RESUMEN:

Extraer el pigmento de la espinaca para llevarlo a la C.C.F con la elaboración previa de las cromatoplacas para encontrar el disolvente. Que se utilizara en la C.C para separar los pigmentos vegetales que constituyen la mezcla. Posteriormente se verificara por C.C.F. si se logró la separación de los pigmentos por C.C donde sí se logró separar el pigmento y se distinguen la diferencia de colores.

CROMATOGRAFIA

La cromatografía puede definirse como la técnica de separación de una mezcla de solutos, basándose esta separación en la diferente velocidad con que se mueve cada uno a través de un medio poroso, arrastrados por un disolvente en movimiento.

La cromatografía es un método que permite separar los componentes de una mezcla de compuestos por distribución entre dos fases, una de las cuales es móvil y la otra estacionaria. La fase estacionaria puede ser un sólido o un líquido, este último debe de estar inmóvil sobre un soporte inerte. La fase móvil pude ser un líquido o un gas.

Dependiendo de la naturaleza de las fases usadas; la cromatografía puede clasificarse en varios tipos: solido-liquido, liquido-liquido, solido-gas y liquido-gas; por esta diversidad, la cromatografía en las últimas décadas ha adquirido un gran valor, ya que su empleo ha contribuido no solo a la identificación sino también al aislamiento de compuestos que son de origen biológico; aun en cantidades muy pequeñas, dichos compuestos generalmente poseen propiedades físicas y químicas muy semejantes; siendo muy difícil por otras técnicas conseguir tales resultados.

Las distintas técnicas cromatografías se pueden dividir según cómo esté dispuesta la fase estacionaria:

• Cromatografía plana. La fase estacionaria se sitúa sobre una placa plana o sobre un papel. Las principales técnicas son:

◦ Cromatografía en papel.

◦ Cromatografía en capa fina.

• Cromatografía en columna. La fase estacionaria se sitúa dentro de una columna. Según el fluido empleado como fase móvil se distinguen:

◦ Cromatografía de líquidos.

◦ Cromatografía de gases.

◦ Cromatografía de fluidos supe críticos.

TIPO FASE MOVIL-FASE ESTACIONARIA

Cromatografía en papel (liquido-Solido)

Cromatografía en capa fina (Liquido-Solido)

Cromatografía de gases (Gas-Solido o liquido)

Cromatografía liquida en fase inversa (Liquido (polar)-Solido o liquido (menos polar))

Cromatografía liquida en fase normal (Liquido (menos polar)-Solido o liquido (polar))

Cromatografía liquida de intercambio iónico (Liquido (polar)-Solido)

Cromatografía liquida de exclusión (Liquido-Solido)

Cromatografía liquida de adsorción (Liquido-Solido)

Cromatografía de fluidos supercríticos (liquido-Solido)

Al enfrentarse con el problema de separar una mezcla completamente desconocida lo mejor es emplear un ensayo cromatográfico por medio de la cromatografía en capa fina, la cual dará detalles acerca de la complejidad de la mezcla a separar. La cromatografía en capa fina es uno de los métodos analíticos más sencillos ya que se utiliza poca cantidad de muestra, pues es sensible en alto grado y requiere de poco tiempo para separar compuestos

estructuralmente muy parecidos. Los resultados de la cromatografía son muy valiosos pues ayudan a seleccionar el adsorbente y eluyentes adecuados que pueden ser empleados para una separación en columna.

CROMATOGRAFIA DE CAPA FINA

La cromatografía sobre papel es muy versátil y sus métodos se emplean con mucha frecuencia, pero su uso se limita a separaciones sobre celulosa, ya que otros medios adsorbentes, como la alúmina y el gel de sílice, no pueden prepararse en forma de tiras. Esta dificultad puede superarse fabricando capas finas de estas sustancias sobre placas de vidrio. Las capas finas preparadas sobre vidrio se denominan cromatoplacas.

