Practicas de micro industrial virtual.pdf

7/24/2019 Practicas de micro industrial virtual.pdf

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Reduca(Biologa).SerieMicrobiologa.MicrobiologaIndustrial. 2(4):3557,2009

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DiseodeprcticasvirtualesparalaenseanzadeMicrobiolgicaIndustrial

AntonioSantosdelaSenDomingoMarquinaDaz

DepartamentodeMicrobiologaIII.FacultaddeCienciasBiolgicas.

UniversidadComplutensedeMadrid.C/JosAntonioNovais,2.28040Madrid.

[email protected] [email protected]

Resumen:Enesteartculosedescribelametodologabsicaparaeldesarrollodeunasprcticasdemicrobiologaindustrialenunlaboratoriomicrobiologaconunadotacin

instrumental bsica. Como complemento al desarrollo experimental presencial, en

este trabajo se describe el uso complementariode una herramienta virtual para el

seguimiento y aprendizaje de las prcticas. Se describen toda una serie de casos

prcticos, con su metodologa, haciendo especial mencin a aquellas tcnicas

especficasdelamicrobiologaindustrialcomoeltrabajoconfermentadores.

Palabrasclave:Microbiologaindustrial.Prcticasvirtuales.Fermentacin.

INTRODUCCINALAASIGNATURADEMICROBIOLOGAINDUSTRIAL

LaasignaturadeMicrobiologaindustrial,esunaasignaturaqueelDepartamento

de Microbiologa III de la Facultad de Biologa de la Universidad Complutense de

Madrid imparteendistintas licenciaturasdel reade ciencias experimentales como

asignatura de segundo ciclo. La microbiologa industrial para la Licenciatura en

Bioqumicaesunaasignaturatroncal,yporlotantoobligatoriaqueseimparteatodos

losalumnosdeestalicenciaturaduranteelprimercuatrimestredelcurso.Constade8

crditos,4,5 tericosy3,5prcticos.Sinembargo, lamicrobiologa industrialpara la

LicenciaturaenCienciasBiolgicasesunaasignaturaoptativaqueseimpartedurante

elprimercuatrimestredelcursoyconstade7,5crditosdeloscuales3sonprcticos.Porltimo,lamicrobiologaindustrialparalaLicenciaturadeIngenieraQumicaesuna

asignaturaoptativaqueseimparteduranteelsegundocuatrimestredelcursoyconsta

entotalde6,0crditos(1,5prcticos).

Lasclasesprcticasdeestaasignaturase impartenconcentradasdurante12

semanas(dependiendodelaLicenciaturayelnmerodecrditosprcticos)debidoal

elevadonmerodealumnosdelasmismas,ysobretodoalainfraestructuraymaterial

de laboratorio necesario para la realizacin de las mismas. El objetivo de esta

asignaturaesponerencontactoalosalumnosconprocesosqueserealizandeforma

realenlas industriasbiotecnolgicas.Nohayqueolvidarque losalumnosquecursanestaasignaturadebentenerunaseriedeconocimientospreviosdelprimerciclodesus


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respectivas licenciaturas.Enelcasode losalumnosdeBiologa,estoshancursadode

formaobligatorialaasignaturaMicrobiologaquelesproporcionaunabaseparapoder

abordar con garantas esta asignatura. En el caso de las otras licenciaturas, el

Departamento de Microbiologa III ofrece la asignatura genrica denominada

FundamentosdeMicrobiologaquejuegaelmismopapelque laMicrobiologaenelrestodelicenciaturas.

Lanecesidaddeunasprcticasvirtualescomplementarias

Lasprcticasdeestaasignaturahansidodiseadasparaponerenconocimiento

de losalumnosunaseriedeprocesosbiotecnolgicosquerequieren laaplicacinde

distintas tcnicas bioqumicas y microbiolgicas que se desarrollan en plantas de

produccin industrial.Sinembargo,eldesarrollodeestasprcticas seve limitadoal

escaso margen espaciotemporal de las mismas, lo que obliga en muchos casos a

finalizar un proceso prctico cuando su desarrollo real en la industria pudiera sermuchomsamplio.

Estoprovocaque losalumnosquehacenestasprcticasnopuedanobtenerun

aprovechamiento ptimo de esta parte de la asignatura o no lleguen a tener la

perspectivasuficientedelprocesoensuvertientemsenfocadaa la industria.Todo

elloconduceapensarquelasprcticasdelaasignaturadeberansercomplementadas

con una herramienta de trabajo para que el alumno desarrolle, durante su trabajo

personalfueradel laboratorio,aquellasaptitudesquenopuedendesarrollarseen los

laboratoriosporsuspropiaslimitacionestemporalesydotacionales.

As,enelpresentetrabajopresentamosunaherramientavirtualenformatode

pginaweb.Estapginaweb,esuncomplementoa lasprcticasdesarrolladasenel

laboratorio,quesonnecesariasynuncadebensuprimirse,puesenellas, losalumnos

seponenen contactodirectocon losproblemas realesde losprocesos industriales.

Por tanto, conel simuladorquepresentamos sepretende llevar a trmino aquellas

experienciasquedeotraforma,poreltiempoquerequieren,sobrepasaraneltiempo

destinadoalasprcticaspresenciales.

