Resistencia a estres abiotico.pdf

Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Universidad de Buenos Aires

Agrobiotecnología Curso 2011

Tolerancia a estreses abióticosAlejandro Mentaberry

Solutos compatibles Bomba de Na+/H+

Sobrexpresión de citoquininasFactores de transcripciónProteínas LEACitrato sintetasa

Estreses abióticos

Referencias

Problemas y pérdidas producidas por estreses abióti cos

Respuestas a estreses abióticos

Solutos compatibles

Estrategias para aislar genes de toleranciaa estreses abióticos en plantas

Sumario

Uso de genómica funcional para la búsquedade genes de tolerancia a estreses abióticos

Búsqueda de genes regulados por factores detranscripción inducibles por estreses abióticos

Ejemplos de tolerancia frente a diferentesestreses abióticos:

Agrobiotecnología

Toleranciaa estreses abióticos

Estresesabióticos • Las plantas son frecuentemente sometidas

a estreses, condiciones externas que adversamente afectan su crecimiento, desarrollo o productividad.

• Los estreses pueden ser bióticos , provocados por otros organismos, o abióticos , causados por condiciones desfavorables en el ambiente físico o químico.

• Los estreses disparan un amplio rango de respuestas en la planta, desde alteraciones en la expresión genética y el metabolismo celular, a cambios en la tasa de crecimiento y rendimientos de los cultivos.

• La tolerancia o sensibilidad a los estreses depende de las especies, del genotipo y del estadío de desarrollo de la planta.

Agrobiotecnología


La mayoría de estos factores ambientales induce est rés osmótico

Diferentes factores ambientales que resultan en estreses abióticos

Tomado de: Holmberg and Bülow, Trends in Plant Science, 1998.

• Se espera que la población mundial dupliquesu número para el año 2050.

• En ese momento, la población mundial alcanzará los 11.000 millones de personas, de las cuales el 90% residirá en países en desarrollo.

• La producción de alimento deberáduplicarse o triplicarse para entonces.

• En Latinoamérica sólo el 7% del total de tierra es cultivable. Los esfuerzos por satisfacer las demandas de una población en aumento han conducido al cultivo de suelosde pastoreo y, en algunos casos, de tierrasforestales, así como también de tierrasmarginales (suelos salinos, ácidos, etc.).

Demandasy restricciones futuras de la agricultura

Agrobiotecnología


Problemas y pérdidas producidaspor estreses abióticos

Agrobiotecnología


Muchas tierras cultivables se pierden debido al exceso de uso o al mal manejo de los suelos

La producción alimentaria en aumento es el principal factor de presión ejercido sobre los recursos de la tierra. Esto acentúala degradación de los suelos y conduce a fenómenos de desertificación y pérdidade los mismos.

Más de 3.500 millones de ha (25% de la superficie total) están afectadas por la desertificación a nivel mundial. En Sudamérica, la desertificación afecta unos 250 millones de ha.

Las principales causas de desertificación son la salinidad y la sequía.

El acceso a la alimentación de más de 900 millones de personas corre peligro debido a que las tierras de las que dependen están amenazadas por este problema.

Agrobiotecnología


Las aplicaciones biotecnológicas contribuirán a la recuperación de suelos inapropiados para el cultivo

Para aumentar laproducción agrícolay preservar los suelos se requiere implementar políticas sociales y económicas de largo plazo, introducir nuevas formas de manejo agronómico e incrementar la investigación científica y tecnológica.

Las aplicaciones biotecnológicas, en particular el uso de cultivos transgénicos, prometen incrementar la producción agrícola disminuyendo los costos de producción.

El uso de plantas tolerantes a estreses abióticos podría permitir el uso y la recuperación de tierras afectadas por salinidad, acidez, sequía, etc.

Agrobiotecnología


50,761.30017.10042.600121.000Remolacha

54,150.90017.77528.30094.100Papa

75,48.5907652.05011.400Cebada

75,17.9609241.72010.600Avena

80,616.2001.0512.83020.100Sorgo

69,35.1206661.6107.390Soja

82,111.9007261.88014.500Trigo

65,812.7001.9524.60019.300Maíz

(% rend. max.)Abióticas bBióticas a(Kg/Ha)(Kg/Ha)Cultivo

Pérdidas abióticas

Pérdidas promedio (Kg/Ha)

Rendimiento promedio

Rendimientomáximo

a Los estreses bióticos incluyen enfermedades, insect os y malezas.b Los factores abióticos ambientales incluyen, pero n o se limitan a, sequía, salinidad, inundación, y altas y bajas temperaturas.

Rendimientos y pérdidas promedio de los principales cultivos

Adaptado de : Buchanan, Gruissem and Jones. Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2000.

La incidencia de los factores ambientales sobre los rendimientos es mayor en las zonas tropicales

a Las zonas subtropicales y templadas se consideran templadas. Las zonas entre 23,5º latitud Norte y 23,5º latitud Sur se consideran tropicales. b Asia está representada por Filipinas, Thailandia e India. Centro América está representada por México y Colombia.

Tomado de: Chispeels y Sadava, Plants, Genes and Crop Biotechnology, 2003..

12,9 (Zimbabwe)1,422,2 (USA)4,0Maíz

7,4 (Asia) b2,010,5 (Japón)4,1Arroz

10015,710020,8% rendimiento récord

4,8 (Zimbabwe)1,07,3 (Japón)1,6Soja

9,6 (Zimbabwe)1,08,6 (USA1,7

10,3 (Asia)1,220,1 (USA)2,3Sorgo

10,3 (Asia, Zimbabwe,

América Central)

1,414,1 (USA)3,0Trigo

---6,965,0 (USA)13,6Batata

60,0 (América Central) b

8,7126.0 (USA)18,1Papa

RécordPromedioRécordPromedioCultivo

Rendimiento clima tropical (Tm/ha)Rendimiento clima templado (Tm/ha) a

12,9 (Zimbabwe)1,422,2 (USA)4,0Maíz

7,4 (Asia) b2,010,5 (Japón)4,1Arroz

10010020,8ré

4,8 (Zimbabwe)1,07,3 (Jap1,6Soja

9,6 (Zimbabwe)1,08,6 (USA1,7

10,3 (Asia)1,220,1 (USA)2,3Sorgo

10,3 (Asia, Zimbabwe,

América Central)

1,414,1 (USA)3,0Trigo

---6,965,0 (USA)13,6Batata

60,0 (América Central) b

8,7126.0 (USA)18,1Papa

RécordPromedioRécordPromedioCultivo

Rendimiento clima tropical (Tm/ha)Rendimiento clima templado (Tm/ha) a

La creciente demanda de agua es uno de los problemas más acuciantes que enfrentarála agricultura intensiva

Agrobiotecnología


Uso

de

agua

(K

mcu

bico

s)

Agricultura Industria Uso doméstico

El uso de agua en la agricultura se ha incrementado siguiendo una función lineal en los últimos 70 años

Agrobiotecnología


Aproximadamente 60 millones de hectáreas están sometidos a procesos erosivos en la Argentina

Cada año se suman unas 650.000 hectáreas a los procesos de erosión

Unos 9,5 millones de personas están localizadas en tierras áridas o semiáridas

El desarrollo de las tierras áridas y semiáridas es un problema geo-económico importante de la Argentina

Respuestas a estreses abióticos

Agrobiotecnología


- Estrés letal que puede conducir a la muerte de la planta debido al incremento de los procesos de senescencia.

