Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA
FACULTAD DE RECURSOS NATURALES RENOVABLES
DEPARTAMENTO ACADEMICO DE CIENCIAS AMBIENTALES
INFORME FINAL DE PRACTICA PRE- PROFESIONAL
IDENTIFICACION DE MICROORGANISMOS EN SUELOS
CONTAMINADOS CON HIDROCARBURO EN OLEOCENTROS DE LA LOCALIDAD
DE LA CHANCADORA Y SANTA ROSA.
EJECUTOR : CASTRO RIOS, Luz Jackeline
ASESOR : Blog. GOZME SULCA, CESAR
LUGAR DE EJECUCION : Laboratorio de microbiologia - FRNR
DURACION : 8 de Enero al 8 de Abril
Tingo María – Peru
2016
ÍNDICE GENERAL
Página
I. INTRODUCCIÓN ................................................................................. 1
1.1 Objetivos General ....................................................................... 3
1.1.1 Objetivo Específico………………………………………….. 3
II. REVISIÓN DE LITERATURA ............................................................... 4
2.1 El suelo ........................................................................................ 4
2.2 Hidrocarburo ................................................................................ 5
2.3 Microorganismos del suelo .......................................................... 6
2.4 Degradación de los hidrocarburos ............................................... 7
2.4.1 Factores que influyen en la degradación del hidrocarburo 10
2.5 Bacterias ..................................................................................... 13
2.6 Actinomicetos .............................................................................. 15
2.7 Hongos ........................................................................................ 16
III. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................ 18
3.1 Ubicación ................................................................................... 18
3.1.1 Ubicación política…………………………………………..... 18
3.1.2 Ubicación geográfica………………………………………... 19
3.1.3 Aspectos ambientales ....................................................... 19
3.2 Materiales .................................................................................... 20
3.2.1 Medios de cultivo .............................................................. 20
3.2.2 Reactivos .......................................................................... 21
3.2.3 Materiales de laboratorio .................................................. 21
3.2.4 Equipos ............................................................................ 22
3.3 Metodología ................................................................................. 22
3.3.1 Puntos de muestreo .......................................................... 22
3.3.2 Selección y toma de muestreos para la evaluación .......... 23
3.3.3 Identificación de loa parámetros fisicoquímicos ................ 23
3.3.4 Determinación de la concentración celular ........................ 25
3.3.5 Identificación de los géneros preponderantes……………. 26
IV. RESULTADOS .................................................................................... 33
4.1 Identificación los parámetros influyentes en el desarrollo de los
microorganismos en suelos contaminados por hidrocarburo…… 33
4.2 Determinación de la concentración celular de microorganismos presentes
en suelos contaminados por hidrocarburo ................................... 36
4.3 Identificación géneros microbianos preponderantes en suelos
contaminados con hidrocarburo. .................................................. 42
V. DISCUSIÓN ........................................................................................ 45
5.1 Parámetros físicos del suelo ........................................................ 45
5.2 Concentración celular .................................................................. 47
5.3 Géneros preponderantes de microorganismos............................ 49
VI. CONCLUSIONES................................................................................. 53
VII. RECOMENDACIONES ........................................................................ 54
VIII. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ................................................................ 55
IX. ANEXO ................................................................................................. 61
INDICE DE CUADRO
Cuadro Página
1. Numero de microorganismos presentes en el suelo ............................. 7
2. Géneros más comunes de bacterias y hongos ...................................... 9
3. Puntos de muestreo ................................................................................ 23
4. Parámetros fisicoquímicos ..................................................................... 33
5. Concentración de bacterias .................................................................... 36
6. Concentración de actinomicetos ............................................................ 38
7. Concentración de hongos ....................................................................... 40
8. Reconocimiento de bacterias ................................................................. 42
9. Reconocimiento de hongos. ................................................................... 44
INDICE DE FIGURA
Figura Página
1. Mapa de ubicación UNAS .................................................................... 18
2. Datos del pH ......................................................................................... 34
3. Datos de la Temperatura ...................................................................... 34
4. Datos de la Humedad ........................................................................... 35
5. Concentración de bacterias ................................................................. 37
6. Concentración de actinomicetos .......................................................... 39
7. Concentración de hongos..................................................................... 41
8. Pesado de suelo ................................................................................... 59
9. Disolución de suelo en caldo peptona al 0.1%. ................................... 59
10. Filtrado del suelo despues de haber sido diluido en peptona al
0.1%. ..................................................................................................... 60
11. Realización de la siembra en los medios de cultivo ............................ 60
12. Placas con medios de cultivo sembrados. ........................................... 61
13. Crecimientos de microorganismos despues de 48 horas de
incubación a 37°C ................................................................................ 61
14. Realización de la Prueba Bioquímica. ................................................. 62
15. Realización de la Prueba Bioquímica .................................................. 62
16. Crecimiento de Genero Staphylococcus en el medio Manitol Salado 63
17. Crecimiento de microorganismos en el medio MacConkey. ............... 63
18. Crecimiento de especie Actinomicetos. ............................................... 64
19. Crecimiento de microorganismos en medio M77. ............................... 64
20. Crecimiento de microorganismos en medio Cleed..............................
65
21. Realización del Microcultivo para el crecimiento de hongos. .............
65
22. Crecimiento de especies de hongos en el medio A.S. ........................
66
1
I. INTRODUCCIÓN
La industria petroquímica es importante en la sociedad, no obstante,
la falta de un programa de protección ambiental hace que el medio se vuelva
más frágil ante derrames de petróleo por el deterioro de oleoductos, descargas
de efluentes contaminados (ACOSTA et al., 1995).
La selección de microorganismos a través de pruebas sucesivas de
crecimiento poblacional en cultivos ricos en petróleo, es una estrategia eficiente
para evaluar la adaptación y supervivencia de bacterias tolerantes a elevadas
concentraciones de petróleo. Los resultados de estas pruebas confirman la
selección de bacterias más tolerantes y adaptadas, dependiendo de estas el
éxito en las siguientes etapas de tratamiento tanto de suelos como de aguas
contaminadas con petróleo (ACOSTA et al., 1995).
Hoy en día los microorganismos son muy importantes, pues tienen
la capacidad de transformar una gran variedad de contaminantes orgánicos e
inorgánicos a sustancias inocuas, que pueden ser reciclados al medio ambiente.
Aquellas bacterias disponen de la capacidad de oxidar una gran cantidad de
compuestos orgánicos producidos y utilizados industrialmente (RITTMANN,
2001).
2
Para tal fin, hoy se hace indispensable contar con gestiones
ambientales eficientes, económicas y ecológicas, para recuperar tales suelos
contaminados. Es bajo esta premisa que se deben implementar tecnologías
limpias y naturales para recuperar aquellos ecosistemas perturbados por la
actividad de hidrocarburo.
En esta práctica realizada se busca identificar microorganismos que
tenga la capacidad de sobrevivir y degradar hidrocarburos presentes en suelos
contaminados de hidrocarburo, con el fin de mitigar impactos negativos que se
generan dentro del suelo.
3
1.1. Objetivo general
- Identificar microorganismos en suelos contaminado con hidrocarburo
en oleocentros de la localidad de la Chancadora y la Santa Rosa.
1.1.1. Objetivos específicos
Identificar los parámetros influyentes en el desarrollo de los
microorganismos en suelos contaminados con hidrocarburo.
Determinar la concentración celular de microorganismos
presentes en suelos contaminados por hidrocarburo.
Identificar géneros microbianos preponderantes en suelos
contaminados con hidrocarburo.
4
II. REVISIÓN DE LITERATURA
2.1. El Suelo
Según BROCK Y MADIGAN, (2000). El suelo se define como la
parte superior de la corteza terrestre, y está compuesto por componentes
minerales (meteorización de las rocas), componentes orgánicos (humus y
derivados, biomasa viva y muerta), gas (aire en el espacio existente en los
poros), y agua envolviendo partículas y el espacio capilar .En términos
generales, está formado por un 50 % de espacio libre (la mitad del espacio
poroso ocupada por gases y la otra mitad por líquidos); un 40-50 % de sólidos
minerales (meteorización de las rocas) y un 0,5-5% de materia orgánica (humus
y derivados, biomasa viva y muerta).
El suelo constituye la interfaz entre la tierra, el aire y el agua,
lo que le confiere la capacidad de desempeñar tanto funciones naturales
como de uso antropogénico. Según las proporciones de arenas (2-0,05 mm
de diámetro), limos (2-50 µm de diámetro), arcillas (inferior a 2 µm de diámetro)
y materia orgánica, principalmente humus y derivados, existe una gran
variedad de tipos diferentes de suelos.
5
Los componentes minerales y la materia orgánica se distribuyen en
el espacio generando una estructura porosa. Los poros pueden contener agua
o aire, de manera que existen tres fases: sólida, líquida y gaseosa.
