada gen y se purificaron
mediante la extracción de un gel de agarosa al 2% de electroforesis horizontal con el
sistema de purificación de DNA “Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System” de
Promega. Para la secuenciación de cada amplicón, y con el fin de contar con material
genético suficiente en la reacción de secuenciación, se juntó el producto de 3, 4, 12 o
16 reacciones distintas de PCR generadas a partir de la misma muestra, según sus
rendimientos. Los amplicones se enviaron al servicio de secuenciación del Centro de
Equipamiento y Servicios de Apoyo Tecnológico (CESAT) de la Facultad de Medicina
Norte de la Universidad de Chile o al servicio de secuenciación del Departamento de
Ecología de la Pontificia Universidad Católica de Chile (PUC). Ambos servicios utilizan
el método de secuenciación por fluorescencia, pero difieren en que el CESAT utiliza un
sistema de electroforesis en gel vertical y la PUC uno de electroforesis capilar. El
servicio de secuenciación del CESAT utiliza un secuenciador ABI PRISM 377 de AME
Bioscience (Toroed, Noruega) y el sistema de marcación DYEnamic ET Terminator
Cycle Sequencing Kit de Amersham Biosciences (Little Chalfort, BU, Inglaterra),
34
mientras que el servicio de la PUC cuenta con un secuenciador ABI PRISM 3100 de
AME Bioscience (Toroed, Noruega) y utiliza el sistema de marcación BigDye
Terminator v3.1 de Applied Biosystems (Foster City, CA, EE.UU.).
5.9. Análisis de secuencias
Las secuencias se analizaron manualmente a partir de los electroforetogramas
entregados por los secuenciadores automáticos. Se visualizaron con el programa
Chromas Lite (de licencia libre) y se compararon con las secuencias de los genes
ADH1B y ADH1C publicadas en GenBank, DQ017646 y DQ088981, respectivamente.
35
6. RESULTADOS
Para determinar si ciertos polimorfismos en el gen de la deshidrogenasa alcohólica
ADH1C confieren una protección genética contra el alcoholismo a la población chilena
se genotipificaron pacientes alcohólicos (n = 30) y población chilena general (n = 105)
en los genes ADH1C y ADH1B de la deshidrogenasa alcohólica mediante PCR-RFLP,
metodología que se verificó mediante secuenciación. Se determinaron las frecuencias
alélicas y genotípicas de los genes ADH1C y ADH1B de ambos grupos, se compararon
y se evaluó la significación estadística de las diferencias encontradas.
6.1. Obtención de DNA de sangre de pacientes alcohó licos
Al comienzo de este estudio la extracción del DNA de las muestras de sangre de los
pacientes alcohólicos se efectuó con el reactivo DNAzol (Chomczynski et al., 1997),
usando una fracción de la sangre rica en leucocitos y plaquetas conocida en inglés
como “buffy coat”. La separación de esta fracción mediante centrifugación permitió
utilizar una cantidad reducida de DNAzol. Este método dio un rendimiento de 2 a 8 µg
de DNA por 5 mL de sangre, menor en comparación a los 30 a 40 µg obtenidos
después con el método de Lahiri y Nurnberger (1992) que se basa en la separación de
los núcleos celulares de la sangre total para la purificación del DNA nuclear. Se adoptó
este método por su mayor rendimiento y menor costo que el método que emplea
DNAzol y por no requerir el uso de solventes orgánicos o digestiones enzimáticas.
6.2. Diseño del método de genotipificación
Se desarrolló un método de genotipificación para los genes ADH1C y ADH1B basado
en la técnica de PCR seguida de la identificación de polimorfismos mediante digestión
con enzimas de restricción (PCR-RFLP; del inglés “polymerase chain reaction -
restriction fragment length polymorphism”). En la literatura hay un gran número de
publicaciones en que se determinan los genotipos de la ADH1C y de la ADH1B de
distintas poblaciones del mundo. Estos estudios relacionan los distintos genotipos con
riesgos aumentados, o disminuidos, de alcoholismo o hepatopatías. Las técnicas
36
utilizadas abarcan hibridación con oligonucleótidos específicos (Neumark et al., 2004,
Wall et al., 2003, Espinós et al., 1997, Shen et al., 1997, Higuchi et al., 1996,
Thomasson et al., 1994, Gilder et al., 1993, Day et al., 1991), digestiones con enzimas
de restricción (PCR-RFLP) (Konishi et al., 2004, Vidal et al., 2004, Frenzer et al., 2002,
Hines et al., 2001, Lee et al., 2001, Borràs et al., 2000, Chao et al., 2000, Chen et al.,
1999, Grove et al., 1998, Chen et al., 1997, Nakamura et al., 1996), identificación de
polimorfismos de conformación de hebra simple (SSCP; del inglés “single strand
conformation polymorphism”) (Ballo et al., 2003, Walzer et al., 1993) y secuenciación
directa (Chambers et al., 2002, Tanaka et al., 1996). En los estudios más antiguos se
realizaron fenotipificaciones (Parés et al., 1994, Poupon et al., 1992) en lugar de
genotipificaciones, lo que requiere de biopsias hepáticas, que son más difíciles de
conseguir que muestras de sangre. El método implementado en esta memoria
comparte ciertos aspectos de lo realizado anteriormente por otros autores y difiere en
otros, como se detalla más adelante.
Se amplificaron mediante PCR dos exones de cada uno de los genes: los exones 6 y 8
del gen ADH1C y los exones 3 y 9 del gen ADH1B. Estos exones contienen los
polimorfismos codificantes de los cambios aminoacídicos que definen las variantes
alélicas de cada enzima. Se diseñaron partidores específicos para la amplificación de
los segmentos de interés y se encontraron enzimas de restricción específicas para el
análisis de cada posición nucleotídica de interés. Además de la determinación de los
genotipos de la ADH1C y de la ADH1B en base a los nucleótidos tradicionalmente
identificados para ello, se analizaron en cada gen posiciones nucleotídicas polimórficas
adicionales, contenidas en los exones amplificados para la genotipificación, utilizando
la misma técnica de PCR-RFLP. Se detallan más adelante los resultados de la
genotipificación en términos de frecuencias genotípicas y alélicas de los genes ADH1C
y ADH1B, comparando lo obtenido en los grupos de pacientes alcohólicos y población
chilena general.
6.2.1. Diseño de partidores de PCR
Los partidores de PCR se diseñaron luego de hacer un análisis de los partidores
37
utilizados en la literatura. Se compararon los partidores publicados respecto a los
archivos GenBank DQ017646 para el gen ADH1B y DQ088981 para el gen ADH1C. Se
descartaron aquellos partidores publicados en la literatura que contuviesen errores de
secuencia o que se anclaran en sitios polimórficos descritos en GenBank o en la base
de datos de SNPs (Tablas 7, 8 y 9). Los tres genes de la deshidrogenasa alcohólica de
la clase I (ADH1A, ADH1B y ADH1C) comparten un gran porcentaje de identidad,
razón por la cual los partidores se diseñaron utilizando un alineamiento de las
secuencias de estos genes (ADH1A GenBank AY948115, ADH1B GenBank DQ017646
y ADH1C GenBank DQ088981) generado con el programa ClustalW (Thompson et al.,
1994) (www.ebi.ac.uk/clustalw/) y posicionando los partidores en zonas con un máximo
de diferencias de secuencia entre los genes. Todos los partidores se diseñaron para
anclarse fuera de sitios polimórficos cuando fue posible y para tener una temperatura
media de apareamiento teórica de 62ºC calculada en base a la fórmula Tm = 4 × (CG) +
2 × (AT), exceptuando al partidor TG-330 que tiene una Tm de 66ºC.
Partidores para el gen ADH1C
La amplificación del exón 6 del gen ADH1C no ha sido reportada en la literatura, por lo
que los partidores utilizados (TG-351 y TG-352) se diseñaron sin contar con tal
información. El partidor TG-352 es el único oligonucleótido que se diseñó degenerado
(Tabla 3), porque dentro de su secuencia se encuentra un nucleótido polimórfico.
Los partidores utilizados al comienzo de esta memoria para la amplificación del exón 8
del gen ADH1C (TG-341 y TG-342) se diseñaron a partir de los publicados por Osier et
al. 2002a (Tabla 7), con leves modificaciones para aumentar su Tm de 58 a 62ºC. Con
esta pareja de partidores sólo se logró amplificar muestras que tenían uno o dos alelos
ADH1C*1 según el análisis del exón 6 del mismo gen. Con tales partidores las
muestras de individuos homocigotos ADH1C*1/*1 se amplificaron con un rendimiento
aproximado de 700 ng, las de heterocigotos ADH1C*1/*2 con un rendimiento de 350 a
200 ng y las de homocigotos ADH1C*2/*2 no se amplificaron en absoluto. Se intentó
aumentar el rendimiento disminuyendo la temperatura de apareamiento de la PCR,
pero no dio resultado, así como tampoco funcionó agregar seroalbúmina bovina (BSA)
38
Tabla 7 Partidores de PCR descritos en la literatura para l a amplificación del exón 8 del gen ADH1C Se informan las características de los partidores utilizados en cada trabajo; las publicaciones se presentan en orden cronológico. Las características de los partidores son: orientación (sentido > o antisentido <), largo en nucleótidos, secuencia (en la que se encuentran destacados los errores en negrita), temperatura media de apareamiento (Tm) calculada según la fórmula Tm = 4 × (CG) + 2 × (AT), posición de anclaje según el archivo GenBank DQ088981 y tipo de error que contiene la secuencia del partidor. Algunos de estos partidores han sido utilizados en más de un estudio, por lo que sólo se informan aquéllos de los artículos originales o los que presentan diferencias respecto de estos artículos. ADH1C exón 8
Anclaje Autores
>
<
Largo
(nt) Secuencia 5’ – 3’
Tm
(teórica) 5' 3' Errores
> 23 CTT TAA GAG TAA AGA ATC TGT CC 62ºC 15033 15055 SNP Xu et al.
(1988) < 22 ACC TCT TTC CAG AGC GAA GCA G 68ºC 15172 15151 no
> 20 GAA TCT GTC CCC AAA CTT GT 58ºC 15046 15066 SNP Gennari et al.
(1988) < 20 CTT TCC AGA GCG AAG CAG GT 62ºC 15168 15149 no
> 26 GCT TTA AGA GTA AAT ATT CTG TCC CC 72ºC 15032 15057 SNP Groppi et al.
(1990) < 20 AAT CTA CCT CTT TCC GAA GC 58ºC 15177 15158 AG
> 26 GCT TTA AGA GTA AAT ATT CTG TCC CC 72ºC 15032 15057 SNP Chao et al.
(1994) < 20 AAT CTA CCT CTT TCC AGA GC 58ºC 15177 15158 no
> 24 TTG TTT ATC TGT GAT TTT TTT TGT 58ºC 14842 14865 no Osier et al.
(2002a) < 21 CGT TAC TGT AGA ATA CAA AGC 58ºC 15218 15198 C
> 26 GCT TTA AGA GTA AAT AAT CTG TCC CC 72ºC 15032 15057 T; SNP Vidal et al.
(2004) < 20 ATT CTA CCT CTT TCC AGA GC 58ºC 15177 15158 A
partidores utilizados en la presente memoria Los partidores utilizados por Osier et al. (2002a) se utilizaron también al inicio de esta memoria. Estos se nombraron TG-341 (sentido) y TG-342 (antisentido) descritos en la Tabla 3 en Materiales. Con esta pareja de partidores sólo se logró amplificar el alelo ADH1C*1, por lo que se utilizó el partidor antisentido de Groppi et al. (1990), llamándolo TG-375 (Tabla 3), junto con un partidor sentido, TG-374, que se diseñó sin utilizar referentes.
39
Tabla 8
Partidores de PCR descritos en la literatura para l a amplificación del exón 3 del gen ADH1B Se informan las características de los partidores utilizados en cada trabajo; las publicaciones se presentan en orden cronológico. Las características de los partidores son: orientación (sentido > o antisentido <), largo en nucleótidos, secuencia (en la que se encuentran destacados los errores en negrita), temperatura media de apareamiento (Tm) calculada según la fórmula Tm = 4 × (CG) + 2 × (AT), posición de anclaje según el archivo GenBank DQ017646 y tipo de error que contiene la secuencia del partidor. Algunos de estos partidores han sido utilizados en más de un estudio, por lo que sólo se informan aquéllos de los artículos originales o los que presentan diferencias respecto de estos artículos. ADH1B exón 3
Autores >
<
Largo
(nt) Secuencia 5’ – 3’
Tm
(teórica) Posición Errores
> 22 AAT CTT TTC TGA ATC TGA ACA G 58ºC 5129-5150 no Xu et al.
(1988) < 21 GAA GGG GGG TCA CCA GGT TGC 70ºC 5235-5215 SNP
> 20 ATT CTG TAG ATG GTG GCT GT 58ºC 5160-5179 SNP Gennari et al.
(1988) < 20 GGG GGT CAC CAG GTT GCC AC 68ºC 5231-5212 SNP
> 20 ATT CTG TAG ATG GTG GCT GT 58ºC 5160-6179 SNP Groppi et al.
(1990) < 20 GAA GGG GGG TCA CCA GGT TG 66ºC 5235-5216 SNP
> 24 CTT TAT TCT GTA GAT GGT GGC TGT 68ºC 5160-5179 SNP Walzer et al.