Mediante un sistema informtico con una base de datos (reales), aplicando

programas informticos adaptados a cadaprctica, el alumnodispondrde todo elmaterialnecesarioparasimularocomprenderelprocesodeprincipioafin.Utilizando

estosprogramas,elalumnopodr introducirsusdatosobtenidosenel laboratorioy

extrapolarlosparaver laevolucindelproceso.Losalumnosdispondrndeunaserie

decuestionariosdondeseplantearnpreguntasprcticaspararesolveraplicando los

conocimientosadquiridos.Deestaformaseestableceunsistemadeautoevaluacin,

donde ellos puedan establecer si han cubierto los objetivos planteados en las

prcticas.De igual forma, losalumnospodrn resolvercualquiercuestinque se les

plantee mediante un sistema de consulta con el profesor por correo electrnico

medianteunbuzndeprcticasdeMicrobiologaIndustrial.


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Laestructuradelaherramientainformtica

Elcontenidodelaherramientavirtualsepresentaconunapginaprincipalenla

cual seobserva fcilmente todoelcontenidoyestructurade lapginaweb (Fig.1).

Comosepuedeobservarenestaprimerapgina,elcontenidoprincipalde lamisma(lasprcticasde microbiologaindustrial)sevecomplementadoconotrainformacin

adicionalcomplementariaque losalumnospudierannecesitarenunmomentodado.

Esta informacin (observacinmicroscpica, tcnicaasptica,coleccionesdecultivo,

etc.)hacereferenciaalasprcticaspreviasdemicrobiologa,llammoslageneral,que

losalumnosdeberanhabercursadopreviamente.

Figura 1. Pgina principal de presentacin de los contenidos de la herramienta informticadesarrolladaenformatohtmlparasuvisualizacincomopginaweb.

En esta pgina bajo el nexo contenido se hace una presentacin de la

asignatura,unajustificacinaldesarrollode lapresenteherramienta informticayse

daunavisingeneralde lamicrobiologa industrialconantecedenteshistricos.Bajo

el vnculo microorganismos se aporta una amplia informacin sobre los

microorganismos de coleccin, de los microorganismos usados en las prcticas de

microbiologa industrial,ascomo lastcnicasparasuconservacinymantenimiento

durantelargosperiodosdetiempo.

Porotrolado,todalainformacinconcernientealosmicroorganismosdescritos,

las tcnicas empleadas, el desarrollo de las prcticas, el aparataje del laboratorio,

etcteraestncomplementadosconunagaleradeimgenesyvideos.Estabasepone

alalumnoensituaciny lepermitecomprender losprocedimientospasoapasoy

podervisualizarlostantasvecescomoquiera.Lastcnicasymicroorganismosdescritos

puedenservisualizadosdeformaindependientedesdelaGaleraMultimediaobien,

desdelaprcticaoprocedimientoqueestencadacasodirectamenterelacionadaconlasimgenesoconlosvideoscorrespondientes(Fig.2).


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Figura 2. Informacin complementaria sobre los microorganismos de prcticas de microbiologaindustrial, su conservacin y mantenimiento. Cada entrada, bien sea un microorganismo, unaobservacinmicroscpicaounatcnicaconcretapuedeservisualizadaendetallehaciendoclicsobrela misma. Simultneamente, la galera multimedia permite al alumno reconocer losmicroorganismosconlosquetrabajayhacerunseguimientodelosprocesosindustrialesatravsdelosvideosaportados.

Unas prcticas de microbiologa industrial estn basadas en el desarrollo de

mltiples tcnicas microbiolgicas y bioqumicas, por ello, bajo el vnculo

Metodologa Analtica encontramos en esta herramienta todas las tcnicas

necesariasparaeldesarrollode lasprcticas,ascomo todos losdetallesnecesarios

paralapreparacindereactivosysoluciones(Fig.3).

Figura 3. Estructura de la informacin contenida en el epgrafe de MetodologaAnaltica. En lafiguraseobservacomodesplegandoelvnculodeMediosdecultivoaparecendetalladoslosmediosempleadosenlaprcticaconsucomposicin,preparacinyesterilizacin.Losdemsvnculosestnenfocadosenelmismosentido.


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OBJETIVO

Desarrollo de una herramienta virtual para el conocimiento por parte de los

alumnos de las tcnicas y procesos empleados en la asignatura de microbiologa

industrial para el seguimiento personalizado y tutelado de las prcticas de laasignatura. Bajo este objetivo general podemos a su vez destacar los objetivos

particularesqueencadaprcticadetallaremos.

LASPRCTICAS

Lapedagogadeberealizarsedemaneracrtica,reflexivaycreativa;endondelos

saberes multidisciplinares confluyen en un proyecto de diseo. La pedagoga en s

mismaesunelementomvilyactivodenuestrasociedad.Enestesentidoelactual

trabajoplantea la realizacindeunasprcticas virtualeseminentementedirigidas acomplementar los aspectos ms aplicados de la microbiologa facilitando as una

formacinenunmbitodegran importanciaen la industriaactual,LaMicrobiologa

Industrial. Lasprcticasquepresentamos recogenungrupodeexperienciaspara su

realizacinenun laboratoriobsicodemicrobiologa,peroquesinuncomplemento

adicional quedan restringidas por las limitaciones dotacionales y temporales de la

docencia impartidaenunaFacultad.Lasprcticasplanteadas,ochoentotal,darnal

alumnounaformacinmuydirigidaa loquesersuactividad laboral.Estasprcticas

sedetallanacontinuacin.

Prctica

1.