El agua contenida en los poros del suelo contiene sales minerales y
nutrientes y es el medio en el cual se puede desarrollar la actividad
metabólica de los microorganismos que lo colonizan. El contenido en agua
de un suelo puede oscilar enormemente, afectando dicha actividad.
2.2. Hidrocarburos
Los hidrocarburos son compuestos orgánicos formados únicamente por átomos
de carbono e hidrogeno. La estructura molecular consiste en un armazón de
átomos de carbono a los que se unen los átomos de hidrogeno. Las cadenas de
átomos de carbono pueden ser lineal, ramificados, abierto y cerradas
(ESPINOZA, 2011).
Según WILSON Y JONES, (1993). En función de su estructura química los
hidrocarburos se pueden clasificar de manera clara en cinco grupos:
- Saturados: Incluyen a los alcanos que son cadenas lineales
(aciclicas) de carbono unidades por enlaces sencillos. Los alcanos son
la familia más numerosa en el petróleo crudo y se conocen como
parafinas.
6
Estos pueden ser lineales o ramificados y su longitud varia de 1 a 40
átomos de carbono, aunque se han logrado detectar cadenas de hasta
de 60 átomos de carbono .Cuando estas cadenas forman estructuras
cíclicas dan lugar a los cicloalcanos o cicloparafinas, los cuales son
componentes minoritarios del petróleo crudo.
- Insaturados: incluyen a los alquenos y alquinos que son cadenas
lineales de C unidas por enlaces dobles y triples.
- Aromáticos: los compuestos aromáticos son derivados del benceno,
ciclos donde los átomos de carbono se unen por medio de enlaces
simples y dobles alternados. Los anillos pueden encontrarse
fusionados entre sí, dando lugar a los compuestos policiclicos
aromáticos (PHA), constituyendo entre si el 10% y 25% del petróleo
crudo y son las fracciones más pesadas.
- Resinas: Agregados con una multitud de grupos del tipo sulfoxido,
amida, tiofenos, piridinas, quinolinas y carbazones.
- Asfáltenos: Esta formados por poliaromaticos, acidos naftalenicos,
sulfuros, compuestos polifenolicos, acidos grasos y metaloporfinas.
Estos son a menudos considerados como no biodegradables o
escasamente biodegradables.
2.3. Microorganismos del suelo.
Para los microorganismos, el suelo no solo aporta la materia
necesaria para la síntesis de sus células, sino que también la energía para sus
actividades vitales. Las características físicas y químicas del suelo, van a
determinar el ambiente en el que se desarrollan los microorganismos.
7
Dichas características afectan la composición de la comunidad
microbiana tanto cuantitativa como cualitativamente (ALEXANDER, 1961).
Cuadro 1. Se presenta una estimación del número de microorganismos
presentes en forma natural en los suelos.
Poblaciones de promedios de microorganismos de suelo superficial
Organismos Valores típicos Extremos
(células /g de suelo) (células /g de suelo)
Bacterias 0.1 - 1 billones > 10 billones
Actinomices 10 - 100 millones 100 millones
Hongos 0.1 - 1 millones 20 millones
Algas 10000 - 100000 3 millones
Subsuelo(células /g de suelo)
Bacterias 1000-10 millones 200 millones
Fuente: Sarubbi (2000).
2.4. Degradación de los hidrocarburos.
Bioquímicamente, la degradación de hidrocarburos por acción
bacteriana se basa, en qué nivel de la cadena respiratoria o transportadora de
electrones de las células, se van a producir una serie de reacciones oxido -
reducción cuyo fin es la obtención de energía. La degradación, altera la
estructura molecular de los compuestos orgánicos y el grado de alteración
determina si se ha producido biotransformación o mineralización.
8
El término biotransformación implica la descomposición de un
compuesto orgánico en otro similar, en tanto que la mineralización involucra una
transformación total de las moléculas orgánicas en dióxido de carbono, agua,
residuos inorgánicos inertes y se incorpora el resto a las estructuras de los
microorganismos. En conclusión, la biotransformación es una degradación
parcial y la mineralización es completa (LAGREGA et al., 1996).
El proceso más básico del metabolismo microbiano, es la
transferencia de electrones desde un sustrato donador hacia un sustrato
receptor. Para la bacteria, el donador de electrones primarios será uno entre
varios compuestos orgánicos contaminantes y los receptores de electrones
primarios normalmente son O2, NO3 - , NO2 - ó CO2 LEVIN y GEALT, (1997).
Así, la cadena la inicia un sustrato orgánico (el hidrocarburo) que es
externo a la célula y que actúa como dador de electrones, de modo que la
actividad metabólica de la célula acaba degradando y consumiendo dicha
sustancia. Son los microorganismos conocidos como quimioorganotróficos los
encargados de utilizar estos compuestos naturales y xenobióticos (órgano-
contaminantes) como fuente de carbono y dadores de electrones para la
generación de energía (BURGOS, 1999).
9
Cuadro 2. Géneros más comunes de Levaduras, Bacterias y Hongos que tienen
la capacidad de degradar Hidrocarburo.
Géneros Bacterias Géneros Hongos
Candida Chomobacterium Micrococus Acremonium Gliocladium
Crytococcues Corynebacterium Mycobacterium Asperigillus Graphium
Endomyces Cytophaga Nocardia Aureobasidium Humicola
Hansenyla Flavobacterium Proteus Beauveria Monilia
Mycotorula Achromobacter Pseudomona Botrytis Mortierela
Pichia Enwinia Sarcina Candida Paecelomyces
Rhodotorula Acinetobacter Serratia Chryisosporium Penecillium
Torulopis Alcaligenes Spirillum Cladosporium Rhodotorula
Trichsporon Arthrobacter Streptomyces Cochlobolus Saccharomyces
Bacillus Vibrio Cylindrocarpon Spicardia
Brevibacterium Xanthomonas Debaryomyces Tolyplocadium
Actinomyces Benecka Fusarium Thrichoderma
Aeromonas Coryneforms Geotrichum Verticillium
Lactobacullus Klebsiella
Moraxella Leumthrix
Spherotilus Peptococcus
Fuente: Maroto (2001).
10
2.4.1. Factores que influyen en la degradación de hidrocarburo.
Uno de los principales problemas de la biodegradación, es que en
presencia de altas concentraciones del contaminante en el suelo, pueden existir
efectos de toxicidad sobre la población microbiana. Los factores ambientales que
influyen en la biodegradación son: temperatura, pH, humedad, nutrientes
(principalmente nitrógeno y fósforo), aceptores de electrones (oxígeno, nitrato,
sulfato) y presencia de microorganismos ROLDAN Y ITURBE (2002).
- Temperatura
Es uno de los factores ambientales más importantes, esta tiene una
gran influencia en la biodegradación por su efecto sobre la naturaleza física y
química del petróleo y sus derivados (PARDO et al., 2004).
A bajas temperaturas la viscosidad de los hidrocarburos aumenta,
la volatilización de alcanos de cadena corta se reduce y disminuye la solubilidad
del O2 en agua, afectando así la biodegradación. Las tasas de degradación
generalmente aumentan cuando la temperatura incrementa (RIOS, 2005).
La temperatura también afecta la actividad metabólica de los
microorganismos y la tasa de biodegradación. Generalmente, las especies
bacterianas crecen a intervalos de temperatura bastante reducidos, entre 18 y
30ºC (condiciones mesófilas),
11
Cuando supera los 40ºC se produce una disminución de la
actividad microbiana, una rotación poblacional hacia especies más resistentes a
las altas temperaturas o puede decrecer la biorremediación debido a la
desnaturalización de enzimas y proteínas de las bacterias (RIOS, 2005). .
Cuando la temperatura está a 0ºC se detiene substancialmente la
biodegradación (GÓMEZ et al., 2008), también se ha dado la biodegradación de
hidrocarburos a temperaturas extremas: a 10ºC en suelos subárticos y
subalpinos, a 5ºC en suelos árticos, a 60ºC por una cepa termófila de Bacillus
stearothermophilus aislada de un suelo contaminado con crudo de petróleo del
desierto kuwaití TORRES Y ZULUAGA , (2009). Los cambios climáticos y de
estaciones, seleccionan de manera natural a las poblaciones de los
microorganismos degradadores de hidrocarburos, los cuales se adaptan a las
temperaturas ambientales (RÍOS, 2005).
- pH
El pH es un factor químico importante que influye en la
recuperación de suelos contaminados por hidrocarburos, ya que determina el
grado de adsorción de iones por las partículas del suelo, afectando así su
solubilidad, movilidad, disponibilidad y sus formas VOLKE Y VELASCO, (2002).
El pH afecta las poblaciones microbianas, por la biodisponibilidad
de fuetes de carbono y energía. A pH extremadamente alcalinos o
extremadamente ácidos la biodegradación se hace lenta. Generalmente los
suelos contaminados por hidrocarburos tienden a ser ácidos, lo cual limita el
crecimiento y la actividad de los microorganismos.