(1993) < 20 GGT TGC CAC TAA CCA CGT GG 64ºC 5229-5211 SNP
> 22 AAT CTT TTC TGA ATC TGA ACA G 58ºC 5129-1250 no Chao et al.
(1994) < 20 GAA GGG GGG TCA CCA GGT TG 66ºC 5235-5216 SNP
> 23 TAA TCT TTT CTG AAT CTG AAC AG 60ºC 5128-5150 C Tanaka et al.
(1996) < 20 GGC CTA AAA TCA CAG GAA GG 60ºC 5250-5231 no
> 15 CTG TAG GAA TCT GTC 44ºC 5176-5190 no Nishiyori et al.
(1998) < 15 CCT TCT CCA ACA CTA 44ºC 5643-5629 GGT CAG; SNP
> 25 ATT CTA AAT TGT TTA ATT CAA GAA G 60ºC 4954-4978 no Osier et al.
(2002a) < 21 ACT AAC ACA GAA TTA CTG GAC 58ºC 5632-5612 no
> 21 ATT CTT TTC TGA ATC TGA ACA 54ºC 5129-5149 A Vidal et al.
(2004) < 20 GAA GGG GGG TCA CCA GGT TG 66ºC 5235-5216 SNP
partidor utilizado en la presente memoria Se le llamó TG-330 (Tabla 4 en Materiales) y se utilizó junto con un partidor antisentido, TG-331, que se diseñó sin utilizar referentes (Tabla 4).
40
Tabla 9 Partidores de PCR descritos en la literatura para l a amplificación del exón 9 del gen ADH1B Se informan las características de los partidores utilizados en cada trabajo; las publicaciones se presentan en orden cronológico. Las características de los partidores son: orientación (sentido > o antisentido <), largo en nucleótidos, secuencia (en la que se encuentran destacados los errores en negrita), temperatura media de apareamiento (Tm) calculada según la fórmula Tm = 4 × (CG) + 2 × (AT), posición de anclaje según el archivo GenBank DQ017646 y tipo de error que contiene la secuencia del partidor. Algunos de estos partidores han sido utilizados en más de un estudio, por lo que sólo se informan aquéllos de los artículos originales o los que presentan diferencias respecto de estos artículos. ADH1B exón 9
Anclaje Autores
>
<
Largo
(nt) Secuencia 5’ – 3’
Tm
(teórica) 5' 3' Errores
> 22 TGG ACT CTC ACA ACA AGC ATG T 64ºC 15423 15444 no Xu et al.
(1988) < 24 TTG ATA ACA TCT CTG AAG AGC TGA 66ºC 15624 15601 SNP
> 23 TGG ACT CTC ACA ACA AGC ATG GT 68ºC 15423 15445 G sobra
< 20 TTT CTT TGG AAA GCC CCC AT 58ºC 15654 15635 no
> 16 TCT TTC CTA TTG CAG C 46ºC 15475 15490 G TAG C
Groppi et al.
(1990)
< 20 TTT CTT TGG AAA GCC CCC AT 58ºC 15654 15635 no
> 21 TGG ACT TCA CAA CAA CAA GCA TGT 69ºC 15423 15444 T CT Osier et al.
(2002a) < 24 TTG ATA ACA TCT CTG AAG AGC TGA 75ºC 15624 15601 SNP
Ninguno de estos partidores se utilizó en la presente memoria.
41
o dimetilsulfóxido (DMSO) para disminuir la cantidad de productos secundarios. Se
diseñaron, entonces, dos nuevos partidores para esta amplificación, TG-374 y TG-375,
el primero sin tomar otro partidor como referencia y el segundo modificado del partidor
inverso utilizado para el mismo fin por Groppi et al. (1990) (Tabla 7). Con esta nueva
pareja de partidores sí se consiguió amplificar muestras de distintos genotipos de la
ADH1C, por lo que se utilizó para la genotipificación de todas las muestras. Para
determinar si ambos TG-341 y TG-342 o sólo uno restringía la amplificación al alelo
ADH1C*1 se combinaron en distintas reacciones de amplificación los partidores
TG-341 con TG-375 y TG-374 con TG-342. Se determinó así que sólo el partidor TG-
341 es específico para el alelo ADH1C*1, ya que la pareja de partidores TG-374 y
TG-342 permitió amplificar muestras de todos los genotipos de la ADH1C encontrados,
mientras que la pareja TG-341 y TG-375 sólo permitió amplificar muestras portadoras
del alelo ADH1C*1, como se había obtenido en un principio.
Partidores para el gen ADH1B
Para la amplificación del exón 3 del gen ADH1B se modificó el partidor directo utilizado
por Xu et al. (1988) (Tabla 8) para aumentar su Tm de 58 a 66ºC agregándole dos
citosinas (C), una en el extremo 5’ y otra en el extremo 3’ (partidor TG-330, Tabla 4). El
partidor inverso (TG-331) se diseñó sin utilizar referentes, así como ambos partidores
para la amplificación del exón 9 del mismo gen (TG-349 y TG-350).
6.2.2. Enzimas utilizadas en la genotipificación me diante PCR-RFLP
Se encontró que las enzimas de bacterias termófilas (BstXI, MaeIII, TasI y Tru1I)
digirieron el DNA más rápidamente por unidad de enzima que las de organismos
mesófilos (todas las otras), por lo que se utilizaron tres horas de digestión para las
enzimas resistentes a temperaturas altas y toda la noche para las restantes.
6.3. Determinación del genotipo de la ADH1C mediant e PCR-RFLP
El genotipo de la ADH1C de los pacientes alcohólicos y de los individuos de la
42
población chilena general se determinó analizando las variaciones nucleotídicas que
codifican los dos cambios aminoacídicos en que difieren las variantes polimórficas de
la deshidrogenasa alcohólica ADH1C.
Se analizaron mediante PCR-RFLP los nucleótidos 11939 (G/A) en el exón 6 y 15115
(A/G) en el exón 8 del gen ADH1C. Se encontraron ambas variaciones nucleotídicas en
los dos grupos de estudio, encontrándose los dos alelos del gen ADH1C tanto en los
pacientes alcohólicos como en la población chilena general: ADH1C*1 (Arg271, Ile349)
y ADH1C*2 (Gln271, Val349). Los resultados de las digestiones determinantes del
genotipo de la ADH1C fueron siempre concordantes entre sí, encontrándose sólo las
combinaciones descritas para estas identidades nucleotídicas: ADH1C*1 = 11939 G y
15115 A, y ADH1C*2 = 11939 A y 15115 G.
La distribución de los alelos del gen ADH1C en los pacientes alcohólicos es
notoriamente distinta de la distribución en la población general (Tabla 10). Esta
diferencia se mantiene al descontar de ambos grupos los portadores de los alelos
protectores ADH1B*2 y ADH1B*3. También hay una diferencia entre los grupos en las
frecuencias genotípicas del gen ADH1C (Tabla 11).
6.3.1. Identidad del nucleótido 11939 (aa 271) del gen ADH1C (exón 6)
La identidad del nucleótido 11939 (G/A) se determinó digiriendo el amplicón del exón 6
con las enzimas Bsh1285I y AluI en paralelo (Figura 3), lo que permitió identificar los
alelos ADH1C*1 y ADH1C*2, respectivamente. En todos los casos se obtuvieron
resultados congruentes, ya que cuando una enzima cortó completamente un amplicón,
la otra no lo cortó y cuando una enzima produjo un corte parcial, la otra también lo hizo.
Los resultados obtenidos para ambas digestiones se muestran visualmente en la
Figura 3 para las tres combinaciones obtenidas: nt 11939 A/A, A/G y G/G (genotipos
ADH1C*2/*2, ADH1C*1/*2 y ADH1C*1/*1, respectivamente).
43
Tabla 10
Alelos de los genes ADH1C y ADH1B en pacientes alcohólicos y población general Se detallan los alelos de los genes ADH1C y ADH1B encontrados en los grupos de pacientes alcohólicos y población chilena general. Se informa la identidad de los nucleótidos analizados de cada alelo encontrado, junto con el aminoácido que codifica cada variación nucleotídica. Se indican el número encontrado de cada alelo y su proporción en cada grupo de estudio. Para el gen ADH1C se muestran por separado los grupos al incluir y al descontar a los portadores de los alelos ADH1B*2 y ADH1B*3. En la parte inferior de cada segmento se detallan la significación estadística (p) de Pearson, la razón de probabilidades (OR) y el inverso de la OR (1/OR) de cada análisis. El análisis de las frecuencias alélicas del gen ADH1C muestra que el alelo ADH1C*2 aumenta el riesgo de alcoholismo de la población chilena. Alelos del gen ADH1C
exón 6 exón 8 Sin descontar a los
portadores de los alelos ADH1B*2 y ADH1B*3
Descontando a los portadores de los alelos
ADH1B*2 y ADH1B*3 Alelo nt
11939
aa
271
nt
15115
aa
349
pacientes
alcohólicos %
población
general %
pacientes
alcohólicos %
población
general %
ADH1C*1 G Arg A Ile 36 60 155 74 31 57 132 73
ADH1C*2 A Gln G Val 24 40 55 26 23 43 50 28
60 100 210 100 54 100 182 100
p = 0,038; OR = 1,88; 1/OR = 0,53 p = 0,035; OR = 1,96; 1/OR = 0,51
Un portador del alelo ADH1C*2 tiene casi el doble de probabilidades de ser alcohólico que un portador del alelo ADH1C*1.
Alelos del gen ADH1B
exón 3 exón 9 Pacientes
alcohólicos Población
general Alelos
nt 5191
aa 47
nt 15494
aa 369
n % n %
ADH1B*1 G Arg C Arg 57 95 198 94
ADH1B*2 A His C Arg 3 5 10 5
ADH1B*3 G Arg T Cys 0 0 2 1
60 100 210 100
44
Tabla 11 Genotipos de la ADH1C y la ADH1B de pacientes alcoh ólicos y población general Se detallan los genotipos de la ADH1C y de la ADH1B encontrados en los grupos de pacientes alcohólicos y población chilena general. Se informa la identidad de los nucleótidos 11939 y 15115 para el gen ADH1C y 5191 y 15494 para el gen ADH1B, junto con los aminoácidos codificados por cada variación nucleotídica. Se indican el número encontrado de cada genotipo y su proporción en cada grupo de estudio. Genotipo de la ADH1C
exón 6 exón 8 Pacientes
alcohólicos
Población
general Genotipo
nt
11939
aa
271
nt
15115
aa
349 n % n %
ADH1C*1/*1 G/G Arg A/A Ile 11 37 57 54
ADH1C*1/*2 G/A Arg/Gln A/G Ile/Val 14 46 41 39
ADH1C*2/*2 A/A Gln G/G Val 5 17 7 7
30 100 105 100
p < 0,05 al comparar los genotipos ADH1C*1/*1 y ADH1C*2/*2 de los pacientes alcohólicos y respecto de la población general
Genotipo de la ADH1B
exón 3 exón 9 Pacientes
alcohólicos
Población
general Genotipo
nt
5191
aa
47
nt
15494
aa
369 n % n %
ADH1B*1/*1 G/G Arg C/C Arg 27 90 94 90
ADH1B*1/*2 G/A Arg/ His C/C Arg 3 10 8 8
ADH1B*2/*2 A/A His C/C Arg 0 0 1 1
ADH1B*1/*3 G/G Arg C/T Arg/Cys 0 0 2 2
30 100 105 100
45
Figura 3 Identidades de los nucleótidos 11939 (exón 6) y 151 15 (exón 8) del gen ADH1C En la parte superior se muestra un esquema lineal del gen de la ADH1C, los dos amplicones generados con la PCR y los sitios de corte de las enzimas Bsh1285I, AluI y SspI en los correspondientes amplicones de los alelos ADH1C*1 y ADH1C*2. Las flechas verticales negras corresponden a sitios de corte variable (polimórficos) y las grises a sitios de corte constante (no polimórficos). En la parte inferior se muestran los tres patrones de bandas de DNA obtenidas para cada digestión. Sobre cada carril se informa la identidad del nucleótido analizado, inferida a partir del respectivo patrón de bandas de DNA.