Cuantificacin

de

la

produccin

de

penicilina

por

una

cepa

de

Penicilliumchrysogenum

Las interacciones de los microorganismos en el suelo son la base de los

fenmenos de competencia entre los mismos. Muchos microorganismos para

desplazar a otros de su hbitat sintetizan sustancias que inhiben o restringen el

crecimientode lossegundos,permitiendoas,unamssencillacolonizacin.Algunas

de estas sustancias son los antibiticos, cuya produccin en el laboratorio y

posteriormenteen la industriahapermitidoerradicarocontrolarbuenapartede las

enfermedadesinfecciosas.

Objetivo

Elobjetivodeestaprcticaescuantificarlaproduccindeunantibiticoporun

microorganismo.

Metodologayplandetrabajo

Para comenzarhemosde inocularunabotellaque contenga granosdemaz,

conPenicilliumchrysogenumquepreviamente tenemoscrecidoenunaplaca.

Tomaremoselinculoconunsacabocados.


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Sesiembraenmatracesconunacapacidadde1.000ml,con200mldemedio

de produccin de penicilina, 5 granos de maz cubiertos de esporas como

inculodePenicilliumchrysogenumproductordepenicilinaeincubarentre24

a27Cdurante7dasenagitacina200rpm.

PrepararplacasdePetriconAgarnutritivopararealizarunantibiograma.Una

vez secas, se extender sobre la superficie de lasplacas una suspensin (en

suero salino)deunmicroorganismo sensible.Empleandoparaellounhisopo

estril.ParaesteensayoseutilizarlacepadeEnterococcusfaecalisCECT481T.

A partir del cultivo lquido sembrado con el microorganismo productor del

antibitico y transcurridos los siete das, se filtra el contenido del matraz a

travsdeunpapelde filtroyseenvuelveelmicelioconcuidadoenpapelde

aluminio para su posterior esterilizacin. A continuacin, se toman dos

alcuotasde1ml cadaunaendos eppendorfestrilesque semantienenen

hielo.

SepreparaunasolucindepenicilinaGaunaconcentracin1.0g/mlSetoman

discosdeantibiogramaestrilesalosqueseaaden:1,2,5,10,20,25,30,35y

40mlde lasolucindepenicilinaysecolocansobre lasplacasdePetriconel

cspeddelmicroorganismosensible.Acontinuacinsediluyea lamitad,a la

quintaya ladcimaparteelsobrenadantedelmediodecultivoquecontiene

antibitico.SobreotrasplacasdePetriseponendiscosdeantibiogramacon20

mlde sobrenadante sindiluir. Sedejaque el antibiticodifundadurante 30

minutosyseincubanlasplacasdurante24horasa37Cbocaarriba,habiendo

anotado en la base de la placa las distintas concentraciones de antibiticoensayadas.

Anotar los resultados del antibiograma:Medir los halos de inhibicin de los

discoscon lasdistintasconcentracionesdeantibiticoy representarenpapel

semilogartmico laconcentracindeantibitico frentealdimetrodehalo.A

partirde esta rectapatrn y conociendo eldimetrodehalodel antibitico

problemasepuedecalcularsuconcentracinenmg/ml.

Aportacionesdelaherramientainformticaaldesarrollodeestaprctica

Videodelprocesoprctico,fotografasdelosmicroorganismosempleadosyde

ciertas fasesdelproceso.Aplicacin informticaparael ajustepor regresin

linealdelosdatosexperimentales.Ejemplosprcticos.


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Figura4.Esquemaaseguirduranteelprocesadodelosdatosobtenidos.Comosepuedeobservarlaherramientainformticapresentaunaaplicacinparaajustarlosdatosporregresinquepermitealalumnoobtenerlaecuacindelarectadecalibrado.Elalumnopodrentoncesinterpolarlosdatosexperimentalesobtenidos.

Prctica2.InmovilizacindeclulasdeSaccharomycescerevisiaeparalaproduccindeetanol

Los productos fermentados son tan antiguos como la humanidad. Desde que

comenzelcultivodelavidoloscereales,elhombreobservquetantoelmostodela

uva como los macerados de cebada eran transformados en bebidas euforizantes

alcohlicas.Desdeentonceslaproduccindelasdistintascalidadesdevinoycervezas

han cambiadomucho,yen laactualidad tanto laenologa como la tecnologade lacerveza cuidan todos los aspectos relacionados con laproduccin (tipodematerias

primas,levaduras,factoresambientales,etc.).

Objetivo

Elobjetivode laprcticaesestudiarelprocesodefermentacinalcohlicade

una cepa industrial de Saccharomyces cerevisiae inmovilizada en bolas de

alginato.

Metodologa

y

plan

de

trabajo

Da1.Sembrarlosmatracesde500mlconteniendo200mldemedioYPDcon1mldeun cultivo recientede Saccharomyces cerevisiae (A yB). Incubar en

agitacina28C.Preparacindelalginato:Pesar2.0gramosdealginatosdico

y solubilizarlo lentamente en 100 ml de agua destilada. Esterilizar a 121C

durante20minutos.

Da2.Centrifugarelcultivode la levaduraenYPDa5000 r.p.m.durante10minutos.Elsedimentose resuspendeen100mldeaguaestrilyserepiteel

proceso de centrifugado. El sedimento se resuspende en 10 ml de agua


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destiladaestril.Mantener las clulas enhielo.Preparar 200mldeCaCl250

mM.Esterilizara121Cdurante20minutos.

