Practicas+BASICAS+2014_2015_conReflotron_

Depto. De Bioquímica y Biología Molecular B e Inmunología. Universidad de Murcia. Prácticas de Bioquímica. Curso 2014-15

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PRÁCTICAS BÁSICAS EXPERIMENTALES PARA

GRADOS EN CIENCIAS DE LA SALUD

CURSO 2014-2015

DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR B e

INMUNOLOGIA. UNIVERSIDAD DE MURCIA

P1. Medida de pH. Poder regulador. Acción de la lipasa P2. Propiedades de aminoácidos y proteínas P3. Disoluciones y determinaciones analíticas. Acción de amilasa sobre el almidón P4. Determinación de creatinina en orina y de otros parámetros en sangre

Datos del alumno

Nombre:

DNI:

Grado:

Grupo:

Fecha de entrega:


2

PRÁCTICA 1.

MEDIDAS DE pH. TAMPONES. INICADORES. APLICACIÓN AL

SEGUIMIENTO DE LA HIDRÓLISIS DE GRASAS POR LA LIPASA.

INTRODUCCIÓN

La medida del pH es una de las determinaciones analíticas más utilizadas en disoluciones acuosas y por

tanto en Bioquímica, ya que los fluidos biológicos son soluciones acuosas. El valor de pH determina las

características estructurales y funcionales de muchas macromoléculas, incluyendo proteínas y ácidos nucleicos.

En el hombre, el control del pH sanguíneo es importante porque sus cambios no altera solo el plasma, sino

además el pH intracelular, lo que a su vez afecta profundamente al metabolismo. El plasma presenta un pH casi

constante de 7.4, superior al que presenta el citosol intracelular de la mayoría de las células tisulares. La sangre

es un buen vehículo para suministrar y retirar eficazmente agentes alcalinizantes o acidificantes cuando es

necesario alterar el pH, por estados de acidosis o alcalosis metabólica.

El pH es definido como log H+, y su medida es, por tanto, un reflejo en escala logarítmica de la

concentración de protones, es decir, de la acidez del medio. Las medidas se realizan experimentalmente con

electrodos combinados de vidrio, que presentan una respuesta rápida y son sencillos de utilizar. Los electrodos

de vidrio deben, antes de su utilización, calibrarse con disoluciones patrón de pH conocido y tener unas

condiciones de conductancia (contenido iónico) adecuadas para asegurar una medida precisa. El pH del agua

pura es difícil de medir con precisión por la ausencia de iones. Además, su pH puede variar drásticamente con

pequeñas adiciones de un ácido o una base.

El mantenimiento del pH de una solución acuosa en unos límites de variación controlada se consigue

con los denominados tampones, reguladores, amortiguadores o buffers. Estos sistemas están formados por un

par mezcla de un ácido débil y la sal de su base conjugada que se interconvierten como consecuencia de la

adición de H+ u OH- gracias al equilibrio químico entre las dos especies, lo que permite variar sus proporciones

relativas sin un cambio drástico del pH. La relación fundamental entre las dos especies que constituyen un

sistema regulador es la ecuación de Henderson-Hasselbalch:

pH = pKa + log [BASE CONJUGADA / [ÁCIDO]

Volviendo a la sangre humana, el intervalo compatible con la vida es, a lo sumo, entre 6.8 a 7.8. Por

ello, la sangre posee sistemas muy eficaces de regular el pH de tal forma que no varíe significativamente frente

a una aparición más o menos masiva de ácidos o bases como consecuencia de desórdenes metabólicos y/o

respiratorios. En la sangre, el sistema regulador principal es el CO2/HCO

3

-

, pero también participan el sistema

fosfato H2PO

4

-

/HPO4

2-

y las proteínas plasmáticas, gracias a ciertos residuos aminoacídicos, principalmente el

grupo imidazol de las histidinas. Por ejemplo, en la hemoglobina, existen 38 histidinas por tetrámero,

constituyendo el principal sistema regulador del pH intraeritrocítico (cuyo valor es aproximadamente 7.2).


3

Según la ecuación de Henderson-Hasselbalch en el plasma siempre se cumple respecto al sistema

carbónico/bicarbonato:

pH= pK1 + log -HCO

3] / CO

2] (ya que el ácido carbónico H2CO3 H2O + CO2)

De lo cual, conociendo el valor de pK1 (aprox. 6.1) y la relación entre las concentraciones de bicarbonato y

carbónico, se puede determinar fácilmente el pH. Si la pareja de ácido y base conjugada es el fosfato, la

ecuación sería:

pH= pK2 + log -2

HPO4] /

-H2PO

4] (en este caso, pK2 = 6.8)

Las experiencias a realizar en la primera parte de la práctica intentan familiarizar al alumno con el

uso del pH-metro y constatar el poder tamponante de alguno de estos sistemas. En la segunda parte se utiliza

una medida indirecta del pH para poder seguir la acción de una enzima digestiva, y detectar la liberación de

ácidos grasos.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

MATERIAL

pHmetro con electrodo de vidrio combinado Papel "científico"

1 vaso de 50 y 1 de 100-250 ml 2 Gradillas con 6 tubos de ensayo transparentes

2 Pipetas de 5 o 10 ml Micropipeta P100 o P200 y puntas desechables.

Propipeta de 10 ml 1 Varilla de agitación

Pipeta Pasteur de plástico Pinza de madera

1 Baño termostático o termobloque para 37 ºC

7 viales de 20 ml de capacidad y boca ancha para introducir electrodo

REACTIVOS

Disolución patrón de pH 7 HCl 1N

Tampón fosfato 0,1 M pH 7 NaOH 1N

KCl Saturado Agua destilada

Fenolftaleína 1% en etanol Pancreatina bovina al 2%

Carbonato sódico 0.1 M Bilis 2% (o desoxicolato 2%)

Leche entera

Parte A: UTILIZACION DEL ELECTRODO. MEDIDA DEL pH EN AGUA Y EN

DISOLUCIONES TAMPONADAS.