1k750
500
250
585
279306
pb
pb
std A/A A/G G/G
Bsh1285I
200
150
100
75
585364
134
pb
pbA/A A/G G/Gstd
Alu I
191173
84
Ssp I
500400300
200
100
242307
65
pb
pb
A/Gstd A/A G/G
1 92 3 4 5 6 7 8
TG-351
11631 12215TG-375
15179
TG-374
14873TG-352 307 pb585 pb
ADH1C
(Val349)G
(Gln271)A ADH1C*2
307G
134 173A
84191
15115
(Ile349)A
11939
(Arg271)G ADH1C*1
Ssp IAAT/ATT
65A
242
Bsh1285ICGRY/CG
G306 Alu I
AG/CT
279
3
364G (ADH1C*1)
1k750
500
250
585
279306
pb
pb
std A/A A/G G/G
Bsh1285I
200
150
100
75
585364
134
pb
pbA/A A/G G/Gstd
Alu I
191173
84
Ssp I
500400300
200
100
242307
65
pb
pb
A/Gstd A/A G/G
1k750
500
250
585
279306
pb
pb
std A/A A/G G/G
Bsh1285I
1k750750
500500
250250
585585
279306
pb
pb
std A/A A/G G/G
Bsh1285I
200
150
100
75
585364
134
pb
pbA/A A/G G/Gstd
Alu I
191173
84
200
150
100
75
585364
134
pb
pbA/A A/G G/Gstd
Alu I
191173
84
Ssp I
500400300
200
100
242307
65
pb
pb
A/Gstd A/A G/G
Ssp I
500500400400300300
200200
100100
242307
65
pb
pb
A/Gstd A/A G/G
1 92 3 4 5 6 7 8
TG-351
11631 12215TG-375
15179
TG-374
14873TG-352 307 pb585 pb
ADH1C1 92 3 4 5 6 7 81 92 3 4 5 6 7 8
TG-351
11631 12215TG-375
15179
TG-374
14873TG-352 307 pb585 pb
ADH1C
(Val349)G
(Gln271)A ADH1C*2
307G
134 173A
84191
15115
(Ile349)A
11939
(Arg271)G ADH1C*1
Ssp IAAT/ATT
65A
242
Bsh1285ICGRY/CG
G306 Alu I
AG/CT
279
3
364G (ADH1C*1)
(Val349)G
(Val349)G
(Gln271)A
(Gln271)A ADH1C*2
307G
134 173A
84191
15115
(Ile349)A
(Ile349)A
11939
(Arg271)G
(Arg271)G ADH1C*1
Ssp IAAT/ATT
65A
242
Bsh1285ICGRY/CG
Bsh1285ICGRY/CG
G306 Alu I
AG/CTAlu IAG/CT
279
3
364G (ADH1C*1)
46
6.3.2. Identidad del nucleótido 15115 (aa 349) del gen ADH1C (exón 8)
La identidad del nucleótido 15115 (A/G) se determinó mediante la digestión del
amplicón del exón 8 con la enzima SspI (Figura 3). Esta enzima reconoce la identidad
15115 A, característica del alelo ADH1C*1. No se contó con una enzima que
reconociera la identidad 15115 G, característica del alelo ADH1C*2, por lo que esta
identidad se asignó a la reacción negativa con SspI. Se obtuvieron tres resultados
distintos: corte total (A/A = ADH1C*1/*1), corte parcial (A/G = ADH1C*1/*2) o sin corte
(G/G = ADH1C*2/*2). Los distintos resultados obtenidos se muestran visualmente en la
Figura 3.
6.4. Determinación del genotipo de la ADH1B mediant e PCR-RFLP
Se determinó el genotipo de la ADH1B de los pacientes alcohólicos y de los individuos
de la población chilena general para descartar la contribución de los alelos de este gen
al riesgo de alcoholismo. A pesar de que no se ha determinado este genotipo en la
población chilena, se espera encontrar resultados similares a los encontrados en la
población mexicana (Konishi et al., 2003a), en que el alelo permisivo ADH1B*1 se
encuentra en una frecuencia de 95%. Entonces, de encontrarse diferencias en el riesgo
de alcoholismo según las variantes del gen ADH1C, no serían atribuibles a una
asociación de las variantes protectoras de los genes ADH1C y ADH1B como en la
población asiática, sino a un efecto propio del gen ADH1C e independiente del
genotipo de la ADH1B.
El genotipo de la ADH1B de cada individuo se obtuvo determinando la identidad de las
posiciones nucleotídicas en los exones 3 y 9 que codifican los cambios aminoacídicos
entre las tres isoformas de la deshidrogenasa alcohólica ADH1B.
Se analizaron mediante PCR-RFLP los nucleótidos 5191 (G/A) en el exón 3 y el
nucleótido 15494 (C/T) en el exón 9. Sólo la posición 5191 presentó variaciones en
ambos grupos de estudio. Se encontraron en la población chilena los tres alelos del
gen ADH1B: ADH1B*1 (5191 G, 15494 C), ADH1B*2 (5191 A, 15494 C) y ADH1B*3
47
(5191 G, 15494 T), codificantes de las respectivas isoenzimas, ADH1B1 (Arg47,
Arg369), ADH1B2 (His47, Arg369), ADH1B3 (Arg47, Cys369). El alelo ADH1B*1
(permisivo) se encontró en una frecuencia de 95 y 94% en los grupos de pacientes
alcohólicos y población chilena general (Tabla 10) y los otros dos alelos se encontraron
en muy baja proporción. Las distribuciones de las frecuencias alélicas (Tabla 10) y
genotípicas (Tabla 11) tienen poca variación entre los grupos estudiados. No se
encontraron resultados que sugirieran la presencia de un alelo con la doble variante
5191 A y 15494 T, que puede existir en teoría, pero que nunca ha sido descrito.
6.4.1. Identidad del nucleótido 5191 (aa 47) del ge n ADH1B (exón 3)
Se determinó la identidad del nucleótido 5191 (G/A) mediante la digestión del amplicón
del exón 3 con la enzima MaeIII (Figura 4). Esta digestión permitió identificar el alelo
ADH1B*2 (5191 A) y diferenciarlo de los alelos ADH1B*1 y ADH1B*3 (ambos 5191 G).
Se obtuvieron los tres resultados posibles debidos a la variación del nucleótido 5191:
G/G, G/A y A/A, que se muestran en la Figura 4. El alelo protector ADH1B*2 se
encontró en los dos grupos de estudio y en ambos en una frecuencia baja (Tabla 10).
6.4.2. Identidad del nucleótido 15494 (aa 369) del gen ADH1B (exón 9)
La identidad del nucleótido 15494 (C/T) se determinó mediante la digestión del
amplicón del exón 9 con las enzimas BfuI y CaiI por separado (Figura 4), lo que
permitió diferenciar al alelo ADH1B*3 (15494 T) de los alelos ADH1B*1 y ADH1B*2
(ambos 15494 C). Sólo se encontraron dos individuos heterocigotos portadores del
alelo ADH1B*3 en el grupo de población general, no encontrándose ningún portador
entre los pacientes alcohólicos (Tablas 10 y 11). Las identidades de este nucleótido y
el anterior (nt 5191, aa 47) permiten identificar al alelo ADH1B*1, ya que difiere de los
alelos ADH1B*2 y ADH1B*3 en estas dos posiciones (Figura 4). En la determinación de
esta identidad nucleotídica se encontró un individuo portador de una nueva mutación
en el nucleótido 15490, codificante de un cambio aminoacídico Ser367Arg. Este caso
en particular se detalla más adelante (sección 6.7.8.).
48
Figura 4 Identidades de los nucleótidos 5191 (exón 3) y 1549 4 (exón 9) del gen ADH1B En la parte superior se muestra un esquema lineal del gen de la ADH1B, los dos amplicones generados con la PCR y los sitios de corte de las enzimas MaeIII, BfuI y CaiI en los correspondientes amplicones de los alelos ADH1B*1, ADH1B*2 y ADH1B*3. Las flechas verticales negras corresponden a sitios de corte variable (polimórficos) y las grises a sitios de corte constante (no polimórficos). En la parte inferior se muestran los patrones de bandas de DNA obtenidas para cada digestión. Sobre cada carril se informa la identidad del nucleótido analizado, inferida a partir del respectivo patrón de bandas de DNA.
Cai I
200150
10075
50
217290
73
pbpb
C/Tstd sinEnz
200150
10075
50
249
35
95886660
pbpb
std sinEnzG/G G/A A/A
Mae III
500400300
200
100
290207
83
pb
pb
C/C C/T sinEnzstdBfu I
Cai ICAGNNN/CTG
(Cys369)T
(Arg47)G ADH1B*3
217T
73G
886695G
(Arg369)C
(His47)A ADH1B*2
207C
8360 35A
8866
15494
(Arg369)C
5191
(Arg47)G ADH1B*1
Bfu IGTATCC(6/5)
207C
83
Mae III/GTNAC
G886695
1 92 3 4 5 6 7 8
TG-330
5128 5276TG-350
15706
TG-349
15417TG-331 290 pb249 pb
ADH1B
Cai I
200150
10075
50
217290
73
pbpb
C/Tstd sinEnz
200150
10075
50
249
35
95886660
pbpb
std sinEnzG/G G/A A/A
Mae III
500400300
200
100
290207
83
pb
pb
C/C C/T sinEnzstdBfu I Cai I
200150
10075
50
217290
73
pbpb
C/Tstd sinEnzCai I
200150
10075
50
217290
73
pbpb
C/Tstd sinEnz
200150
10075
50
249
35
95886660
pbpb
std sinEnzG/G G/A A/A
Mae III
200150
10075
50
249
35
95886660
pbpb
std sinEnzG/G G/A A/A
Mae III
500400300
200
100
290207
83
pb
pb
C/C C/T sinEnzstdBfu I
500400300
200
100
290207
83
pb
pb
C/C C/T sinEnzstdBfu I
Cai ICAGNNN/CTG
(Cys369)T
(Arg47)G ADH1B*3
217T
73G
886695G
(Arg369)C
(His47)A ADH1B*2
207C
8360 35A
8866
15494
(Arg369)C
5191
(Arg47)G ADH1B*1
Bfu IGTATCC(6/5)
207C
83
Mae III/GTNAC
G886695
Cai ICAGNNN/CTG
Cai ICAGNNN/CTG
(Cys369)T
(Cys369)T
(Arg47)G
(Arg47)G ADH1B*3
217T
73G
886695G
(Arg369)C
(Arg369)C
(His47)A
(His47)A ADH1B*2
207C
8360 35A
8866
15494
(Arg369)C
(Arg369)C
5191
(Arg47)G
(Arg47)G ADH1B*1
Bfu IGTATCC(6/5)
207C
83
Mae III/GTNAC
Mae III/GTNAC
G886695
1 92 3 4 5 6 7 8
TG-330
5128 5276TG-350
15706
TG-349
15417TG-331 290 pb249 pb
ADH1B1 92 3 4 5 6 7 81 92 3 4 5 6 7 81 92 3 4 5 6 7 8
TG-330
5128 5276TG-350
15706
TG-349
15417TG-331 290 pb249 pb
ADH1B
49
6.5. Análisis estadístico de la comparación entre p acientes alcohólicos y población
chilena general
Se compararon las frecuencias alélicas y genotípicas de los genes ADH1C y ADH1B
entre los pacientes alcohólicos y la población chilena para determinar si el alelo
ADH1C*2 y/o el genotipo ADH1C*2/*2 aumentan el riesgo de alcoholismo en la
población chilena. Se analizó el efecto del genotipo de la ADH1C sobre el riesgo de
alcoholismo en presencia y en ausencia de los portadores de los alelos protectores del
gen ADH1B, para conocer y poder descontar del análisis su posible influencia sobre el
riesgo de alcoholismo. Cuando se encontraron diferencias significativas entre los
grupos se calculó la razón de probabilidades (OR) y su inverso para darle un
significado lógico a las cifras resultantes. Cuando no se encontró una significación
estadística se calculó el tamaño muestral necesario para encontrar tal diferencia. Los
análisis hechos, independientemente de sus resultados, se presentan a continuación.
Se estudiaron modelos de dominancia y recesividad para conocer el comportamiento
de los alelos del gen ADH1C sobre el riesgo de alcoholismo en la población chilena.
6.5.1. Frecuencias de los alelos ADH1C*1 y ADH1C*2
Se encontraron diferencias estadísticamente significativas (χ2 = 4,30; p = 0,0381) entre
los grupos de pacientes alcohólicos y población chilena general al comparar entre ellos
las frecuencias alélicas de ADH1C*1 (Arg271, Ile349) y ADH1C*2 (Gln271, Val349)
(Tabla 10). La diferencia encontrada indica que el alelo ADH1C*2 aumenta el riesgo de
alcoholismo en la población chilena. De esta diferencia se desprende un OR = 1,88,
indicando que un portador del alelo ADH1C*2 tiene casi un 90% más de probabilidades
de ser alcohólico que un portador del alelo ADH1C*1.
Al realizar la misma comparación anterior entre las frecuencias de ADH1C*1 y
ADH1C*2, pero descontando del análisis a los individuos portadores de los alelos
ADH1B*2 o ADH1B*3 se observa un leve aumento en la significación estadística en la
diferencia entre los dos grupos (χ2 = 4,46; p = 0,0347) (Tabla 10), mostrando que los
50
alelos protectores ADH1B*2 y ADH1B*3 enmascaran levemente la permisividad al
alcoholismo otorgada por el alelo ADH1C*2.
6.5.2. Frecuencias alélicas del gen ADH1B
Al comparar las frecuencias de los alelos ADH1B*1 y ADH1B*2 entre los grupos no se
encontraron diferencias significativas (p ≈ 1,0000), ni se pudo calcular el tamaño
muestral necesario para encontrarlas, ya que las frecuencias alélicas de ADH1B*1
difieren entre los grupos en la tercera cifra decimal (0,950 en los pacientes alcohólicos
y 0,951 en la población chilena general) cuando se descuentan los portadores del otro
alelo protector, ADH1B*3, del análisis. El mismo resultado se obtuvo de la comparación
de las frecuencias alélicas de ADH1B*1 y ADH1B*3, ya que el alelo ADH1B*3 presenta
una frecuencia más baja aún que la del alelo ADH1B*2 y no está presente en los
pacientes alcohólicos (Tabla 10).
6.5.3. Frecuencias genotípicas del gen ADH1C
Se encontró una diferencia estadísticamente significativa (χ2 = 4,14; p = 0,0418) al
comparar las frecuencias genotípicas de ADH1C*1/*1 y ADH1C*2/*2 entre los grupos,
(Tabla 12). Se calculó un OR = 3,70, lo que quiere decir que un individuo homocigoto
ADH1C*2/*2 tiene casi cuatro veces más probabilidades de ser alcohólico que un
individuo homocigoto ADH1C*1/*1. Este análisis demuestra que el genotipo
homocigoto ADH1C*2/*2 aumenta en gran medida el riesgo de alcoholismo en la
población chilena respecto del genotipo ADH1C*1/*1.