12
El rango óptimo para la biodegradación está entre 6 – 8 unidades
de pH. Sin embargo, para mantener una mejor capacidad degradante, por
periodos de tiempo prolongados, el pH debe ser neutro, entre 7.4–7.8, evitando
al máximo las fluctuaciones (RIOS, 2005).
El pH también tiene efecto en la disponibilidad de nutrientes, debido
a que afecta la solubilidad y estado de los compuestos. La solubilidad del fósforo
se maximiza a pH de 6.5, mientras que el plomo se encuentra menos soluble a
pH de 7 a 8. En general para minimizar el transporte de metales se recomienda
un pH mayor a 6 (RIOS, 2005).
- Humedad
La humedad es un factor importante porque actúa como medio de
transporte de nutrientes y oxígeno a la célula ya que forma parte de su
protoplasma bacteriano, este proceso es necesario para su crecimiento y
desarrollo. Es conveniente mantener una humedad del orden del 20 - 75 % de la
capacidad de campo, la cual se define como la masa de agua que admite el suelo
hasta la saturación (GÓMEZ et al., 2008).
Un exceso de humedad inhibirá el crecimiento bacteriano al reducir
la concentración de oxígeno en el suelo y una poco o nula humedad priva el
intercambio de gases y da como resultado zonas anaeróbicas. Por lo anterior, la
humedad del suelo puede limitar de forma severa la biodegradación (GÓMEZ et
al., 2008).
13
2.5. Bacterias
Son los microorganismos más abundantes y pequeños (0,1 a 1
micras). Pueden ser aerobias (crecen con oxígeno), anaerobias (crecen sin
oxígeno) o facultativas (crecen con o sin oxígeno). Pueden tolerar pH ácido
(acidófilas), pH básico (basófilas) o pH neutro (neutrófilas). En suelos ácidos
algunas bacterias neutrófilas tienen la capacidad de neutralizar el suelo donde
se están desarrollando para cumplir su función. Si las bacterias se alimentan de
compuestos orgánicos son heterótrofas. Si se alimentan de inorgánicos, son
autótrofas (ALEXANDER, 1961).
Las que se desarrollan a temperaturas medias (15 a 40 grados
centígrados) son mesófilas, a temperaturas menores a 15 grados centígrados
son psicrófilas y a temperaturas mayores a 40 grados centígrados son termófilas.
La mayoría de las bacterias del suelo que son importantes para las plantas son
heterótrofas, aerobias y mesófilas. Algunas bacterias producen endósporas y
quistes latentes que les proporcionan resistencia a las variaciones de
temperatura, los niveles extremos de pH y a la desecación del suelo
(ALEXANDER, 1961).
De esta forma pueden crecer de nuevo cuando encuentran
condiciones favorables. Otras se protegen de la depredación y de la desecación
emitiendo una cápsula de sustancias mucoides. Otras se desplazan en la
solución del suelo mediante un flagelo para encontrar más fácilmente el sustrato
alimenticio.
14
Su capacidad de multiplicación les permite crear poblaciones muy
grandes en un tiempo muy corto, colonizando rápidamente los sustratos a
degradar (ALEXANDER, 1961).
La clase y abundancia de bacterias presentes en una fracción de
suelo dependen de los sustratos que la compongan y de sus condiciones (suelo
ácido, con materia orgánica alta, anegado, de sabana, etc). Los grupos
bacterianos que actúan primero sobre los sustratos disponibles son dominantes
hasta que termina su acción y luego dan oportunidad a que otros grupos crezcan
en el residuo del metabolismo de los primeros. Por lo tanto hay grupos
bacterianos que permanecen y otros que entran en latencia hasta que
encuentran condiciones favorables para su crecimiento (ALEXANDER, 1961).
Las bacterias benéficas del suelo son indispensables para
recuperar la estructura perdida por las prácticas agrícolas, para hacer
disponibles los nutrientes que hay en el suelo y para incorporarle la materia
organiza que necesita para mejorar la fertilidad.
Entre los géneros bacterianos más importantes agrícolamente por
la transformación de los compuestos orgánicos e inorgánicos y que favorecen la
nutrición de las plantas están: Bacillus, Pseudomonas, Azotobacter,
Azospirillum, Beijerinckia, Nitrosomonas, Nitrobacter, Clostridium, Thiobacillus,
Lactobacillus, y Rhyzobium (ALEXANDER, 1961) .
15
2.6. Actinomicetos del suelo
Son microorganismos que se parecen a los hongos y a las bacterias.
Crecen a manera de micelio radial, forman conidias como los hongos pero las
características morfológicas de sus células son similares a las de las bacterias.
Se encuentran en el suelo, las aguas estancadas, el lodo y los materiales
orgánicos en degradación. Se nutren de materiales orgánicos (heterótrofos).
Degradan desde azúcares simples, proteínas, ácidos orgánicos hasta substratos
muy complejos compuestos por hemicelulosas, ligninas, quitinas y parafinas. Por
esto son importantes en el proceso de transformación hasta la obtención del
humus en el suelo. Además son considerados como los mejores agregadores
del suelo, pues son muy eficientes produciendo sustancias húmicas
(ALEXANDER, 1961).
En suelos bien aireados con alto contenido de materia orgánica
alcanzan poblaciones muy altas. Constituyen del 10 al 50% de la comunidad
microbiana del suelo. Se desarrollan bien en suelos con pH desde 5 hasta 7. Se
reproducen por conidias y estas son resistentes a condiciones difíciles de
temperatura, acidez y humedad. Esto les permite germinar cuando se
restablecen las condiciones favorables para su desarrollo (ALEXANDER, 1961).
En suelos secos los actinomicetos se comportan muy bien.
Algunos actinomicetos producen antibióticos que regulan los patógenos de las
plantas que están en el suelo. Al agregar conidias de actinomicetos en un suelo
contaminado con bacterias y hongos fitopatógenos, crecen inhibiendo las
16
poblaciones de los patógenos, regulando los problemas hasta alcanzar un
balance que le permita a las plantas obtener nutrientes y desarrollarse.
Los géneros de actinomicetos del suelo más importantes para la
nutrición de las plantas son: Streptomyces, Nocardia,
Micromonospora,Thermoactinomices, Frankia y Actinomyces.
2.7. Hongos del suelo
Conforman una importante fracción de la biomasa total microbiana
del suelo. Crecen en forma de red extendiéndose como micelio hasta su estado
reproductivo donde dan origen a esporas sexuales o asexuales.
Son importantes degradadores aerobios de material vegetal en
descomposición en suelos ácidos. Producen enzimas y metabolitos que
contribuyen al ablandamiento y a la transformación de sustancias orgánicas.
También estas enzimas forman parte de la actividad de otros microorganismos
(ALEXANDER, 1961).
Los hongos metabolizan compuestos carbonados de muy difícil
degradación como las celulosas, las hemicelulosas y las ligninas. También
degradan azúcares simples, alcoholes, aminoácidos y ácidos nucleicos.
Pueden ser parásitos o saprofiticos. Son muy importantes en
suelos con desechos de cosecha. Su crecimiento ramificado rápido y la intensa
actividad degradadora les permiten mantener un equilibrio en los ecosistemas
del suelo.
17
Los hongos movilizan nutrientes minerales hacia las raíces de las
plantas, aumentan la capacidad de retener agua en sequía, fijan nitrógeno y
fósforo y protegen las raíces de Fito patógenos por espacio y emitiendo
sustancias que los inhiben. Los hongos son muy activos en las plantas y
prefieren los azúcares que estas segregan por las raíces. También toman
aminoácidos. Algunos hongos entran en simbiosis con las raíces llamadas
micorrizas (ALEXANDER, 1961).
Son más activos en suelos arenosos y pobres en materia orgánica.
La simbiosis se ve favorecida por la pobreza mineral del suelo. Los géneros de
hongos más importantes asociados a las raíces de las plantas son Aspergillus,
Penicillium, Rhizopus y Trichoderma.
El Aspergillus y el Penicillium movilizan el fósforo y el nitrógeno del
suelo. El Trichoderma sostiene la humedad en las raíces en condiciones de
sequía. Algunas levaduras son importantes fermentadoras de carbohidratos
produciendo alcoholes que son utilizados por otros microorganismos como
fuentes de energía. Entre los géneros más importantes están el Saccharomyces
y el Rhodotorula (ALEXANDER, 1961).
18
III. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. Ubicación
3.1.1. Ubicación política
El trabajo se desarrolló en las instalaciones del laboratorio de
Microbiología, de la Universidad Nacional Agraria de la Selva, políticamente
ubicado en la ciudad de Tingo María, distrito de Rupa Rupa, provincia de Leoncio
Prado, Región Huánuco.