IMPORTANTE: PRECAUCIONES PARA EL USO DEL ELECTRODO

Un electrodo convencional, como el utilizado en la práctica, tiene la membrana porosa en la pared

lateral, pero en algunos casos se encuentra expuesta, en la zona inferior. Llevar cuidado de no dañarla.

a) Antes de efectuar las medidas, asegurarse de que el electrodo está limpio lavándolo con agua destilada y

pasándole suavemente papel científico.


4

b) Para realizar la medida, es esencial que la membrana porosa situada en el lateral de electrodo esté

totalmente sumergida en la disolución. Es el área por donde se produce el intercambio iónico entre la

disolución exterior y la interior del electrodo.

c) En casos donde se necesite agitación magnética, no agitar a gran velocidad ni con movimientos excéntricos

de la barra magnética para evitar que ésta pueda golpear y romper el electrodo.

1. Uso del electrodo.

Extraer el electrodo de la capucha con solución de KCl saturado donde debe mantenerse al finalizar las

medidas. Lavar con agua destilada y secar pasando suavemente un trozo de papel por el electrodo.

Preguntar al profesor encargado de la práctica si el electrodo ha sido calibrado recientemente. Si es

así, pasar directamente al punto 2. De lo contrario, debe calibrarse según los siguientes pasos:

Añadir unos 5 ml de disolución patrón pH 7 en un tubo de ensayo.

Sumergir el electrodo en esa disolución.

Conectar el pH-metro y esperar unos segundos hasta estabilización de la lectura.

Si ésta es distinta de pH 7, ajustar con el mando correspondiente.

Desconectar el botón de lectura de pH.

Sacar el electrodo de la disolución patrón, quedando listo para medidas.

2. Medidas de pH. Poder tamponante.

Utilizar las 2 series de 3 tubos marcados con 1A, 2A 3A y 1B, 2B, 3B. A la serie A añadir 10 ml de agua

destilada a cada tubo y a la serie B 10 ml de tampón fosfato pH=7. Utilizar los tubos 1A y 1B para medir el pH

inicial del agua o del tampón fosfato, que deberá ser próximo a 7. Después, adicionar con la micropipeta 100

l de HCl 1N a los tubos 2A-2B y 100 l de NaOH a los tubos 3A-3B o alternativamente con la pipeta pasteur

2 gotas del ácido o la base respectivamente. Tener siempre la precaución de cambiar las puntas de la

micropipeta o cambiar la pipeta Pasteur si se va a utilizar para más de un reactivo antagónico (por ejemplo no

utilizar la misma punta o pipeta para añadir ácido y base).

Medir los pH de todos los tubos y rellenar la tabla de abajo. Calcular los cambios de pH producidos por la

adición de un ácido o una base fuertes sobre el agua o el tampón fosfato (columna 3) y comparar con los

resultados teóricos.

Tubo pH inicial (1ª medida)

pH final (tras adición)

Variación respecto a 1A

o 1B

Valor teórico del pH final (pK2= 6,8).

Opcional

1A (agua) Id a 1A 0 7

2A (agua+ HCl) Id a 1A 2

3A (agua+ NaOH) Id a 1A 12

1B (fosfato) Id a 1B 0 7

2B (fosfato+ HCl) Id a 1B 6.82

3B(fosfato+ NaOH) Id a 1B 7.19


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Parte B: APLICACIÓN DEL CAMBIO DE pH A MEDIDAS ENZIMÁTICAS: HIDRÓLISIS

DE TRIACILGLICÉRIDOS.

Algunas reacciones metabólicas producen sustancias que modificarían considerablemente el pH celular

si no estuvieran suficientemente tamponados. Un ejemplo es la hidrólisis de los triacilglicéridos (TAG),

principales componentes de los lípidos de la dieta, durante la digestión en el lumen intestinal, gracias a la

actuación de la lipasa pancreática.

La reacción se denomina saponificación. Una vez que actúa la lipasa y saponifica el TAG, los ácidos

grasos liberan H+, produciendo un descenso del pH medible en un medio no tamponado. Dicho descenso se

podría seguir utilizando un pHmetro, pero en este caso, vamos a utilizar un indicador que cambia de color

como consecuencia del paso de pH de ácido a base y que cualitativamente puede reemplazar al electrodo.

Se utiliza pancreatina bovina, que contiene una mezcla de enzimas con lipasa. Como fuente de TAG se

utiliza leche entera de vaca. Mediante fenolftaleína, un indicador ácido/base, es posible visualizar el descenso

de pH ya que este indicador a pH>7 presenta coloración rosa, mientras que a pH<7 es incoloro. Puesto que la

leche entera natural tiene un pH inicial inferior a 7, y para acercar el pH al óptimo de actuación de la lipasa,

próximo a 8, previamente a la acción de la lipasa la leche con la fenolftaleína debe basificarse con carbonato

sódico para poder visualizar el descenso de pH.


Añadir unos 25 ml de leche entera al vaso de precipitados y adicionar agitando 5 gotas de fenolftaleína.

Ir adicionando disolución de carbonato sódico con agitación continua hasta que adquiera un color rosa

homogéneo y permanente, con una intensidad semejante a un batido de fresa. A continuación se numeran 4

tubos de ensayo y se les añaden los reactivos reflejados en la Tabla (cantidades expresadas en ml). Las

adiciones se deben realizar en el orden expresado, y con agitación cada vez que se añade un nuevo reactivo.

REACTIVOS 1 2 3 4

Leche basificada 5 5 5 5

Agua destilada 1.5 1 0.5 0

Sales biliares 0 0.5 0 0.5

Pancreatina (con lipasa) 0 0 1 1

CH2-OOC-R

CH-OOC-R

CH2-OOC-R

TAG

H2O R-COOH

RCOO- H+

+

CH2-OH

CH-OH

CH2-OH

+

+Glicerol

Acido graso

lipasa


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Apuntar tiempo, agitar todos los tubos con rapidez y hasta homogenización total y situarlos a 37 ºC en un baño

termostático o termobloque, observando atentamente lo que sucede con los tubos a lo largo del tiempo.

Anotar donde se producen decoloraciones y el tiempo transcurrido. Interpretar resultados.