- Estrés sub-letal o estrés letal precedidopor un estrés sub-letal durante elcual pueden producirse cambiosadaptativos que permiten la supervivencia de la planta (tolerancia).

• En un ambiente desfavorable,una planta podría enfrentarlas siguientes situaciones:

• Estas adaptaciones pueden ocurrir a nivel molecular, (expresión génica y sí ntesis

. proteica) o a nivel bioquí mico

. (síntesis de nuevos metabolítos),

. lo que conduce a respuestas

. celulares y fisiológicas alteradas.

Respuesta de las plantas a niveles letales o sub-letales de estrés

Tomado de: Grover et al., Current Science, 2001.

• A nivel de toda la planta:

- Reducciones en la germinación de las semillas- Reducciones en el establecimiento de las plántulas- Pobre vigor de los brotes - Decrecimiento en la extensión de las raíces - Enrollamiento y senescencia de las hojas

. - Disminución de la tasa fotosintética

. - Reducción en la viabilidad del polen- Reducción y llenado incompleto de los granos

• A nivel celular o subcelular:

- Niveles incrementados de diferentes osmolitos (sequía y salinidad) - Represión general de la biosíntesis de proteínas (sequía y salinidad)- Cambios selectivos en los niveles de K+/Na+ (sequía y salinidad)- Incremento en la insaturación de los lípidos de membrana

. (descenso de temperatura)- Regulación positiva de la glucólisis y enzimas requeridas

para la fermentación alcohólica (anaerobiosis; innundaciones)

Respuesta de las plantas a niveles letales o sub-letales de estrés

Las plantas responden al estrés tanto a nivel celular como del conjunto de los tejidos. Los estreses constituyen señales ambientales que son percibidas y reconocidas por las plantas. Las señales son transducidas en las

células y transmitidas a través de la planta. Típicamente, la transducción de señales a nivel celular resulta en la alteración de la expresión genética, lo que a su vez influye sobre el metabolismo y el desarrollo de la planta.

Respuestas a estreses ambientales

Adaptado de: Buchanan, Gruissem and Jones. Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2000.

ácido jasmónico,,ácido abscísico,

etileno, Ca 2+

Las rutas de señalización del estrés hídrico y sali no son inducidas por exceso de Na + o por cambios osmóticos. Las rutas de señalización ió nica y osmótica derivan en la

restauración de la homeostasis a nivel celular y de la planta.

Demarcación funcional de las rutas de señalización de estreses inducidos por salinidad y sequía

Adaptado de: Zhu, Annual Review in Plant Biology, 2002.

Rutas de transducción de señales involucradas en las respuestas a estreses abióticos

Agrobiotecnología


MPK, MPKK, MPKKK, : MAP quinasa, MAPK quinasa y MAP KK quinasa, respectivamente; CaM: Calmodulina; CDP K: proteína quinasa dependiente de calcio; SOS3, SOS2: proteína quinasas ( Salt overly sensitive); LEA: proteínas abundantes en la

embriogénesis tardía; Hsfs: factores de choque térm ico; GPCR: receptor acoplado a proteína G; RLKs: q uinasas de tipo receptor

Señal de estrés

Sensores:histidina kinasa, canales ionicos,

Hsfs, GPCR, RLKs

Ca2+ Ca2+MAPKKK

MAPKK

MAPKK

CaM, CaN, CDPK

SOS3

SOS2Fosforilación de proteínas

Factores de transcripción

antioxidantes, osmolitos

Protección de macromoléculas,

reparación de daños, homeostasis osmótica

Transportadores iónicos

proteínas de tipo LEA

homeostasis ionica

Protección celular, reparación de daños,

homeostasis osmótica

membrana

plasmática

recepcióntransducción de señales

Efectores/

niveles de acción

CaM, CaNCDPKCaM, CDPK

estrés biótico y heridas

sequía y alta salinidad

calor frío

AJ ABA

MYB MYCAREB/ABF

(bZIP) NAC HDZF DREB1D/CBF4 (AP2/ERF)

DREB2 (AP2/ERF)

DREB1/CBF (AP2/ERF)

MYBR MYCR ABRE NACR HDZR DRE/CRT

Expresión de genes inducibles por estrés

Tolerancia a estrés

Los factores de transcripción que controlan respuestas inducibles por estrés están representados por elipses. Los elementos que actúan en ciscontrolando la trascripción inducida por el estrés están representados como cajas. Los círculos pequeños sobre los factores de transcripción

representan modificaciones (tales como fosforilaciones) inducidas por el estrés que resultan en su activación.

Adaptado de: Nakashima y Yamaguchi-Shinozaki, Abiotic stress adaptation in plants, 2010.

Control transcripcional de las respuestas a estrés

El esquema incluye tres espacios que están definidos por la membrana plasmática y el tonoplasto. Se muestran los efectos de la acción de proteínas relacionadas con la tolerancia al déficit de H2O. El esquema se focaliza en los eventos bioquímicos y no incluye eventos de señalización o rutas que conducen a alterar la expresión génica.

Funciones bioquímicas asociadas con la tolerancia al estrés hídrico

Adaptada de : Bohnert and Jensen, Trends in Biotechnology, 1996.

Agrobiotecnología


Las respuestas de tolerancia a estrés hídrico se basan en:

� Aumentar la actividad de bombas Na 2+/H+

. en las membranas plasmáticas de células de raíz

. y en los tonoplastos del mesófilo y de otros tejido s

. (exportación y compartimentación de sodio)

� Controlar la expresión, actividad y propiedades de .. los sistemas de transporte de potasio y la activida d . de las acuoporinas

� Controlar el flujo de agua y el nivel de turgencia . .incrementando la producción de solutos compatibles .

. (ajuste osmótico)

� Proteger las enzimas, complejos proteicos y estruct uras . de membrana incrementando la capacidad de detoxific ación . de radicales hidroxilos y la producción de osmoprote ctores.

Respuestas de tolerancia al estrés hídrico

Solutos compatibles

Agrobiotecnología


ψW : potencial de H2OψW= ψS+ ψP

ψS : potencial de solutoψP : potencial de presión

Adaptado de : Buchanan, Gruissem and Jones, Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2000.

Parámetrosque determinanel ajuste osmótico

con ajuste osmótico

sin ajuste osmótico

ψp = + 0,5 Mpa

ψs = – 2,0 MPa

ψw = – 1,5 MPa

ψp = 0 MPa

ψs = – 1,2 MPa

ψw = – 1,2 MPa

Déficit de H 2O

Suelo

ψw = – 1,2 MPaAgrobiotecnología


turgencia tensión

El movimiento de agua hacia dentro o fuera de la célula depende del gradiente de potencial de agua (ψw) a través de la membrana plasmática

Adaptado de : Buchanan, Gruissem and Jones, Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2000.

Agrobiotecnología


ψp = 0 MPa

ψs = – 2,0 MPa

ψw = – 2,0 MPa

Valores intracelulares

ψw externo< ψw internoH2O

Membrana plasmática

ψw externo= – 2,5 MPa

Valores intracelulares

ψp = + 0,5 MPa

ψs = – 1,6 MPa

ψw = – 1,1 MPa

Membrana plasmática

Pared celular

H2Oψw externo> ψw interno

ψw externo= 0 MPa

VacuolaRodeada por la membranadel tonoplasto

Célula plasmolizada:

Los iones de sodio y cloruro, que pueden interrumpi r el metabolismo en el citoplasma, se concentran en la v acuola.Por el contrario, la concentración de glicina-betaí na es altaen los cloroplastos y el citoplasma, pero baja en l a vacuola.