Figura 1. Mapa de Ubicación de la UNAS
Fuente: Elaboración propia.
19
3.1.2. Ubicación geográfica
Geográficamente el laboratorio de Microbiología General está
ubicado en las coordenadas UTM (E: 390552 m. y N: 8970269 m.); a una altitud
de 668 m.s.n.m dentro del empalme Tingo María hoja 19-k de la Carta Nacional
del Instituto Geográfico Nacional, correspondiente a la Región Selva, a la cual
se accede por vía terrestre, por la carretera afirmada de Lima a Tingo María.
3.1.3. Aspectos ambientales
Ecológicamente de acuerdo a la clasificación de zonas de vida o
formaciones vegetales del mundo y el diagrama bioclimático de HOLDRIDGE
(1982), Tingo María se encuentra en la formación vegetal bosque muy húmedo
Pre-montano Tropical bmh-PT, y de acuerdo a las regiones naturales del Perú
corresponde a Rupa Rupa o Selva Alta. Hidrográficamente pertenece a la cuenca
del río Huallaga; el comportamiento climático es variable, con una precipitación
anual promedio de 3328.9 mm. Las mayores precipitaciones se producen entre
los meses de septiembre a abril y alcanza un máximo extremo en el mes de
febrero con un promedio mensual de 608.4 mm.
20
En los últimos años se han registrado los siguientes datos
climatológicos relacionados con el proyecto (Estación meteorológica José
Abelardo Quiñones, 2010).
Temperatura máxima : 30,70 º C
Temperatura mínima : 18,90 º C
Temperatura promedio : 24,90 º C
Humedad relativa promedio : 86 %
Velocidad del viento máxima : 22,2 m/s
3.2. Materiales
3.2.1. Medios de cultivo
- Agar cistina-lactosa deficiente en electrolitos (CLED)
- Agar MacConkey
- Agar Plate count
- Agar M77
- Agar Manitol salado
- Agar Saburound
- Caldo peptona
- Actinomicetos
- Caldo peptona 0.1%(indol)
- Caldo rojo de metilo(RM)
- Caldo Voges-Proskauer (VP)
- Caldo Malonato
- Agar hierro-triple azúcar (TSI)
21
- Agar lisina hierro (LIA)
- Agar Citrato de Simmons
- Agar SIM
- Agar Urea.
3.2.2. Reactivos
- Reactivo del Indol según Kovacs
- Rojo de metilo
- Hidróxido de sodio al 4% (NaOH)
- Alfanaftol
- Azul lacto glicerol.
3.2.3. Materiales de laboratorio
- Matraces Erlenmeyer
- Placas Petri
- Tubos de ensayo
- Termómetro
- Algodón
- Pipetas
- pinzas
- Varillas de vidrio
- Porta objetos
- Cubre objetos
- Gradillas para tubos de ensayo
- Mechero de Bunsen
22
- Asa de siembra
- Anza micológica
- Espátulas
- Papel mantequilla
3.2.4. Equipos
- Baño maría
- Autoclave
- Estufas
- Balanza
- Microscopio
- Contador de colonias
- Termómetro
3.3. Metodología
3.3.1. Puntos de Muestreo
Se realizaron dos muestreos, el primero tuvo lugar el 25 de enero y el segundo
muestreo se realizó el 23 de febrero, teniendo como puntos de muestreos los
siguientes Grifos.
23
Cuadro 3. Puntos seleccionados para la colecta microbiológica.
Lugar de muestreo Coordenadas geográficas Altitud
(m.s.n.m.) E N
Grifo Thedi 388263 8990823 585
Grifo Torito 378273 8890943 587
Grifo Shelton 388232 8890854 589
Grifo Angelita 378237 8890956 578
Fuente: Elaboración propia.
3.3.2. Selección y Toma de muestras para evaluación
Según el MINAM (2014) se realizó el muestreo para tomas superficiales como
primer paso se realizó la limpieza cuidadosamente el área a muestrear de
cualquier desecho o escombro superficial (ramas, piedras, residuos, etc.) se
extrajo 300 gr de muestras de hoyos de 0 a 10 cm de profundidad, la muestra se
pusieron en en bolsas de primer uso, rotulado, que fue trasladado al laboratorio
para su respectivo secado al aire libre y análisis.
24
3.3.3. Determinación de parámetros fisicoquímicos influyente en el
desarrollo de los microorganismos en suelos contaminados
con hidrocarburo de la Chancadora y Santa Rosa.
3.3.3.1. Determinación de la T(°C)
Para la medición de la temperatura, se introdujo el termómetro digital en forma
vertical a 6 cm de la superficie del suelo.
3.3.3.2. Determinación del pH
Según ZUMDAHL (1992) para lo cual se pesaron 10 g de la muestra
de suelo y se le agregaron 25 ml de agua. Luego las muestras se agitaron 3
veces a intervalos de 15 minutos, posteriormente se dejaron reposar luego con
el indicador universal una tira de papel se proseguío a medir el pH.
3.3.3.3. Determinación de la Humedad
Estos parámetros se han determinado según el procedimiento
descrito por la US Department of Agriculture and Council en el 2001 citado por
BARRENA (2006):
- Se pesó en un crisol de porcelana previamente tarado (T) en una
balanza de precisión (± 0.0001 g) la muestra húmeda (P0).
- Se secó la muestra en la estufa a 105°C al menos 18 horas, hasta que
su peso sea constante. Sacar la muestra de la estufa, dejar enfriar en
el desecador y pesar (Pf).
- Se determinó el porcentaje en humedad (%H) según la ecuación
respectivamente.
25
%𝐻 = (𝑃𝑜−𝑃𝑓)
𝑃𝑜 × 100…………ecuación (1)
3.3.4. Determinación de la concentración celular de microorganismos
presentes en suelos contaminados por hidrocarburo.
Según LOPEZ (1990) para el recuento de microorganismos se
realizó el método de Recuento en placa, para ello se prepararon cuatro matraces
conteniendo cada uno caldo peptona al 1% , luego se pesa 10 gr de suelo se
diluye en los caldos peptonas se filtra después de haber sido incubado por 48
horas se retira con una pipeta 10 mL, los cuales obedeciendo al método de
“diluciones seriadas”, se adicionan a su respectivo matraz con caldo peptona (10-
1); se homogeniza el resultado para luego realizar dos diluciones más, sacando
1 mL de la muestra y adicionándolo a un tubo de ensayo con 9 mL de caldo
peptona (10-2), se homogeniza y se repite el procedimiento (10-3), de ésta última
dilución, se realiza el método de “placa vertida”, para el cual se retira 1 mL de la
última dilución.
Se vierte en una placa petri vacía y esterilizada para luego agregar
10 mL de agar Plate Count más un 1 gr de manitol salado,Agar Saboroun y
Actinomicetos se deja solidificar por unos 10 minutos para posteriormente llevar
las placas a la estufa a 37 ºC por 48 horas. Después de este tiempo se puede
realizar el conteo de microorganismos utilizando el contador de colonias manual.
La fórmula para el conteo de microorganismos (M.O.) es la siguiente:
“M.O. = Nº colonias × Inóculo × Factor de dilución”
26
3.3.5. Identificación géneros microbianos preponderantes en suelos
contaminados con hidrocarburo de la localidad de la
Chancadora y Santa Rosa.
Según LOPEZ (1990) se pesó 10 g de la muestra de suelo,
adicionamos en caldo peptonado al 0.1% luego se filtró se sacara 10 ml para las
diluciones 10-1, 10-2, 10-3, de la última dilución (10-3), se sembró en agar M77,
Agar Manitol salado, Agar Cleed, Agar Macconkey, dejamos incubar a
temperatura 37°C y el M77 incubar a T° ambiente por 24 - 48 horas.
3.3.5.1. Diferenciación Bioquímica
Según LOPEZ (1990) de todas las colonias que se aislaron en el
medio M77, Cleed, Macconkey, Manitol salado se cogerá una sola colonia con
el ansa de siembra, se sembró en todos con medios de cultivo diferenciales,
dejamos incubar a 37°C por 48 horas.
Después de haber incubado las placas Petri para el crecimiento de bacterias, se
realizaron las pruebas bioquímicas:
- Indol: Se vierte aproximadamente 9 mL de caldo peptona al 0.1% a
un tubo de ensayo, se realiza la siembra de bacterias con el anza de
siembra por el método de enjuague. Se incuba por 48 horas, para la
determinación se usa el reactivo de Kovacs, de 2 – 3 gotas.
- Rojo de metilo: Se utiliza el caldo rojo de metilo y voges-proskauer
(RMVP), aproximadamente 9 mL en cada tubo de ensayo, se siembra
mediante el método de enjuague; se incuba por 48 horas y como
reactivo se adiciona el rojo de metilo de 2 -3 gotas.