CUESTIONES (Ser breves y utilizar solo el espacio disponible)

A1) ¿Cuál es la relación entre el pH y el pOH? ¿Por qué?

A2) ¿Hay alguna relación entre el pKa de un grupo y su eficacia tamponante en un rango de pH

determinado? Explique por qué.

A3) Según lo anterior, explique brevemente por qué los grupos imidazol es un buen agente tamponante en

la sangre.

B1) ¿A qué pH fisiológico actúan las lipasas? ¿Qué producto de la acción de las lipasas es el responsable

directo del cambio de color de la fenolftaleína?


7

B2) ¿Cuál es el efecto de las sales biliares sobre la digestión de triacilglicéridos? ¿Afecta a otras clases de

lípidos como los esteres del colesterol?

B3) En el experimento de la digestión de los TAG de la leche ¿En qué orden se produce el cambio de

coloración?¿Observa diferencias entre los tubos 1 y 2 a tiempo final? ¿Y entre el 3 y 4? ¿Por qué? ¿Tiene

alguna explicación para los hechos observados?

Problema (de mayor Dificultad).

Asumiendo que ha adicionado a los 10 ml de agua o de tampón fosfato 0.1M, pH=7 exactamente 100 l de

HCl o NaOH 1N, ¿Podría calcular de forma teórica el pH de las disoluciones resultantes en los tubos 2A, 3A,

2B y 3B? Compárelas con las medidas experimentales.


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PRÁCTICA 2.

PROPIEDADES DE AMINOÁCIDOS Y PROTEINAS.

INTRODUCCION

A. AMINOACIDOS. CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA.

Los -aminoácidos son las unidades estructurales de las proteínas. Se caracterizan por la presencia

sobre el mismo carbono (C) de un grupo básico (amino, –NH2 o –NH3+) y un grupo ácido (carboxilo, –COOH

o –COO-), además de una cadena lateral de naturaleza química diversa.

La cromatografía se define como la separación de una mezcla de dos o más compuestos por distribución

entre dos fases inmiscibles: una fase móvil, que transporta las sustancias que se separan y que progresa en

relación con la otra, denominada fase estacionaria. La fase móvil puede ser un líquido o un gas y la estacionaria

puede ser un sólido o un líquido. Estas técnicas también permiten identificar un compuesto comparando su

comportamiento cromatográfico con el de sustancias conocidas empleadas como patrón.

En la cromatografía en capa fina (TLC, por Thin Layer Chromatography), la fase estacionaria es una

fina capa de material poroso e hidrofílico (gel de sílice, alúmina, etc.) extendida sobre un soporte plano inerte

(vidrio o aluminio), y la fase móvil es una mezcla de disolventes en diferentes proporciones, que migra por la

fase estacionaria por capilaridad. La fase móvil, en su movimiento, arrastra en mayor o menor medida a los

componentes de la mezcla.

Durante la cromatografía, un determinado soluto interactúa con las dos fases y experimenta una serie de

procesos (solubilización en cada fase, adsorción en fase sólida, arrastre por la fase móvil, etc.) que condicionan

su reparto entre ellas. En el equilibrio, la relación entre las concentraciones del soluto de ambas fases es

constante. Este parámetro se denomina coeficiente de reparto y depende de la naturaleza del compuesto y la de

las fases, así como de las condiciones en las cuales se corre la muestra (temperatura, vapor de saturación, etc).

La separación de los componentes de una mezcla es buena si todos presentan coeficientes de reparto diferentes.

El coeficiente de reparto es poco empleado en la práctica. En su

lugar, e íntimamente relacionado con él, se emplea el denominado Rf,

característico de cada sustancia y definido como la relación entre la

distancia que recorre dicha sustancia y la que recorre la fase móvil. Los

componentes de la mezcla más insolubles en el disolvente empleado

tendrán un Rf próximo a cero, mientras que el de los más solubles se

acercará a uno.

La cromatografía en capa fina se puede emplear para separar distintos grupos de biomoléculas, tales

como aminoácidos, fosfolípidos, azúcares, etc, y en cada caso cambiaría la fase móvil empleada y los reactivos

reveladores. En esta práctica, separaremos aminoácidos y revelaremos la placa con ninhidrina, que al


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reaccionar con el grupo amino de los aminoácidos produce un color púrpura (en algunos casos puede ser rosa o

rojizo), y con el grupo imino o amino secundario (iminoácidos) da un color amarillo/ocre.

B. PROTEÍNAS

Las proteínas son las biomoléculas más abundantes de la materia viva. Están formadas por -

aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, lo que origina cadenas lineales. Las proteínas conjugadas contienen

otros componentes de distinta naturaleza (no peptídica), que se denominan grupos prostéticos. Las propiedades

fisico-químicas de las proteínas pueden ser muy diferentes: así, proteínas estructurales como la queratina del pelo

se parecen poco a la hemoglobina o a la hormona insulina.

Para que las proteínas cumplan su función biológica tienen que adoptar una estructura espacial

determinada, denominada nativa. La mayoría de las proteínas globulares son solubles en disoluciones acuosas y a

pH próximos a la neutralidad mantienen su estructura nativa intacta. La alteración de esta estructura tridimensional

conlleva la pérdida de su actividad biológica, proceso que se denomina desnaturalización: las propiedades fisico-

químicas cambian drásticamente y, en el caso de las proteínas globulares solubles, generalmente se produce una

insolubilización o precipitación. Agentes desnaturalizantes típicos son el calor, valores extremos de pH,

disolventes orgánicos, metales pesados (Pb+2

, Hg+2

, Ag+), agentes caotrópicos y detergentes iónicos.