Ajuste osmótico en una céluladel mesófiloen una hojade espinaca sometidaa exceso de sal


Agrobiotecnología


a No todos los compuestos que se acumulan se encuentran en todas las especies; las rutas bioquímicas sonespecíficas para órdenes y familias de plantas.

b Las LEAs (late-embryogenesis abundant proteins) y las dehidrinas, así como las proteínas relacionadas con lapatogénesis, son ejemplos del reclutamiento de proteínas con “otra función” en las respuestas de estrés abiótico.

Funciones sugeridas de compuestos que se producen en las plantas como respuesta al estrés hídrico

Adaptado de: Bohnert and Jensen, Trends in Biotechnology, 1996.

Balance iónico, protección de la cromatinaEspermina, espermidinaPoliaminas

Carotenoides, antocianinas, betalaínas

Glicina betaínaβ-alanina betaínaDimetilsulfonio propionato

Acíclicos (ej., manitol)Cíclicos (ej., pinitol)

SacarosaFructanos

ProlinaEctoína

LEA/dehidrinasb

Osmotinab

SOD/catalasa

Potasio

Componente específico

Protección contra la fotoinhibiciónPigmentos y carotenoides

Osmoprotector Osmoprotector Osmoprotector

Aminas cuaternarias

Reserva de carbono, ajuste osmóticoOsmoprotector, ajuste osmótico

Polioles

Ajuste osmóticoOsmoprotector, reserva de carbono

Azúcares

Ajuste osmóticoOsmoprotector

Aminoácidos

Osmoprotección Proteínas relacionadas con patogénesis Detoxificación de radicales

Proteínas

Ajuste osmótico, requisitos de macronutrientes,exclusión / exportación de sodio

Iones

Funciones sugeridasGrupo de productos a

Balance iónico, protección de la cromatinaEspermina, espermidinaPoliaminas

Carotenoides, antocianinas, betalaínas

Glicina betaínaβ-alanina betaínaDimetilsulfonio propionato

Acíclicos (ej., manitol)Cíclicos (ej., pinitol)

SacarosaFructanos

ProlinaEctoína

LEA/dehidrinasb

Osmotinab

SOD/catalasa

Potasio

Componente específico

Protección contra la fotoinhibiciónPigmentos y carotenoides

Osmoprotector Osmoprotector Osmoprotector

Aminas cuaternarias

Reserva de carbono, ajuste osmóticoOsmoprotector, ajuste osmótico

Polioles

Ajuste osmóticoOsmoprotector, reserva de carbono

Azúcares

Ajuste osmóticoOsmoprotector

Aminoácidos

Osmoprotección Proteínas relacionadas con patogénesis Detoxificación de radicales

Proteínas

Ajuste osmótico, requisitos de macronutrientes,exclusión / exportación de sodio

Iones

Funciones sugeridasGrupo de productos a

Amidinas

Estructuras químicas de solutos celulares compatibles

+ +NH3(CH2)3NH (CH2)4NH (CH2)3NH3

Espermina

Compuestos con amonios cuaternarios


- -

-

-

-

Colina-O-sulfato


Espermina



- -

-

-


Espermina



- -

-

-

-

Colina-O-sulfato

Proteína desnaturalizada:pocas moléculas de H 2O unidas

a la proteína; alta entropía

Proteína intacta: moléculas de H 2O rodeando a la proteína en forma

altamente ordenada; baja entropía

La capa de hidratación de las macromoléculas

no es perturbada por los solutos compatibles.

Los solutos compatibles preservanla capade hidrataciónde las macromoléculas

Adaptado de: Buchanan, Gruissem and Jones, Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2000.

Agrobiotecnología


Estrategias para aislar genes de tolerancia a estreses abióticos

Agrobiotecnología


ABF: ABRE binding factor; AtHK1: histidin quinasa 1 de Arabidopsis thaliana; bZIP: basic leucine zippertranscription factor; CBF/DREB: C-repeat-bindingfactor/dehidratation-responsive binding protein; CDPK: protein quinasa dependiente de Ca2+; COR: cold-responsiveprotein; Hsp: Heat-shock protein; LEA: late embryogenesisabundant; MAP: mitogen-activatedprotein; MYC/MYB: familias de actores de transcripción PLD: fosfolipasa; Ptd-OH: ácido fosfatídico; PX: peroxidasa; ROS: especies reactivas de oxígeno; SOS: salt overly sensitiveSOD: superoxidodismutasa; SP1: stable protein 1

Las respuestas al estrés abiótico involucran mecanismos complejos

Agrobiotecnología


Adaptado de: Vinocur andAltman, Current Opinion in Biotechnology, 2005.

sequía

frio

salinidad

poluciónquímica

calor

estreses primarios estreses secundarios

estrés osmótico

estrés oxidativo

Disrrupción de lahomeostásis osmótica

e iónica; daños aproteínas funcionales

y estructurales y amembranas celulares

Sensado, percepcióny transducción

de señales

Control transcripcional

Mecanismos derespuesta al estrés

Osmosensores (ej., AtHK1),enzimas que clivan fosfolípidos (ej., PDL),

segundos mensajeros (ej., Ca2+, PtdOH, ROS),MAP quinasas, sensores de Ca2+ (ej., SOS3),quinasas dependientes de Ca2+ (ej., CDPKs)

Factores de transcripción(ej., CBF/DREB, ABF, HSF, bZIP, MYC/MYB

Activación génica

Detoxificación(SOD, PX)

Chaperonas(Hsp, SP1, LEA, COR)

Osmoprotección(prolina, glicina-betaína,

polioles azúcares)

Movimiento de agua e iones(acuoporinas,

transportadores de iones)

Restablecimiento de la homeostásis celular,protección funcional y estructural de proteínas

y membranas celulares

Tolerancia al estrés

Genes y proteínas asociadas a estreses

Tolerancia adquirida a estrés

Mejoramiento

vegetal y

marcadores

moleculares

(ej., QTLs)

Transformación

genética

Metabolitos asociados a estreses

Hsps,chaperonasy proteínas

LEA

Componentesde rutas de

señalización,factores de

transcripción

Transportede agua e

iones

Osmolitos,osmo-

protectoresPoliaminas Metabolismo

de carbono

Otrosmecanismosde respuesta

a estrés(ej., apoptosis)

Detoxificacióny scaveging

de ROS

Estrategias para desarrollar plantas tolerantes al estrés mediante ingeniería genética

Adaptado de: Vinocur and Altman, Current Opinion in Biotechnology, 2005.

La tolerancia adquirida al estrés puede ser incrementada modificando la expresión de genes y proteínas o por la sobrexpresión de metabolitos asociados al estrés. La tolerancia es un carácter que depende de la actividad concertada de muchos genes, proteínas y rutas metabólicas. La tolerancia a los estreses abióticos puede desarrollarse por ingeniería genética o mejoramiento asistido con marcadores moleculares y quantitative trait loci (QTLs).