27
- Voges-Proskauer: Se vierte en el tubo de ensayo el caldo RMVP, se
siembra mediante el método de enjuague y se incuba por 48 horas;
como reactivo se utiliza hidróxido de sodio (NaOH) al 4% de 2 - 3 gotas
y se adiciona el reactivo de alfa naftol de 2 – 3 gotas.
- TSI: Se vierte el agar a 45 ºC hasta la tercera parte de los tubos de
ensayo, se deja enfriar en pico de flauta, luego se siembra con puntura
y estrías, se incuba a 37 ºC por 48 horas; el tipo de reacción positivo
o negativo se conoce por el cambio de color.
- LIA: Se vierte el agar a los tubos de ensayo a una temperatura de 45
º C y se deja enfriar en pico de flauta, para proceder a sembrar la
colonia de bacteria seleccionada mediante el método de puntura y
estrías; la reacción se muestra mediante el cambio de color.
- Citrato de Simmons: Se vierte el agar en los tubos de ensayo y se
deja enfriar en modo inclinado para luego sembrar por el método de
estrías. Pasada las 48 horas de incubación, el cambio a color azul
indica reacción positiva.
- Caldo Malonato: Se vierte el caldo en los tubos de ensayo y se realiza
la siembra por el método de enjuague, después de incubar por 48
horas se observa si hubo o no reacción, es positivo si cambia a color
azul.
- Úrea: Se distribuye el agar en tubos de ensayo, se siembra la colonia
de bacterias por el método de puntura, al cabo de las 48 horas el
cambio de color nos dirá si hubo reacción positiva.
28
Y leemos los resultados, agregamos reactivos de confirmación a los
tubos que corresponda y observar el cambio de color.
- Prueba de indol. Se agregara 3 o más gotas del reactivo de kovac al
tubo con caldo peptona. Si da un anillo rojo es positivo a indol
(metabolitos proteicos), anillo anaranjado negativo al indol.
- Prueba de rojo de metilo (RM). Se agregara 2 a 3 gotas de colorante
rojo de metilo a uno de los tubos con caldo MRVP, si da color rojo es
positivo a rojo de metilo, si da color anaranjado es negativo a rojo de
metilo.
- Prueba de voges pros kauer (VP). Al otro tubo con caldo MRVP se
agregara 2 a 3 gotas de K OH al 4% luego se añadió gotas de reactivo
alfa naftol se espera entre 10 a 20 minutos. Una coloración rosada nos
indica positivo a VP, coloración amarilla nos indica negativo a VP.
Luego para las otras pruebas de citrato TSI, LIA, Urea, se observaron
el viraje de color de cada prueba, para observar con una tabla de
pruebas bioquímicas la especie o genero de cada microorganismo.
- Prueba TSI: Degradación de los tres azucares (Lactosa, Glucosa y
Sacarosa).
K= Alcalino
A= Acido
K/A: La bacteria ha degradado sacarosa y glucosa.
A/A: La bacteria ha consumido los tres azucare +H2S+gas.
A/K: bacterias anaerobias.
R/K: No hay reacción.
29
- Prueba de LIA:(Lisina descarboscilasa).se observa desaminacion
descarboxilacion
K= Alcalino
A= Acido
K/K: No reacción.
K/A: Diseminación de lisina.
A/K: Diseminación de lisina.
A/A: Diseminación de lisina +H2S+gas.
- Prueba de Citrato de Simón: Cuando la bacteria utiliza como fuente
de carbono al citrato el medio se alcaliniza sube su pH a 6.8 – 7.4 y da
un color azul (positivo) y verde (negativo).
- Prueba caldo Malonato: Cuando la bacteria utiliza como una única
fuente de carbono el malonato de sodio este medio se alcaliniza sobre
pH a 6.8 – 7.4 y da un color azul (positivo) y verde (negativo).
- Prueba de Urea: Cuando la bacteria utiliza como una única fuente de
carbono la ureasa este medio se alcaliniza sobre pH a 6.8 – 6.9 fucsia
con un Ph 7.8 (positivo) y si da un color rosado pálido (negativo) .
- Prueba SIM: Se adiciona 2-3 gotas de reactivo kovacs si la bacteria
utiliza como fuente de carbano da un anillo color rojo indol (positivo) y
si no reacciona (negativo).
3.3.5.2. Coloración
Según LOPEZ (1990) se tomó una pequeña muestra de la cepa y
diluirla en el portaobjetos. Posteriormente se fija la muestra al calor flameándola
en el mechero, cuidando no quemar la muestra.
30
- Colocar el portaobjetos sobre un soporte, cubre la muestra con cristal
violeta y esperar que transcurra 1 minuto. Escurrir y enjuagar.
- Luego cubrir la muestra con solución de lugol y esperar que transcurra
1 minuto. Escurrir y enjuagar.
- Cubrir la muestra con alcohol cetona y esperar que transcurran 5
segundos. Escurrir y enjuagar.
- Cubrir la muestra con safranina, y esperar que transcurra 1 minuto.
Escurrir y enjuagar.
- Dejar secar la muestra. Agregar una gota de aceite de inmersión y
observar en el microscopio a 100x.
-
3.3.5.3. Identificación de mohos y levaduras (fungí)
- Aislamiento de microorganismos mohos y levaduras
Según LOPEZ (1990) se pesó 10 g de la muestra de suelo seco
tamizado, se reparte en un diluyente que contiene 90 mL de caldo peptonado al
0.1% luego se filtra y se reparte en diluciones con tubos de ensayos con 9 ml
hasta la dilución 10-3 y de la última dilución se reparte 1 ml de inoculo y se coloca
en una placa Petri esterilizado vacía y luego se adiciona en medios de agar,
Sabouraud glucosado al 4% más antibiótico y dejar que se sodifique, incubar a
temperatura ambiente de 3 - 8 días.
31
- Micro cultivó de hongos
Según LOPEZ (1990) se realizó micro cultivos, los materiales que
utilizamos, una placa Petri conteniendo un soporte de vidrio en forma de U con
un porta y cubre objeto todo esterilizado un día antes (esto es la placa de micro
cultivo), luego se utilizara placas Petri con medio agar de Saboraud mas
antibiótico (ceftrioxona de 1g).
para hacer cubitos divididos 20 x 20 x 10 mm que cada cubito se
colocó sobre el portaobjeto dentro de la placa del micro cultivo, ( el espesor del
medio depositado dentro de la placa de micro cultivo no debe ser mayor de 10
mm), luego se procedió a elegir una colonia de la muestra aislada por cada placa
de micro cultivo, con la ayuda de un ansa micológica, tomamos un inoculo y lo
trasladamos sobre el cubito del medio de Saboraud que se ha colocado en el
porta objeto dentro de la placa del micro cultivo colocamos el cubre objeto sobre
el cubito y colocamos un algodón húmedo, dejamos en incubación por un periodo
de 10 días a temperatura ambiente y diariamente verificar si el algodón está
húmedo.
32
- Coloración de hongos
Según LOPEZ (1990) pasado los 10 días de incubación retirar
suavemente con ayuda de una pinza el cubre objeto de la placa de micro cultivo
y colocarlo sobre un porta objeto limpio y esterilizado y se coloca 3 a 4 gotas de
azul de AMANN luego con papel secante, se absorbe el exceso de colorante
sellamos los lados laterales con esmalte de uñas transparente, el cubito sacamos
del medio y llevamos a un recipiente con solución sulfocrómica, retiramos el porta
objeto de la placa de micro cultivo y agregamos 3 gotas de azul de AMANN,
añadimos un cubre objeto limpio y sellamos con el esmalte transparente de uñas
y llevamos al microscopio.
33
V. RESULTADOS
5.1. Identificación los parámetros influyentes en el desarrollo de los
microorganismos en suelos contaminados por hidrocarburo en la
localidad de la Chancadora y Santa Rosa.
5.1.1. Datos obtenidos de la evaluación de T, pH y humedad en
el primer muestreo.
En el cuadro 4 se observa los valores medidos de los parámetros
fisicoquímicos como son la T°C, pH y H% en el primer muestreo en suelos
contaminados con hidrocarburo.
Cuadro 4. Parámetros influyentes en el desarrollo de los microorganismos para
el Primer muestreo y segundo muestreo.
Fuente: Elaboración propia.
Primer muestreo Segundo muestreo Promedio
Zona de muestreo pH T(°C) H (%) pH T(°C) H (%) pH T(°C) H (%)
Grifo Tedhi 5 27.5 25.4 5 27.7 25.1 5 27.6 25.25
Grifo Torito 5 27.8 26.8 5 27.8 26.7 5 27.8 26.75
Grifo Shelton 5 27.5 24.5 5 27.1 25.4 5 27.3 24.95
Grifo Angelita 5 27.2 25.8 5 27.3 25.3 5 27.25 25.55
34
Figura 2. Datos del pH para el primer muestreo y segundo muestreo.