Se usan dos tipos de capas: la capa compacta que se adhiere a la placa de vidrio por medio de un agente aglomerante incorporado al adsorbente o por las cualidades adherentes del propio material, y capa suelta.

Estas últimas solo se emplean en la determinación de la actividad de los adsorbentes y en uno de dos casos especiales.

Las separaciones sobre la capa finase parecen en muchos aspectos a la del papel, pero es posible la elección de muchos más medios, ye que con esta técnica pueden realizarse separaciones por reparto, filtración sobre gel, adsorción e intercambio iónico. Las propiedades particulares de la cromatografía en capa fina permiten desarrollar el fraccionamiento en un periodo de tiempo mucho menor. Una razón de esto es el tamaño de las partículas que constituyen los medios empleados en cromatografía en capa fina, por lo que se consiguen mejores resoluciones y manchas más compactas. Las capas compactas se preparan aplicando una papilla del medio elegido en un disolvente adecuado, sobre las placas de vidrio.

En la cromatografía de capa fina es posible emplearse cualquier medio, habiendo discutido que factores influyen en la elección. Los más populares son la celulosa micro granular o micro cristalina, gel de sílice (silica gel) en adsorción y reparto y alúmina.

La elección del disolvente dependerá de la naturaleza del compuesto que se va a separar y del material en que la separación va llevarse a cabo. Una regla general para la elección del disolvente es la comparación de la polaridad del mismo y de la sustancia que se va a separar, así aplicamos el criterio en el cual se emplea un disolvente poderoso (activos) para sustancias no polares y adsorbentes con menos actividad para sustancias más polares.

El revelado de las placas pude llevarse a cabo con agentes corrosivos, tal como ácidos concentrados y compuestos fuertemente oxidantes, a alta temperatura, debido a la naturaleza inorgánica de la capa.

Otro reactivo muy empleado son los vapores de yodo. En una cámara que contiene en el fondo algunos cristales de yodo, se introduce el cromatograma y se deja durante unos minutos. El yodo tiende a concentrarse en los sitios donde están los compuestos, por lo que aparece una mancha marrón oscuro, sobre el fondo amarillo pálido.

Otros métodos que no afectan el revelado son la fluorescencia y la radioactividad. Muchas placas llevan sustancias fluorescentes como aditivos para el revelado de los compuestos, localizándose los mismos por la aparición de machas no fluorescentes. Además muchos compuestos que se separan absorben ultravioleta, siendo este el método más sencillo para localizarlos.

CROMATOGRAFIA DE COLUMNA (filtración en gel)

La cromatografía de filtración en gel se realiza empleando unas matrices formadas por unas esferas porosas. El volumen de los poros es muy elevado y su diámetro está determinado. Cuando penetran en el lecho de la columna dos proteínas de tamaños tales que una penetra en los poros de las bolas de gel y la otra no, la primera se reparte entre el espacio entre las bolas y el interior de los poros, reduciéndose la concentración en la fase libre entre las bolas. La segunda proteína, por tamaño, sólo puede encontrarse entre las bolas. El flujo de solvente es más elevado entre las bolas que en el interior de los poros de éstas, por lo que el efecto neto es el de acelerar el desplazamiento de las proteínas de mayor peso molecular respecto al de las de menor peso molecular. En esta cromatografía se eluyen primero las proteínas mayores, y en segundo lugar las menores, y tiene una gran influencia en el resultado la longitud de la columna y el volumen de la misma. Columnas largas aseguran separaciones de mayor calidad. Empleando patrones de proteínas de peso molecular conocido se emplea para determinar el peso molecular de proteínas de tamaño desconocido.

Son numerosos los adsorbentes empleados en la cromatografía de columna. Las separaciones pueden realizarse por reparto, adsorción o intercambio iónico. Pueden usarse cualquier medio adsorbente, siendo los más generales la celulosa, gel de sílice, alúmina, oxido de magnesio. El tamaño de la columna está determinado por la cantidad de mezcla que se va a fraccionar.