La presencia proteínas en una disolución puede ponerse de manifiesto por gran número de ensayos,

basados en la formación de un compuesto coloreado entre la proteína y un reactivo específico. Dentro de un rango

de concentraciones adecuado, la intensidad del color desarrollado es proporcional a la concentración de proteína,

por lo que se puede cuantificar y correlacionar con la cantidad de proteína presente en la muestra. Los distintos

métodos colorimétricos presentan diferencias de sensibilidad, especificidad y variables como la dificultad o el

precio del ensayo que es importante valorar a la hora de elegir el más idóneo para cada caso. Entre los métodos

más utilizados para proteínas destacan:

a) Ensayo de Biuret: Compuestos con enlaces peptídicos producen un cambio de color del azul al púrpura cuando

reaccionan con Cu (II) en medio alcalino. El ensayo es bastante específico para proteínas (pocos interferentes) y

barato, pero poco sensible: se requieren de 1 a 10 mg de proteína.

b) Ensayo de Lowry: Es hasta 10 veces más sensible que el de Biuret, pero más tedioso de realizar. El principio de

la reacción es similar a aquél: se basa en la reacción de proteínas con el Cu (II) en medio alcalino y en la reacción

de grupos fenólicos (mayoritariamente de tirosina) con un reactivo, denominado de Folin-Ciocalteau, que contiene

fosfomolibdato y fosfowolframato. Como inconvenientes destacan su dependencia del contenido en Tyr y Trp de

la proteína y las interferencias debidas a la eventual presencia de compuestos fenólicos en el medio.

c) Ensayo de Bradford: Es un ensayo rápido y muy sensible para cuantificar proteínas (1-20 g), aunque la

presencia de detergentes en la muestra puede producir interferencias. El método se basa en el cambio de color que

experimenta el colorante azul coomassie en medio ácido en presencia de proteínas. Las proteínas producen el

cambio de la coloración parda del reactivo a una tonalidad azulada.

En esta práctica se utilizarán y compararán los ensayos de Biuret y de Bradford.


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A. AMINOACIDOS. CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA.

MATERIAL.

Placa fina (TL) de Sílice o celulosa Micropipeta 1-10 l y puntas adecuadas (blancas)

Cubeta cromatográfica para TLC Batea plana para el revelado

Pinza de madera Lápiz nº 2 con punta fina y regla de 10-20 cm

Secador de aire y Horno de incubación a 95ºC

REACTIVOS.

Muestras de aminoácidos al 1% Ninhidrina (1mg/ml en acetona)

Fase móvil: n-butanol/acetona/acético/agua (35/35/20/10)

Importante: Tocar la placa solo por los bordes, sin tocar la superficie, para evitar contaminarla.

1. Colocar aprox. 20 ml de fase móvil en la cubeta y cerrarla, para saturar su atmósfera. La cromatografía

se efectuará en esa cubeta cerrada.

2. Trazar con un lápiz, sin apretar demasiado para no dañar la placa, una línea horizontal a 1,5 cm del

borde inferior de la placa. Marcar sobre ella 5 puntos con igual separación entre sí, y aplicar en cada uno de

esos puntos 1 l de cada aminoácido con la micropipeta anotando las posiciones en que se han colocado los

diferentes aminoácidos y el problema. Es importante que las gotas se extiendan lo menos posible, por lo que se

debe secar la primera antes de aplicar la segunda, si es necesario utilizando el secador.

3. Colocar la placa en la cubeta, cuidando de que el nivel de disolvente quede por debajo de la línea de

aplicación de las muestras. Cerrar y esperar unos 35-45 minutos. La fase móvil no debe llegar al extremo

superior de la placa. En ese tiempo, realizar los otros apartados de la práctica.

4. Sacar la placa, marcar en un borde el nivel alcanzado por la fase móvil, medir y anotar la distancia

recorrida por la fase móvil en mm (en la Tabla de la sección de cuestiones, A2) y secarla con aire caliente

del secador. Sumergirla en revelador (20-30 ml de ninhidrina). Introducir la placa en la estufa unos 3-5 min, a

105ºC, o hasta la aparición de manchas.

5. Observar las manchas aparecidas, su forma e intensidad. Calcule en Rf de cada muestra y determine

cuál(es) es (son) el (los) desconocido(s) de la muestra problema. Para ello, tener en cuenta que Rf = Distancia

corrida por la muestra / Distancia recorrida por la fase móvil. Anotar los datos de distancias y Rf y rellenar

con ellos la Tabla de la cuestión A2.

B. PROTEÍNAS

MATERIAL ADICIONAL Tubos de ensayo (vidrio y plástico seco para Bradford)

Micropipetas de 200l y 1000 l y puntas apropiadas

Pipetas de 1-2, 5 y 10 ml y propipetas adecuadas (azul y verde respectivamente)

REACTIVOS.

Disolución de albúmina (10 mg/ml) Tampón fosfato pH 7, 10 mM

NaOH 2.5 N Ácido tricloroacético (TCA) 10%

Acetona Acetato de plomo 0.2 M

Reactivo de Biuret Reactivo de Bradford

45 min


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1. Precipitación de proteínas.

Rotular 5 tubos de ensayo, y añadir a cada tubo 1 ml de la disolución de albúmina de 10 mg/ml. A continuación

agitar bien el contenido en cada tubo y observar los efectos de cada agente sobre la solubilidad de la proteína:

Tubo Condición Tratamiento Observaciones a apuntar

(precipitado, turbidez)

1 Calor Calentar a 100 ºC unos minutos

2 Medio ácido Añadir 1 ml de ácido tricloroacético

3 Medio básico Añadir 1 ml de hidróxido sódico

4 Disolv. orgánico Añadir 2 ml de acetona

5 Catión pesado Añadir 1 ml de acetato de plomo

2. Ensayo del Biuret.

Preparar, a partir de la disolución de albúmina original, 10 ml de disolución 2 mg/ml en albúmina. Rotular 4

tubos de vidrio y añadir, en el orden indicado, cada uno de los reactivos que se especifican (en ml). Agitar y

esperar 10 min y observar resultados apuntado en la Tabla si el color permite dar el ensayo como positivo.

1(Control) 2 3 4

H2O destilada 2 1.8 1 -

Albúmina 2 mg/ml - 0.2 1 2

Reactivo de Biuret 3 3 3 3

Comentarios respecto a la diferencia de

color observable entre el control y tubos

2, 3 y 4

3. Ensayo de Bradford.

Preparar para este ensayo una disolución de albúmina aún mas diluida, de 0,2 mg/ml a partir de la de 2 mg/ml.

