RESPUESTA HUMORAL

Concepto

La respuesta humoral pertenece al sistema inmune específico o adaptativo y esta diseñada para eliminar patógenos extracelulares y evitar la diseminación de los intracelulares.

Engloba a los componentes de la respuesta inmune que van disueltos en los "humores" (líquidos del organismo), es decir a los anticuerpos y al complemento.

Este tipo de respuesta es mediada por los linfocitos B que reconocen al antígeno a través de inmunoglobulinas (anticuerpo) de membrana y de ciertas interleucinas que funcionan como estimulo antigénico para las células B.

Al darse la interacción entre las células B con el antígeno se promueve su proliferación y diferenciación en células plasmáticas (secretar anticuerpo) y en células de memoria.

El anticuerpo actúa como efector de la respuesta humoral, se une al antígeno y neutraliza o facilita su eliminación.

Clasificación de la respuesta humoral

Respuesta humoral primaria: Se produce la primera vez que se entra en contacto con el antígeno (a los 7 días de la primera infección). Las células plasmáticas producen anticuerpos IgM en dosis moderadas hasta que cesa la infección.

Respuesta humoral secundaria: Se produce si se repite el ataque, al cabo de días incluso años, se desencadena la respuesta secundaria, más rápidamente. Las células de memoria producen en poco tiempo (unos 3 días) de 100 a 1000 veces más anticuerpos del tipo IgG (en ciertas situaciones de los tipos IgA e IgE).

Cabe mencionar que dicho tipo de respuestas se llevan a cabo gracias a la interacción entre antígeno-anticuerpo (ag-ac) la cual está dada a través de enlaces no covalentes como las fuerzas de van der Waals, uniones hidrofóbicas, puentes de hidrogeno entre otras que van a permitir la neutralización o eliminación del antígeno por medio de una serie de procesos desencadenados a raíz de la unión. Hay que recalcar que dicha unión es reversible, depende de sus concentraciones y también de la afinidad, cuanto mayor sea ésta, más proporción de moléculas estarán unidas.

Los anticuerpos son los efectores de la respuesta humoral y es el plasma sanguíneo el medio adecuado para el diagnostico inmunológico.

Los derivados sanguíneos son los más utilizados ya que el suero y el plasma son fuente importante de proteína y por lo tanto de anticuerpos que son fundamento en la respuesta humoral.

Además existen otras características que les hacen ser pruebas altamente utilizadas como por ejemplo:

- Resultan en general de fácil realización

- Evitan procedimientos invasivos en ciertos casos

- Aplicación al diagnóstico y a la realización de encuestas epidemiológicas

- Permiten el estudio de Ags y de Acs

- Pueden emplearse de modo Cualitativo o Cuantitativo

a) Cualitativo: Objetivo, conocer la presencia de un Ag o Ac determinado. El resultado se expresa como “+” o “-”

b) Cuantitativo: Permite realizar una dosificación exacta (mg de Ag o de Ac / ml) o aproximada

Existen entonces un conjunto de técnicas que permiten establecer la reacción entre antígeno-anticuerpo, teniendo en cuenta los factores previamente mencionados. Entre estas encontramos ELISA, Aglutinación, Precipitación e Inmunoflorescencia. (Concepto)

CATEGORIAS DE LA PRUEBAS INMUNODIAGNOSTICAS

Pruebas de unión primaria

Miden la cantidad de inmunocomplejos (unión antígeno anticuerpo) utilizando radioisotipos, colorantes fluorescentes o enzimas.

Elisa

Inmunofluorescencias

RIA

Los anticuerpo o antígenos marcados reciben el nombre de conjugados. Los anticuerpos conjugados suelen ser monoclonales o anti inmunoglobulinas.

Pruebas de unión secundaria

Los complejos se agregan y originan fenómenos perceptibles visualmente. Son reacciones no reversibles.

Depende de factores físicos del antígeno, de la temperatura, de los electrolitos presente en la reacción, de la afinidad y avidez en la interacción antígeno-anticuerpo, proporción entre ambos, tipo de inmunoglobulina presente.

La reacción antígeno anticuerpo va seguida de una segunda reacción. Si el antígeno es soluble la reacción que se da es de precipitación. Si el antígeno es particulado (suspensión) la reacción es de aglutinación.

Son de mayor sensibilidad que las anteriores

Aglutinación

Precipitación

Hemaglutinación

Inhibición de la hemaglutinación

Fijación de complemento

Neutralización y seroneutrilización realizadas.

Fases de las pruebas inmunodiagnósticas

Fase pre analítica:

Se caracteriza por el registro de datos, recolección, preparación y conservación de la muestra. Va desde la solicitud de la prueba hasta que la muestra llega al laboratorio, comprendiendo la fase de la preparación del paciente y toma de muestra hasta la preparación de ésta para su análisis.