Preparacindelasclulasinmovilizadas.Mezclar5mldelasuspensinacuosa

de levadurascon5mldealginatoal2%enunvasodeprecipitadosutilizandounavarilladevidrio.Introducirlamezcla(levadura+alginato)enunajeringuilla

estril(10ml).DejarcaergotasdelamezclasobrelasolucindeCaCl2(vasode

precipitados) que previamente se ha puesto en hielo. Dejar las bolas de

alginato con las clulas inmovilizadasalmenos20minutosen la solucinde

CaCl2.Eliminarel lquidoy lavarconaguaestril.Eliminarelexcesode lquido

filtrandoatravsdeunpapeldefiltroestril.

En cada mesa se trabajar con dos estirpes de levaduras A y B y con dos

inculos:Grupo 1. Estirpe A + 50 bolitas. Grupo 2. Estirpe A + 25 bolitas.

Grupo3. EstirpeB+50bolitas.Grupo4. EstirpeB+25bolitas.Abriruntubode ensayo con tapn de rosca y aadir 20ml demedio YPD e introducir el

nmero de bolitas descrito de cada una de las estirpes (A B) y cerrar

hermticamente a continuacin. Incubar sin agitacin a 28C durante 2448

horas. Posteriormente se realizar la valoracin de azcares consumidos y

etanolproducido:

Valorar los azcares reductores presentes en las mismas mediante el

mtododeNelsonySomogy.Comparar los resultadoscon lacantidadde

azcarpresenteenelmediodecultivosinfermentar.

Valorareletanolproducidoencadaunadelascondiciones.Lavaloracinde

etanolserealizarconelkitcomercialde lamarcaRoche(ref.62024101).

Calcular el rendimiento en la produccin segn la ecuacin: C6H12O6

2C2H5OH+2CO2

Da3.Tomar2alcuotasde1mldecadaunadelasmuestras,yconservarenhielo,para a continuacin valorar los azcares reductorespor elmtodode

NelsonySomogy.Elprocesoserealizaentubosdeensayograndes.Parapoder

cuantificarlaconcentracindeazcaresreductoresdelamuestraesnecesario

realizaruna rectapatrndeglucosa.Acontinuacin realizar lavaloracindeletanoldelamuestra.


Videodelprocesoprctico(Fig.5),fotografasdelmicroorganismoempleadoy

deciertasfasesdelproceso.Aplicacininformticaparaelajusteporregresin



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esttico y en agitacin,buretas,pipetas, fenolftalena al1% en etanol,NaOH

0,01 N (1.000 ml), cido lctico 0.01N (100 ml), colorantes de Gram,

microscopioyaccesorios.


Enunmatrazde250o500ml, conteniendo100mlde lechepasteurizadao

esterilizada, se inocula con 1mlde yogur comercial. Elmatraz se incuba en

estticooenagitacinauna temperaturadeterminada,28C,37Cy45C.A

las24horasseobservan losmatraces incubadosendistintascondicionesyse

anotan lasdistintascaractersticasorganolpticas:aspecto (homogneoono,

confasesseparadasono),viscosidadyolor.

Acontinuacin,setoma1mldelproductoformadoysediluyeen9mldeagua

destilada,enunmatrazoenunvasode50ml.Sepondrn10mldelasolucin0,01 M de cido lctico en un matraz de 250 ml de capacidad que se

neutralizar frenteaunvolumendeNaOH0,01M,seapuntarn losmililitros

consumidosen lavaloracin.Acontinuacin,sepondr1.0mldeyogurenun

matrazyse leaadirn9.0mldeaguadestinada,neutralizandosucontenido

de cido lctico conNaOH0,01M.Se realizarn los clculosnecesariospara

determinarlamolaridaddelcidolctico.Acontinuacinseharuncuadrode

resultados,comparandotodaslascondicionesensayadasenellaboratorio(Fig.

5).

Tambin se realizar una tincin de Gram de una muestra previamentedesengrasada que permita observar los diferentes tipos de microoganismos

que aparecen en el yogur. La tincin se realizar como se detalla:sobre un

porta limpioseponeunagotadeaguaysobreellaseextiendeunapequea

gotadeyogurtomadaconunasaflameada.Sesecaalaireoconcalorsuavey

sefijaa la llama.Paradesengrasar lapreparacin,secubreconunasgotasde

xilenoysemantieneduranteunminutoaproximadamentemovindoladevez

en cuando.Paraeliminarelxileno, se lava lapreparacin conalcoholde96

durante3060segundos.Acontinuacinsevuelvealavarconaguayestlista

paraserteidasegnunmtodoconvencionalcomolatincindeGram(Fig.6).

Prctica4.Cinticadelavadodeunfermentadorencultivocontinuo

EnMicrobiologaeltrminofermentadorenglobaatodosaquellosrecipientesen

los cuales se desarrolla un proceso de fermentacin con microorganismos. En los

sistemas cerrados losmicroorganismos crecenenunmedioqueno se renueva,por

ello,losmicroorganismospresentanlastpicas4fasesdelacurvadecrecimiento.Los

cultivos crecenhasta terminar losnutrientes,por tanto,duranpoco tiempo. En los

sistemas abiertos y semiabiertos los microorganismos crecen en un medio que se

renueva. En los semiabiertos se renueva cada cierto intervalo de tiempo. En los

abiertos

se

renueva

constantemente.

