PRINCIPALES ENZIMAS DE LA MIEL

INTRODUCCIÓN

La miel es una sustancia natural producida por las abejas (Apis mielifera) a partir del

néctar de las flores o de secreciones de partes vivas de plantas. Esta contiene al

menos 60% de azucares y no mas de 21% de humedad, de acuerdo a Ajlouni y

Sujirapinyokul (2010), esta composición es ampliamente influenciada por la región y

las condiciones climáticas. La miel como producto natural contiene diferentes

enzimas, lagunas producidas por la abeja y otras proporcionadas por la sustancia de

su procedencia (néctar, polen, fluidos de plantas), entre las más importantes

podemos encontrar enzimas como las amilasas, invertasas, glucosidasas, catalasas

y fosfatasas. Según Ureña, Arrieta, Umaña, Zamora y Arias Echandi en el 2007, la

miel como cualquier producto alimenticio debe cumplir con ciertas normas de calidad,

propiedades organolépticas, fisicoquímicas y microbiológicas, entre estos se

destacan como lo indica Voldrich, Rajchl, Cizkova y Cuhra (2009), la actividad de

diastasas (α-β-γ- amilasas) y la relación de esta enzima con el contenido de

Hidrometilfurfural (HMF) que según Ureña Varela, Arrieta Bolaños, Umaña, Zamora

y Arias Echandi en 2007, indican adulteración, sobrecalentamiento y envejecimiento

de una muestra de miel.

DIASTASA (α-, β-, AMILASA)

La α-amilasa (1,4-α-D-glucano-glucanohidrolasa o glucogenasa) tiene la función de

romper las cadenas de almidón al azar produciendo dextrinas y β-amilasa (1,4-α-D-

glucano-maltohidrolasa o amilasa sacarogénica)

Grafico 1: Acción enzimática de la diastasa. Enzimas de la miel 2010

Según la proposición del Codex Alimentario (2001), existen dos indicadores de

calidad en la miel, el 5-hidrometilfurfural y la actividad de la amilasa (diastasa), los

cuales ayudan a identificar cuando una miel es adulterada, esto de acuerdo con

(Voldrich, Rajchl, Cizkova y Cuhra 2009) puede ser producto de daño por calor

excesivo, adición de diferentes tipos de azucares como sacarosa invertida, jarabe de

maíz de alta fructosa, e incluso azúcar de cocina, hacen que la concentración de

HMF aumente y el numero diastasico disminuya, debido a que si la miel es tratada

por un tiempo prolongado en calor, la actividad enzimática se reduce y a un menor

número diastasico, menor la calidad del producto en el mercado.

Existen varios métodos que se han ido desarrollando par detectar y cuantificar la

actividad enzimática de la diastasa entre los principales tenemos:

Según lo planteado por Ajlouni y Sujirapinyokul en 2010, la evaluación de

la actividad de la amilasa (α-amilasa), se toma una muestra de 5g de miel

tratada con calor, se disuelven con 15 ml de agua Mili-Q y 5 ml de una

solución buffer de acetato de pH 3.5, esto se transfiere a un frasco

volumétrico que contiene 3 ml de solución de cloruro de sodio y se lleva a

volumen. Usando una pipeta volumétrica, 10 ml de la solución son trasferidos

a un frasco de 50 ml y puestos en baño de agua a 40ºC con un segundo

frasco que contiene 10 ml de solución al 1% de almidón. Después de 15

minutos, alicotas de 5 ml de la solución de almidón son agregados a la

solución de miel, mezclados y medidos. En intervalos periódicos, para un

primer tiempo de 5 minutos, alicotas de 0,5 ml de la mezcla son diluidos en 5

ml de solución de yodo (I2KI) y 22 ml de agua Mili-Q, mezclados e

inmediatamente medidos a 660 nm contra un blanco de agua. Una grafica de

absorbancia contra tiempo es usada para determinar el tiempo tx, en el que

una absorbancia especifica de 0,235 fue medida.