Hsp: heat shock proteinLEA: late embryogenesisabundantROS: reactive oxygenspecies

Estrategiaspara desarrollar plantas tolerantes al estrés mediante ingeniería genética

Adaptado de: Holmberg and Bülow, Trends in Plant Science, 1998.

Buscar organismos que vivanbajo condiciones medioambientales

extremas de estrés

Estudiar los organismos bajo condiciones estresantes

y no estresantes

Aislar y clonar aquellos genesque confieren la tolerancia al estrés

Caracterizar el producto génicoen un sistema modelo procariota

Introducir el gen en un sistemavegetal y estudiarlo bajo estrés

Introducir el gen en un cultivoy proceder con ensayos de campo

Buscar organismos que vivanbajo condiciones medioambientales

extremas de estrés

Estudiar los organismos bajo condiciones estresantes

y no estresantes

Aislar y clonar aquellos genesque confieren la tolerancia al estrés

Caracterizar el producto génicoen un sistema modelo procariota

Introducir el gen en un sistemavegetal y estudiarlo bajo estrés

Introducir el gen en un cultivoy proceder con ensayos de campo

Agrobiotecnología


Craterostigma plantagineum es una planta poiquilohídricamodelo para el estudio de tolerancia a la deshidratación

Los dos azúcares más prominentes hallados en C. plantagineum son 2-octulosa y

estaquiosa. 2-octulosa predomina en las hojas y es convertido en sacarosa durante la deshidratación. Estaquiosa predomina en las raíces, tanto en condiciones normales como

bajo deshidratación

Arriba: C. plantagineum (“Planta de la Resurrección”). Abajo: efecto de la deshidratación. Planta totalmen te

túrgida (izquierda); planta deshidratada (centro); planta hidratada por 12 h (derecha). , , 2001.Tomado de: Bartels and Salamini Plant Physiology

Thellungiella halophila es una planta halófila modelo para el estudio de la tolerancia a salinidad

Thellingiella halophila es una pequeña halófila altamente tolerante al estrés salino. Tiene un ciclo de vida corto y comparte muchas similitudes biológicas y moleculares con Arabidopsis thaliana.

La fotografía muestra plantas de T. halophila y A. thaliana cultivadas durante 7 días en medio saturado con 0, 200 y 600 mM de NaCl.

Tomado de: Vinocur and Altman, Current Opinion in Biotechnology, 2005.

Thellungiella halophila es una planta halófila modelo para el estudio de la tolerancia a salinidad

Tomado de: Seki et al., The Plant Cell, 2001.

Análisis de la expresión genética frente a estrés i nducido por frío utilizando microarreglos de 1.300 genes de Arabidopsis. Los genes señalados en la imagen corresponden a controles positivos ( rd29A), negativos ( nAChRE) y a controles internos no inducibles ( α-tubulina). Se utilizaron sondas realizadas con ADN c de plantas estresadas y no estresadas con frío. La coloración roja indica inducción génica; la coloración verde, inhibición. Lo puntos en amarillo indican que no hay cambios en la expresión génica.

rd29A nAChRE α-tubulin

Uso de genómica funcional para la búsqueda de genes de tolerancia a estreses abióticos

Clasificación de genes inducibles o reprimibles por frío, sequía y salinidad mediante análisis con microordenamientos. Los números entre paréntesis (panel izquierdo) indican genes cuya inducción

es mayor de cinco veces para el estrés en cuestión y menor de tres veces para los restantes.

Identificación de genes inducibles por estrés abiótico

Tomado de: Seki et al., The Plant Journal, 2002.

Análisis por Northern blot para tres genes altamente inducibles por salinidad (RAFL08-19-G15), sequía ( RAFL08-08-O14) y frío ( RAFL04-12-P22). Se muestra

la expresión de un gen constitutivo (RAFL05-14-L02) como control interno.

Identificación de genes de Arabidopsis thaliana inducidos por estreses de frío, sequía y salinidad

Tomado de: Seki et al., The Plant Journal, 2002.

Estrategia para identificar genes inducidos por frío y sequía que son blanco del factor de transcripción DREB1A (Dehydration Responsive Element Binding Protein)


Identificaciónde genes regulados por factores de transcripción induciblespor estreses abióticos

α

α

Agrobiotecnología


Los genes inducibles por frío y sequí a fueron clasificados en dos grupos: los que son blancos de la acción de DREB1A y los que no son inducibles por este gen.

Identificación de genes inducibles por estrés abiótico


Genes que son blanco de DREB1A: 12rd29A, cor15a, kin1, kin2, rd17, erd10, FL3-

5a3, FL5-77, FL5-2122, erd4, FL5-94, FL3-27

FL6-55, FL5-2D23, FL2-56, FL5-3J4,

rd20

Genes específicos

inducidos por sequía: 5

Genes inducibles por Sequía y frío: 16

Genes que no son blanco de DREB1A: 4

FL5-3M24, FL5-3A15,FL5-2O24, FL5-1A9

Genes inducibles por frío: 2

FL5-90, DREB1A

Secuenciación de alto rendimiento

Roche / 545 FLX (2004) o Titanium 2009

Illumina Solexa Genome analyzer (2006)

Applied Biosystems SOLIDTM System (2007)

Pacific Biosciences SMRT (2010)

Ion Torrent (2010)

Desarrollo de plataformas automatizadas para secuenciación masiva

?21-28 Mb/h25 Mb/h13 Mb/h0,03-0,07 Mb/hProducción de secuencia

1-10 kpb75 pb100 pb300-400 pb700-900 pbLongitud de lectura

Ninguna (molécula

única)

PCR en emulsión

¨Bridge¨ PCRPCR en emulsión

Amplificación in vivo

vía clonado de ADN

Método de amplificación del templado

Secuenciación por síntesis

Secuenciación por ligación


con terminadores reversibles

Piro-secuenciación sobre soporte

sólido

Secuenciación automática

por el método de Sanger

Química de secuenciación

PacificBiosciences

ABI SOLIDIlluminaGenomeAnalyzer

Roche 454 Titanium

ABI 3730xl GenomeAnalyzer

Plataforma de secuenciación

?21-28 Mb/h25 Mb/h13 Mb/h0,03-0,07 Mb/hProducción de secuencia

1-10 kpb75 pb100 pb300-400 pb700-900 pbLongitud de lectura

Ninguna (molécula

única)

PCR en emulsión

¨Bridge¨ PCRPCR en emulsión

Amplificación in vivo

vía clonado de ADN

Método de amplificación del templado


Secuenciación por ligación


con terminadores reversibles

Piro-secuenciación sobre soporte

sólido

Secuenciación automática

por el método de Sanger

Química de secuenciación

PacificBiosciences

ABI SOLIDIlluminaGenomeAnalyzer

Roche 454 Titanium

ABI 3730xl GenomeAnalyzer

Plataforma de secuenciación

Secuenciación de alto rendimiento

• Pronunciado descenso en el costo de secuenciación p or base secuenciada

• Datos cualitativos (secuencia) y cuantitativos (abu ndancia de la secuencia)

• Posibilidad de incluir muchas situaciones por corri da

Identificaciónde genes induciblespor estreses abióticos mediante enfoques transcriptómicos

Agrobiotecnología


Planta no estresada (estado de referencia)

Planta estresada (estado experimental)

ARNm ARNm

ADNc ADNc

Secuenciación masiva

Secuenciación masiva

Análisis bioinformá tico. Selección de genes candidado

Análisis de función génica

Clonado de genes candidatos

Ensayos en sistemas modelo

Tolerancia a estreses abióticos Solutos compatibles

Agrobiotecnología


- Se transformaron plantas de tabaco con una construcción genética que contenía el gen mtlDde E. coli bajo el promotor de 35S de CaMV.