Por

ello

los

microorganismos

crecen

exponencialmentedurantemuchotiempo(nohay4fasesdecrecimiento)puestoque


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losnutrientes son repuestos.Dependiendodelmedio losmicroorganismos crecern

conunatasadecrecimiento(),quepodemoscontrolardentrodeunosmrgenes.Los

cultivostericamentepuedendurarilimitadamente.

Figura6.Resultado tpicoobservadoen laprcticade fermentacin lcticapara la fabricacindelyogur. Arriba se observa la produccin de cido lctico en un experimento propuesto y en lafotografaseobservan, trasuna tincindegran, lasdospoblacioneshabituales responsablesde laproduccindeyogur.

Objetivo

Adems de familiarizarse con los componentes de un fermentador de tipo

clsico,setratadeobservarladisminucinexponencialdelaconcentracindel

contenido de un fermentador de volumen constante y sometido a un flujo

elevado.Deestaformapuedepredecirseelcomportamientodelproceso.

Materiales

Fermentador tipo piloto, capacidad til: 1,5 litros. Bomba peristltica con

medidordeflujo.Depsitosdealimentacinyefluenteconaccesorios.Pipetasde 5mlode10ml. Espectrofotmetro y tubosparaelmismo. Levadurade

panadera,granuladayseca.Colorantes,microscopioyaccesorios.


Laprcticapropuestaconllevadiferentesabordajesquecomienzancon llenar

el fermentador y el depsito de reserva con agua. El clculo del flujo de la

bombaperistlticautilizando agua, tantoen laentrada comoenelefluente.

Sacarunos100mldel fermentador,haceruna suspensincon1,0 1,5gde

levaduraseca

einocular

elfermentador.

Poner

elsistema

en

continuo

ytomar

laprimeramuestra(5ml)delacubacuandocomienzaasalirelefluente.Medir


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la densidad ptica de la muestra a 600 nm y repetir cada 15 minutos. Al

terminar, desmontar el fermentador, limpiando cada una de sus piezas y

tambineldepsitodeefluente.

Hacerunatabladeresultados,representandoenpapelsemilogartmicolasD.O.frente al tiempo. A partir de esos datos calcular D segn la ecuacin

correspondienteycompararestevalorconelobtenidoapartirdeFyV.Hacer

una observacinde levaduras teidas almicroscopio. En elpresente trabajo

tambinsedescribenlasecuacionesparaunfermentadorencultivocontinuoy

sellegaaldesarrollodelaecuacindecultivocontinuo:lnX=lnXo Dtqueseusarparaabordarlosresultadosdeestaprctica(Fig.7).


Videodelprocesoprctico,fotografasdelosmicroorganismosempleadosydeciertas fasesdelproceso.Aplicacin informticaparael ajustepor regresin


Figura 7. Resultado observado en la prctica de cintica de lavado de un fermentador donde seobservaladisminucindeladensidadpticacomoconsecuenciadelaeliminacindebiomasaenelfermentadorlavado.LosdatosdeDOserepresentan,ajustanyanalizanparadeterminarlatasadedilucindelfermentador.


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Videodelprocesoprctico,fotografasdelosmicroorganismosempleados,del

aparatajenecesarioydeciertasfasesdelproceso.Aplicacin informticapara

elajusteporregresin linealde losdatosexperimentales.Ejemplosprcticos.

Testyproblemasdeautoevaluacin.

Prctica 5. Determinacin de los parmetros de muerte trmica de unmicroorganismo

Objetivo

Elobjetivodeesteensayoesestudiarlosparmetrosdemuertetrmicadeun

microorganismocontaminanteyestablecercriteriosparasueliminacin.

Material

Matracesde250mldecapacidadconteniendo100mldeunasuspensindel

microorganismo contaminante de densidad ptica conocida en suero salino.

Baos termostatizados a distintas temperaturas. Pipetas automticas de

distintos volmenes y puntas estriles. Tubos de suero salino estril con un

volumende9.0ml.PlacasdePetriconmediodecultivoYeastMorphologyAgar

(Y.M.A.) para realizar recuento de microorganismos viables. Estufas de

incubacin.EsptulasdeDrigalskypararealizarlaextensindelasmuestras.


Laprcticatienecomoobjetivosfundamentalesladeterminacindeltiempode

reduccindecimal (Dt)y ladeterminacindelcoeficientede temperatura (Z).

Paraello,elabordajeexperimental sercomoelquesedetalla.Matracesde

250mldecapacidadconteniendo100mldesuerosalinosedisponenenbaos

deagua,termostatizadosa44,47y50C.Unavezestabilizadalatemperatura,

se incorporaacadaunode losmatracesunasuspensindelmicroorganismo

contaminante (Saccharomyces cerevisiae PYCC 3507) a estudiar.

Inmediatamente se toma la primera muestra de los matraces a cadatemperatura(0.1ml)correspondientealtiempocero,lacualsedepositasobre

elagardeunaplacadepetri.El inculo sedistribuyehomogneamente con

una esptuladeDrigalsky esterilizadapor flameado con alcohol. La tomade

muestrasysiembradeplacasserepitea los10,15,20,25,hasta90minutos.

Lasplacasseincubana28C.Despusde2448horas,sehacenlosrecuentos

decoloniasestimandoelnmerodemicroorganismosviablespormililitrode

suspensin.