El número diastasico es calculado siguiendo los métodos establecidos por

la Comisión internacional de miel en el 2002, en los cuales se plantea la

unidad Gothe es definida como el monto de enzima que puede convertir 0,01

gramos de almidón antes de prescribir el punto final en una hora a 40ºC bajo

las condiciones del test. La solución de almidón reacciona formando un

complejo con el yodo, de un color característico, el cual va disminuyendo por

la acción de la diastasa (α-amilasa), lo que ocasiona una perdida de color. La

ecuación para el calculo del número de diastasa es:

Figura 2: Calculo del número diastasico. International Honey Commission 2002.

El método establecido por la comisión Internacional de miel esta basado en el

trabajo original de Schade et al (1958).

El procedimiento de detección de adición de azucares u otros diluyentes por medio

del número diastasico puede ser reducido mediante la agregación de amilasas

foráneas, para evitar esto, Voldrich, Rajchl, Cizkova y Cuhra (2009), plantean la

comparación del número diastasico para diferentes sustratos.

Existe una relación directa entre los métodos de conservación y la calidad de este

valioso producto, el HMF es el resultado de un sobrecalentamiento para lograr la

perdida de humedad, aunque su producción es my común al pasar la miel por

grandes periodos de almacenaje, de acuerdo a Ajlouni y Sujirapinyokul (2010) el

almacenaje a una temperatura de 20 ºC aumenta el HMF en ± 1mg por cada

kilogramo mensualmente. La adulteración de mieles por adición de azucares

invertidos, aumenta los niveles de HMF, los cuales son altamente tóxicos para las

abejas. La comisión internacional de miel (2002), establece la determinación de

HMF, mediante el uso del método de Jeuring y Kupers (1980), por medio de HPLC

en fase inversa con detección de UV, la señal producida es comparada con algunos

estándares de concentración conocida, mediante el siguiente cálculo:

Figura 3: Calculo de la concentración de HMF. International Honey Commission

(2002).

INVERTASA

La invertasa es una de las enzimas más importante en el desarrollo del producto

final, ya que esta según Kotwal y Shankar en 2009 esta enzima realiza muchas de

las transformaciones químicas del néctar, este tipo de enzimas (β-D-fructofuranosida

fructohidrolasa, β-fructofuranosidasa, sacarasa) cataliza la hidrólisis de sacarosa y

glucósidos relacionados a simples carbohidratos (fructosa y glucosa), lo que aumenta

el contenido de azúcar sin cristalización del mismo reacción originada por las

glándulas hipofaringeas de la abeja mielifera (Apis mielifera). Esta enzima tiene un

gran valor comercial, principalmente la extraída de Saccharomyces sp., pero su uso

comercial es limitado por los altos costos de producción y su poca estabilidad frente

a cambios de factores como pH, Temperatura y presión osmótica.

Para su detección y cuantificación la comisión internacional de miel en el 2002,

plantea el uso del método Signthaler (1977), expresando en unidades, donde una

unidad es definida como el número de micromoles de sustrato destruidas por minuto

y expresadas por kilogramos de miel. Para esta prueba se usa como sustrato el p-

nitrofenol-α-D-glucopiranosido (pNPG) el cual es transformado en glucosa y p-

nitrofenol. La reacción enzimática es detenida en un pH de 9.5 y al mismo tiempo el

nitrofenol es transformado a anión nitrofelato, que corresponde a la cantidad de

sustrato convertido y es determinado por fonometría a 400 nm.

El cálculo de la actividad de la invertasa o numero invertasico se calcula de la

siguiente manera:

Figura 4: Cálculo del número invertasico. International Honey Commission

2002

GLUCOSA-OXIDASA

Según Pontoh y Low (2002) la β-Glucosidasa (β-d-glucoside glucohidrolasa) hidroliza

los puentes 1,4-β-Glucosa dejando β-d-glucosa de oligo y polisacáridos. Esta

enzima se ha descubierto en plantas, animales hongos y bacterias. En los insectos la

β-glucosidasa se subdivide en tres clases de acuerdo aun sustrato especifico. La

clase I incluye enzimas con actividad β-glucosidasa y aril β-glucosidasa, estas

enzimas tiene la capacidad hidrolizar celubiosa, lactosa, β-p-nitrofenil-glucosidasa (β-

PNPG), β-p-nitrofenilgalactosidasa (β-PNPGal), β-p-nitrofenilfructosidasa (β-

pPNPFru) y otros sustratos similares. La clase 2 incluye solo los que poseen

actividad glicosil β-glucosidasa, sin embargo ella solo puede hidrolizar sustratos con

celubiosa y lactosa. La clase 3 incluye enzimas con solo actividad aril (o alkil) β-

glucosidasa, estas enzimas tiene una actividad similar a la β-PNPG, así como

sustratos similares.