- Se realizaron experiencias de crecimientoen medios de alta concentración salina.

- Se evaluó la altura de la parte aérea y el peso fresco de las plantas.

- Las plantas transgénicas toleraron mayoresniveles de salinidad.

Transformaciónde tabaco con el gen de manitol-1P deshidrogenasade Escherichia coli

Agrobiotecnología


Fructosa 6-fosfato

mtlDManitol 1-fostatodeshidrogenasa

Manitol 1-fosfato

Manitol

Glucosa 6-fosfato

Fructosa

Fructosa 1,6-difosfato

Fosfatasa no específicaFosfatasa

inespecífica

Plantas de tabaco transgénicas que acumulan manitol y plantas control a los 30

días de crecimiento en medio de cultivo conteniendo 250 mM de NaCl.

NT: no transgénica; T: transgénica.

Raíces de plantas de tabaco que acumulanmanitol y plantas control a los 30 dí as en medio

de cultivo sin sales (izquierda) y conteniendo 250 mM de NaCl (derecha).

NT: no transgénica; T: transgénica.

Transformación de tabaco con el gen de manitol-1P deshidrogenasa de Escherichia coli

Tomado de: Tarczynski et al., Science, 1993.

NT T NT T

NT T

La ruta de síntesis de D-ononitol y D-pinitol a parti r de glucosa 6-P es inducible por sequía y/o salinidad en varias familias de plantas halófilas. En la planta del hielo ( Mesembryanthemun

crystallinum) se ha demostrado la inducción coordinada de la tr anscripción de inps1 y imt1. En cambio, inps1 no se induce bajo estrés y el gen imt1 no está presente en Arabidopsis thaliana.

Ruta de síntesis de D-ononitol y de D-pinitolen la planta del hielo (Mesembryanthemun crystallinum)

Adaptada de : Bohnert and Jensen. Trends in Biotechnology,1996.

Pool de glucosa 6 -fostato

Pool de myo-inositol 1-fosfato

inps1Inositol 1 -fosfato

sintetasa

Inositolmonofosfatasa

imp1

myo-inositol

InositolO-metiltransferasa

imt1

D-Ononitol

D-Pinitol

oep1 Ononitolepimerasa

Fosfoinosítidos, fosfolípidos, fitatos

D-glucuronato -1-fosfato, síntesis de pared celular, galactinol para azúcares de rafinosa

Vía

ubi

cua;

no

indu

cibl

e po

r es

trés

en

Ara

bido

psis

thal

iana

Vía

ubi

cua

y su

ext

ensi

ón, l

a cu

al e

s in

duci

ble

por

estr

és e

n M

esem

brya

nthe

mum

crys

talli

num

Acumulación de mio-inositol y D-ononitol en plantas d e tabaco no transformadas (SR1) y en una línea transgénica ( I5A)

transformada con el gen de imt1 de M. crystallinum en condiciones de carencia de riego . Las plantas fueron privadas de agua durante

8 días. Las plantas I5A exhibieron mayor tasa fotos inté tica, mayor nivel de fijación de CO 2 y mayor recuperación de la fotosíntesis que los controles en condiciones de es trés .

Expresiónconstitutiva del gende la mio-inositolO-metiltransferasa deMesembryanthemumcrystallinum enNicotiana tabacum

Tomado de : Sheveleva et al., Plant Physiol.,1997.

Agrobiotecnología


mio-inositol D-ononitol

CMO: colina monooxigenasa

COD: colina oxidasa

CDH: colina deshidrogenasa

BADH: betaína aldehído deshidrogenasa

GSMT: glicina sarcosinametiltransferasa

SDMT: sarcosina dimetiltransferasa

Fd(red) / Fs(ox): ferredoxina en forma reducida u oxidada

SAH: S-adenosilhomocisteína

SAM: S-adenosilmetionina

Rutas biosintéticas presentes en diferentes organismospara la síntesis de glicina betaína

Adaptado de : Murata and Chen Curr. Opin. Plant Biol., 2002.

Rutas de dehidrogenación/oxidación de la colina

Ruta de metilación de la glicina

a) Plantas

c) Arthrobacter globiformis

b) Escherichia coli

colina glicina betaínabetaína aldehído

colina

colina betaína aldehído

glicina betaína

glicina betaína

glicina betaínaglicina sarcosina (N-metilglicina) N,N-dimetilglicina

Rutas de dehidrogenación/oxidación de la colina

Ruta de metilación de la glicina

a) Plantas

c) Arthrobacter globiformis

b) Escherichia coli

colina glicina betaínabetaína aldehído

colina

colina betaína aldehído

glicina betaína

glicina betaína

glicina betaínaglicina sarcosina (N-metilglicina) N,N-dimetilglicina

Rutas de deshidrogenación/oxidación de la colina

* La ruta de metilación de la glicina fue identificada en dos microorganismos halófilos:Actinopolyspora halophila y Ectothiorhodospira halochocloris

*

- Se transformaron plantas de Arabidopsis thaliana con una construcción que contiene el gen codA de la bacteria del suelo Arthrobacter globiformisdirigido por el promotor 35S de CaMV. Se agregó una señal de transportea cloroplastos a la secuencia del transgén para per mitir la acumulaciónde la enzima en dicha organela.

- El contenido de glicina-betaína en hojas de planta s transgénicas aumentórespecto del control.

Línea 3Línea 2Línea 1Control

0,8 ± 0,31,2 ± 0,20,9 ± 0,20,0Glicina-betaína

1,0 ± 0,30,8 ± 0,21,4 ± 0,31,5 ± 0,3Colina

Contenido (µµµµmol g-1 peso fresco)

- Las plantas transgénicas exhiben tolerancia al est rés salino y a altasy bajas temperaturas.

p35S rbcS tr codA tnos

Transformación de Arabidopsis thaliana con el gende colina oxidasa de Arthrobacter globiformis

Tomado de: Hayashi et al., The Plant Journal, 1997.

Se hicieron germinar 5 semillas de plantas controlesy 5 semillas de cada una de las líneas transgénicas

en placas de Petri suplementadas con varias concentraciones de NaCl. Después de incubar a 0oC

por 2 días, las placas se incubaron a 22oC para permitir la germinación y el crecimiento de plántulas. Se midió la altura total de las plantas desde el tope

de la parte aérea hasta la punta de la raíz a los 5 días de transferir las semillas a 22oC.

300 0,0 0,2 ± 0,0 0,1 ± 0,0 0,2 ± 0,0

100 0,2 ± 0,0 2,5 ± 0,3 2,0 ± 0,1 2,2 ± 0,1

Control Línea 1 Línea 2 Línea 3

200 0,1 ± 0,0 0,8 ± 0,1 0,1 ± 0,0 0,7 ± 0,1

0 3,0 ± 0,3 3,0 ± 0,2 3,0 ± 0,3 3,0 ± 0,2

Tamaño de la planta (cm)NaCl(mM)

Transformación de Arabidopsis thaliana con el gende colina oxidasa de Arthrobacter globiformis

Tomado de : Hayashi et al., The Plant Journal, 1997.