ElvalorDt,sedefinecomo:eltiemporequeridoparareducirunapoblacinasu

dcima parte, a una temperatura determinada; o lo que es lo mismo, ladisminucindeunapoblacinenunaunidadlogartmica.Paracalcularelvalor


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de Dt, se representa en papel semilogartmico los microorganismos viables

frentealtiempo,paracadaunadelastemperaturas.Deestaformaseobtienen

tres lneasdeochopuntos.Lospuntosdecada lneaseajustarnaunarecta

medianteunanlisisderegresinlineal(Fig.8).

Deformaanloga,larepresentacinsemilogartmicadelosvaloresDt,frentea

la temperatura, permiten calcular el coeficiente de temperatura. El valor Z,

representael incrementoennmerodegradosquesenecesitanaplicarauna

muestraparareducirdiezveceseltiempodereduccindecimalDt(Fig.8).

Figura8.Organigramade laprcticapara ladeterminacinde losparmetroscinticosdemuertetrmicadeunmicroorganismo.Elalumno,trasobtenerexperimentalmentesusrecuentosdeviables(tabla) representa y ajusta por regresin sus datos para obtener el clculo de la Dt (tiempo dereduccin decimal) y la Z (coeficiente de temperatura). La herramienta le permite representar yajustarporregresinlosvaloresobtenidos.

Prctica 6. Determinacin de los parmetros cinticos de crecimiento de unmicroorganismoparalaobtencindebiomasamicrobiana

EnMicrobiologa lamedidadeltamaocelularnotienecasi importancia,noas

la medida del tamao de la poblacin celular. Podremos hablar del crecimiento

individualdecadaclulamicrobianaperotambindeuncrecimientopoblacional.En

estaprcticaabordamoselcrecimientomicrobianorefirindonosalapoblacinglobal,

esdecir,alaumentodelnmerodeclulas.Unadelasventajasdelpequeotamao

delosmicroorganismosessuelevadarelacinSuperficie/Volumen.Cuandolasclulas

crecen,surelacinS/Vdisminuye,haciendomenoseficientesciertosprocesoscomoel

transportedenutrientes,laexcrecindeproductosdedesechoyporellolavelocidad

de su metabolismo. Esto obliga a las clulas a dividirse. La divisin de una clula


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microbianapuede realizarsedediversasmaneraspero,engeneral,puede resumirse

endos:Biparticin(incluidagemacin)ycrecimientoapical.

Objetivo

El trabajo tiene por objeto evaluar la produccin de biomasa celular

microbiana, susceptible de ser empleada como complemento de la

alimentacinhumanaodeganadoosimplementeserutilizadacomo"starter"

para otros procesos industriales. En esta prctica se trata de estudiar el

comportamiento de la levadura Candida utilis CYC 1018 sobre un sustrato

carbonadodecomposicinconocida.Antesdesuproduccinenplantapiloto,

se requiere la caracterizacin del crecimiento del microorganismo en los

mediosycondicionesseleccionadas,parapoderpredecirsucomportamiento.

Material

Matracesde 500ml, conteniendo 200ml demedio Yeast PeptoneDextrose

(Y.P.D.).Matracesde100mlconteniendo50mldeY.P.D.CultivoenYPDAgar

del microorganismo a ensayar, en este caso Candida utilis CYC 1018.

Opcionalmente se puede emplear Saccharomyces cerevisiae CYC 1001T.

Agitadoresmagnticosyagitadororbitalreguladoa28C.Pipetasestrilesde5

y10ml.Pipetasautomticasdedistintosvolmenesypuntasestriles.Tubos

para muestras (estriles) con tapn de rosca. Medidor de pH.

Espectrofotmetro. Centrfuga refrigerada. Estufa de desecacin, regulada a

80C.Materialesyreactivospara lasdeterminacionesdepesoseco:Filtrosde0.22 mm de tamao de poro. Sistema de filtracin (Kitasato). Bomba

peristltica. Vidrios de reloj. Para la valoracin de azcares reductores:

Reactivos de NelsonSomogy. Tubos de ensayo. Agua destilada.

Baotermostatizadoa100C.


Unmatrazde100mlcon50mldeY.P.D.seinoculaconCandidautilisCYC1018

cultivada en Y.P.D.Agar. Se incuba a 28C en agitacin orbital a 150 r.p.m.

durante24horas (preinculo).Transcurridoeste tiempo,se transfieren20mlde este cultivo a un matraz de 500 ml de capacidad con 200 ml de Y.P.D.

atemperadoa28C.Estematrazesincubadoenlasmismascondicionesqueel

preinculohastaalcanzarlafasedecrecimientoexponencial.

Apartirdeunmomentodeterminado(faseexponencial)setomanmuestrasde

15mldelcultivo(encondicionesaspticas)aintervalosde15minutoshasta90

minutos.Lasmuestrassedisponenendostubosdetapnderoscaaraznde5

y 10 ml cada uno. Con uno de estos tubos (el de 5 ml) se determina el

crecimiento del cultivo mediante medida de la densidad ptica a 600 nm,

frente aunblancoque contengaelmismomediode cultivoestril.Una veztomada lamedida, los tubos sehiervendurante tresminutosy seguardana


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4Cpara laposteriordeterminacindeazcaresreductores.Apartirdeltubo

conteniendo10mldemuestrasehacendeterminacionesdepHydepesoseco.