El producto de esta etapa es la muestra.

Fase analítica:

Se caracteriza por el manejo de la muestra, la bioseguridad, la calidad operacional y el control de calidad interno y externo. Es todo el conjunto de operaciones que se relacionan con la medición y cuantificación de la prueba que se esta estudiando. Engloba las técnicas necesarias para producir un resultado analítico, el cual es el producto de esta fase.

Fase post-analítica:

Se caracteriza por el registro, la interpretación y validación de los resultados, la expresión de los resultados y la expresión de los valores de referencia. Es el conjunto de procesos necesarios para asegurar la calidad del informe del dato obtenido.

Fase preanaltica (pruebas general –sangre)

Instrucciones generales para los análisis de sangre

• No estar tomando antibióticos

• No haber consumido bebidas alcohólicas 48 horas antes de la prueba

• No tener gripa ni fiebre porque podría alterar el resultado

• Evitar el estrés antes y durante la toma de la muestra

- No hacer ejercicios vigorosos durante 3 días antes de tomar la muestra.- Permanecer en ayunas durante 12 horas antes de tomar la muestra.- No fumar antes ni durante la toma de la muestra.- Los pacientes en reposo no deberán cambiar de postura al tomares la muestra.- Suspender anticonceptivos orales durante 7 días.

Muestra

• Suero o plasma en (EDTA, Heparina, Oxalato)

• Las muestras pueden almacenarse por 7 días de 2 a 8 ºC o por 30 días a -20ºC.

• La muestra se congela y descongela solo una vez.

• La muestra descongelada debe homogenizarse

• Eliminar cualquier sedimento por centrifugación o filtración

Análisis de Inmunoabsorción Ligado a Enzima (ELISA)

Conceptualización

Las pruebas de laboratorio para la detección de anticuerpos son principalmente técnicas inmunoenzimáticas. ELISA (Enzime Linked Immunosorbent Assay) fue la primera técnica de este tipo y es ampliamente utilizada para el diagnóstico de muchas enfermedades infecciosas. ELISA se identifica popularmente, como la prueba de detección de anticuerpos para el diagnóstico presuntivo de la infección por VIH.

Las pruebas presuntivas de detección de anticuerpos de este tipo, tienen una altísima sensibilidad pues son capaces de detectar mínimas cantidades de anticuerpos. Esto es muy importante, especialmente en los bancos de sangre. Sin embargo su especificidad nunca es del 100% lo que significa que eventualmente pueden resultar falsamente positivas.

Los Análisis de Inmunoadsorbencia Ligada a Enzimas (ELISA) están tomando un rol importante en los laboratorios médicos y de investigación porque brindan una alternativa viable, mediante la cual es posible realizar la identificación de muchos virus a nivel de género. Estas pruebas están reemplazando a los radioinmunoensayos en muchos laboratorios, por su comparable sensibilidad sin los problemas de manejo, eliminación y corto tiempo de vida de los materiales radioactivos. Entre otros aspectos, ELISA también es denominada o conocida como prueba de Inmunoensayos Ligados a Enzimas (EIA)

Por su objetividad, facilidad de automatización y posibilidad de trabajar con un gran número de muestras, los análisis inmunoenzimáticos, vienen reemplazando parcialmente a una variedad de técnicas en el laboratorio como son inmunofluorescencia y aglutinación.

Ventajas • Los reactivos marcados con enzima son de alta estabilidad. • Permite una completa automatización. • Los resultados son objetivos y pueden ser cuantificados por un espectrofotómetro. • Los Ag o Ac marcados con enzima pueden ser manejados en condiciones normales de laboratorio. • Posee una altísima sensibilidad pues esta prueba es capaz de detectar mínimas cantidades de anticuerpos• Permite trabajar con gran numero de muestras

Desventajas • Diferente afinidad de los Ag para adherirse a la fase sólida • Presencia de reacciones no específicas.

FUNDAMENTO

El fundamento de la prueba inmunodiagnóstica de ELISA se basa en la reacción antígeno-anticuerpo conjugados con una enzima que al interaccionar con el sustrato cromógeno (sustrato incoloro) especifico generan una reacción de color cuantificable en espectrofotómetro a una longitud de onda apropiada (405 nm).

A uno de estos componentes de la reacción antígeno (Ag)-anticuerpo (Ac) se le adhiere la enzima que suele ser una peroxidasa o fosfatasa alcalina.

Al tener lugar la reacción Ag-Ac, la enzima se pone en contacto con un sustrato adecuado y da una reacción que origina una coloración especial que puede medirse espectrofotométricamente. El color se genera por la interacción del sustrato cromogénico y la enzima que ha sido acoplada al anticuerpo detector.