Efecto del estré s salino sobre la germinación y el crecimiento

de plantas transgénicas y control

Efecto del estrés salino en plantas transgénicasy controles desarrolladas

A: Planta control no transgénica

B: Planta transgénica

Transformaciónde Arabidopsis thaliana con el gen de colina oxidasade Arthrobacterglobiformis

Se cultivaron plantas controles sin transformary transgénicas en medio hidropónico por 30 días.Las plantas se transfirieron luegoa medio suplementado con 200 mM de NaCly se las incubó por 10 días con luz.


Agrobiotecnología


5 cm

A B

Inducción de daños visibles en hojas de plantas controles y transgénicas por bajas temperaturas

Se cultivaron plantas transgénicas y controles durante 30 días y se las incubó a 5oC bajo luz continua por 7 días. A continuación, las plantas fueron incubadas en condiciones normales por 2 días.

A: Planta control no transgénica

B: Planta transgénica

A B

Transformaciónde Arabidopsis thaliana con el gen de colina oxidasade Arthrobacterglobiformis


Agrobiotecnología


Efecto de altas temperaturas durante la imbibición y subsiguiente germinación de semillas de plantas no transgénicas y transgénicas. La semil las fueron imbibidas a 22, 40, 50 y 55 oC por 1 hora y luego sembradas en placas. Luego de in cubarlas a 4 oC por 2 días, las semillas

fueron mantenidas a 22 oC por 3 días.

No transgénica Transgénica

22°C 50°C

55°C40°C

Tolerancia a altas temperaturas en plantas de Arabidopsis thaliana que expresan el gen de colina oxidasa de Arthrobacter globiformis

22°C 50°C

55°C40°C

Tomado de: Alia et al., The Plant Journal, 1998.

* No se dispone de datoscodA: gen de colina oxidas de E. coli; cox: gen de colina colina oxidasa de A. globiformis; BetA y BetB: genes de betaína deshidrogenasa y de betaína aldehido deshidrogenasa de E. coli;

Comportamiento frente a distintas formas de estrés de plantas modificadas para sobrexpresar glicina betaína

Adaptado de: Chen and Murata, Curr. Opin. Plant Biol., 2002.

SalinidadSalinidadFrío, salinidad

13 µmol g –1 ps*

0,035 µmol g –1 pf

coxbetAbetA / betB

Nicotiana tabacum

Salinidad0,3 µmol g –1 pfcodADiospyros kaki

Salinidad0,82 µmol g –1 pfcodABrassica juncea

Sequía, salinidad13 µmol g –1 pscox Brassica napus

Frío, salinidadSequía, salinidad

5,3 µmol g –1 pf5,0 µmol g –1 pf

codAbetA (modificado)

Oryza sativa

Frío Frío, salinidadCalor

Luz intensaSalinidad HeladasHeladas, salinidad

1,2 µmol g –1 pf1,2 µmol g –1 pf1,2 µmol g –1 pf

1,2 µmol g –1 pf1,2 µmol g –1 pf1,2 µmol g –1 pf19 µmol g –1 ps

codAcodAcodA

codAcodAcodAcox

Arabidopsis thaliana

Tolerancia aumentada

Acumulación máxima

GenEspecies

SalinidadSalinidadFrío, salinidad

13 µmol g –1 ps*

0,035 µmol g –1 pf

coxbetAbetA / betB

Nicotiana tabacum

Salinidad0,3 µmol g –1 pfcodADiospyros kaki

Salinidad0,82 µmol g –1 pfcodABrassica juncea

Sequía, salinidad13 µmol g –1 pscox Brassica napus

Frío, salinidadSequía, salinidad

5,3 µmol g –1 pf5,0 µmol g –1 pf

codAbetA (modificado)

Oryza sativa

Frío Frío, salinidadCalor

Luz intensaSalinidad HeladasHeladas, salinidad

1,2 µmol g –1 pf1,2 µmol g –1 pf1,2 µmol g –1 pf

1,2 µmol g –1 pf1,2 µmol g –1 pf1,2 µmol g –1 pf19 µmol g –1 ps

codAcodAcodA

codAcodAcodAcox

Arabidopsis thaliana



GenEspecies

Adaptado de: Chen and Murata, Curr. Opin. Plant Biol., 2002..

Tolerancia frente a distintas formas de estrés de plantas modificadas para producir otros solutos compatibles

* No se dispone de datos

SequíaSequíaSequíaSequía

3,2 mg g –1 ps**

90 µg g –1 pf

TabacoPapaTabacoTabaco

TPS1TPS1TPS1otsA, otsB

Trehalosa

Salinidad61,5 µmol g –1 pfCaquiS6PDHSorbitol

Heladas, salinidadSalinidad

600 µg g –1 pf4 mg g –1 pf

ArabidopsisTabaco

Anti-proDHP5CF127A

Prolina

Sequía, salinidad35 µmol g –1 pfTabacoimt1D-ononitol

SalinidadSalinidadSalinidadEstrés oxidativo

10 µmol g –1 pf6 µmol g –1 pf3,8 mg g –1 ps

7 µmol g –1 pf

ArabidopsisTabacoTabacoTabaco

mt1Dmt1Dmt1Dmt1D

Manitol

SequíaSequía

0,35 mg g –1 pf0,5 % ps

TabacoRemolacha azucarera

sacBsacB

Fructano



Planta hospedadora

Gen Solutos compatibles

SequíaSequíaSequíaSequía

3,2 mg g –1 ps**

90 µg g –1 pf

TabacoPapaTabacoTabaco

TPS1TPS1TPS1otsA, otsB

Trehalosa

Salinidad61,5 µmol g –1 pfCaquiS6PDHSorbitol

Heladas, salinidadSalinidad

600 µg g –1 pf4 mg g –1 pf

ArabidopsisTabaco

Anti-proDHP5CF127A

Prolina

Sequía, salinidad35 µmol g –1 pfTabacoimt1D-ononitol

SalinidadSalinidadSalinidadEstrés oxidativo

10 µmol g –1 pf6 µmol g –1 pf3,8 mg g –1 ps

7 µmol g –1 pf

ArabidopsisTabacoTabacoTabaco

mt1Dmt1Dmt1Dmt1D

Manitol

SequíaSequía

0,35 mg g –1 pf0,5 % ps

TabacoRemolacha azucarera

sacBsacB

Fructano



Planta hospedadora

Gen Solutos compatibles

Anti-proDH: ADNc antisentido del gen de prolina deshidrogenasa de A. thaliana; imt: gen de myo-inositol O-metil transferasa de M. crystallinum; mt1D: gen de la manitol-1-fosfato deshidrogenasa de E. coli; otsA y otsB: genes de trehalosa-6-fosfato sintetasa y de treahalosa-6-fosfato fosfatasa de E. coli; P5CS: gen de ∆´-pirrolina-5-carboxilato sintetasa de V. aconitifolia; P5CF127A: gen mutado de ∆´-pirrolina-5-carboxilato sintetasa de V. aconitifolia; SacB: gen de la levanosacarasa de B. subtilis; S6PDH: gen de la sorbitol-6-fosfato deshidrogenasa de manzano; TPS1: gen de la trehalosa-6-fosfato sintetasa de levadura.