Para esto ltimo, se centrfuga la muestra a 5.000 r.p.m. a 4C durante 10

minutos.Acontinuacinselavaelpelletobtenidoconotros10mldeaguayse

vuelve a centrifugar en lasmismas condiciones. Luego se pasa lamuestra atravs de un erlenmeyerkitasato sobre el que se ha colocado un filtro de

membranade0.22mmdetamaodeporoysellevaaunhornoPasteura80C

hasta obtener peso constante. La determinacin de azcares reductores se

realizaporelmtododeNelsonySomogy(1952).

Conlosvaloresobtenidossehaceunarepresentacinenpapelsemilogartmico

del consumo de sustrato (azcares reductores iniciales menos azcares

residuales), de produccin de biomasa (peso seco) y de la densidad ptica

(D.O.)(Fig.9).Analizandolaspendientesdelasgrficas,puedeestimarselatasa

especficade crecimiento (). Ladeterminacin exactadeesteparmetro serealiza mediante anlisis de regresin de las distintas rectas mediante la

determinacin del alineamiento de los puntos segn el coeficiente de

correlacin (peso seco y densidad ptica). De forma anloga, puede

determinarsegrficamenteeltiempodeduplicacin(td)ycompararlocon los

valoresobtenidossegnlafrmulaterica:=Ln2/tg.

Figura 9. Organigrama de la prctica 6 para la determinacin de los parmetros cinticos decrecimientodeunmicroorganismo.


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Prctica7.Deteccindeposiblesantagonismosentredistintasestirpesdelevaduras,(fenmenokiller)

Laactividadkillerfuedescritaporprimeravezen1963.Fueentoncescuandose

comprobqueciertascepasde levaduraspertenecientesa laespecieSaccharomyces

cerevisiaeerancapacesde inhibirelcrecimientodeotras,pudindoseestableceruna

gran analoga con el fenmeno de inhibicin bacterianamediado por bacteriocinas

descubiertoaosantes.Como resultadodeesasprimeras investigaciones,sedefini

un sistemade tres fenotiposdistintospara agrupar las cepas en funcindelnuevo

carcter encontrado: killer (cepas de levadura capaces de inhibir el crecimiento de

ciertascepaspertenecientesalfenotiposensible),sensible(cepassensiblesalaaccin

de ciertas cepaskiller)yneutro (cepasquenopertenecanni al fenotipo killer nial

fenotipo sensible). Posteriormente, este sistema se redefini y se llev a cabo una

primera caracterizacin fsicoqumica de la actividad killer en S. cerevisiae.

Determinandoquelanaturalezadelfenmenosebasabaenlasecrecindetoxinasdecarcterproteico,sensiblesalcaloryhabitualmenteactivasapHcidos.

Objetivo

Lafinalidaddeestaprcticaesladeteccindelainhibicindelcrecimientode

una levaduraporaccindeotraperteneciente a lamismauotraespecieen

basealaexpresindelfenmenokiller.

Material

Cultivosde diferentes cepasde levaduras enmedio YMA (Yeastmorphology

Agar).Tubosconaguadestiladaesteril.Torundasdealgodnestriles.Placas

demedioYMAMBNaCl (YeastMorphologyAgarMethyleneBlueconNaCl6%

p/v).

Metodologa

Paraesteensayoseutilizan las tcnicasnormalesdeantibiogramadirectoen

placa.Sepreparaunasuspensindelaslevaduras"sensibles"enaguadestilada

estril.ConunaD.O.en laescaladeMcFarlandde0.5.Seimpregnaunhisopoestrilconesasuspensinyseextiendedeformahomogneasobrelasplacas

deYMAMBNaCl.

A continuacin se siembra otra levadura, presuntamente killer sobre la

superficiede laplacaanterior, tomandoun inculomuydensoconelasade

siembraydepositndoloenunpuntosobre lamismaplaca. Incubar todas las

placassembradasa20C.

Despusde48a72horasdeincubacin,seobservasiaparecenfenmenosde

inhibicinalrededor

de

las

masas

de

levadura

formadas

(Fig.

10).

Dada

lagran


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especificidaddelfenmeno,sehacenecesariorealizaruncuadroderesultados

detodaslaslevadurasensayadas.

Figura10. Ejemplode los resultadosobtenidosen laprcticapara ladeteccinde factorkillerenlevaduras. En la fotografa observamos una placa petri con un cultivo en csped de la levadurasensibleCandidaboidiniiPYCC3430ytreslevadurassembradasparadeterminarsucarcterkiller.Seobservaunadeellasconungranhalodeinhibicin,otraconunhalodiscretoyotrakillernegativa.

Prctica8.ColumnadeWinogradski

La columna de Winogradsky se ha utilizado de manera tradicional en el

aislamiento de bacterias fototrficas rojas y verdes, y de otros anaerobios. Esta

columna,diseadaporSergeiWinogradskyen1880paraestudiarlosmicroorganismosdelsuelo,esunecosistemaanaerbicoenminiaturaquepuedeconstituirunabuena

reservademicroorganismosdelosdistintosciclosbiogeoqumicos.

En la columna de Winogradsky tpica se desarrollan diferentes tipos de

microorganismos.Lascianobacteriasylasalgasverdescrecenmuyrpidamenteenla

porcinsuperiorde lacolumnadeaguay liberanrpidamenteoxgeno.Enel lodose

producen procesos fermentativos que originan la produccin de cidos orgnicos,

alcoholes,cidosulfhdricoehidrgeno.Comoresultadodelaproduccindesulfuros

se forman colonias coloreadas de rojo y de verde en las capas ms altas del lodo

expuestasalaluz.Laszonasrojascorrespondenconlasbacteriasrojasdelazufre,quesedesarrollanen lapartesuperiorde lacolumna, laszonasverdescorrespondencon


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bacteriasverdesdelazufrequesesitandebajode laszonasrojas(estosedebea la

diferenciadetoleranciadelsulfurodeunasbacteriasodeotras).Enlainterfaseagua

lodosesitanlasbacteriasrojasyverdesnodelazufre(Fig.11).