Al descontar a los individuos portadores de los alelos ADH1B*2 y ADH1B*3 del análisis
anterior de las frecuencias genotípicas de ADH1C*1/*1 y ADH1C*2/*2 se produce una
disminución mínima en la significación estadística (χ2 = 4,10; p = 0,0427) (Tabla 12),
indicando que en este análisis los individuos portadores de los alelos ADH1B*2 y
ADH1B*3 prácticamente no afectan los resultados del riesgo aumentado de
alcoholismo otorgado por el genotipo ADH1C*2/*2. A pesar de la disminución en la
significación estadística, se observa un aumento en la OR (OR = 3,85).
51
Tabla 12 Diferencias significativas en las frecuencias genot ípicas del gen ADH1C entre pacientes alcohólicos y población general Se detallan las frecuencias genotípicas con diferencias estadísticamente significativas entre los pacientes alcohólicos y la población general. Se informa el número de individuos con cada genotipo y su proporción en el grupo respectivo. En la parte inferior de cada segmento se detallan la significación estadística (p) de Pearson, la razón de probabilidades (OR) y el inverso de la OR (1/OR) de cada análisis. El análisis de las frecuencias genotípicas muestra que el genotipo ADH1C*2/*2 aumenta el riesgo de alcoholismo en la población chilena respecto del genotipo ADH1C*1/*1.
Sin descontar a los portadores de los
alelos ADH1B*2 y ADH1B*3
Descontando a los portadores de los alelos
ADH1B*2 y ADH1B*3
Genotipo pacientes
alcohólicos %
población general
% pacientes
alcohólicos %
población general
%
ADH1C*1/*1 11 37 57 54 9 33 49 52
ADH1C*2/*2 5 17 7 7 5 19 7 7
Σ 16 54 64 61 14 52 55 59
total 30 100 105 100 27 100 94 100
p = 0,042; OR = 3,70; 1/OR = 0,27 p = 0,043; OR = 3,81; 1/OR = 0,26
Un individuo homocigoto ADH1C*2/*2 tiene casi cuatro veces más probabilidades de ser alcohólico que un individuo homocigoto ADH1C*1/*1.
52
Se analizaron separadamente los individuos homocigotos ADH1C*1/*1 con los
heterocigotos ADH1C*1/*2. También los individuos heterocigotos ADH1C*1/*2 con los
homocigotos ADH1C*2/*2. No se encontraron diferencias significativas en las
frecuencias genotípicas entre los grupos estudiados (χ2 = 1,616 y 1,274; p = 0,2036 y
0,2589, respectivamente). El tamaño muestral necesario para establecer una diferencia
significativa en estos casos es de 175 individuos en total para los homocigotos
ADH1C*1/*1 y los heterocigotos ADH1C*1/*2. Para los heterocigotos ADH1C*1/*2 y los
homocigotos ADH1C*2/*2, de 330 en total. Estos tamaños muestrales disminuyen a
150 y 320 individuos, respectivamente, si se excluyen del análisis los individuos
portadores de los alelos ADH1B*2 y ADH1B*3. La divergencia en los tamaños
muestrales necesarios para establecer estas diferencias, calculados de esta manera,
sugiere una dominancia del alelo ADH1C*2.
6.5.4. Modelos de dominancia y recesividad para los alelos del gen ADH1C
Se analizaron los genotipos de la ADH1C en modelos de dominancia y recesividad de
los alelos ADH1C*1 o ADH1C*2, agrupando a los individuos heterocigotos con los
individuos homocigotos de la dominancia propuesta o evaluada. Al considerar el alelo
ADH1C*1 como dominante se agruparon los genotipos ADH1C*1/*1 y ADH1C*1/*2 y
se compararon con el genotipo ADH1C*2/*2. Al considerar el alelo ADH1C*2 como
dominante se agruparon los genotipos ADH1C*1/*2 y ADH1C*2/*2 y se compararon
con el genotipo ADH1C*1/*1. En ninguno de los análisis realizados se obtuvo
significación estadística (0,09 > p > 0,08), incluso descontando los portadores de los
alelos ADH1B*2 y ADH1B*3. Tampoco se encontró una tendencia a favor de la
dominancia de un alelo o el otro. El tamaño muestral calculado para encontrar
diferencias significativas entre los grupos es menor al ya utilizado (n = 135), variando
de 93 a 130 muestras en total. Esto se debe a que el programa utilizado calcula
tamaños de grupos iguales, situación distinta a la presente en esta memoria, en que un
grupo es 3,5 veces mayor que el otro (n = 30 y n = 105).
53
6.6. Comparación de frecuencias alélicas de los gen es ADH1C y ADH1B con otras
poblaciones del mundo
Respecto de las frecuencias alélicas del gen ADH1C, en la población chilena general
se encuentra una proporción menor del alelo permisivo ADH1C*2 (26%) que en la
población mexicana (37,6%) (Konishi et al., 2003b). Esta frecuencia es también menor
a la encontrada por Vidal et al. (2004) en españoles (43,8%) y Borràs et al. (2000) en
distintas poblaciones europeas (44,4%), pero es mayor a la que presentan las
poblaciones del este de Asia, como la reportada por Chen et al. (1996) en chinos
taiwaneses (5%). De manera interesante, este alelo se encuentra en la población
chilena general en una frecuencia similar a la que reportó Chen et al. (1996) para
individuos dependientes del alcohol en Taiwán (24%) y la frecuencia encontrada en los
pacientes alcohólicos en la presente memoria (40%) se asemeja a la de las
poblaciones europeas antes descritas.
Respecto de las frecuencias alélicas del gen ADH1B, la población chilena general y los
individuos alcohólicos presentan frecuencias del alelo permisivo ADH1B*1 de 95%,
muy similares a las reportadas para las poblaciones mexicana (95,7%) por Konishi et
al. (2003b), española (93,1%) por Vidal et al. (2004) y europea (97,8%) por Borràs et
al. (2000). Estas frecuencias alélicas del gen ADH1B difieren de las de otras
poblaciones en que hay mayores concentraciones del alelo protector ADH1B*2, como
en el Medio Oriente, donde la frecuencia de este alelo protector supera el 40%, o en el
este de Asia, donde su frecuencia supera por mucho el 70% (Li et al., 2007).
6.7. Determinaciones nucleotídicas adicionales en e l exón 8 del gen ADH1C
Adicionalmente a la determinación de los nucleótidos tradicionalmente estudiados para
definir el genotipo de la ADH1C, se analizaron otras tres variaciones nucleotídicas
descritas en el exón 8: los nucleótidos 15057 (C/A), 15115 (T) y 15121 (C/A) (Figura 5).
No se encontró la identidad A en el nucleótido 15057, siendo su identidad siempre C, y
no se encontró la identidad 15115 T en ninguna muestra. Sí se encontró la variación
descrita en el nt 15121 (A) como exclusiva de población nativa de América (Osier et al.,
54
Figura 5 Identidades de los nucleótidos 15057, 15115 y 15121 del gen ADH1C En la parte superior se muestra un esquema lineal del gDNA de la ADH1C y el amplicón del exón 8 generado con la PCR. Se esquematizan por separado los sitios de corte de las enzimas BstXI, TasI y Tru1I en el amplicón. Las flechas negras corresponden a sitios de corte variable (polimórficos) y las grises a sitios de corte constante (no polimórficos). Al lado de cada esquema de corte se presentan los resultados obtenidos para cada digestión. Sobre cada carril se informa la identidad del nucleótido analizado, inferida a partir del respectivo patrón de bandas de DNA. R = A o G.
307A
120187C
BstXICCANNNNN/NTGG
500400300
200
100
307
187
120
pb
pb
C/C sinEnzstd
(Pro329)A
15057
(Pro329)C
307 pb
TG-374
14873TG-375
15179
1 92 3 4 5 6 7 8ADH1C
200
150
100
75
201
307
106
pb
pbR/R sinEnzstd
(Phe349)T
15115
(Ile/Val349)RR
201106
Tas I/AATT
T106 133 68
R = A o G
200
150
10075
163
307
7650 68
61
pbpb
C/C C/A A/Astd sinEnz
68163C
76
Tru1IT/TAA
163A
68 15 61(Thr351)
A
15121
(Pro351)C
307A
120187C
BstXICCANNNNN/NTGG
500400300
200
100
307
187
120
pb
pb
C/C sinEnzstd
(Pro329)A
15057
(Pro329)C
307A
120187C
BstXICCANNNNN/NTGG
307A
120187C
BstXICCANNNNN/NTGG
BstXICCANNNNN/NTGG
500400300
200
100
307
187
120
pb
pb
C/C sinEnzstd
500500400400300300
200200
100100
307307
187187
120120
pb
pb
C/C sinEnzstd
(Pro329)A
15057
(Pro329)C
(Pro329)A
(Pro329)A
1505715057
(Pro329)C
(Pro329)C
307 pb
TG-374
14873TG-375
15179
1 92 3 4 5 6 7 8ADH1C
307 pb
TG-374
14873TG-375
15179
1 92 3 4 5 6 7 81 92 3 4 5 6 7 8ADH1C
200
150
100
75
201
307
106
pb
pbR/R sinEnzstd
(Phe349)T
15115
(Ile/Val349)RR
201106
Tas I/AATT
T106 133 68
R = A o G200
150
100
75
201
307
106
pb
pbR/R sinEnzstd
200200
150150
100100
7575
201201
307307
106106
pb
pbR/R sinEnzstd
(Phe349)T
15115
(Ile/Val349)R
(Phe349)T
(Phe349)T
1511515115
(Ile/Val349)R
(Ile/Val349)RR
201106
Tas I/AATT
T106 133 68
R = A o G
R201106
Tas I/AATT
Tas I/AATT
T106 133 68
R = A o G
200
150
10075
163
307
7650 68
61
pbpb
C/C C/A A/Astd sinEnz
68163C
76
Tru1IT/TAA
163A
68 15 61(Thr351)
A
15121
(Pro351)C
200
150
10075
163
307
7650 68
61
pbpb
C/C C/A A/Astd sinEnz
200200
150150
1001007575
163163
307307
765050 6868
61
pbpb
C/C C/A A/Astd sinEnz
68163C
76
Tru1IT/TAA
163A
68 15 61
68163C
76
Tru1IT/TAA
Tru1IT/TAA
163A
68 15 61(Thr351)
A
15121
(Pro351)C
(Thr351)A
(Thr351)A
1512115121
(Pro351)C
(Pro351)C
55
2002b) en ambos grupos analizados, siempre asociada a las identidades nucleotídicas
de los exones 6 y 8 que definen el alelo ADH1C*2 (Tablas 13 y 14).
6.7.1. Identidad del nucleótido 15057 del gen ADH1C
Se determinó la identidad del nucleótido 15057 (C/A) mediante la digestión del
amplicón del exón 8 con la enzima BstXI (Figura 5). La variación nucleotídica en esta
posición no ha sido asociada a las identidades de los nucleótidos que definen los alelos
del gen ADH1C (nt 11939 o nt 15115). Se obtuvieron digestiones completas en todos
los casos y en ambos grupos analizados, generándose fragmentos de 187 y 120 pb, lo
que indica que en las muestras analizadas este nucleótido es C y no varía. El patrón de
bandas obtenido en todas las digestiones se muestra en la Figura 5.
6.7.2. Identidad T del nucleótido 15115 (aa 329) de l gen ADH1C
La identidad T del nucleótido 15115, descrita como una tercera identidad posible para
este nucleótido en la base de datos de SNPs del NCBI, se determinó mediante la
digestión del amplicón del exón 8 con la enzima TasI (Figura 5). Esta digestión se
realizó para descartar esta identidad nucleotídica en la genotipificación con SspI. En
todas las muestras TasI sólo cortó el amplicón en su sitio de corte constante, indicando
que la identidad 15115 T no existe en ninguna de las muestras analizadas y, en
consecuencia, la identidad del nucleótido 15115 se puede deducir con certeza de la
digestión con SspI: corte total (A/A = ADH1C*1/*1), corte parcial (A/G = ADH1C*1/*2) o
sin corte (G/G = ADH1C*2/*2). El resultado obtenido en todas las digestiones con TasI
se muestra en la Figura 5.