Rotular dos tubos de plástico y añadir los reactivos en el orden que se indica. Agitar y observar el color de los 2

tubos y sus posibles diferencias.

1 2

H2O destilada 800 l 700 l

Albúmina 0.2 mg/ml -- 100 l

Reactivo de Bradford 200 l 200 l

.



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A1) ¿Qué naturaleza tienen las fases estacionaria y móvil empleadas? Con una fase móvil más polar, la

separación ¿sería mejor o peor? Razonar como afectaría al Rf de los distintos aminoácidos.

A2) Anote distancias y calcule el Rf de los Aminoácidos patrones y el problema. Identificar éste.

Tubo Aa patrón Color de la mancha Distancia recorrida

Rf

1

2

3

4

5 PROBLEMA

A3) ¿Qué aminoácido de cada una de las siguientes parejas tendrá mayor Rf en el sistema cromatográfico

empleado? ¿Por qué?

a) Ala y Lys;

b) His y Phe;

c) Gly y Ser.

A4) La detección precoz de algunas enfermedades congénitas relacionadas con el metabolismo de

aminoácidos se realiza por esta técnica, empleando una muestra de sangre. El caso más importante es la

fenilcetonuria. Consultar el problema metabólico que origina la enfermedad y describir qué observaríamos

en la cromatografía de un suero fenilcetonúrico con respecto a uno sano.


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A5) Buscar en textos o fuentes informáticas la estructura química de la ninhidrina y dibujar su reacción con

los aminoácidos y la estructura del compuesto formado en calor, el denominado púrpura de Ruhemann.

B1) ¿Cómo operaría para transformar 15 ml de la disolución de albúmina 10 mg/ml en otra de concentración

0.4 mg/ml?¿Cual es el volumen final obtenido? ¿Cuánto disolvente ha de añadirse?

B2) En el ensayo del Biuret, ¿qué color presenta la disolución del tubo 1? ¿Por qué?

B3) Calcular los mg de albúmina presentes en los tubos nº 2 de los ensayos de Biuret y de Bradford, y justificar,

en función de los resultados, cuál de los dos métodos es más sensible para detectar proteínas.


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PRÁCTICA 3.

DISOLUCIONES Y DETERMINACIONES ANALITICAS. APLICACIÓN A LA

HIDRÓLISIS DEL ALMIDON

INTRODUCCIÓN.

Una disolución es una mezcla homogénea de dos o más sustancias, cuyos componentes son un medio

generalmente líquido denominado disolvente, y sustancias disgregadas en su seno, denominadas solutos. En los

seres vivos el disolvente fundamental, el agua, sirve para disolver la mayoría de las biomoléculas y sales,

aunque en el caso de las biomoléculas de gran tamaño como las proteínas, más que disoluciones verdaderas son

sistemas coloidales. La composición de una disolución se puede expresar de diferentes maneras:

Peso del soluto por volumen de disolución (por ejemplo g/L o mg/ml).

Porcentaje en peso (% peso): peso de soluto en 100 g de disolución.

Molaridad (M): moles de soluto por litro de disolución.

Molalidad (m): moles de soluto por Kg de disolvente.

Mientras que las concentraciones de los diferentes metabolitos en extractos celulares o de los sustratos y

productos en las reacciones enzimáticas se suelen expresar en μM o mM, en los análisis de la sangre la

concentración de diferentes componentes como glucosa o triglicéridos se expresa generalmente como mg/dL.

En la determinación de metabolitos y de muchas actividades enzimáticas se utilizan métodos basados en la

generación de compuestos coloreados, y el color generado sirve para cuantificar la concentración y la actividad.

Una de las características de las disoluciones coloreadas es la de absorber radiaciones del espectro de

luz visible. La ley de Lambert-Beer relaciona la absorción con las propiedades de la disolución atravesada por

el haz luminoso. En esta práctica se medirán las absorciones correspondientes a diferentes concentraciones de

una disolución coloreada, utilizando una cubeta de 1 cm de paso de luz. En el esquema 1 se representa el paso

de luz monocromática de longitud de onda λ a través de una cubeta de anchura l que contiene una disolución de

concentración c, y en donde I0 e It son las intensidades de luz antes y después de atravesar la disolución.

La ley de Lamber-Beer determina que existe una relación exponencial entre la transmisión de la luz a

través de una sustancia (transmitancia) y la concentración de la sustancia y longitud del cuerpo que atraviesa la

luz. Dicha ley queda reflejada en la expresión

Transmitancia (T) = It/I0 = 10-ε l c

Si al valor –logT se denomina absorbancia (A), la ecuación anterior queda como

Absorbancia (A) = ε l c

que nos dice que la absorbancia de una disolución es función directa de la concentración de dicha disolución y

de la longitud que atraviesa la luz. Para una cubeta de l = 1 cm la ecuación se transforma en:

A = c

donde es el coeficiente de absorción molar o absorbancia molar de la sustancia, y cuyas dimensiones

son M-1

cm-1

.


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En la primera parte de la práctica se van a preparar disoluciones de concentraciones diferentes a partir

de una disolución patrón de concentración conocida, midiéndose a continuación la absorbancia de cada una de

las disoluciones con la ayuda de un espectrofotómetro. A continuación, se representaran en un diagrama x/y los

valores de absorbancia frente a las concentraciones, obteniéndose la recta correspondiente y a partir de la misma

determinar el coeficiente de absorción molar ( de la sustancia analizada.

En la segunda parte, se llevará a cabo la medida de la aparición o desaparición de un color para detectar

la presencia de una biomolécula como el almidón, y la degradación del mismo por la amilasa salivar. Para ello

se hará uso de la propiedad que tienen las cadenas de amilosa del almidón para generar un color azulado/violeta

cuando interaccionan con el yodo, y de la capacidad de amilasa salivar para degradar el almidón, hidrolizando

los enlaces glicosídicos α (1→ 4) de dicho polímero.

PARTE A. LEY DE LAMBERT-BEER. CALCULO DEL Y DE LA CONCENTRACION DE UNA

DISOLUCIÓN PROBLEMA.