Tolerancia a estreses abióticos Bombas de Na+/H+

Agrobiotecnología


El estrés por alta concentración de Na+ da lugar a una señal mediada por Ca2+ que activa el complejo de kinasas SOS3-SOS2, el que a su vez

estimula la actividad de intercambio Na+/H+ de SOS1 y regula la expresiónde distintos genes a nivel transcripcional y post-transcripcional.

Regulación de la homeostasisde Na+ y K+

por la ruta SOS

Adaptado de: Zhu. Annual Review in Plant Biology, 2002.

Agrobiotecnología


H+

exclusión

compartimentalización

exportación

Plantas controles (A) y transgénicas (B) crecidas en 5 mM NaCl

Plantas controles (C) y transgénicas (D)crecidas en 200 mM NaCl

A: Frutos de plantas controles B: Frutos de plantas transgénicas

Tolerancia a estrés salino en plantas de tomate transformadascon el gen nhx1 de la bomba vacuolar de Na+/H+ de Arabidopsis thaliana

Tomado de: Zhang and Blumwald. Nature Biotechnology, 2001

A B

C

D

A B

Tolerancia a estrés salino en plantas de Brassica napus transformadascon el gen nhx1 de la bomba vacuolar de Na+/H+ de Arabidopsis thaliana

Las diferentes líneas transgénicas presentan niveles de expresiónX1OE1: nivel alto; X1OE2: nivel medio; X1OE3: nivel bajo

Plantas transgénicas y control crecidas en 200 mM d e NaCl

X1OE1 X1OE2 X1OE3 ControlesX1OE1 X1OE2 X1OE3 Controles

Tomado de: Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001.

Se transformaron plantas de P. dilatatum con una construcción que permite expresar el gen nhx1 de A. thaliana en forma constitutiva

Texto: Arial 24

Plantas transgénicas (T) y control (WT) regadas co n 250 mM NaCl

T WT T WT T T

Gen

tilez

a: In

g. A

gr. G

. Sch

rauf

Tolerancia a estrés salino en plantas de Paspalum dilatatumtransformadas con el gen nhx1 de Arabidopsis thaliana

Tolerancia a estreses abióticos Sobrexpresión de citoquininas

Agrobiotecnología


• La salinidad y la sequía aceleran el proceso de . senescencia en las plantas.

• Bajo un estrés no letal, las plantas tienden a flor ecer . más rápidamente.

• El estrés modifica la relación fuente/sumidero

• Las citoquininas retrasan el proceso de senescencia

El retraso de la senescencia originada por el estrés puede proveer mecanismos de supervivencia mediante la activación de mecanismos de evasión (regulación del turn-over proteico, mayor eficiencia en el uso de agua, consumo de nutrientes de almacenamiento, retraso dela floración inducida por estrés)

Se expresó un gen de la enzima isopentenil transferasa (IPT) bajo un promotor inducible por senescencia para mantener niveles óptimos de citoquininas y retrasar el estrés inducido por este proceso. La IPT es el factor limitante de la biosíntesis de citoquininas.

Tolerancia a estrés hídrico en tabaco transformado con el gen iptbajo un promotor inducible por senescencia

Agrobiotecnología

Toleranciaa estreses abióticos SARK IPT

El promotor utilizado proviene del gen de una quinasa tipo receptor asociada a senescencia (SARK) de Phaseolus vulgaris.El gen SARK es inducido por este proceso.

Fila superior: sin riego segunda semana Fila inferior: riego restaurado, tercera semana


No transgénica Transgénica

Agrobiotecnología


Gen

tilez

a D

r. E

. Blu

mw

ald


Agrobiotecnología


La tolerancia a estrés hídrico puede visualizarse c omo un carácter de productividad en condiciones de escasez de agua

Plantas transgénicas y control cultivadas en condic iones de riego diario normal (derecha) y bajo 30% del riego diario normal (izquierda)

Gen

tilez

a D

r. E

. Blu

mw

ald

Peso fresco de plantas Producción de semillas

1 L/día 0,3 L/día Sequía

Rendimiento de semillasP

eso

seco

(g

sem

illa/

plan

ta)

Pes

o fr

esco

(g/

plan

ta)

sem

illas

/pla

nta


Agrobiotecnología


Gen

tilez

a D

r. E

. Blu

mw

ald

Tolerancia a estreses abióticos Expresión de factores de transcripción

Agrobiotecnología


Transformación de plantas de Arabidopsis thalianacon el gen del factor de transcripción Hahb-4 de girasol

Agrobiotecnología


La disponibilidad de agua regula la expresión del gen hahb-4en los diferentes órganos de la planta

Gen

tilez

a D

r. R

. Cha

n

Hahb-4 es un factor de transcripción de girasol que pertenece a la familia Hd-Zip. Los factores de est e tipo contienen un dominio de unió n a ADN asociado con un cierre de leucinas y estarían involucrados en pr ocesos del desarrollo vinculados a factores ambientales.


Plantas transformadas con el gen Hahb-4(derecha ) y no transgénicas (izquierda) sometidas a sequía .

Gentileza Dr. R. Chan


Agrobiotecnología


WT T WT T

T WT T WT

Plantas de Arabidopsis

thaliana de 28 días post-

germinación sometidas a

estrés hídrico extremo

Las mismas plantas que en

el panel superior a las 24 h de resumido el

riego normal Gen

tilez

a D

r. R

. Cha

n

Ensayos de campo con plantas de trigo transformadas con el gen Hahb-4 de girasol

Villalonga

a

ab ab

a

ab

b

0

1000

2000

3000

4000

Wild

Type

Ta.IV

.ii.a.

3

Ta.IV

.ii.a.

4

Ta.IV

.ii.a.

6

Ta.IV

.ii.a.

12

BI 300

4

Yie

ld(k

gha

-1)

0

500

1000

1500

2000

Wild type Ta.IV.ii.a.3 Ta.IV.ii.a.4 Ta.IV.ii.a.6 Ta.IV.ii.a.12

Yie

ld(k

gha

-1)

Monte Buey

32°55’08”S62°27’28”W

39°54’51”S62°37’12”W

Villalonga

Monte BueyGentileza Ing. Agr. G. Watson

Tolerancia a estreses abióticos Proteínas LEA

Agrobiotecnología


Se transformaron plantas de arroz con el gen hva1de cebada que codifica una proteína LEA ( Late Embryogenesis Abundant). La secuencia se puso bajo la dirección del promotor de actina de arroz.

Las plantas transgénicas exhibieron mayor crecimientode hojas y raíces en condiciones de estrés.

Planta controlno transgénica (NT) y dos líneas transgénicas (36, 41)que fueron sometidas a tres ciclos consecutivos de estrés hídricode 7 días cada uno, consistentes en 5 días sin riego seguidos por 2 días con riego.

Tomado de: Xu et al., Plant Physiol., 1996.

Sobreexpresióndel gen hva1de cebada (Hordeum vulgareL.) en plantas transgénicas de arroz

Agrobiotecnología


Tolerancia a estreses abióticos Citrato sintetasa

Agrobiotecnología


- Los suelos ácidos y con alta concentración de alum inio resultan tóxicos paralas raíces, las cuales no son capaces de desarrolla rse y absorber los nutrientes disponibles.