La prueba de Inmunoanálisis ligado a Enzimas son en este momento uno de las pruebas mas utilizadas para la detección de antígenos y anticuerpos. De todos los Inmunoanálisis es el más preciso y permite medir concentraciones muy bajas de un Ag, droga u hormona.

Dentro de los parámetros fisicoquímicos que intervienen en la unión del antígeno con el anticuerpo tenemos:

· Fuerzas de Van der Walls producidas por el movimiento de átomos en la superficie de las moléculas generado por un

cambio eléctrico. Son fuerzas débiles presentes cuando la proximidad del Ag y el Ac es grande.

· Fuerzas electrostáticas originadas por la fuerza de atracción entre moléculas de carga iónica opuesta, como sucede con los grupos NH3+ que reaccionan ávidamente con el grupo COOH-.

· Uniones por puentes de hidrógeno son de carga energética baja entre átomos electropositivos de hidrógeno y átomos electronegativos de oxígeno o nitrógeno.

Por otra parte la clasificación de varios tipos de Elisa:

Elisa Directo

Se utiliza para la detección de antígenos. La fase solida se sensibiliza con anticuerpos y se adiciona la muestra constituida por el antígeno conjugado con la enzima. Luego se le adiciona una sustancia cromógena que reacciona con la enzima al producirse la unión antígeno-anticuerpo. El color se observa con el espectrofotómetro.

Elisa indirecto:

Se utiliza para la detección de anticuerpos. La fase solida se sensibiliza con antígeno. Se adiciona la muestra donde se encuentra el anticuerpo específico para el antígeno. Luego se adiciona un anticuerpo conjugado con la enzima y se adiciona posteriormente la sustancia cromógena.

Elisa tipo sándwich:

Se utiliza para la detección de antígenos. La fase solida se sensibiliza con anticuerpos. Se adiciona luego la muestra con el antígeno especifico. Posteriormente se adiciona el anticuerpo con la enzima conjugada que se une al antígeno que se encuentra fijado al anticuerpo de la fase solida. Se adiciona la sustancia cromógena que reacciona con la enzima para la posterior visualización en el espectrofotómetro.

METODOLOGÍA GENERAL:

Los métodos de ELISA dependiendo de la actividad enzimática se dividen en dos tipos: competitivos y no competitivos.

ELISA COMPETITIVO: En este método, el anticuerpo de la muestra va a competir con el conjugado por un número limitado de sitios de unión del antígeno. Habrá ausencia de color en una muestra positiva debido a que el sustrato no encontrará a la enzima porque el conjugado ha sido desplazado por el anticuerpo presente en la muestra.

ELISA NO COMPETITIVO: Consiste en enfrentar la muestra con el antígeno o anticuerpo que está en la fase sólida. Si una muestra es positiva se formará el complejo antígeno-anticuerpo y al agregar el conjugado reaccionará con el respectivo sustrato desarrollandocolor.

Dentro de los no competitivos tenemos, los directos que detectan antígenos y los indirectos que detectan anticuerpos. En la presente investigación se utilizará la modalidad de ELISA no competitiva indirecta.

PROCEDIMIENTO ESTANDAR ELISA

Fijación del Antígeno a la fase sólida:

La reacción inmunológica tiene lugar en la fase sólida, ésta puede ser de plástico, vidrio o nitrocelulosa. Actualmente los más usados son los de plástico, dentro de éstos los de poliestireno gamma irradiados y los de cloruro de polivinilo porque tienen mayor capacidad para formar enlaces mas estables que los de poliestireno no tratados. Además estos permiten procesar varias muestras simultáneamente y requerir pequeñas cantidades de cada uno de los reactivos.

El antígeno diluido en buffer es adherido a la fase sólida por enlaces electrostáticos entre los sitios activos del plástico y regiones de la proteína responsables de esta interacción. El buffer puede ser carbonato a pH 9.6 o buffer fosfato salino

(PBS 1X) a pH 7.4.

La estabilidad de los enlaces electrostáticos, el tiempo de incubación y la temperatura son factores importantes a tener en cuenta para evitar pérdidas de las proteínas y que pueden afectar la sensibilidad del ensayo.

Reacción con anticuerpo:

La reacción del antígeno con el anticuerpo se debe realizar en condiciones similares a las fisiológicas, pH 7.4, temperatura de 37ºC y concentración salina equivalente a 0.15M de NaCl. Estas condiciones pueden variar dentro de un rango razonable sin afectar la reacción. El tiempo puede variar entre 1 a 3 horas.

Moléculas no específicas en solución pueden adherirse a la fase sólida afectando el resultado final del ensayo, para disminuir este riesgo se suele agregar al medio de reacción un exceso (0.1% a 1%) de una proteína inerte para que compita eficientemente por los sitios de unión inespecíficos en la fase sólida. Esta proteína puede ser seroalbúmina bovina, caseína, suero entero, gelatina u otros.