En la figura 2 se observa los datos del primer muestreo y segundo
muestreo para ambos un valor de 5.
Grifo Tedhi Grifo Torito Grifo Shelton Grifo Angelita
Primer muetreo 5 5 5 5
Segundo muestreo 5 5 5 5
0
1
2
3
4
5
6
pH
Grifo Tedhi Grifo Torito Grifo Shelton Grifo Angelita
Primer muestreo 27.5 27.8 27.5 27.2
Segundo muestreo 27.7 27.8 27.1 27.3
26.6
26.8
27
27.2
27.4
27.6
27.8
28
T°(C
)
35
Figura 3. Datos de la Temperatura para el primer muestreo y segundo
muestreo.
En la figura 3 se observa los datos del primer muestreo obteniendo
el máximo en el grifo Torito de 27.8°C y el mínimo en el grifo Angelita de 27.2°C
y para el segundo muestreo obteniendo el máximo en el grifo Torito de 27.8°C y
el mínimo en el grifo Shelton de 27.1°C
Figura 4. Datos de la H (%) para el primer muestreo y segundo muestreo.
En la figura 3 se observa los datos del primer muestreo obteniendo
el máximo en el grifo Torito de 26.8% y el mínimo en el grifo Shelton de 24.5%y
para el segundo muestreo obteniendo el máximo en el grifo Torito de 26.7% y el
mínimo en el grifo Thedy de 25.1%
Grifo Tedhi Grifo Torito Grifo Shelton Grifo Angelita
Primer muetreo 25.4 26.8 24.5 25.8
Segundo muestreo 25.1 26.7 25.4 25.3
23
23.5
24
24.5
25
25.5
26
26.5
27
H%
36
5.2. Determinación de la concentración celular de microorganismos
presentes en suelos contaminados por hidrocarburo en la localidad
de la Chancadora y Santa Rosa.
5.2.1. Concentración celular de microorganismos en bacterias en
suelos contaminados con hidrocarburo.
En el cuadro 5 se observa la concentración celular de
microorganismos en bacteria en el primer y segundo muestreo y promediado
para la obtención de un único resultado.
Cuadro 5.Concentración celular de microorganismos en bacterias.
Zona de
muestreo
Nº de microorganismos Promedio del
número de UFC.
1º muestreo 2º muestreo
Grifo Thedi 155x103 UFC/gr 167 x 103UFC/gr 161x 103UFC/gr
Grifo Torito 157x103 UFC/gr 145x 103UFC/gr 151x 103 UFC/gr
Grifo Shelton 200x103 UFC/gr 210x 103UFC/gr 205x 103 UFC/gr
Grifo angelita 175 x103UFC/gr 155 x 103UFC/gr 165 x 103 UFC/gr
Fuente: Elaboración propia.
37
Figura 5. Promedio de Concentración celular de microorganismos en
bacterias.
En la figura 5 se observa el promedio de las concentraciones
celulares de bacterias en los dos muestreos, en donde también se observa que
en el grifo Shelton con 205x103 UFC/gr con mayor concentración y el de menor
concentración fue el grifo Torito con 151x103 UFC/gr.
Grifo Thedi Grifo Torito Grifo Shelton Grifo angelita
Series1 161 151 205 165
0
50
100
150
200
250N
°d
e U
FC/g
r en
bac
teri
as
38
5.2.2. Concentración celular de microorganismos en Actinomicetos
en suelos contaminados con hidrocarburo.
En el cuadro 6 se observa la concentración celular de
microorganismos en Actinomicetos en el primer y segundo muestreo y
promediado para la obtención de un único resultado.
Cuadro 6. Concentración celular de microorganismos en Actinomicetos.
Zona de
muestreo
Nº de microorganismos Promedio del
número de UFC
1º muestreo 2º muestreo
Grifo Thedi 340x103UFC/gr 290 x 103UFC/gr 315x 103UFC/gr
Grifo Torito 360x103UFC/gr 378x 103UFC/gr 369 x 103 UFC/gr
Grifo Shelton 320x103UFC/gr 350 x 103UFC/gr 335x 103UFC/gr
Grifo angelita 280x103UFC/gr 310x 103UFC/gr 345 x 103UFC/gr
Fuente: Elaboración propia.
39
Figura 6. Promedio de la concentración celular de microorganismos en
Actinomicetos.
En la figura 6 se observa el promedio de las concentraciones
celulares de bacterias en los dos muestreos, en donde también se observa que
en el grifo Torito con 369x103 UFC/gr con mayor concentración y el de menor
concentración fue el grifo Thedy con 315x103 UFC/gr.
Grifo Thedi Grifo Torito Grifo Shelton Grifo angelita
Series1 315 369 335 345
280
290
300
310
320
330
340
350
360
370
380
N°
de
UFC
/gr
en A
ctin
om
ycet
os
40
5.2.3. Concentración celular de microorganismos en hongos en
suelos contaminados con hidrocarburo.
En el cuadro 7 se observa la concentración celular de
microorganismos en hongos en el primer y segundo muestreo y promediado para
la obtención de un único resultado.
Cuadro 7. Concentración celular de microorganismos en hongos.
Zona de
muestreo
Nº de microorganismos Promedio del
número de UFC/gr
1º muestreo 2º muestreo
Grifo Thedi 22x103UFC/gr 32x 103UFC/gr 27x 103UFC/gr
Grifo Torito 18x103UFC/gr 26x 103UFC/gr 22x 103UFC/gr
Grifo Shelton 12x103UFC/gr 16x 103UFC/gr 14x 103UFC/gr
Grifo angelita 14 x103UFC/gr 20 x 103UFC/gr 12 x 103UFC/gr
Fuente: Elaboración propia.
41
Fuente: Elaboración propia.
Grafica 7. Promedio de la concentración celular de microorganismos
en Hongos.
En la figura 7 se observa el promedio de las concentraciones
celulares de bacterias en los dos muestreos, en donde también se observa que
en el grifo Shelton con 27x103 UFC/gr con mayor concentración y el de menor
concentración fue el grifo Torito con 12 x103 UFC/gr.
Grifo Thedi Grifo Torito Grifo Shelton Grifo angelita
Series1 27 22 14 12
0
5
10
15
20
25
30N
°D
E U
FC/g
r d
e H
on
gos
42
5.3. Identificación géneros microbianos preponderantes en suelos
contaminados con hidrocarburo de la localidad de la Chancadora y
Santa Rosa.
5.3.1. Reconociendo de Bacterias.
En el cuadro 8 muestra las especies identificadas en el primer y segundo
muestreo en suelos contaminados con hidrocarburo.
Cuadro 8. Reconocimiento de bacterias para el primer muestreo y segundo
muestreo.
Grifo Primer muestreo Segundo muestreo
Citrobacter sp Citrobacter sp
Grifo Thedi Pseudomona sp Pseudomona sp
Actinomyces sp Actinomyces sp
Stafilococcos sp Stafilococcos sp
Echerichia coli
Bacillus sp Bacillus sp
Grifo Torito Citrobacter sp Citrobater sp
Actinomyces sp Actinomyces sp
Stafilococcos sp Stafilococcos sp
Pseudomona sp Pseudomona sp
Echerichia coli
Bacillus sp Bacillus sp
Grifo Shelton Citrobacter sp Cittrobacter sp
43
Pseudomona sp Pseudomona sp
Actinomyces sp Actinomyces sp
Stafilococcos sp Stafilococcos sp
Bacillus sp Bacillus sp
Grifo Angelita Citrobacter sp Citrobacter sp
Pseudomona sp Pseudomon sp
Actinomyces sp Actinomyces sp
Stafilococcos sp Stafilococcos sp
Bacillus sp Bacillus sp
Fuente: Elaboracion propia.
44
4.1. Reconocimiento de hongos
En el cuadro 9 muestra las especies identificadas en el primer y segundo
muestreo en suelos contaminados con hidrocarburo.
Cuadro 9. Especies de hongos encontradas en suelos contaminados con
Hidrocarburo.
Lugar de muestreo Primer muestreo Segundo muestreo
Grifo Thedi Geotrichum sp Geotrichum sp
Aspergillus sp Aspergillus sp
Rhizopus sp Rhizopus sp
Grifo Torito Rhizopus sp Rhizopus sp
Geotrichum sp Geotrichum sp
Aspergillus sp Aspergillus sp
Grifo Shelton Rhizopus sp Rhizopus sp
Geotrichum sp Geotrichum sp
Aspergillus sp spergillus sp
Rhizopus sp Rhizopus sp
Grifo Angelita Geotrichum sp Geotrichum sp
Aspergillus sp Aspergillus sp
Fuente: Elaboracion propia.
45
V. DISCUSIÓN
5.1. Parámetros físicos del suelo
5.1.1. Temperatura
Según RIOS (2005) la temperatura es uno de los factores que afecta
la actividad metabólica de los microorganismos y la tasa de biodegradación.