El primer paso en el montaje de la columna cromatográfica es colocarla fija en posición vertical. A continuación se pone en la columna un disco de porcelana con varios orificios, y encima de este un poco de lana de vidrio. Este dispositivo

retiene el material solido de la columna, mientras que el líquido puede circular libremente. El adsorbente puede introducirse en seco, pero lo más frecuente es echarlo en forma de una papilla con eluyente. La papilla formada por el adsorbente y el disolvente se agrega lentamente en porciones, lo que permite que se pose en el adsorbente por la fuerza de gravedad, hasta alcanzar la altura deseada. Finalmente se abre la llave inferior de la columna para que salga el exceso de disolvente contenido. La altura del disolvente no debe exceder más de 2 a 5 mm sobre el sólido. Una vez realizado esto la columna esta lista para introducir la muestra que se va a separar.

OBJETIVOS:

• Seleccionar a técnica cromatográfica para purificar compuestos coloridos y no coloridos.

• Identificar a la cromatografía en capa fina como una herramienta en la determinación del número de componentes de una mezcla.

• Elegir la cromatografía en columna como una técnica para purificación de compuestos.

HIPOTESIS:

En la cromatografía de capa fina obtendremos un buen ensayo para encontrar el eluyente más apto para la CC, siendo este aquel que sea más afín a la mezcla problema y muestre una mayor ascendencia en los componentes del extracto. En la cromatografía de columna observaremos la separación de los componentes del extracto de la espinaca.

MATERIALES

EMBUDO DE SEPARACION 300ML

SOPORTE UNIVERSAL

2 PINZAS DE TRES DEDOS CON NUEZ

20 CUBREOBJETOS

10 TUBOS DE ENSAYE

GRADILLA

2PIPETAS GRADUADAS 5ML

20 FRASCOS DE JUGO GERBER

MORTERO CON PISTILO

CHAROLA DE ALUMINIO

BOLA DE ALGODÓN

EMBUDO TALLO CORTO

3 VASO DE PP DE 100 ML

VASO DE PP DE 250 ml

REACTIVOS:

HEXANO 250 ml

ETER DE PETROLEO 250 ml

CICLOHEXANO 250 ml

BENCENO 250 ml

COLRURO DE METILO 250 ml

TOLUENO 250 ml

ETER DIETILICO 250 ml

CLOROFORMO 250 ml

ACETONA 250 ml

ETANOL 250 ml

METANOL 250 ml

SILICA GEL P/CAPA FINA 30gr

SILICA GEL P/COLUMNA 30gr

PROCEDIMIENTO:

Obtención del extracto:

1. Se lavó la espinaca para quitarle la tierra y suciedad que tuviera

2. Se macero la espinaca en un mortero con pistilo y se le agrego 10 ml de etanol para ayudar a la obtención del extracto.

3. se agregó ____ ml de ____________ y _______ ml de _________ en total entre 3 veces que se realizó para la extracción en un embudo de separación (como no se separaba agregamos una disolución de salmuera para ayudar a separar las fases).

4. se separan las fases en los vasos de precipitados y el que se va a utilizar es el concentrado verde, se le agrega el agente desecante se deja reposar en un recipiente perfectamente sellado (para evitar que el disolvente se evapore) y luego se filtra.

Preparación de la papilla para la cromatografía de capa fina:

1. Se colocó una cantidad de cloruro de metileno dentro de un frasco y se fue agregando poco a poco la silica gel para capa fina.

2. Se agito hasta que en el agitador se observó una capa opaca y uniforme (sin grumos y no debe ser espesa).

Preparación de las cromatoplacas:

1. Se tomaron dos cubreobjetos juntos y se sumergieron en la papilla de silica gel.

2. Se sacaron cuidando no dañar la papilla adherida al cubre objetos, se separaron y se colocaron en una charola de aluminio.