6.7.3. Identidad del nucleótido 15121 (aa 351) del gen ADH1C
La identidad del nucleótido 15121 (C/A) se determinó mediante la digestión del
amplicón del exón 8 con Tru1I (Figura 5). Esta reacción permitió identificar un
polimorfismo que se ha encontrado sólo en población amerindia (Osier et al., 2002b) y
que se encuentra fuertemente ligado a las identidades nucleotídicas tradicionalmente
56
Tabla 13 Alelos de los genes ADH1C y ADH1B en pacientes alcohólicos y población general incluyendo posiciones nucleotídicas analiza das adicionalmente Se detallan los alelos de los genes ADH1C y ADH1B encontrados en los grupos de pacientes alcohólicos y población chilena general. Se informa la identidad de todos los nucleótidos analizados para cada alelo encontrado, junto con el aminoácido que codifica cada variación nucleotídica. Se indican el número encontrado de cada alelo y su proporción en cada grupo de estudio. Se presentan los alelos ADH1C*2 y ADH1B*1 totales para su comparación con los otros alelos del mismo gen y más abajo desglosados en los polimorfismos adicionales encontrados en estos alelos. No se informa la identidad de los nucleótidos 15057 del gen ADH1C ni 5219 del gen ADH1B, ya que fueron C (Pro329) y C (Asn56) en todos los casos, respectivamente. Alelos del gen ADH1C
exón 6 exón 8 Pacientes
alcohólicos Población
general Alelos
nt 11939
aa 271
nt 15115
aa 349
nt 15121
aa 351
n % n %
ADH1C*1 G Arg A Ile C Pro 36 60 155 74
ADH1C*2(total) A Gln G Val M Pro/Thr 24 40 55 26
60 100 210 100
ADH1C*2 A Gln G Val C Pro 16 27 42 20
ADH1C*2Thr351 A Gln G Val A Thr 8 13 13 6
24 40 55 26
Alelos del gen ADH1B
exón 3 exón 9 Pacientes
alcohólicos Población
general Alelos
nt 5191
aa 47
nt 5226
aa 59
nt 15490
aa 367
nt 15494
aa 369
n % n %
ADH1B*1(total) G Arg W Thr/Ser K Ser/Arg C Arg 57 95 198 94
ADH1B*2 A His A Thr T Ser C Arg 3 5 10 5
ADH1B*3 G Arg A Thr T Ser T Cys 0 0 2 1
60 100 210 100
ADH1B*1 G Arg A Thr T Ser C Arg 57 95 195 93
ADH1B*1Ser59 G Arg T Ser T Ser C Arg 0 0 2 1
ADH1B*1Arg367 G Arg A Ser G Arg C Arg 0 0 1 0,5
57 95 198 94
57
Tabla 14 Genotipos de la ADH1C y la ADH1B de pacientes alcoh ólicos y población general detallando alelos no convencionales Se detallan los genotipos de la ADH1C y la ADH1B separando los alelos que no tienen una nomenclatura oficial. Se informa la identidad de todos los nucleótidos analizados para cada genotipo encontrado, junto con el aminoácido que codifica cada variación nucleotídica. Se indican el número encontrado de cada genotipo y su proporción en cada grupo de estudio. No se informan las identidades de los nucleótidos 15057 (ADH1C) ni 5219 (ADH1B), ya que fueron C (Pro329) y C (Asn56) en todos los casos, respectivamente. Se indican el número encontrado de cada genotipo y su proporción en cada grupo de estudio. Genotipo de la ADH1C
exón 6 exón 8 Pacientes
alcohólicos
Población
general Genotipo
nt
11939
aa
271
nt
15115
aa
349
nt
15121
aa
351 n % n %
ADH1C*1/*1 G/G Arg A/A Ile C/C Pro 11 37 57 54
ADH1C*1/*2 G/A Arg/Gln A/G Ile/Val C/C Pro 9 30 33 31
ADH1C*1/*2Thr351 G/A Arg/Gln A/G Ile/Val C/A Pro/Thr 5 16 8 8
ADH1C*2/*2 A/A Gln G/G Val C/C Pro 2 7 3 3
ADH1C*2/*2Thr351 A/A Gln G/G Val C/A Pro/Thr 3 10 3 3
ADH1C*2Thr351/*2Thr351 A/A Gln G/G Val A/A Thr 0 0 1 1
30 100 105 100
Genotipo de la ADH1B
exón 3 exón 9 Pacientes
alcohólicos
Población
general Genotipo
nt
5191
aa
47
nt
5226
aa
59
nt
15490
aa
367
nt
15494
aa
369 n % n %
ADH1B*1/*1 G/G Arg A/A Thr T/T Ser C/C Arg 27 90 91 87
ADH1B*1/*2 G/A Arg/ His A/A Thr T/T Ser C/C Arg 3 10 8 8
ADH1B*2/*2 A/A His A/A Thr T/T Ser C/C Arg 0 0 1 1
ADH1B*1/*3 G/G Arg A/A Thr T/T Ser C/T Arg/Cys 0 0 2 2
ADH1B*1/*1Ser59 G/G Arg A/T Thr/Ser T/T Ser C/C Arg 0 0 2 2
ADH1B*1/*1Arg367 G/G Arg A/A Thr T/G Ser/Arg C/C Arg 0 0 1 1
30 100 105 100
58
utilizadas para definir el alelo ADH1C*2. En el análisis de los dos grupos de estudio se
obtuvieron los tres resultados posibles de esta digestión, indicando que esta posición
nucleotídica presenta gran variación en la población chilena, que concuerda con el
origen mestizo entre europeos y amerindios de nuestra población. Los distintos
resultados obtenidos para esta digestión se muestran en la Figura 5.
Esta variación, así como en la literatura, sólo se encontró asociada a las identidades
nucleotídicas de los exones 6 y 8 que definen el alelo ADH1C*2. De esta manera se
pudo desglosar el alelo ADH1C*2 en dos según la identidad del nucleótido 15121,
codificante del cambio aminoacídico Pro351Thr. Ambas variantes de este alelo se
encontraron en los dos grupos de estudio, encontrándose la variante exclusiva de
población nativa de América (ADH1C*2Thr351) en frecuencias alélicas menores en la
población general chilena (6%) que en los pacientes alcohólicos (12%) (Tabla 13). Este
alelo no posee una nomenclatura oficial, por lo que el nombre aquí utilizado,
ADH1C*2Thr351, cumple el fin de diferenciarlo del alelo ADH1C*2.
6.7.4. Análisis estadístico del efecto en el riesgo de alcoholismo del polimorfismo
exclusivo de población nativa de América
Se analizó la variación nucleotídica C15121A del gen ADH1C exclusiva de la población
nativa de América (Pro351Thr), que se encontró en la población chilena asociada a las
identidades nucleotídicas que definen el alelo ADH1C*2, para determinar si modifica el
riesgo de alcoholismo conferido por este alelo. Se consideró la variante que posee la
identidad 15121 A de manera independiente al alelo ADH1C*2, y para diferenciarlo de
éste, se utilizó la denominación ADH1C*2Thr351, aunque no sea una nomenclatura
oficial.
No se encontraron diferencias estadísticamente significativas (p = 0,0675) entre los
grupos al comparar las frecuencias de los alelos ADH1C*2Thr351, ADH1C*2 y
ADH1C*1 entre los pacientes alcohólicos y la población chilena general en una tabla de
2 por 3, haciendo el análisis exacto de Fisher (Tabla 15). Esto quiere decir que al
59
subdividir en dos al alelo ADH1C*2 no se encuentran diferencias significativas entre los
grupos.
Sí se encontró una diferencia estadísticamente significativa entre los grupos (χ2 = 4,26;
p = 0,0389) al comparar, en un análisis de χ2, las frecuencias de los alelos
ADH1C*2Thr351 y ADH1C*1 (Tabla 15). Esta diferencia permitió establecer una OR =
2,63, indicando que un portador del alelo ADH1C*2Thr351 tiene una probabilidad dos y
media veces mayor de ser alcohólico que un portador del alelo ADH1C*1. Esta razón
de probabilidades es mayor a la encontrada entre los alelos ADH1C*1 y ADH1C*2 (OR
= 1,96), sugiriendo que podría haber una diferencia entre los alelos ADH1C*2 y
ADH1C*2Thr351 en relación al riesgo de alcoholismo. Sin embargo, si en esta
comparación entre los alelos ADH1C*2Thr351 y ADH1C*1 se excluyen del análisis los
individuos portadores del alelo ADH1C*2 propiamente tal (47% de los pacientes
alcohólicos y 37% de la población chilena general), es decir, al comparar sólo los
portadores de los alelos ADH1C*2Thr351 y ADH1C*1, no hay una diferencia
significativa entre los grupos (χ2 = 1,964; p = 0,1610). El tamaño muestral necesario
para encontrar tal diferencia es de 340 individuos en total, distribuidos equitativamente
en dos grupos.
Al comparar entre los grupos las frecuencias alélicas de ADH1C*2Thr351 y ADH1C*2
(χ2 =0,805; p = 0,3695) no se encontró una diferencia significativa; se necesitaría un
tamaño muestral de más de 1.000 individuos en total para encontrarla. Si además se
quisiera encontrar una diferencia significativa descontando del análisis a los portadores
del alelo ADH1C*1 (el 83% de los pacientes alcohólicos son portadores de este alelo)
se necesitarían más de 8.500 muestras en total, indicando que, probablemente, en la
población chilena estos dos alelos no tienen gran diferencia entre sí respecto del
alcoholismo. Cabe recalcar que la influencia del cambio aminoacídico Pro351Thr sobre
la actividad enzimática de la ADH1C2 y, por ende, sobre el riesgo individual de
alcoholismo se desconoce y no ha sido abordada en la literatura. El análisis hecho aquí
pretende dilucidar si este cambio modifica el riesgo de alcoholismo en la población
chilena portadora del alelo ADH1C2Thr351, exclusivo de población nativa de América.
De manera similar a lo anterior, si al comparar las frecuencias alélicas de ADH1C*1 y
60
Tabla 15 Análisis estadístico del efecto del alelo ADH1C*2Thr351 Se comparan las frecuencias del alelo ADH1C*2Thr351 con: (A) las frecuencias de los alelos ADH1C*1 y ADH1C*2 en una tabla de contingencia de 2 x 3, haciendo un análisis de Fisher, y (B) con la frecuencia del alelo ADH1C*1 en una tabla de 2 x 2 en una prueba de chi cuadrado de Pearson. Se informan el número de alelos encontrados en cada grupo, las proporciones relativas de cada alelo y se detallan la significación estadística (p) de Fisher (A) y Pearson (B). Se informan la razón de probabilidades (OR) y el inverso de la OR (1/OR) para el análisis en que se encontró una diferencia significativa. A
Alelo pacientes
alcohólicos %
población general
%
ADH1C*1 36 60 155 74
ADH1C*2 16 27 42 20
ADH1C*2Thr351 8 13 13 6
Σ 60 100 210 100
p = 0,068
B
Alelo pacientes
alcohólicos %
población general
%
ADH1C*1 36 60 155 74
ADH1C*2Thr351 8 13 13 6
Σ 44 73 168 80
total 60 100 210 100
p = 0,039; OR = 2,63; 1/OR = 0,38
Un portador del alelo ADH1C*2Thr351 tiene una probabilidad dos y media veces mayor de ser alcohólico que un portador del alelo ADH1C*1.
61
ADH1C*2 se descuentan del análisis los portadores del alelo ADH1C*2Thr351, no se
encuentra una diferencia significativa (χ2 = 1,496; p = 0,2212). El tamaño muestral
necesario para encontrar esta diferencia sería también de 340 individuos en total.
6.8. Determinaciones nucleotídicas adicionales en e l exón 3 del gen ADH1B
Adicionalmente a la determinación de los nucleótidos tradicionalmente estudiados para
definir el genotipo de la ADH1B, se analizaron otras dos variaciones nucleotídicas
descritas en el exón 3: los nucleótidos 5219 (C/A) y 5226 (A/T) (Figura 6), codificantes
de los cambios aminoacídicos Asn56Lys y Thr59Ser, respectivamente. Ninguna de
estas variaciones ha sido asociada a las identidades nucleotídicas que definen los
alelos del gen ADH1B (nt 5191 y 15494). No se encontró variación alguna en el
nucleótido 5219, siendo su identidad siempre C en ambos grupos. Se encontró la
variación 5226 T de manera heterocigota en dos individuos de la población general
(Tablas 13 y 14), pero no en los pacientes alcohólicos. Esta variación se encontró
asociada a las identidades nucleotídicas de los exones 3 y 9 que definen el alelo
ADH1B*1 (5191 G y 15494 C).
6.8.1. Identidad del nucleótido 5219 (aa 56) del ge n ADH1B
Se determinó la identidad del nucleótido 5219 (C/A) mediante la digestión del amplicón
del exón 3 con la enzima MvaI (Figura 6). Todos los individuos analizados de ambos
grupos tienen la identidad 5219 C/C. La variación nucleotídica 5219 A no ha sido
asociada a las identidades de los nucleótidos que definen los alelos del gen ADH1B (nt
5191 y nt 15494).
6.8.2. Identidad del nucleótido 5226 (aa 59) del ge n ADH1B
Se determinó la identidad del nucleótido 5226 (A/T) mediante la digestión del amplicón
del exón 3 del gen ADH1B con la enzima MaeIII (Figura 6), al igual que la identidad
5191 (G/A), que diferencia el alelo ADH1B*2 (5191 A) de los alelos ADH1B*1 y
62
Figura 6 Identidades de los nucleótidos 5219 y 5226 del gen ADH1B En la parte superior se muestra un esquema lineal del gDNA de la ADH1B y el amplicón del exón 3 generado con la PCR. Se esquematizan por separado los sitios de corte de las enzimas MaeIII y MvaI en el amplicón. Las flechas negras corresponden a sitios de corte variable (polimórficos) y las grises a sitios de corte constante (no polimórficos). Al lado de cada esquema de corte se presentan los resultados obtenidos para cada digestión. Sobre cada carril se informa la identidad del nucleótido analizado, inferida a partir del respectivo patrón de bandas de DNA.