- El exudado de ácidos orgánicos produce la quelació n del aluminio produciendotolerancia al mismo.

- Se transformaron plantas de Nicotiana tabacum con una construcción que contieneel gen de citrato sintetasa ( csb) de la bacteria Pseudomonas aeruginosa dirigidopor el promotor 35S de CaMV.

- Se cuantificaron los niveles de citrato en la plan ta y del exudado por las raíces,en raíces transgénicas con CSb y controles sin trans formar.

- Las plantas transformadas toleraron altas concentr aciones de aluminio.

Eflujo de citrato (nmolpor plántula por hora)

Niveles de citrato (mmolpor gramo de peso fresco)Línea

231 ± 15,34,47 ± 0,35CSb-18

163 ± 14,32,31 ± 0,10CSb-15

111 ± 12,61,62 ± 0,08CSb-11

105 ± 12,21,41 ± 0,07CSb-4

57 ± 7,20,43 ± 0,05Control

Tolerancia a aluminio en plantas de tabaco transformadascon el gen de citrato sintetasa de Pseudomonas aeruginosa

Tomado de: de la Fuente et al., Science, 1997.

A B

C

D E F G

IH J

A: Plantas controles germinadasen medio con (derecha) y sin (izquierda) 300 µM de aluminio,2 semanas post-germinación.

B y C: Plantas controles (B)y CSb-18 (C) germinadasen medio conteniendo 0, 75, 300

y 1000 µM de aluminio, 10 días post-germinación.

D y E: Plántulas CSb-4 y CSb-18 de una semana germinadasen 200 µM de aluminio.

H: Segregación del fenotipode tolerancia a aluminioen la progenie de CSb-18 luegode 4 semanas de crecimientoen medio con 300 µM de aluminio. Las flechas indicanlas plántulas susceptibles.

F, G, I y J: Tinción con hema-toxilina de los pelos y la puntade las raíces de plántulas de 7 días tratadas por 1 h con 100 µMde aluminio. (F) y (I) son controlesy (G) y (J) plántulas CSb-18.

Tolerancia a aluminio en plantas de tabaco transformadascon el gen de citrato sintetasa de Pseudomonas aeruginosa


Plantas de papaya ( Carica papaya) controly transformadas con el gen csb a los 30 dí as de

cultivo en presencia de 300 µµµµM de aluminio. Izquierda: planta de papaya transgé nica;

derecha: planta transformada con el vector vacío.

Tolerancia a aluminio en plantas de papaya transformadas con el gen de citrato sintetasa de Pseudomonasaeruginosa


Agrobiotecnología


• En suelos alcalinos (compuestos fosforados con calc io y magnesio) y ácidos (compuestos fosforados con hierro y aluminio) la di sponibilidad de fósforo soluble es baja.

• El exudado de ácidos orgánicos por parte de las raí ces aumenta su disponibilidad.

• Se introdujo en plantas de tabaco el gen de citrato sintetasa de Pseudomonasaeruginosa bajo el promotor 35S de CaMV.

231 ± 15,3595 ± 18Csb-18

105 ± 12,2430 ± 14CSb-4

57 ± 7,2225 ±111522 (control)

eflujo de citrato(nmol por plántula por

hora)

actividad CS (mg CoA min -1mg -1

proteína)Línea

• Las plantas que expresaron la citrato sintetasa fue ron capaces de solubilizary absorber el fósforo inmovilizado en suelos alcali nos.

Incremento de la captación de fósforo en plantas de tabaco que expresan el gen de la citrato sintetasa de Pseudomonas aeruginosa

Tomado de: López-Bucio et al., Nature Biotechnology, 2000.

Crecimiento y productividad de líneas de tabaco CSb sometidas a distintos tratamientos con fósforo. Se cultivaron plantas transgénicas (CSb-4 y CSb-18) y control (1522) en suelo alcalino estéril de bajo contenido de fósforo, con o sin agregado de fósforo. Las plantas fueron fotografiadas luego de 4 meses en el invernáculo.

A: Plantas cultivadas sin agregado de P.e P.

B y C: Plantas cultivadas con el agregado de 22 ó 108 mg de PO4H2Na por kg de suelo, respectivamente

D: Frutos de plantas cultivada con 22 ppm de PO4H2Na

E: Vista superior de una maceta conteniendo la planta CSb-18 en que se observan precipitados de citrato de calcio (flechas).

F-H: Tinción de raíces de la planta CSb-18 con Tryptan blue. F: planta no inoculada. G y H: planta inoculada con la micorriza Glomus fasciculatum

A B C

G

ED

HF



1522 CS-4 CS-18 1522 CS-4 CS-18 1522 CS-4 CS-18

1522 CS-4 CS-18

A B C

D

Efecto de citratoen la acumulaciónde biomasa de plantasde tabaco cultivadasen medio conteniendo una fuente insoluble de fosfato

Se cultivaron plantas transgénicas (CSb-4y CSb-18) y control (1522)en medio (pH 8,0) suplementado o no con 1 mM de ácido cítrico. Las fuentes soluble e insoluble de fosfato (PO4H2Na y Ca10(PO4)6(OH)2) se ajustaron a 1 mM. Las plántulas se cosecharona los 15 días y se determinóel peso seco. Datos promedio de tres experimentos independientes.



Sin

Ejemplos de otros genes utilizados para conferir tolerancia a estreses abióticos

Umezawa et al., Current Opinion in Biotechnology, 2006.









1. Umezawa, T., Fujita, M., Fujita, Y., Yamaguchi-Shinozaki, K. AndShinozaki, K. Engineering drought tolerance in plants: discovering andtailoring genes to unlock the future. Current Opinion in Biotechnology, 17:113-122, 2006.

2. Vinocur, B. And Altman, A. Recent advances in engineering planttolerance to abiotic stress: achievements and limitations. Current Opinionin Biotechnology, 16:123-132, 2005.

3. Zhu, J.-K. Salt and drought stress signal transduction in plants. AnnualReview in Plant Biology, 53:247-273, 2002.

4. Iba, K. Acclimative response to temperature stress in higher plants: approaches of gene engineering for temperature tolerance. AnnualReview of Plant Biology, 53:225-245, 2002.

5. Seki, M., Narusaka, M., Ishida, J., Nanjo, T., Fujita, M., Oono, Y., Kamiya, A., Nakajima, M., Enju, A., Sakurai, T., Satou, M., Akiyama, K., Taji, T., Yamaguchi-Shinozaki, K., Carninei, P., Kawai, J., Hayashizaki, Y. andShinozaki, K. Monitoring the expression profiles of 7000 Arabidopsisgenes under drought, cold and high-salinity stresses using a full-lengthcDNA microarray. The Plant Journal, 31:279-292, 2002.

6. Chen, H.H. and Murata, N. Enhancement of tolerance of abiotic stress by metabolic engineering of betaines and other compatible solutes. CurrentOpinion in Plant Biology, 5:250-257, 2002.

7. Zhang, H.X. and Blumwald, E. Transgenic salt-tolerant tomato plantsaccumulate salt in follage but not in fruit. Nature Biotechnology, 19:765-768, 2001.

8. Zhu, J.-K. Plant salt tolerance. Trends in Plant Sciences, 6:66-71, 2001.

Referencias

Agrobiotecnología


Documents

Resistencia a estres abiotico.pdf