MATERIALES

Espectrofotómetro. Gradilla tubos

Juego y puntas de micropipetas. Tubos de plástico de 10 ml.

Frasco lavador Cubetas de espectrofotómetro.

Disolución patrón de azul de metileno de 300 μM y Disolución problema (P).

Ioc, ε

l

It

haz de luz

A = ε l c T = (It/Io) = 10- ε l c A = -log T

A es la absorbancia

T es transmitancia

Io es la intensidad de la luz incidente

It es la intensidad de la luz transmitida

c es la concentración de la muestra

ε es el coeficiente de absorciónl es la distancia que la luz atraviesa

por la disolución

Esquema 1.

Ioc, ε

l

It

haz de luz

Ioc, ε

l

It

haz de luz

A = ε l c T = (It/Io) = 10- ε l c A = -log T

A es la absorbancia

T es transmitancia

Io es la intensidad de la luz incidente

It es la intensidad de la luz transmitida

c es la concentración de la muestra

ε es el coeficiente de absorciónl es la distancia que la luz atraviesa

por la disolución

Esquema 1.


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PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL.

a) Rotular 6 tubos de plástico y añadir a cada uno de ellos los volúmenes de agua destilada y de disolución

patrón que se indican en la siguiente tabla

1 2 3 4 5 6

Agua destilada (ml) 3 2.97 2.94 2.85 2.70 2.40

Disolución patrón (ml) 0 0.03 0.06 0.15 0.30 0.60

Agitar los tubos y mediar la absorbancia a λ=550 nm de cada uno. Para ello se debe de ajustar en primer lugar

los valores de 0 y 100% de transmitancia, utilizando una cubeta de espectrofotómetro llena con la disolución del

tubo 1. A continuación medir y anotar los valores de absorbancia de todos los tubos, calculando a continuación

la concentración de la sustancia medida en cada uno de los tubos. Medir la absorbancia del problema (P)

Tubo 1 2 3 4 5 6 P

Absorbancia

Concentración

A partir de los valores anotados, obtener la representación gráfica de los mismos, utilizando el papel

milimetrado y calcular el coeficiente de absorción y la concentración de la disolución problema:

Coeficiente de absorción: Concentración problema:

NOTA: Es muy importante saber expresar las unidades del coeficiente de absorción y la concentración.


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PARTE B. ACTIVIDAD AMILASA SALIVAR. REACCIÓN DEL ALMIDON CON EL YODO.

Materiales

Gradilla Vaso pequeño desechable para recolectar saliva.

Tubos de vidrio de 10 ml. Disolución de almidón 1%

Micropipetas. P100 y P1000 Disolución de yodo 1 mM

Puntas de micropipetas. Agua destilada

Termobloque Saliva

Procedimiento experimental

a) Recolectar saliva utilizando el vaso de plástico, y diluir dicha saliva con un volumen

aproximadamente igual de agua destilada.

Numerar seis tubos. Adicionar a los tubos 1 y 2 los siguientes componentes:

Tubo 1 2

Almidón 1% (ml) 1 1

Agua destilada (ml) 1 0

Saliva (ml) 0 1

Agitar los tubos y dejar incubar hasta realizar el apartado b.

b) Añadir los siguientes reactivos a los otros cuatro tubos

Tubo 3 4 5 6

Almidón 1% 1 0 1 1

Agua destilada 1 1 0 0

Disolución de yodo 1 mM 0 1 1 1

Agitar y anotar los cambios observados.

Introducir el tubo 5 en el calefactor puesto a una temperatura de 90ºC. Ir observando los cambios producidos en

relación con el tubo 6 mantenido a la temperatura ambiente. A continuación enfriar el tubo 5 usando el agua del

grifo. Anotar los cambios.

c) Una vez terminado el apartado b, añadir 1ml de disolución de yodo a cada uno de los tubos 1 y 2 y

agitar. Comparar la coloración de ambos tubos.


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A1)? ¿Qué sustancia patrón ha utilizado para verificar la Ley de Lambert-Beer? ¿Qué absorbancia

tendría una disolución 50 μM de dicho patrón?

A2) ¿Qué cantidad de soluto existe en 3 ml de disolución 60 μM?

A3) ¿Cuál será la concentración mM de glucosa en sangre si el valor de la glucemia es 90 mg/dL?

(El peso molecular de la glucosa es 180).

B1) ¿A que se debe la coloración observada en los tubos 5 y 6?

B2) ¿Cómo explicaría los cambios observados al calentar y enfriar el tubo 5?

B3) ¿A que se deben los cambios observados entre los tubos 1 y 2?


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PRÁCTICA 4.

DETERMINACIÓN DE CREATININA EN ORINA Y DE OTROS

PARÁMETROS EN SANGRE.

A. DETERMINACIÓN DE CREATININA EN ORINA.

El fosfato de creatina es un compuesto que actúa como almacén de alta energía fácilmente convertible

en ATP, en músculo y otros tejidos de mamíferos. La creatina se sintetiza en hígado y páncreas. Desde estos

órganos se transporta a través de la sangre a tejidos, donde puede fosforilarse. El contenido muscular de

creatina+fosfocreatina oscila sobre 400 mg/100g. Ambos se convierten espontáneamente en creatinina, que

llega por la sangre al riñón y es eliminada en la orina.

Cada día, y de forma casi constante, un 2% del contenido muscular se convierte en creatinina. Así, sus

niveles plasmáticos y en orina dependen de la masa muscular, por lo que su producción varía según el sexo y

edad del individuo. Los valores normales de creatinina en plasma son 0.5-1.3 mg/ml para hombres y 0.4-1.0

mg/ml para mujeres. Las determinaciones de creatinina en orina y en plasma sirven para calcular el

aclaramiento (clearance) de creatinina, una prueba utilizada para estimar el filtrado glomerular y valorar la

función renal. Existen distintas fórmulas empíricas para el cálculo del aclaramiento, como la de Cockcroft-

Gault o la de Jelliffe (buscar esas fórmulas en libros de Bioquímica Clínica).