3. Se activaron las placas en la estufa a no más de 100° por 5 min.

Preparación de las cámaras de elución:

Se lavaron 20 frascos de gerber con tapa, se etiquetaron y se les coloco el papel filtro alrededor dejando solo una pequeña ventana para observar el proceso.

El desarrollo de las placas se lleva a cabo en las cámaras de elución por el método ascendente. En el interior de la cámara debe colocarse un papel filtro empapado de disolvente, que cubra las paredes interiores de la misma, para conseguir que la atmosfera este saturada de vapor del disolvente. El fondo de la cámara se cubre de disolvente hasta una altura de 0.5 a 1 cm y, después de un periodo apropiado en el que se consigue el equilibrio se introduce la placa. Durante el desarrollo no puede moverse la cámara de elución.

Elección de la efectividad del disolvente:

1. Se eligieron varias mezclas de disolventes con diferentes polaridades, sumando un total de 5 ml de cada combinación. Se colocaron en la cámara de elución y se esperó a la absorción del papel filtro.

2. En las cromatoplacas activadas se colocaron, con ayuda de un tubo capilar, dos puntos de la sustancia problema a una distancia de la base de la cromatoplacas a los puntos de 1 cm, para que el disolvente no toque los puntos. Guardando además una distancia entre dichos puntos para evitar su cruce en la corrida cromatográfica.

3. Se introdujeron las cromatoplacas en la cámara de elución y se esperó el ascenso del disolvente, cuidando que este no rebasara la capa de silica.

4. Al terminar la corrida se retiró la cromatoplaca y se esperó a su secado para corroborar la efectividad de la mezcla.

Preparación de la columna para la cromatografía fraccionada:

1. Se montó la bureta en forma vertical se le agrego el eluyente q fue 70ml de hexano y 30ml de etanol para quitarle la burbuja de aire a la bureta Se le introdujo un pedazo de algodón en el fondo.

2. Se prepararon cerca de 8gr de silica para columna con el disolvente escogido y se vertieron en la columna esperando que la silica fuera asentándose lentamente hasta tener un aproximado a 10 cm de silica en la columna.

3. Se colocó después cerca de 1 cm de sal, cuidando quedase esta de forma horizontal.

CORRIDA DE LA CROMATOGRAFIA DE COLUMNA:

1. Se introdujo una cantidad de mezcla problema sobre la columna preparada y después se colocó el disolvente elegido.

2. Se abrió la llave de la bureta permitiendo la evacuación del disolvente a más o menos 1 gota cada 10 segundos.

3. Se esperó a la separación de los componentes de la sustancia problema reservando cada uno de ellos en tubos de ensaye. Separados por sus tonalidades en cada tubo desde el primero hasta el último.

ES IMPORTANTE NO DEJAR SECAR LACOLUMNA DURANTE LA CORRIDAYA QUE SE ESTROPEARIA EL TRABAJO

COMPROBACION DE LOS COMPONENTES DE LA SUSTANCIA PROBLEMA:

Una vez obtenidos los componentes de la sustancia problema por separado en los tubos de ensaye:

• Para comprobar si los componentes de la sustancia se obtuvieron puros, se realizó una corrida en CCF para cada componente desde los más claros hasta los más oscuros.

• Se revelaron las cromatoplacas para ver si efectivamente los componentes eran puros. Aquellos que no se podían notar a simple vista se revisaron con luz UV en un lugar oscuro para una mayor eficacia.

Resultados:

ANALISIS DE RESULTADOS:

En la cromatografía de capa fina creímos haber obtenido la mezcla de disolventes apropiada para realizar la CC, sin embargo comprobamos al final que tal vez pudo haberse adecuado alguna mezcla de mayor eficacia ya que al comprobar la pureza de los extractos no fue posible encontrarlos todos ellos en estado puro. Algunos de estos estaban en mezcla. Por lo tanto recomendamos realizar la elección de la mezcla de disolventes de una manera más eficaz, lo cual permitiría una mejor obtención de los componentes en sus estados puros.