Generalmente, las especies bacterianas crecen a intervalos de temperatura
bastante reducidos, entre 18 y 30ºC (condiciones mesófilas), Cuando supera los
40ºC se produce una disminución de la actividad microbiana, una rotación
poblacional hacia especies más resistentes a las altas temperaturas o puede
decrecer la biorremediación debido a la desnaturalización de enzimas y
proteínas de las bacterias. En la practica la temperatura promedio oscilo 27.2 °C
para el grifo Angelita, para el grito Shelton 27.3 °C y grifo Thedy 27.6 °C y 27.8°C
para el grifo Torito promedio como se muestra en el cuadro 6 lo cual los cuatro
puntos de muestreo estarían cumpliendo con lo que menciona el autor .Así
mismo los resultados obtenidos con relación a la temperatura indican
características del lugar de donde provienen estos microorganismos. Es
necesario recordar que el suelo de donde se aislaron los microorganismos se
encuentra ubicado en la región Amazónica por lo que es posible encontrar en la
clasificación general que la mayoría de microorganismos son mesofilas
soportando temperaturas de 18 a 30°C.
46
Estos microorganismos podrían ser utilizadas potencialmente en
otros lugares en donde existen sitios para biorremediacion en la región
Amazónica y Sierra debido a los rangos de crecimiento.
5.1.2. pH
Según RÍOS (2005) el rango óptimo para la biodegradación está
entre 6 - 8 unidades de pH. Sin embargo, para mantener una mejor capacidad
degradante, por periodos de tiempo prolongados, el pH debe ser neutro, entre
7.4 - 7.8, Según MADIGAN et al., (1999) muchos de los microorganismos
bioremediadores de hidrocarburos nativos del suelo, funcionan óptimamente a
un pH ácido cercano a 5 obteniendo estos valores en los cuatro puntos de
muestreos. Esta disminución se atribuye a la descomposición de la materia
orgánica como la contaminación por hidrocarburo también constituye la materia
orgánica MARTINEZ y LOPEZ (2001) mencionan que la materia orgánica puede
incrementar como consecuencia de la suma de materia orgánica (biogénica) y la
aportada por los hidrocarburos (patogénicos), a través de la digestión de
bacterias y hongos, generando ácidos húmicos los cuales serían responsables
por la disminución del pH. HACHICHA et al., (2008).
5.1.3. Humedad
Según GÓMEZ et al., (2008). Es conveniente mantener una
humedad del orden del 20 - 75 % de la capacidad de campo, la cual se define
como la masa de agua que admite el suelo hasta la saturación. Un exceso de
humedad inhibirá el crecimiento bacteriano al reducir la concentración de
oxígeno en el suelo y una poco o nula humedad priva el intercambio de gases y
47
da como resultado zonas anaeróbicas. Por lo anterior, la humedad del suelo
puede limitar de forma severa la biodegradación TORRES Y ZULUAGA, (2009).
La humedad es un factor importante porque actúa como medio de
transporte de nutrientes y oxígeno a la célula ya que forma parte de su
protoplasma bacteriano, este proceso es necesario para su crecimiento y
desarrollo en la práctica la humedad promedio oscilo en el grifo Shelton 24.95%
,grifo Thedi 25.25 %,grifo Angelita 25.55 % y grifo Torito 26.75 % promedio
cómo se muestran el cuadro 6 los cuales están dentro de los valores establecidos
según el autor mencionado y estaría cumpliendo con condiciones necesarias
para que se dé el proceso de remediación una influencia en los valores de
humedad fue que el muestreo se realizó en temporada de verano para obtener
valores bajos de humedad .
5.2. Concentración celular de microorganismos
Según HATTORI (1973) las bacterias presentan una distribución
poblacional de tipo vertical en el perfil del suelo y GRANT (1981) indica que en
todos los suelos el mayor número de microorganismos se encuentra en el estrato
superior del suelo, que corresponde a la zona más rica en materia orgánica y
humus.
Según el EPA (2003) la densidad de microorganismos en el suelo
es un factor primordial en el proceso de biorremediación. Se requiere una
concentración mayor de 1x103 UFC/gr para que se alcance una aceptable
actividad biodegradativa por los microorganismos. En ecosistemas no
contaminados las comunidades degradadoras de hidrocarburos constituyen
48
menos del 0.1% y en ecosistemas contaminados forman el 85% de
microorganismos viables, estas diferencias se dan por el grado de exposición y
por la adaptabilidad de los microorganismos a los hidrocarburos del ambiente
(LEVIN Y GEALT, 1997) en la práctica los valores de concentración obtenidos
en bacterias en el grifo Shelton 205 x 103 UFC/gr,grifo Angelita 165 x 103
UFC/gr,grifo Thedy 161 x 103 UFC/gr y grifo Torito 151 x 103 UFC/gr encontrando
una mayor concentración en el grifo torito y eso se debe a que hay una mayor
biodisponibilidad de hidrocarburo lo que hace a haygue una mayor concentración
en Actinomicetos grifo Torito 369 x 103 UFC/gr,grifo Shelton 335 x 103
UFC/gr,grifo Angelita 345 x 103 UFC/gr y grifo Thedy 151 x 103 UFC/gr y por
último en hongos grifo Thedi 27x 103 UFC/gr,grifo Torito 22x 103 UFC/gr,grifo
Shelton 14 x 103 UFC/gr y grifo Angelita 12x 103 UFC/gr cumpliendo con lo que
menciona este autor.
Con las concentraciones encontradas se pordria decir teoricamente
que en casi todos los ambientes del planeta existen microorganismos capaces
de degradar hidrocarburos a formas menos tóxicas y emplearlos como fuente de
carbono (PARRISH et al. 1999 citado por FONTURBEL y ACHA, 2000) lo que
explica su presencia y aumento poblacional en ambientes contaminados luego
de tiempo de exposición. Teóricamente, si estos microorganismos tienen la
capacidad de sobrevivir en ese ambiente, pueden llegar a degradar aquellos
compuestos sin mayor inconveniente. (BURGOS, 1999), por lo que no se
descarta que la población bacteriana presente en aquellos suelos con problemas
de contaminación por hidrocarburo presenten la capacidad de degradar dicho
hidrocarburo.
49
5.3. Determinación de géneros preponderantes
Actualmente, numerosos géneros bacterianos han sido descritos
como degradadores de hidrocarburos, a partir de procesos de biorremediación
se ha identificado microorganismos tolerantes y con capacidad de degradación,
a partir de sitios contaminados, como es el caso de Pseudomonas sp.
Citrobacter sp, Actinomyces sp, Stafilococcos sp, Bacillus sp y Echerichia coli
todos estos generos identificados durante la práctica y que encuentran en el
cuadro 2, los cuales son Géneros más comunes de Bacterias que tienen la
capacidad de degradar Hidrocarburo según Maroto (2001).
Asi como también se identificaron géneros de hongos entre los
cuales se destacan se han realizado diversas investigaciones en las cuales se
reporta el aislamiento de microorganismos a partir de suelos impactados por
derivados del petróleo. WEMEDO et al., (2002), en Nigeria, aislaron de suelo
contaminado con kerosene los géneros de hongos como el género Rhizopus.
Otros estudios realizados en Egipto encontraron en suelos contaminados con
kerosén y/o benceno, los hongos Aspergillus (HEMIDA et al., 1993). Por otro lado
OUDOT et al., (1993) aislaron cepas de hongos degradadores de hidrocarburos
de ambientes tropicales en Indonesia, donde identificaron miembros de los
géneros Aspergillus sp. Actualmente, muchos microorganismos son conocidos
como buenos productores de lipasas que catalizan la hidrólisis de aceites y
grasas. Estas enzimas son producidas intra y extracelularmente en diversos
microorganismos como hongos, bacterias y levaduras. Algunos géneros de
bacterias particularmente conocidos por producir lipasas son:, Geotricum sp. Sin
50
embargo, la propiedad de lipólisis está extendida en la naturaleza y no limitada
a estos microorganismos (APHA, 2001).
Los estudios presentes en la literatura, demuestran que los
microorganismos identificados durante la práctica realizada presentan
capacidades para degradar compuestos orgánicos como son los hidrocarburos.
51
IV. CONCLUSION
1. Los parámetros influyentes se identificó un pH moderadamente acido, una
temperatura en fase termófila y un humedad ligeramente húmedo
cumpliendo con las condiciones óptimas para el desarrollo de los
microorganismos.
2. La concentración celular de microorganismos presentes en suelos
contaminados de hidrocarburo están dentro de los rangos establecidos
por los autores mencionados en Bacterias, Actinomicetos y Hongos.
3. Los seis Géneros identificados en bacterianas fueron: Pseudomona,
Actinomices sp, Estafilococos sp, Citrobacter sp,Echerichia coli , bacillus
sp y en géneros de Hongos fueron Geotrichum sp, Rizopos sp,
Aspergillus sp.