Aunque se han descrito otros procedimientos más específicos para determinar creatinina en orina, el

método más rápido es el basado en la reacción de Jaffé, que consiste en la formación de un complejo con

coloración amarillo-naranja por reacción con el picrato en medio alcalino que se cuantifica por la medida de la

absorbancia en el colorímetro. Finalmente, se debe calcular la concentración de la creatinina en la orina

problema utilizando una recta de calibrado obtenida previamente.

MATERIAL Y REACTIVOS

Colorímetro Micropipeta de 1000 l

NaOH 1,4 M Tubos de ensayo y gradilla

ClH 25 mM Ácido pícrico 14 mM


Rotule 4 tubos y adicione los siguientes reactivos (ml) en el orden establecido en la Tabla (orden horizontal).

AGITE todos los tubos tras la adición de ácido pícrico y espere 15 minutos. Mida la absorbancia en el

colorímetro a una longitud de onda de 500 nm. Utilice el tubo nº 1, exento de creatinina, para ajustar el cero de

absorbancia. A continuación, y haciendo uso de la recta de calibrado siguiente:

Absorbancia500 = 0,824 x (miligramos de creatinina)

calcule la cantidad de creatinina en cada tubo, su concentraciones y finalmente en la orina problema.


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REACTIVO / nº tubo 1 2 3 4

HCl 25 mM 1,6 0,8 0,4 --

Orina problema -- 0,8 1,2 1,6

Ácido Pícrico 14 mM 2,6 2,6 2,6 2,6

NaOH 1,4 M (AGITAR) 0,8 0,8 0,8 0,8

Anotar valores de A500

Cantidades o concentraciones

de creatinina

0

CUESTIONES (utilizar solo el espacio disponible)

A1. ¿Cuál es la concentración de creatinina estimada en la orina problema?¿Utiliza los datos de los tubos 2,

3 y 4? ¿Cómo?

B. DETERMINACIÓN DEL VOLUMEN DE HEMATOCRITO.

El hematocrito representa la proporción de glóbulos rojos a sangre entera, y se expresa en volúmenes

por ciento. Su medida se realiza por centrifugación de la sangre heparinizada o tratada con algún otro inhibidor

de la coagulación, calculando el % que alcanza la masa globular.

Normalmente, en el adulto oscila del 36-50 %, con un valor medio de 46 para varones y 40 para

mujeres. En neonatos, los valores normales son más altos, sobre el 56%, pero la cifra decrece progresivamente

en el primer mes hasta alcanzar un mínimo próximo al 35% y ascender de nuevo lentamente.

Aproximadamente, el hematocrito multiplicado por 100.000 nos indica el número de eritrocitos por

milímetro cúbico. Ello es debido a la poca contribución que los glóbulos blancos y plaquetas tienen sobre el

volumen celular de la sangre.


Centrífuga de hematocrito

Sangre entera

Capilares heparinizados de 1.8 mm de diámetro máximo y longitud no superior a 75 mm.


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PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL.

Todas las personas que manejen sangre deben conocer las denominadas PRECAUCIONES

UNIVERSALES EN EL MANEJO DE SANGRE Y FLUIDOS CORPORALES, que establecen que toda

muestra de sangre o fluido corporal debe ser considerada como potencialmente infecciosa. Por ello, se

deben adoptar las medidas adecuadas para evitar cualquier posible contagio. El alumno de Ciencias de la

Salud está obligado a conocerlas (consúltense en las normativas, manuales o sitios pertinentes) y a

ponerlas en práctica de manera inexcusable. Entre ellas, es fundamental la utilización obligatoria de

guantes y evitar el contacto de la sangre o fluidos con heridas, ojos y mucosas.

1. Introducir la sangre en el tubo capilar por capilaridad, sumergiendo éste, con un cierto ángulo

respecto a la vertical, en una gota de sangre por uno de sus extremos. Mantener el otro extremo abierto. No

llenar el capilar menos de 40 mm ni más de 70 mm.

2. Tapar el extremo del tubo capilar con plastilina u otro tipo de cera. Para ello, tapone con el dedo el

extremo superior del capilar y apriételo en forma vertical sobre dicha lámina, con cuidado de no romperlo.

3. Sitúe el capilar en una hendidura del rotor de la centrifuga de hematocrito, con el extremo tapado

con plastilina hacia la parte exterior.

4. Centrifugue durante 3 minutos y lea el volumen de hematocrito mediante el empleo de la plantilla

excéntrica, ajustando el cero en el inicio de la sangre y el 100 en el menisco superior del plasma.

CUESTIONES

B1) Exprese el resultado obtenido para el volumen de hematocrito, e indique si se trata de un valor normal o,

por el contrario, es indicativo de anemia o de poliglobulia.

B2) Explique la diferencia existente entre los términos sangre entera, plasma y suero.

B3) ¿Qué puede significar la obtención de un plasma de color rojizo? ¿si se observa, el valor de hematocrito

que se mide es incorrecto?¿porqué?


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C. DETERMINACIÓN AUTOMATIZADA DE PARÁMETROS CLÍNICOS.

DETERMINACIÓN DE ÁCIDO ÚRICO EN SANGRE.

El ácido úrico es el producto final del catabolismo humano de las purinas (adenina y guanina). La

producción diaria de ácido úrico procedente del catabolismo de productos endógenos es, aproximadamente, 400

mg por día; el procedente de la dieta supone unos 300 mg diarios. El ácido úrico es un ácido débil cuyo pKa es

5,75. Por tanto, en el medio fisiológico se encuentra en forma de urato. Los valores normales de referencia

oscilan entre 3-7 mg/dl en hombres y 2-6 mg/dl en mujeres.

La causa más común de hiperuricemia es la disminución de la excreción de urato, fundamentalmente de

origen renal. Puede aparecer hiperuricemia temporal en enfermedades neoplásicas de la sangre (leucemias), en

el alcoholismo, tras un ejercicio físico intenso, en el caso de deshidratación o tras tratamiento con diuréticos. de

pacientes con esa enfermedad.