CONCLUSION:

La cromatografía es un método muy recomendable para quien quiere comprobar los componentes de una mezcla descocida. Facilita en todo caso la obtención de estos y resulta ser sencilla y superficial (CCF) o compleja y eficaz (CC).

BIBLIOGRAFIA:

http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/cromatografia.htm

http://www.uprm.edu/biology/profs/velez/cromatografias.htm

Análisis químico e instrumental moderno. Harold F. Walton y Jorge Reyes. Ed. Reverté. México D.F.

Análisis Químico Cuantitativo. Gilbert H. Ayres. Ed. Harla. Mexico D.F.

CUESTIONARIO:

¿A qué grupo de compuestos pertenecen los pigmentos?

Carotenoides y a la Clorofila

¿A qué se deben que estos compuestos sean coloridos?

A la presencia de los carotenoides que otorgan ese color respectivo amarillo y naranja o rojos y a la clorofila, esta da un color verde característico de los vegetales.

Explique la diferencia entre cromatografía de adsorción y partición.

Los métodos cromatográficos se pueden clasificar de acuerdo a la naturaleza de las fases estacionarias y móviles.

Cromatografía de adsorción: Cuando la fase estacionaria es un sólido

Cromatografía de reparto: Cuando la fase estacionaria es un líquido

¿Cuáles son las ventajas y desventajas de la cromatografía en capa fina en comparación con la cromatografía en columna?

La cromatografía en capa fina presenta una serie de ventajas frente a otros métodos cromatográficos (en columna, en papel, en fase gaseosa, ...) ya que el utillaje que precisa es más simple. El tiempo que se necesita para conseguir las separaciones es mucho menor y las separación es generalmente mejor. Pueden usarse reveladores corrosivos, que sobre papel destruirían el cromatograma. El método es simple y los resultados son fácilmente reproducibles, lo que hace quesea un método adecuado para fines analíticos. En la cromatografía en columna, se pueden obtener las separaciones de los compuestos coloridos, las cuales pueden concentrarse y así obtenerse cada uno de los componentes por separados, es decir es un proceso de purificación y aislamiento total de la sustancia. La desventaja de este método es que solo es para sustancias coloridas, para que puedan observarse las separaciones

Explique la diferencia que existe entre el adsorbente utilizado en cromatografía en capa delgada y el de columna. Hacer una lista en orden creciente de actividad

En columna:

Puede usarse cualquier medio adsorbente siendo los más generales la celulosa, gel de sílice, alúmina oxido de magnesio, oxido de cálcico y carbón activo (para separaciones por adsorción y de intercambio iónico). Se emplea para la separación de mezclas o purificación de sustancias a escala

preparativa. Como fase estacionaria se usa, generalmente, gel de sílice o alúmina dentro de una columna. La elección del disolvente es crucial para una buena separación. Dicho disolvente pasa a través de la columna por efecto de la gravedad o bien por aplicación de presión (cromatografía flash). La columna se prepara mezclando el soporte con disolvente

Capa delgada:

Silica gel (se utiliza en el 80% de las separaciones)

Óxido de Aluminio ó Alúmina (ácida, neutra ó básica)

Celulosa (Nativa o micro-cristalina)

Poliamidas

Estos adsorbentes deber tener las siguientes características:

• Tamaño de Partícula

• Volumen de Poro

• Diámetro de Poro

• Área Superficial

• Homogeneidad

• Pureza

Hacer una lista de los eluyentes usados comúnmente en cromatografía en columna y capa delgada en orden creciente de polaridad.

En capa fina:

Éter de petróleo

Tolueno

Dietil-éter, t-butil-éter

Diclorometano

Acetato de etilo

n-pentano, n-hexano

Ciclohexano

Tetracloruro de carbono

Éter dietílico

Cloroformo

Acetona

Iso-propanol

Etanol

Metanol

Ácido acético

¿Como se prepara el capilar para aplicar la muestra en la cromato-placa?