52
V. RECOMENDACIONES
1. Realizar el análisis de textura, permeabilidad, nutrientes y aceptores de
electrones para determinar que técnica utilizar para biorremediar suelos
contaminados con hidrocarburo.
53
VI. REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA
ACOSTA, I., LOPEZ, C. 1995.”Efecto de lodos petrolizados y lodos de
tratamiento de aguas servidas sobre suelo calciothids de la península de
Paraguaya”. Facultad de Agronomía. p. 527-537.
ALEXANDER, M. 1961. Introduction to soil microbiology. John Wiley. New York,
USA. 472 p.
ALEXANDER, M. (1980). Introducción a la microbiología del suelo. Traducción
al español por J. J. Peña-Cabriales AGT Editor, México. 491p.
APHA. (2001). American Public Health Association. Compendium of methods for
the microbiological examination of foods. Lipolytic Microorganisms, 4th
Ed. 175-181 p.
ATLAS, R.M. 1981. Microbial degradation of petroleum hydrocarbons: An
environmental perspectiva. Microbiological Reviews 180 – 209 p.
ATLAS R. y BARTHA R. 2002. Ecología Microbiana y microbiología ambiental.
4ta dición. Addison Wesley. Madrid, España. 677 p.
54
BARRENA, R. 2006. Compostaje de residuos sólidos orgánicos. Aplicación de
técnicas respirométricas en el seguimiento del proceso. 2 da Ed. Por la
Universidad Autónoma de Barcelona. Departamento de Ingeniería
Química. Barcelona, España. p. 28.
BROCK, D., MADIGAN, M. 2000. Microbiología. 8va. Edición. Prentice Hall
Hispanoamericana. S.A. México 111-113p.
BURGOS R. 1999. Degradación de hidrocarburos. Disponible en
http://www.bioinformatica.uab.es. Consultado el 03 abril. 2017.
CARAVACA, F. Y ROLDÁN, A. 2003. Assessing changes in physical and
biological properties in a soil contaminated by oil sludges under semiarid
mediterranean conditions, Geoderma (117) 53-61.
ESPINOZA, 1999. Boletín Nº 04.Refinería la Pampilla. Callao. Perú.
MATHUR, S.P. 1991. Composting processes. In Bioconversion of Waste
Materials to Industrial Products, ed. A.M. Martin New York, 147-186 p.
FONTÚRBEL, F. y ACHÁ D. 2000. Empleo del método de determinación de
biomasa microbiana por fumigación-extracción para el estudio en suelos
del altiplano boliviano contaminados por hidrocarburos. Ciencia abierta.
Disponible en http://cabierta.uchile.cl. Consultado el 15 mayo. 2017.
GUERRERO, J. 2001. El Compost un abono orgánico compuesto para mejorar
y dar vida a nuestros suelos. Taller de conservación de suelos
agricultura sostenible. UNALM. Lima.
55
GOMEZ M., CAMPOS N., HURTADO C., CASANOVA R. 2008. Selección y
aplicación de bacterias con capacidad degradadora. Programa de
Calidad Ambiental Marina. Instituto de Investigaciones marinas y
costeras. Bogota, Colombia. 18 p.
GRANT, W. 1981. Environmental microbiology. John Willet and Sons. New Cork,
USA. 207 p.
HATTORI T. 1973. Microbial life in the soil; An introduction. M. Dekker. New
York, USA. 427 p.
HACHICHA, S., F. SALLEMI, K. MEDHIOUB, R. HACHICHA, E. AMMAR. 2008.
Quality assessment of composts prepared with olive mill wastewater and
agricultural wastes. Waste Management 28:2593–2603p.
HEMIDA, S.K., BAGY, M.M.K., KHALLIL, A.M. 1993. Utilization of hydrocarbons
by fungi. Cryptogamie Mycol 143: 207-213 p.
JONES J.B. 2001. Laboratory guide for conducting soil test and plants analysis.
Editorial CRC Press. Florida, USA. 256 p.
LAGREGA, M. BUCKINGHAM, L., EVANS, J. 1996. Gestión de Residuos
Tóxicos. Tratamiento, eliminación y recuperación de suelos. Volumen II.
McGraw-Hill.Madrid, España. 316 p.
LEVIN M. y GEALT M. 1997. Biotratamiento de residuos tóxicos y peligrosos.
McGraw-Hill. Madrid, España. 153 p.
56
LÓPEZ, C. 2004. Protocolos de prácticas de Microbiología Ambiental.
Universidad Nacional Agraria de la Selva. Tingo María, Perú.
MADIGAN M., MARTINKO J. & PARKER J. 1999. Brock:Biología de los
microorganismos. 8º edición. Prentice Hall, Madrid, España 986p.
MAROTO, A. 2001. Sistemas de biorremediacion de suelos y aguas
contaminadas por hidrocarburo 3 era ed, Barcelona, Geocisa, 896 p.
MARTINEZ E. Y LOPEZ S. 2001.Efecto de hidrocarburo en las propiedades
físicas y químicas de suelos arcillosos Terra Latinoamericana 9-11
MINISTERIO DEL AMBIENTE - MINAM. 2014. Guía para muestreo de suelos.
Estándares de Calidad Ambiental (ECA) para Suelo. Decreto supremo N°
002-2013-MINAM. Lima – Perú.
PÉREZ, R., CAMACHO, C., GÓMEZ, J., ÁBALOS, A. VIÑAS, M. Y CANTERO,
D. 2008. Aislamiento y selección de una cepa bacteriana degradadora
de hidrocarburos a partir de suelos contaminados con petróleo, Revista
CENIC ciencias biológicas, 39 (1): 44-51p.
PARDO J., PERDOMO M., BENAVIDES J. 2002. Efecto de la adición de
fertilizantes inorgánicos compuestos en la degradación de hidrocarburos
en suelos contaminados con petróleo a nivel de laboratorio. Tesis para
optar al titulo de Ingeniero Ambiental. Universidad De La Salle, Costa
Rica. Facultad de Ingeniería Ambiental y Sanitaria. 188 p.
RÍOS, R. 2005. Estudio de la Estimulación Biológica Para el Tratamiento de
Residuos de Perforación Petrolera Empleando Lisímetros. Universidad
57
Autónoma Metropolitana. Unidad Iztapalapa. Casa Abierta al Tiempo.
México D.F 334 p..
RITTMANN, B. 2001. Biotecnología del medio ambiente, Principios y
aplicaciones. McGraw-Hill. Madrid, España. 745 p.
ROLDÁN, A., Y ITURBE, R. 2002. Saneamiento de Suelos Contaminados con
Hidrocarburos Mediante Biopilas. Instituto de Ingeniería, UNAM 233-245p.
SARUBBI, A. 2000. Aspectos importantes en biorremediación. AIDIS Argentina.
Disponible en http://www.aidisar.org. Consultado el 15 ene. 2017.
OUDOT, J.P., DUPONT, J., HALOUI, S., ROQUEBERT, M.F. 1993.
Biodegradation potential of hydrocarbon-degrading fungi in tropical soil.
Soil Biol Biochem 25: 1167-1173p.
TORRES, K., Y ZULUAGA, T. 2009. Biorremediación de Suelos Contaminados
por Hidrocarburos. Proyecto de Grado. Universidad Nacional de
Colombia. Medellín 134 -136 p.
USEPA, 2003. Environmental Fact Sheet: Analytical Métodos for Fuel
Oxygenates.
VOLKE, T., Y VELASCO, J. 2002. Tecnologías de Remediación para Suelos
Contaminados. Instituto Nacional de Ecología. INE-SEMARNAT.
México. D.F 114-116p.
58
ANEXOS
59
Figura 8: Pesado del suelo.
Figura 9: Disolucion de suelo en caldo peptona al 0.1%.
60
Figura 10: Filtrado del suelo despues de haber sido diluido en peptone
a 0.1%.
Figura 11: Realizacion de la siembra en los medios de cultivo
61
Figura 12: Placas con medios de cultivo sembrados.
Figura 13: Crecimientos de microorganismos despues de 48 horas de
incubacion a 37°C.
62
Figura 14: Realizacion de la Prueba Bioquímica.
Figura 15: Resultados de la Prueba Bioquímica
63
Figura 16: Crecimiento de Genero Staphylococcus en el medio
Manitol Salado.
Figura 17: Crecimiento de microorganismos en el medio MacConkey.
64
Figura 18: Crecimiento de especie Actinomicetos.
Figura 19: Crecimiento de microorganismos en medio M77.
65
Figura 20: Crecimiento de microorganismos en medio Cleed.
Figura 21: Realizacion del Microcultivo para el crecimiento de hongos.
66
Figura 22: Crecimiento de especies de hongos en el medio A.S.