249
9185
40
200150
100
75
50
pbpb
C/Cstd sinEnz
Mva ICC/WGG
8791C
176
44
44A
14
14
15
15(Lys56)
A
5219
(Asn56)C
Mae III/GTNAC
G886695
A
161G
88T
200150
10075
50
249
958866
pbpb
std A/A A/T
161
G/G G/G
sinEnz
5226
5191
(Ser59)T
5226
(Thr59)A
(Arg47)G
5191
(Arg47)G
1 92 3 4 5 6 7 8
249 pb
TG-330
5128TG-331
5276
ADH1B
249
9185
40
200150
100
75
50
pbpb
C/Cstd sinEnz
Mva ICC/WGG
8791C
176
44
44A
14
14
15
15(Lys56)
A
5219
(Asn56)C
249
9185
40
200150
100
75
50
pbpb
C/Cstd sinEnz
249249
9185
40
200200150150
100100
7575
5050
pbpb
C/Cstd sinEnz
Mva ICC/WGG
8791C
176
44
44A
14
14
15
15
Mva ICC/WGGMva ICC/WGG
8791C
176
44
44
44
44A
14
14
14
14
15
15
15
15(Lys56)
A
5219
(Asn56)C
(Lys56)A
(Lys56)A
52195219
(Asn56)C
(Asn56)C
Mae III/GTNAC
G886695
A
161G
88T
200150
10075
50
249
958866
pbpb
std A/A A/T
161
G/G G/G
sinEnz
5226
5191
(Ser59)T
5226
(Thr59)A
(Arg47)G
5191
(Arg47)G
Mae III/GTNAC
G886695
A
161G
88T
Mae III/GTNAC
Mae III/GTNAC
G886695
A
161G
88T
G886695
A
161G
88T
200150
10075
50
249
958866
pbpb
std A/A A/T
161
G/G G/G
sinEnz
5226
5191
200150
10075
50
249
958866
pbpb
std A/A A/T
161
G/G G/GG/G G/G
sinEnz
5226
5191
(Ser59)T
5226
(Thr59)A
(Arg47)G
5191
(Arg47)G
(Ser59)T
5226
(Thr59)A
(Ser59)T
(Ser59)T
52265226
(Thr59)A
(Thr59)A
(Arg47)G
5191
(Arg47)G
(Arg47)G
(Arg47)G
51915191
(Arg47)G
(Arg47)G
1 92 3 4 5 6 7 8
249 pb
TG-330
5128TG-331
5276
ADH1B1 92 3 4 5 6 7 81 92 3 4 5 6 7 81 92 3 4 5 6 7 8
249 pb
TG-330
5128TG-331
5276
ADH1B
63
ADH1B*3 (ambos 5191 G), posición analizada en la determinación del genotipo de la
ADH1B. Se obtuvieron cuatro resultados distintos para esta digestión en el análisis de
los dos grupos, involucrando variaciones en los nucleótidos 5191 y 5226. Tres de los
cuatro resultados obtenidos vienen de la posición 5191: G/G, G/A y A/A, estando todos
asociados a la identidad 5226 A/A. El cuarto resultado corresponde a dos individuos de
la población general heterocigotos 5226 A/T. La identidad 5226 T se encontró asociada
a las identidades 5191 G y 15494 C que definen el alelo ADH1B*1 (Tablas 13 y 14).
6.8.3. Nueva mutación encontrada en el nt 15490 (aa 367) del gen ADH1B (exón 9)
Como se indicara anteriormente, para diferenciar al alelo ADH1B*3 (15494 T) de los
alelos ADH1B*1 y ADH1B*2 (ambos 15494 C) se determinó la identidad del nucleótido
15494 (C/T) mediante la digestión del amplicón del exón 9 del gen ADH1B con las
enzimas BfuI y CaiI por separado (sección 6.4.2.). La enzima BfuI, que reconoce la
identidad 15494 C, produjo un corte completo del amplicón en todos los casos (15494
C/C), exceptuando tres muestras en las que produjo sólo un corte parcial. En estos tres
casos se realizó una nueva amplificación de las muestras y se sometieron a digestión
con la enzima contraparte CaiI, que reconoce la identidad 15494 T, característica del
alelo ADH1B*3. De estas tres muestras, sólo dos se cortaron parcialmente al ser
digeridas con CaiI, indicando que son heterocigotas 15494 C/T y que, por lo tanto,
tienen un alelo ADH1B*3. La tercera muestra no se cortó en lo absoluto al ser digerida
con CaiI, discordante con el diseño experimental en que si no corta BfuI, CaiI tiene que
cortar y viceversa, por lo que se secuenció. En el electroforetograma se encontró que
la muestra tenía la identidad 15494 C/C, lo que indicaba que no tenía un alelo
ADH1B*3, que concuerda con que la enzima CaiI no cortara, pero en uno de los alelos
se identificó un cambio nucleotídico no descrito previamente en la posición 15490
(T/G), que se encuentra dentro del sitio de reconocimiento de BfuI e impide que la
enzima pueda cortar el DNA a pesar de tener esta muestra la identidad 15494 C/C
(Figura 7).
La mutación encontrada genera un cambio aminoacídico de serina a arginina en la
posición 367 y está asociada a las identidades nucleotídicas que definen el alelo
64
Figura 7 Nueva mutación encontrada en la posición 15490 del gen ADH1B Se muestra un esquema del límite entre el intrón 8 y el exón 9 del gen ADH1B. El exón 9 se representa como una barra gris, mientras que el intrón 8 sólo por su secuencia en mayúsculas. Los nucleótidos del exón 9 se encuentran agrupados en los codones respectivos. Dentro del exón 9 se destacan las posiciones nucleotídicas 15490 con un círculo y 15494 con un cuadrado. La mutación en la posición 15490, que no ha sido descrita antes de esta memoria, se encontró realizando la identificación del nucleótido 15494. Se muestran las dos enzimas utilizadas en la determinación de la identidad del nucleótido 15494, BfuI y CaiI, junto con sus respectivas secuencias de reconocimiento. En las secuencias de reconocimiento de las enzimas de restricción se destacan también los nucleótidos 15490 y 15494; al cambiar el nucleótido 15490 de T a G se impide el reconocimiento de BfuI, pero no de CaiI. N = A, C, G o T.
ADH1Blímite intrón 8 / exón 9
Cai ICAGNNN/CTG
Bfu IG T ATCC(6/5)
• • • CCTATTGCAG T ATC CGT ACC GTC • • •
T/G15490
C/T15494
exón 9intrón 8
corta el aleloADH1B*3(15494T)
corta los alelosADH1B*1 y ADH1B*2
(15494C),pero no corta si
15490G
nueva mutaciónencontrada
polimorfismo que defineel alelo ADH1B*3
ADH1Blímite intrón 8 / exón 9
Cai ICAGNNN/CTG
Bfu IG T ATCC(6/5)
• • • CCTATTGCAG T ATC CGT ACC GTC • • •
T/G15490
C/T15494
exón 9intrón 8
corta el aleloADH1B*3(15494T)
corta los alelosADH1B*1 y ADH1B*2
(15494C),pero no corta si
15490G
nueva mutaciónencontrada
polimorfismo que defineel alelo ADH1B*3
65
ADH1B*1 (nt 5191 G y 15494 C) (ver Tablas 13 y 14). Adicionalmente, la posición
15490 corresponde al primer nucleótido del exón 9 del gen ADH1B, pero su variación
no modifica la definición del extremo 3’ del intrón 8 durante el procesamiento de corte y
empalme del ácido ribonucleico (RNA) mensajero, de acuerdo con las secuencias
consenso conocidas para este proceso (Lewin, 1997).
6.9. Genotipos combinados de los genes ADH1C y ADH1B
En las Tablas 16 y 17 se muestran las combinaciones de genotipos de la ADH1C y de
la ADH1B encontradas en los dos grupos de estudio, la cantidad de individuos con
cada combinación y su proporción relativa en cada grupo. Estas tablas consideran
todas las posiciones nucleotídicas analizadas, al igual que las Tablas 13 y 14 de
frecuencias alélicas y genotípicas. Las Tablas 16 y 17 muestran exactamente los
mismos datos, aunque de forma distinta, ya que la Tabla 16 agrupa primero los
genotipos de la ADH1C y luego los genotipos de la ADH1B, mientras que la Tabla 17
muestra los datos agrupados de la manera inversa, permitiendo apreciar la distribución
de genotipos combinados de la ADH1C y de la ADH1B encontrados en cada grupo.
6.10. Secuenciación
Se secuenciaron 16 amplicones de PCR distintos, correspondientes a los distintos
resultados obtenidos de los cuatro segmentos amplificados de los genes ADH1C y
ADH1B. En detalle, tres amplicones corresponden al exón 6 del gen ADH1C, seis
amplicones al exón 8 del gen ADH1C, cuatro al exón 3 del gen ADH1B y tres al exón 9
del gen ADH1B. Se secuenció adicionalmente un amplicón del alelo que presentó la
nueva mutación en el nucleótido 15490.
En todas las secuenciaciones se obtuvo el resultado esperado según las
genotipificaciones realizadas y se comprobó la identidad de los amplicones
secuenciados con los archivos GenBank utilizados como referencia.
66
Tabla 16 Genotipos combinados de la ADH1C y la ADH1B de paci entes alcohólicos y población general detallando alelos no convencional es Se detallan de manera combinada todos los genotipos de la ADH1C y la ADH1B encontrados en los grupos de pacientes alcohólicos y población chilena general. Se indican el número y proporción de individuos con cada genotipo encontrado para cada grupo de estudio. Los alelos con nomenclaturas no oficiales corresponden a los detallados en la Tabla 13. Genotipo combinado
Pacientes
alcohólicos
Población
general genotipo de la ADH1C genotipo de la ADH1B
n % n %
ADH1C*1/*1 ADH1B*1/*1 9 30 48 46
ADH1B*1/*2 2 7 6 6
ADH1B*2/*2 0 0 1 1
ADH1B*1/*3 0 0 1 1
ADH1B*1/*1Arg367 0 0 1 1
ADH1C*1/*2 ADH1B*1/*1 8 27 28 27
ADH1B*1/*2 1 3 2 2
ADH1B*1/*3 0 0 1 1
ADH1B*1/*1Ser59 0 0 2 2
ADH1C*1/*2Thr351 ADH1B*1/*1 5 17 8 8
ADH1C*2/*2 ADH1B*1/*1 2 7 3 3
ADH1C*2/*2Thr351 ADH1B*1/*1 3 10 3 3
ADH1C*2 Thr351/*2Thr351 ADH1B*1/*1 0 0 1 1
30 100 105 100
67
Tabla 17 Genotipos combinados de la ADH1B y la ADH1C de paci entes alcohólicos y población general detallando alelos no convencional es Se detallan de manera combinada todos los genotipos de la ADH1B y la ADH1C encontrados en los grupos de pacientes alcohólicos y población chilena general. Se indican el número y proporción de individuos con cada genotipo encontrado para cada grupo de estudio. Los alelos con nomenclaturas no oficiales corresponden a los detallados en la Tabla 13. Genotipo combinado
Pacientes
alcohólicos
Población
general genotipo de la ADH1B genotipo de la ADH1C
n % n %
ADH1B*1/*1 ADH1C*1/*1 9 30 48 46
ADH1C*1/*2 8 27 28 27
ADH1C*1/*2Thr351 5 17 8 8
ADH1C*2/*2 2 7 3 3
ADH1C*2/*2Thr351 3 10 3 3
ADH1C*2 Thr351/*2Thr351 0 0 1 1
ADH1B*1/*2 ADH1C*1/*1 2 7 6 6
ADH1C*1/*2 1 3 2 2
ADH1B*1/*3 ADH1C*1/*1 0 0 1 1
ADH1C*1/*2 0 0 1 1
ADH1B*1/*1Ser59 ADH1C*1/*2 0 0 2 2
ADH1B*1/*1Arg367 ADH1C*1/*1 0 0 1 1
ADH1B*2/*2 ADH1C*1/*1 0 0 1 1
30 100 105 100
68
7. DISCUSIÓN
7.1. De los resultados obtenidos
En esta memoria se determinó que en la población chilena los individuos portadores
del alelo ADH1C*2 y del genotipo ADH1C*2/*2 de la deshidrogenasa alcohólica tienen
un riesgo mayor de alcoholismo que los portadores del alelo ADH1C*1 y del genotipo
ADH1C*1/*1, respectivamente. Se encontró que el alelo ADH1C*2 aumenta el riesgo
de alcoholismo en una población que tiene un genotipo de la ADH1B uniforme, en que
el 90% de los individuos es homocigoto para el alelo permisivo de este gen (ADH1B*1),
equivalente a lo reportado por Konishi et al. (2003b) en la población mexicana. Es
decir, el efecto del alelo ADH1C*2 sobre el riesgo de alcoholismo es independiente del
genotipo de la ADH1B en la población chilena. El alelo ADH1C*2 se encontró en una
frecuencia significativamente mayor en los individuos alcohólicos (40%) que en la
población general (26%) y se estableció una razón de proporciones (OR) de 1,88, que
significa que un portador del alelo ADH1C*2 tiene casi un 90% más de probabilidades
de ser alcohólico que un portador del alelo ADH1C*1. Esta OR es mayor que la
establecida para este alelo por Zintzaras et al. (2006) en su metaanálisis (1,32), que
abarca a poblaciones orientales y caucásicas en conjunto. Cabe destacar que en esta
memoria se encontraron diferencias estadísticamente significativas para el genotipo de
la ADH1C con un tamaño muestral relativamente pequeño en comparación con los
utilizados por otros autores (Konishi et al., 2004, Vidal et al., 2004, Borràs et al., 2000,
Chen. et al., 1999, Chen. et al., 1997). Esto puede deberse a que en la población
chilena existan factores, ya sea genéticos o ambientales, que favorezcan una
diferenciación mayor entre los portadores de los distintos alelos del gen ADH1C en
relación al alcoholismo, o bien que en las otras poblaciones que se han analizado
existan factores conducentes a disminuir una respuesta diferencial al alcohol causada
por los distintos genotipos de la ADH1C.