Quedaclaroquelaidentificacindelosmicroorganismospresentesesunatareaquerequieremuchomstrabajoyelempleodeprocedimientosmscomplejos,yque

las imgenes que se presentan, nica y exclusivamente, deben servir de forma

orientativa para la diferenciacin a grandes rasgos de algunos tipos de

microorganismos.

Lo que se pretende sobre todo es relacionar los cambios macroscpicos

observados (ennegrecimiento,aparicindeburbujasdeaire, cambiosde color,etc.)

conelmetabolismoylafisiologageneraldelosmicroorganismos.

Objetivo

Los objetivos de nuestro trabajo son dos. Primero, por un lado se pretende

observar la evolucin de una poblacin microbiana natural a lo largo del

tiempo.Estodebeserrealizadoobservando tanto loscambiosmacroscpicos

que han ocurrido, como los microorganismos presentes, "in vivo" tras una

tincinadecuada.Segundo,estudiaruncasoconcretodepolucinambiental(la

produccin de sulfuros) y su posible control. Para ello la columna se ha

preparadoporduplicadoconysinnitratoaadido.

Material

Tubosdeensayodetamaoadecuado.1012trozosde23mm2depapeldefiltro.

Lododero.SO4Ca(tiza).100mg/tubo.CO3Ca100mg/tuboNO3Na2100mg/tubo.

Metodologa

MarcarcadaunodelostubosdeensayoconlasletrasAyB.Aadiracadauno

delostubosporesteorden:SO4Ca(tiza)100mg/tubo.CO3Ca100mg/tubo.10

12trozosde23mm2depapeldefiltro.Lododero.

Secontinarellenandocon lodoo tierraresuspendidaenagua,evitandoque

queden burbujas de aire atrapadas. El objetivo es que la tierra quede bien

depositadayque losvolmenes intersticialesqueden llenosdeaguaynode

aire,paracrearunambienteanaerobio.Esto seconsiguemejor si seecha la

suspensindetierrapocoapoco,seesperaque latierrasedepositedejando

unos milmetros de agua por encima y slo entonces se echa la porcin

siguiente.AltuboB,ademsdetodoloanterior,hayqueecharleantesdellodo

yhacialamitaddelacolumna100mgdeNO3Na2.Marcareltuboconunaseal

ensupartesuperioryexponerlodurantevariassemanasconlasealdecaraa

laluz.


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Figura 11. Fotografa de la columna de Winogradsky reflejando el desarrollo de las diferentespoblacionesmicrobianasquesedistinguenporlospigmentosdedistintocolorqueproducen.

LARESOLUCINDEPROBLEMAS

ParaStaceyyGroves(1999),elresolverproblemasycmoensearahacerlo,es

unodelospuntoslgidosdentrodelmundodelaprendizaje.Quizsestoseaproducto

depensarquecon losconocimientostericosqueposeen losalumnosseasuficiente,

peroalahoradeponerlosenprcticaalgofalla,comosialgncomponenteestuviera

ausente. Esto nos hace pensar en la influencia de ciertos elementos que en algo

contribuirnalxitode laresolucindeproblemas. Igualpodrapasarencuantoa la

necesidaddeacompaaralalumnoen la tareaderesolverunproblema,bienporel

profesoroporotroalumnomscapaz.

Ros Cabrera (1997), sostiene que: "La mediacin social est ntimamente

relacionadaconlainternalizacinporcuantoeslainteraccinsocialconuncompaero

ounadultolaquefavorecelainternalizacindelasfuncionespsicolgicasnuevas".En

el presente trabajo se propone un modelo de aprendizaje complementario que, a

primeravistaparecierasencillo,sinembargono loes,basadoenel trabajopersonal

delalumnoconunaherramientainformtica.Necesariamente,elprofesoryelalumno

debern contar con un mtodo que de alguna manera contribuya con la tarea a

realizar.Porestaraznlaherramientavirtualdesarrolladapermiteponerenprcticael

modelo educador a travs de consultas remotas, via email, pero adems permite

establecerunsencillomtododeautoevaluacin.


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RedMicrob

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Figura12.Esquemaseguidoparalaresolucindeproblemas.Elalumnoselecciona,entre20problemaspropuestos,unodloverificaobservando la solucincorrespondiente.Simultneamente,lpuede realizardiferentes test (msde150prconocimientosmsrelacionadosconlosaspectostericos.


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Por ambas vas,el alumno se familiarizar con la tarea a realizar tantoen los

aspectos tericos, que como complemento tambin se incluyen, y los aspectos

prcticos,atravsdelosproblemaspropuestos,resueltosylostestdeautoevaluacin

(Fig.12).

BIBLIOGRAFA

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UniversidadCatlicaAndrsBello.Caracas.

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EstadosAmericanos

http://www.science.oas.org/Simbio/mbio_ind/mbio_ind.htm

Recibido:13julio2009.

Aceptado:14julio2009.

Documents

Practicas de micro industrial virtual.pdf