La identificación hecha por Pontoh y Low (2002), para la detección de actividad β-

glucosidasa en la miel, y como esta actividad esta correlacionada con la formación

de puentes tipo β-O-glicosidicos, detectan la presencia de actividad β-glucosidasa

en el intestino medio y posterior de la abeja melífera (Apis mielifera). El origen de la

actividad β-glucosidasa en miel no ha sido totalmente identificado, pero puede

porvenir de la abeja de la miel, luego la β-glucosidasa puede estar presente en el

saco de miel y los órganos segregan enzimas digestivas a la boca. Muchas glándulas

descargan secreciones en las partes bucales de la abeja, algunas torácicas, de la

cabeza y de las glándulas hipofaringeas, pueden relacionarse con la actividad β-

glucosidasa en la miel

Estudios recientes como los realizados por Zhang, Zheng, Shen en 2007, muestran

la localización de la glucosidasas tipo I esta presente en ventrículo, la glucosidasas

de tipo II esta presente en ventrículo y hemolinfa y la glucosidasas tipo III esta

presente en glándulas hipofaringeas. En abejas obreras, la glándula hipofaringea

hidroliza la sacarosa presente en el néctar, la glucosa y la fructosa mediante α-

glucosidasa, la estructura de la glucosidasa presente en las glándulas hipofaringeas

de la abeja de la miel, son muy similares a las presentes en mosca de la fruta y

mosquito

Los métodos para la detección y cuantificación de la glucosidasa de acuerdo con lo

establecido por Pontoh y Low en 2002, se baso en el método Low (1986) en el cual

un volumen seleccionado de muestra fue diluido con una muestra buffer a un

volumen total de 0,1 ml y fue añadido de 1 a 2 ml de β-PNPG 0,02 M en un buffer de

acetato 0,1 M a un pH 5,0 en un tubo de prueba. Esta mezcla fue incubada en baño

de agua (35 ºC) por 20 minutos. A esta solución se le agrego 0,01 ml de buffer Tris 3

M y pH 10,0. Despues de enfriarse, la solución fue transferida en un

espectofotometro y la absorbancia fue medida a 400 nm.

De la misma manera, se realiza una prueba para determinar la presencia de

glucosidasas, mediante la producción de peroxido de hidrogeno. Se toam una

muestra de 10 gr de miel y se diluye en 40 ml de agua Mili.Q a una temperatura de

20ºC. luego de una hora se mide el máximo de peroxido de hidrogeno producido

mediante Marckoquant hydrogen-peroxide testtrips Nr. 10.011. Se compara el color

de la tira con la escala de 0 a 25 mg de peroxido/litro, este valor se multiplica por 5

para determinar la cantidad de microgramos de peroxido, creados por 1 gramo de

miel en una hora

Una unidad de β-glucosidasa es definida como la cantidad de enzima requerida para

producir un µmol de p-nitrofenol por minuto en las condiciones del ensayo.

CATALASA

Como lo plantea Weston (2000), la sustancia identificada en la miel con mayor

propiedad antibacterial es el peroxido de hidrogeno, el cual es producido por la

enzima glucosa oxidasa, cuando la miel esta diluida. La catalasa descompone el

peroxido de hidrogeno en agua y oxigeno, esta enzima también se encuentra en la

miel, pero es originada por el polen de las flores, mayormente, aunque existen

pequeños rastros de catalasa en néctar.

Figura 5: Reacción de la catalasa. Enzimas presentes en la miel 2010.

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Zamora y María Laura Arias Echandi. Evaluación de la posible adulteración

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