La independencia del efecto del genotipo de la ADH1C sobre el alcoholismo se
demostró además al analizar su efecto incluyendo o excluyendo del análisis a los
portadores de los alelos protectores del gen ADH1B. En este análisis se encontró que
el genotipo de la ADH1B no afecta mayormente los resultados encontrados para el
69
genotipo de la ADH1C, y que el genotipo de la ADH1B no presenta diferencias
aparentes en frecuencias alélicas o genotípicas entre pacientes alcohólicos y población
normal.
La técnica de PCR-RFLP utilizada para analizar los genotipos de la ADH1C y de la
ADH1B en individuos alcohólicos e individuos de la población general chilena ha sido
utilizada ampliamente en la literatura (Konishi et al., 2004, Vidal et al., 2004, Frenzer et
al., 2002, Lee et al., 2001, Borràs et al., 2000, Chao et al., 2000, Chen et al., 1999,
Chen et al., 1997, Nakamura et al., 1996). Sin embargo, en todos los trabajos
mencionados, el genotipo de la ADH1C ha sido determinado analizando sólo una de
las dos posiciones nucleotídicas codificantes de los cambios aminoacídicos que
diferencian las isoenzimas ADH1C1 y ADH1C2 estudiadas en esta memoria. A pesar
de que estos métodos han sido extensamente utilizados en los estudios anteriores, se
encontraron numerosos errores al evaluarlos críticamente, por lo que se diseñaron
métodos nuevos para la realización de este trabajo.
7.2. De los métodos utilizados
Durante la fase de diseño experimental se encontró que muchos partidores de PCR
publicados presentaban errores de secuencia o se anclaban sobre sitios polimórficos
descritos en la base de datos GenBank (Tablas 7, 8 y 9). Se eligieron, por
consiguiente, partidores que no tuvieran estas falencias, o se diseñaron partidores
nuevos que, junto con las condiciones de reacción utilizadas en la PCR, constituyen un
aporte para los métodos de genotipificación de la ADH1C y la ADH1B basados en la
PCR, ya que no contienen errores de secuencia, no amplifican otros genes bajo las
condiciones descritas y permiten amplificar los segmentos deseados independiente-
mente del genotipo de la muestra.
Se encontró que el partidor TG-341, utilizado en un comienzo para la amplificación del
exón 8 del gen ADH1C, permite amplificar sólo el alelo ADH1C*1 bajo todas las
condiciones ensayadas. Este partidor se diseñó a partir del utilizado por Osier et al.
(2002b) con el mismo fin (Tabla 7), pero posee una guanina adicional en el extremo 3’,
70
agregada en esta memoria para aumentar su temperatura media de apareamiento (Tm).
Este nucleótido adicional puede ser el responsable de la selectividad adquirida, si
fuese polimórfico y la identidad guanina estuviese asociada a las identidades
nucleotídicas que definen el alelo ADH1C*1. Aunque no hay polimorfismos reportados
en el resto de la extensión del partidor TG-341, su especificidad por el alelo ADH1C*1
puede estar dada por otro nucleótido contenido en el partidor utilizado por Osier et al.
(2002b), lo que explicaría la menor temperatura de apareamiento que utilizaron los
autores en la reacción de PCR: 51ºC.
Se diseñó un método para la determinación de la identidad del nucleótido 11939 del
gen ADH1C (exón 6), que codifica el cambio del aminoácido 271 entre la ADH1C1 y la
ADH1C2. Esta posición no ha sido analizada anteriormente en estudios de
genotipificación poblacional por suponerse su identidad perfectamente asociada a la
identidad del aminoacídico 349 (nt 15115), la que sí es analizada en dichos estudios.
Esta presunción contempla sólo dos identidades nucleotídicas posibles en la posición
15115 (A/G), sin embargo, en la base de datos de polimorfismos de un nucleótido
(dbSNP) se informa que en esta posición puede haber tres identidades (A/G/T). La
enzima resultante de la variante 15115 T tiene una fenilalanina en la posición 349, en
contraste con la isoleucina de la ADH1C1 y la valina de la ADH1C2, pero no se sabe a
qué aminoácido de la posición 271 está asociada, ya que esta variación fue encontrada
en un estudio de secuenciación masiva en la población japonesa (Haga et al., 2002).
En esta memoria, de forma adicional a la determinación del genotipo de la ADH1C, se
analizó la posición 15115 T y se descartó su presencia en la población chilena. De
acuerdo a los resultados obtenidos las identidades nucleotídicas que determinan la
identidad de los aminoácidos 271 y 349 se encuentran en perfecta asociación en la
población chilena. Se comprobó entonces que la presunción que sólo es necesario
determinar una de las identidades nucleotídicas 11939 o 15115 para determinar el
genotipo de la ADH1C es correcta para la población chilena.
La importancia de la determinación de la identidad del aminoácido 271 radica en que
teóricamente es éste el aminoácido determinante de las diferencias catalíticas entre la
ADH1C1 y la ADH1C2 y no el cambio de la posición 349. Según estudios
71
cristalográficos (Niederhut et al., 2001, Eklund et al., 1984) y de modelamiento
computacional (Eklund et al., 1987) el aminoácido 271 se encuentra en el sitio activo
de la enzima en el bolsillo de unión del cofactor, interactuando directamente con el
NAD+ y, por ende, modificando su cinética de unión, mientras que el aminoácido de la
posición 349 se encuentra en la superficie de la enzima, lejos del sitio de interacción de
los monómeros constituyentes del dímero. Esto quiere decir que la variación
nucleotídica asociada al cambio en las actividades enzimáticas y a la modificación del
riesgo de alcoholismo es probablemente la posición 11939 (aa 271) y no la 15115 (aa
349). No obstante, los estudios cristalográficos no son determinantes para decir que
sólo la variación del aminoácido 271 es la responsable del cambio en las actividades
enzimáticas y no los dos cambios aminoacídicos en conjunto.
7.3. De las enzimas utilizadas en la genotipificaci ón mediante PCR-RFLP
Las enzimas utilizadas en la genotipificación se eligieron tras hacer un análisis de los
artículos en la literatura que utilizan la misma técnica. Los autores Konishi et al. (2004),
Vidal et al. (2004), Borràs et al. (2000), Chao et al. (2000), Chen et al. (1999) y Chen et
al. (1997) utilizaron la enzima SspI para la identificación del alelo ADH1C*1 (nt 15115
A) y la enzima MaeIII para la identificación del alelo ADH1B*2 (nt 5191 A), técnica
desarrollada por Xu et al. (1988) y mejorada por Groppi et al. (1990). Los autores Lee
et al. (2001) y Nakamura et al. (1996) utilizaron adicionalmente la enzima AluI (Groppi
et al., 1990) para la identificación del alelo ADH1B*3 (nt 15494 C), mientras que
Frenzer et al. (2002) y Osier et al. (2002a) utilizaron con el mismo fin la enzima AlwNI
(isoesquisómero de la enzima CaiI, utilizada en esta memoria). Hines et al. (2001) y
Grove et al. (1998) utilizaron sólo la enzima SspI en la identificación del alelo
ADH1C*1, ya que sólo determinaron el genotipo de la ADH1C. De manera alternativa
al uso de MaeIII, Osier et al. (2002a) y Nishiyori et al. (1998) utilizaron la enzima MslI.
El nucleótido 11939 del gen ADH1C, codificante del cambio del aminoácido 271 entre
la ADH1C1 y la ADH1C2, no ha sido analizado en la literatura, por lo que las enzimas
utilizadas para su análisis, AluI y Bsh1285I, se eligieron en base a sus secuencias de
reconocimiento. De igual manera se eligieron las enzimas del análisis de las posiciones
nucleotídicas adicionales a la secuenciación, que tampoco han sido analizadas en la
72
literatura, BstXI para el nucleótido 15057, TasI para el nucleótido 15115 (T) y Tru1I
para el nucleótido 15121 del gen ADH1C, así como MvaI para el nucleótido 5219,
MaeIII para el nucleótido 5226 y BfuI para el nucleótido 15494 del gen ADH1B.
7.4. De las muestras utilizadas
Los dos grupos de estudio tienen individuos de edades equivalentes (p = 0,1312)
según la prueba de T de Student bilateral (“two tailed Student’s T-test” en inglés) de la
página SISA (http://www.quantitativeskills.com/sisa/). Sin embargo, la proporción de
mujeres y hombres entre los dos grupos de estudio es significativamente diferente
(p = 0,0002; análisis exacto de Fisher), siendo mayor la cantidad de hombres en el
grupo de pacientes alcohólicos (90%) que en la población general chilena (53%). Esto
hace que los grupos no sean equivalentes en términos de género. Sin embargo, los
genes de las ADHs son autosómicos, por lo que no se espera que su expresión
dependa del género.
No se conoce el grado de mestizaje del grupo de pacientes alcohólicos, ya que se
desconoce el grupo sanguíneo (ABO y factor Rh) de cada uno de los pacientes o del
grupo en total, por lo que la validez de su comparación con el grupo de población
general chilena, del cual sí se conoce el grado de mestizaje, admite cuestionamiento.
Sin embargo, la equivalencia en el grado de mestizaje de ambos grupos se puede
deducir gracias a la gran similitud en la variación alélica del gen ADH1B entre los dos
grupos (5% para el alelo ADH1B*2 en ambos grupos). Si la población general tuviese
un componente amerindio mayor que los individuos alcohólicos, la frecuencia del alelo
ADH1B*2 debiera haber sido menor, por estar prácticamente ausente en poblaciones
nativas de Sudamérica (Osier et al., 2002a, Osier et al., 2002b, Goedde et al., 1992).
7.5. Del análisis estadístico
Al hacer un análisis de las frecuencias alélicas y genotípicas del gen ADH1C entre los
grupos se excluyeron los portadores de los alelos ADH1B*2 y ADH1B*3 codificantes de
73
las isoenzimas rápidas (protectoras) del gen ADH1B. Esta exclusión fue realizada
también por Mulligan et al. (2003) en población nativa de Norteamérica al encontrar
niveles muy bajos de estas variantes del gen ADH1B. Se ha demostrado que el efecto
protector de estos alelos es independiente del conferido por el alelo ADH1C*1 (Chen et
al., 1996), pero se ha encontrado que el alelo ADH1B*2 está asociado al alelo
ADH1C*1 en las poblaciones del este de Asia (Osier et al., 1999), europea (Borràs et
al., 2000) y del resto del mundo (Osier 2002a), haciendo necesario analizar el efecto
protector de distintos haplotipos generados por la combinación de los alelos de los
genes ADH1C y ADH1B en poblaciones con alto grado de variación en ambos genes
(como la asiática). En el caso de la población chilena, en que los alelos protectores del
gen ADH1B presentan frecuencias bajas, se deben descontar los portadores de los
alelos protectores del gen ADH1B para poder establecer que las diferencias en el
riesgo de alcoholismo son causadas por las variantes del gen ADH1C y no por una
asociación entre los alelos de ambos genes. Los alelos de los genes ADH1C y ADH1B
pueden no heredarse independientemente, por no separarse en el entrecruzamiento,
ya que estos genes se encuentran cercanos en el brazo largo del cromosoma 4 en un
segmento de alrededor de 80 kb (Yasunami et al., 1990).
Se observó sólo un aumento menor en la significación estadística al descontar a los
individuos portadores de los alelos ADH1B*2 o ADH1B*3 del análisis de chi cuadrado
de las frecuencias alélicas de ADH1C*1 y ADH1C*2. Por otro lado, en el análisis de χ2
de las frecuencias genotípicas de ADH1C*1/*1 y ADH1C*2/*2 se observó una leve
disminución en la significación estadística al descontar del análisis a los mismos
individuos. La discrepancia entre el aumento y la disminución en la significación
estadística en los análisis puede estar relacionada con el tamaño relativamente
pequeño de la muestra utilizada.
Por haber una frecuencia baja del alelo ADH1B*2 en la población chilena, no resultó
necesario calcular en esta memoria el desequilibrio de vinculación (del inglés “linkage
disequilibrium”) entre los alelos de los genes ADH1C y ADH1B. No se estudió, por lo
tanto, si en la población chilena existe una asociación entre los alelos ADH1C*1 y
ADH1B*2, como se ha descrito en la población del este de Asia (Osier et al., 1999), u
74
otras combinaciones de alelos de estos dos genes. El cálculo de esta asociación sería
sólo necesario de encontrarse una diferencia, en el riesgo aumentado de alcoholismo
otorgado por el alelo ADH1C*2, al descontar a los portadores de los alelos protectores
del gen ADH1B, lo que querría decir que los alelos protectores de los genes ADH1C y
ADH1B se encuentran asociados.