Pero el síndrome que mejor caracteriza la hiperuricemia es la gota, acompañada de artritis aguda y

depósitos tisulares de urato sódico. La crisis aguda de gota se inicia por la respuesta inflamatoria a los cristales

de urato monosódico.

La determinación analítica de ácido úrico se lleva a cabo habitualmente utilizando dos enzimas

acopladas: uricasa (urato oxidasa) y peroxidasa, según la secuencia de reacciones expresada a continuación:

uricasa

Ácido úrico + O2 + 2H2O --------- alantoína + H2O2 + CO2

peroxidasa

H2O2 + indicador reducido ---------- indicador oxidado + H2 O

En esta práctica se utiliza un sistema de química seca, útil para la medida de ácido úrico y otros

parámetros, tales como hemoglobina, glucosa, colesterol, glucosa, creatinina, urea, triglicéridos, GPT, GOT, etc.

El aparato de medida consiste en un fotómetro de reflexión. El fundamento de la medida se basa en la reflexión

de luz sobre una tira portarreactivos que contiene un sustrato cromógeno. Dicha tira dispone de una banda

magnética que contiene todas las informaciones del método necesarias para la ejecución y calibración del

aparato de forma automatizada. Sólo se necesitan 32 l de sangre y el tiempo de medida es de 3 minutos.


-Tiras portarreactivos -Instrumento medidor Reflotrón

-Papel científico -Pipeta Reflotrón de 32 l

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL (Este apartado de la práctica se realiza como demostración)

1. Conecte el aparato y ponga el interruptor en la posición I (parte trasera).

2. Déjelo que se caliente hasta que en la pantalla aparezca el mensaje “LISTO”. Si no va a ser utilizado durante

algún tiempo, puede pulsar la tecla “Stand-by”, situada en la parte inferior derecha de la pantalla.

(Al mismo tiempo que sigue este protocolo, la lectura de las hojas informativas para cada test, que se incluyen

en este cuadernillo como apéndice, pueden facilitarle el proceso).

3. Tome una tira portarreactivos correspondiente al parámetro que pretende determinar. Cierre inmediatamente

el tubo. No toque la zona gris.


23

4. Retire la hoja protectora de la tira portarreactiva, evitando doblar la tira.

5. Introduzca la tira cuidadosamente en la ranura para los portarreactivos.

6. Utilice la pipeta de volumen fijo para aspirar sangre (bien de la muestra proporcionada o bien por punción en

el dedo de algún voluntario -en este caso consulte con el profesor)

7. Coloque la muestra como gota en el centro del campo de aplicación (rojo) provisto de una malla, evitando

tocar éste con la punta de la pipeta.

8. Introduzca la tira horizontalmente en la ranura de la cámara de medición. Cierre la tapa.

9. En la pantalla aparece la confirmación de la medida que estamos realizando (UA), Asimismo aparece el

tiempo necesario hasta que disponible el resultado. Tome nota de la lectura.

10. Abra la cámara de medición y retire la tira. Observe que el color debe haberse desarrollado en toda la zona

del test, presente en la tira. Descarte la tira.


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CUESTIONES

C1) ¿Cuál es la enzima responsable de la última etapa en la vía de formación del ácido úrico?¿sabe de

alguna propiedad de esta enzima?

C2) Busque los valores normales de ácido úrico en sangre. ¿Porque se produce la enfermedad de la gota? El

alopurinol suele ser utilizado para su tratamiento ¿Cómo actúa?

D. DETERMINACIÓN DE GLUCOSA EN SANGRE.

La determinación de la glucemia es una prueba frecuentemente utilizada en Bioquímica Clínica. La

concentración normal de glucosa en sangre para un individuo en ayunas oscila entre 80 y 120 mg/100ml.

Después de una comida que contenga carbohidratos, esta cifra se incrementa para volver en unas dos horas a los

niveles basales. Si el ayuno es prolongado el nivel de glucosa desciende, pero nunca por debajo de 50 mg/100

ml; la razón fundamental es que el sistema nervioso requiere un aporte continuo de glucosa.

Aunque el número de métodos utilizados históricamente para la determinación de glucosa es abundante,

la mayoría no son ya utilizados en los laboratorios de bioquímica clínica de forma manual. En cualquier caso, si

los agrupamos según el tipo de reacción química que se lleva a cabo, podemos distinguir tres grandes grupos:

1. Métodos basados en el poder reductor de la glucosa sobre un agente oxidante, generalmente una

sal de cobre o hierro. Entre ellos están los métodos de Folin-Wu, Hagedorn y Jensen, hoy día en desuso.

2. Métodos de determinación de furfural. Más específicos que los de reducción, se basan en el

comportamiento de las hexosas y pentosas en medio muy ácido, donde forman furfural. A partir de glucosa se

obtiene hidroxi-metil furfural, que puede detectarse colorimétricamente, mediante la o-toluidina.

3. Métodos enzimáticos. Son los más utilizados en la actualidad. Entre ellos destacan:

a) Método de la glucosa-oxidasa y peroxidasa acopladas. Se mide colorimétricamente la formación de

un aceptor de oxígeno cromogénico como el ABTS.

b) Método de la glucosa deshidrogenasa, en el que se sigue colorimétricamente la formación de NADH.

c) Método de la hexoquinasa. Utiliza esta enzima acoplada a la deshidrogenasa de la glucosa -6-P, con

la formación concomitante de NADH y su medida colorimétrica a 340 nm.

La determinación de glucosa en esta práctica se lleva a cabo por el método enzimático de la

glucosa oxidasa y peroxidasa acopladas (ver documento adjunto).


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Glucosa oxidasa

Glucosa + O2 ---------------- δ-D-gluconolactona + H2O2

Peroxidasa

H2O2 + Ind.. reducido (ABTS) ---------- Indicador oxidado + H2O

CUESTIONES

D1) ¿Qué problema tienen los métodos químicos basados en la medida del poder reductor de la glucosa?

¿Cuál es la ventaja de los métodos enzimáticos para medir la glucemia?

D2) ¿En qué consiste la prueba de tolerancia oral a la glucosa?¿para que sirve?


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COMENTARIOS

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