Se le aplica calor para así poder romperlo pero esto hace que n nos quede un orificio muy grande

¿Porque es necesario que la cámara de elusión este saturada con los vapores del eluyente?

Porque así será mas fácil el arrastre de los pigmentos

Explique cada uno de los siguientes términos:

Eluyente: Un eluyente es un solvente que se usa en técnicas de cromatografía para extraer un compuesto que se quiere separar de otra fase.

Eluato: la sustancia que se separa o sale de la columna después de cada extracción.

Eluccion fraccionada: Aparato de elución fraccionada electroforético tiene una columna con una rotación conjunta de sello en el que un delgado chorro de elución búfer es dirigido a través de la luz de la columna electroforética en una dirección perpendicular a la de migración electroforética. El contenido de la columna se gira en relación con el jet estacionario o se gira el jet con respecto a la columna. El sistema puede emplear electroforesis en solución libre o en columnas empaquetadas.

Adsorcion: La adsorción es un proceso donde un sólido se utiliza para eliminar una sustancia soluble del agua. Es un proceso por el cual átomos, iones o moléculas son atrapados o retenidos

Elusión: se produce por el flujo de una fase móvil de gas inerte

Adsorbente: es un sólido que tiene la capacidad de retener sobre su superficie un componente presente en corrientes líquidas o gaseosas. Se caracterizan por una alta superficie específica y por su inercia química frente al medio en el que se van a utilizar.

Actividad del adsorbente: El nivel de actividad de la adsorción depende de la concentración de la sustancia en el agua, la temperatura y la polaridad de la sustancia. Una sustancia polar (= soluble en agua) no puede ser eliminada.

¿Cómo se prepara la papilla para la cromatografía en capa fina?

Se machaca con ayuda de un mortero y pistilo hasta llegar a una papilla

¿Cuándo es conveniente activar una placa y como se activa?

Antes de que se puedan usar las placas generalmente deben ser calentadas para retirar el agua que actúa como una impureza y evita una buena separación. La magnitud de calor depende del tipo de separación que se requiere para compuestos hidrofilicos o polares, el secado al aire o con un secador de pelo son generalmente adecuados, para los compuestos hidrofobicos o no polares es necesario un calentamiento más intenso. Las placas de oxido de aluminio y de gel de sílice con adhesivo requieren ser secadas al aire durante aproximadamente 30 min. Y después ser activadas en un horno a 100°C alrededor de 30 min. Las placas de celulosa deberán secarse al aire libre durante 30 min. y activarse al horno durante 10 min. A 105°C.

¿Cómo se controla la salida de los componentes en una cromatografía en columna?

Se controla con la llave de la bureta se va colocando los distintos pigmentos en tubos de ensaye.

¿Por qué es importante que la muestra a separar por cromatografía deba estar lo mas seca posible?

Las cantidades altas de flujo dan malas separaciones, el promedio es 3 a 4ml/min. en una columna de 40 cm. de altura.

¿Qué espesor debe tener la fase estacionaria en una C.C.D.?

No tiene que ser espeso y No debe ser muy aguado, debe deslizarse solo por la placa.

¿Cómo debe de ser la polaridad del eluyente al empacar una columna?

La polaridad del eluyente debe ser mayor

¿Cuál es el orden de polaridad en que salen los compuestos de una cromatografía en columna?

En la cromatografía de columna las moléculas de una mezcla son separadas en base a la afinidad de las moléculas por la fase estacionaria o por la fase móvil. Si una molécula A tiene más afinidad por la fase estacionaria que la B, B bajará más rápido que A.

• Éter de petróleo.

• Éter dietílico.

• Ciclohexano.

• Acetato de etilo.

• Tetracloruro de carbono.*

• Piridina.

• Benceno.*

• Etanol.

• Cloroformo.*

• Metanol.

• Diclorometano.

• Agua.

• Ácido acético.

*compuestos cancerígenos.