No se encontró evidencia de dominancia o recesividad para los alelos del gen ADH1C
en relación al riesgo de alcoholismo, probablemente debido al tamaño muestral
empleado. En el cálculo de los tamaños muestrales requeridos para demostrar esta
dominancia o recesividad se encontró cierta discrepancia. Para encontrar diferencias
significativas en la comparación de los homocigotos ADH1C*1/*1 con los heterocigotos
ADH1C*1/*2 sería necesario un total de 150 muestras, pero para comparar a los
heterocigotos ADH1C*1/*2 con los homocigotos ADH1C*2/*2 se necesitaría el doble,
sugiriendo una dominancia del alelo ADH1C*2, queriendo decir que un heterocigoto
ADH1C*1/*2 es fenotípicamente más similar a un homocigoto ADH1C*2/*2 que a un
homocigoto ADH1C*1/*1. Sin embargo, al agrupar los distintos genotipos aplicando un
modelo de dominancia no se observó una tendencia hacia la dominancia de ningún
alelo. En el metaanálisis de Zintzaras et al. (2006) se encontró en un modelo de
dominancia que la isoforma lenta ADH1C2 es dominante sobre la isoforma rápida
ADH1C1 respecto del riesgo de alcoholismo. Sin embargo, de acuerdo a los resultados
obtenidos en esta memoria, no se puede concluir que algún alelo del gen ADH1C sea
dominante o recesivo. Además, esta relación no ha sido reportada por otros autores.
7.6. De las posiciones nucleotídicas analizadas adi cionalmente
En esta memoria se analizaron posiciones polimórficas adicionales a las que definen a
los alelos de los genes ADH1C y ADH1B. Se estudiaron sólo posiciones previamente
descritas en las bases de datos GenBank o dbSNP y que estuvieran presentes en los
exones a amplificar en la determinación de los genotipos de la ADH1C y de la ADH1B.
Se analizaron cinco sitios polimórficos adicionales, tres para el gen ADH1C y dos para
el ADH1B. Se encontraron asociaciones no descritas entre los nucleótidos analizados
de manera adicional y aquellos que definen los genotipos de la ADH1C y de la ADH1B,
75
pudiendo describir inequívocamente el alelo nuevo ADH1B*1Ser59 del gen ADH1B y
reportar una frecuencia alta (13%) del alelo ADH1C*2Thr351 en un grupo de pacientes
alcohólicos. Además, se encontró una nueva mutación (G15490T del gen ADH1B) al
utilizar un método de genotipificación diseñado en esta memoria y analizar
concienzudamente datos inesperados. El estudio de las posiciones nucleotídicas
asociadas a esta nueva mutación permitió describir un segundo alelo nuevo del gen
ADH1B (ADH1B*1Arg367). La variación G15490T puede ser analizada mediante PCR-
RFLP con la enzima Sau3AI, porque reconoce el nucleótido 15490 G
independientemente de la identidad del nucleótido 15494 (que cambia en el alelo
ADH1B*3) y además tiene un sitio de corte constante en el amplicón de 290 pb del
exón 9 del gen ADH1B.
Al encontrarse el alelo ADH1C*2Thr351, exclusivo de población nativa de América, en
la población chilena general y en los pacientes alcohólicos se pudo analizar si este
alelo difiere del alelo ADH1C*2 tradicional en su riesgo asociado de alcoholismo. No se
encontraron diferencias significativas en las frecuencias del alelo ADH1C*2Thr351
entre los dos grupos estudiados, a pesar de haber encontrado una tendencia
(p = 0,068) hacia un riesgo aumentado de alcoholismo para sus portadores, por
encontrarse en una frecuencia mayor en alcohólicos (13%) que en población general
(6%). Esta diferencia no cuenta con un respaldo teórico que la justifique, porque no se
conoce la influencia del cambio aminoacídico Pro351Thr sobre la actividad enzimática
o sobre el riesgo de alcoholismo de un portador de esta variación. Los estudios
cristalográficos (Niederhut et al., 2001, Eklund et al., 1984) y de modelamiento
computacional (Eklund et al., 1987) disponibles en la literatura, que pudieran predecir
la importancia del aminoácido 351 en la actividad enzimática, no se refieren a este
cambio aminoacídico por ser anteriores a su descubrimiento. Otros estudios en
población nativa de América que estudiaron las variaciones de los genes de las ADHs
en relación al alcoholismo (Konishi et al., 2004, Mulligan et al., 2003, Wall et al., 2003)
no estudiaron esta variación, incluso habiendo sido publicados después del reporte de
Osier et al. (2002b), en que se describe esta variación por primera vez. De esta forma,
estos autores agruparon inadvertidamente los alelos ADH1C*2 y ADH1C*2Thr351 y los
compararon con el alelo ADH1C*1. Por esto, esta memoria es el primer trabajo que
76
estudia la posible contribución diferencial de este alelo al riesgo de alcoholismo.
7.7. De las bases de datos consultadas
En esta memoria se analizaron variaciones nucleotídicas publicadas en las bases de
datos de SNPs (dbSNP) y GenBank, ambas del National Center for Biotechnology
Information (NCBI). De todas las posiciones e identidades nucleotídicas analizadas en
esta memoria se encontraron sólo aquellas publicadas en ambas bases de datos
(nt 11939 (G/A) y nt 15115 (A/G) del gen ADH1C y nt 5191 (G/A), nt 5226 (A/T) y nt
15494 (C/T) del gen ADH1B) o sólo en GenBank (nt 15121 (C/A) del gen ADH1C), pero
no se encontraron aquellas que sólo estaban publicadas en la base de datos de SNPs
(nt 15057 (C/A) y nt 15115 (T) del gen ADH1C y nt 5219 (C/A) del gen ADH1B).
Las variaciones nucleotídicas descritas en GenBank pueden considerarse
polimorfismos, ya que han sido encontradas en una frecuencia mínima del 1% en
alguna población. En cambio, en la base de datos de SNPs también hay variaciones
nucleotídicas reportadas cuya frecuencia no ha sido estudiada en la población de
origen y que podrían representar sólo el hallazgo de una mutación, con una frecuencia
menor al 1% en la población estudiada. Este es el caso de la identidad 15115 T, que
ha sido reportada sólo por un autor. Las variaciones C15057A del gen ADH1C y
C5219A del gen ADH1B presentan un estatus de validación mayor por haber sido
reportadas por más de un autor, pero así como la variación 15115 T del gen ADH1C,
no han sido encontradas en más de un cromosoma por estudio, ni su hallazgo ha sido
confirmado por cada autor, que representan niveles de validación superiores. Las
variaciones nucleotídicas publicadas en los archivos GenBank DQ017646 y DQ088981
son polimorfismos propiamente tales (tienen frecuencias reportadas mayores a un 1%),
por lo que existe una mayor probabilidad de encontrarlas en una muestra poblacional
cualquiera que aquellas publicadas en la base de datos de SNPs sin una frecuencia
asociada. En efecto, de las nueve variaciones nucleotídicas estudiadas, las seis que sí
se encontraron corresponden a variaciones reportadas como polimorfismos en las
bases de datos, mientras que las tres que no se encontraron no tienen frecuencias
reportadas. Estas últimas podrían ser mutaciones y no polimorfismos explicando por
77
qué no se detectaron en la muestra poblacional utilizada.
7.8. De las proyecciones
El haber realizado el presente estudio, en el que se analizó un número mayor de
polimorfismos que en estudios anteriores, permite que en futuras investigaciones en la
población chilena se analice un número menor de posiciones nucleotídicas. No se
encontró que el genotipo de la ADH1B modifique el riesgo de alcoholismo en la
población chilena, ni tampoco que afecte el efecto protector conferido por el genotipo
de la ADH1C, por lo que su determinación no resulta necesaria en términos de
protección genética contra el alcoholismo. A pesar de esto, se encontró una nueva
mutación en el gen ADH1B de la cual se ignora la frecuencia en otras poblaciones, así
como el efecto que puede tener en la cinética de la enzima el cambio aminoacídico al
cual conduce. Si esta nueva mutación tiene en otras poblaciones una frecuencia mayor
a la encontrada en Chile, el estudio de su efecto sobre el alcoholismo sería de interés.
Las identidades nucleotídicas analizadas en la determinación del genotipo de la
ADH1C (11939 y 15115) presentaron una perfecta asociación en la población chilena
(11939 G y 115115 A para ADH1C*1 y 11939 A y 115115 G para ADH1C*2), por lo que
sólo sería necesario el análisis de una de estas posiciones para determinar el genotipo
de la ADH1C. De las dos posiciones nucleotídicas posibles para analizar, la
determinación de la identidad del nucleótido 15115 (aa 349) ha alcanzado gran
credibilidad y un alto grado de replicación en la literatura, a pesar de sus debilidades de
diseño o posibles consideraciones, descritas previamente (sección 7.2.). Por otro lado,
la determinación de la identidad del nucleótido 11939 (aa 271), aunque ha sido
utilizada sólo en esta memoria, tiene una mayor fortaleza en su diseño experimental
por a) contar con reacciones positivas para las dos identidades nucleotídicas (A y G)
de esta posición y b) analizar la sustitución nucleotídica codificante del cambio
aminoacídico que, en teoría, es responsable de las diferencias catalíticas entre las
isoenzimas ADH1C1 y ADH1C2, por encontrarse en el sitio activo de la enzima. Esto lo
convierte en el método de elección para el análisis del genotipo de la ADH1C en
estudios posteriores.
78
Dentro de las posiciones nucleotídicas analizadas de manera adicional en los genes
ADH1C y ADH1B, la única que tendría sentido analizar en estudios futuros, en distintos
grupos étnicos, regionales o socioeconómicos de la población chilena, sería el
polimorfismo que modifica el aminoácido 351 de la ADH1C, por ser un polimorfismo
exclusivo de población nativa de América y por haber presentado diferencias, aunque
no significativas, entre los grupos analizados en la población chilena.
Dentro de las proyecciones del presente trabajo se encuentra el estudio del efecto del
genotipo de la ADH1C sobre la respuesta de pacientes alcohólicos al tratamiento
farmacológico con disulfiram, el fármaco más utilizado en el tratamiento del
alcoholismo. Este fármaco basa su acción en inhibir irreversiblemente la ALDH2, de tal
manera que al consumir alcohol se produce una acumulación de acetaldehído,
generado por la ADH. Esta acumulación de acetaldehído genera reacciones
desagradables en el cuerpo, limitando la ingesta de alcohol del individuo en
tratamiento. El disulfiram presenta, sin embargo, amplias variaciones interindividuales
en su eficacia (Brewer, 1984), por lo que proponemos que los individuos alcohólicos
portadores de la variante más activa (ADH1C1) presentan una reacción de aversión
más intensa que aquellos individuos que no la portan, resultando en una mayor eficacia
terapéutica. Esta hipótesis se basa en parte en lo indicado por Chen et al. (1999),
quienes describieron que los efectos de las variantes de los genes ADH1B y ALDH2
son independientes y aditivos, encontrando que los portadores de las variantes
protectoras de ambos genes tienen un riesgo menor de alcoholismo que los portadores
de las variantes por separado. En este estudio se encontró que un 37% de la población
alcohólica chilena es homocigota para el alelo protector ADH1C*1 y un 46% es
portador heterocigoto de este alelo. Estos individuos tendrán, en teoría, un tratamiento
más eficaz con disulfiram que aquellos que no portan la variante más activa.
79
8. CONCLUSIONES
I) Se determinaron los genotipos de la ADH1C (alelos ADH1C*1 y ADH1C*2) y de la
ADH1B (alelos ADH1B*1, ADH1B*2 y ADH1B*3) en pacientes alcohólicos y población
general chilena utilizando un métodos de PCR-RFLP. Con esto se pudo determinar que
el alelo ADH1C*2 y el genotipo ADH1C*2/*2 tienen frecuencias significativamente
mayores en pacientes alcohólicos que en población chilena general, aumentan el
riesgo de alcoholismo (OR = 1,96 y 3,81, respectivamente) y son, por lo tanto,
permisivos del alcoholismo en la población chilena.
II) No se encontró evidencia estadística de que el alelo ADH1C*2 y su variante exclusiva
de población nativa de América, el alelo ADH1C*2Thr351, sean diferentes en relación
al riesgo de alcoholismo en la población chilena, aunque sí se observó una tendencia
hacia una mayor permisividad al alcoholismo asociada al alelo ADH1C*2Thr351.
III) No se encontró que el genotipo de la ADH1B modifique el riesgo de alcoholismo en la
población chilena; las frecuencias alélicas del gen ADH1B prácticamente no varían
entre los pacientes alcohólicos y la población chilena general. El alelo permisivo
ADH1B*1 predomina en ambos grupos con frecuencias alélicas del 95% y sus
portadores homocigotos alcanzan el 90%.
IV) El descontar a los portadores de las variantes rápidas de la ADH1B del análisis del
efecto permisivo del alelo ADH1C*2 y del genotipo ADH1C*2/*2 sólo produjo cambios
pequeños en la significación estadística de la diferencia entre grupos. El efecto del
genotipo de la ADH1C sobre el riesgo de alcoholismo es independiente del genotipo de
la ADH1B.
V) Para estudiar la protección genética conferida por las isoenzimas de la ADH en la
población chilena se puede analizar el genotipo de la ADH1C sin necesidad de
determinar el genotipo de la ADH1B. El genotipo de la ADH1C se puede determinar
analizando sólo la posición nucleotídica 11939 (aa 271), sin necesidad de analizar la
posición 15115 (aa 349), ya que las identidades de ambas se encuentran
perfectamente asociadas.
80
9. REFERENCIAS
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87
10. ANEXO Consentimiento informado
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92