También es necesario añadir al medio tween 20 para evitar uniones inespecíficas de macromolécula. Por este motivo es agregado en los tampones de dilución y de lavado.

Adición del conjugado enzimático:

El conjugado enzimático se prepara por unión covalente de una enzima con el anticuerpo; esta enzima puede ser peroxidasa de rábano (HPR)con su sustrato Ortofenilendiamina, fosfatasa alcalina (AP) con su sustrato p-nitrofenol o dietanolamina en buffer carbonato PH a 9.6 o beta-galactosidasa con su sustrato o-nitrofenil-beta-galactosido. Los criterios a tener en cuenta en la selección de la enzima apropiada son su toxicidad, estabilidad, disponibilidad, viabilidad de conjugarla eficazmente con el anticuerpo elegido, sensibilidad y precio. Además es importante valorar que la enzima debe reunir condiciones como la temperatura de catálisis, semejante a la reacción antígeno-anticuerpo, dar productos coloreados y solubles al degradar el sustrato y por otra parte no dar productos intermedios de catálisis.

Las condiciones de reacción entre el conjugado y el complejo formado por la unión antígeno-anticuerpo son similares a las descritas en la etapa anterior.

Adición del sustrato:

La elección del sustrato va de acuerdo con el tipo de enzima presente en el conjugado. El sistema AP hidroliza al p-nitrofenil fosfato o p-nitrofenol generando un producto soluble de color amarillo. El sistema HRP reduce al sustrato peróxido de hidrógeno produciendo oxígeno que oxida a otros compuestos cromógenos tales como:

· Tetrametilbenzidina (TMB), cuya oxidación genera un producto de color azul oscuro.

· o-phenylene diamine (OPD), que es oxidado a un producto coloreado que varía del naranja al pardo oscuro.

· Ácido azino-(3-etil)-benzo-sulfónico (ABTS), cuya oxidación genera un producto que va del verde al azul.

La fosfasa presenta una alta estabilidad, razón por la cual es la enzima de elección en muchos procedimientos. La peroxidasa, por su parte presenta un costo mucho menor que las otras; sin embargo, la estabilidad de los productos es muy corta. La beta-galactosidasa es tal vez la mas estable en si misma y la que libera un producto de alta calidad de medición pero es la mas costosa.

La intensidad del color desarrollado es de acuerdo con la cantidad de enzima presente en la reacción. La lectura se realiza en un espectrofotómetro a 405 nanómetros como lo habíamos mencionado anteriormente.

FASES DE LA PRUEBA INMUNODIAGNOSTICA ELISA

Fase solida

Es el soporte de la reacción. La fase solida consiste en la parte solida donde se fijan los anticuerpos para que se dé la reacción. Se han probado diferentes materiales pero los más utilizados son los plásticos como el Poliestireno y el

Polivinilo que pueden absorber proteínas mediante interacciones hidrofóbicas. Estos materiales se escogen en base a el tipo de anticuerpo o antígeno que se quiere determinar. La absorción depende del tipo de proteína, la concentración de esta, y características físicas de la superficie del plástico, el pH, el tiempo y la temperatura. Las proteínas a absorber, son diluidas en una concentración de 1 a 50 micro gramos / ml en una solución de buffer carbonato a pH 9.6. El tiempo y la temperatura de incubación van desde 3 horas a 37º C hasta 18 horas a 4º C o una combinación de los dos.

Conjugados

Dependiendo del ensayo, en la Elisa se utilizan anticuerpos o antígenos unidos a enzimas, lo que se conoce como conjugados. Diferentes formas de anticuerpos son empleados como: policlonales completos (obtenidos de conejo o cabra), isotopos de Ig purificadas, fracciones de anticuerpos como el FAB y anticuerpos monoclonales. Las propiedades deseables de una enzima incluyen alta propiedad de recambio, estabilidad , bajo costo, facilidad de conjugación, ausencia endógena de la enzima en las muestras a analizar, de fácil detección y compatibilidad con las condiciones estándares utilizadas para Elisa.

Las enzimas utilizadas en la marcación son diversas: maleato deshidrogenasa, glucosa deshidrogenasa, peroxidasa, fosfatasa alcalina, betagalactosidasa. Las fuentes de obtención son diversas como tejidos de animales, vegetales como el rábano picante y bacterias como E. coli. Las más usadas en la actualidad son la fosfatasa alcalina y la peroxidasa de rábano picante.

Sustratos

El aspecto más importante para la selección de un sustrato óptimo es que la acción de la enzima sobre el sustrato genere un producto soluble que pueda ser cuantificable. Habitualmente, se utilizan sustratos incoloros que cambian a una solución coloreada que puede ser medida por espectrofotometría en unidades de absorbancia, a una longitud de onda determinada. Otros factores a tener en cuenta son: la sensibilidad, la estabilidad del componente, la toxicidad y el costo.Los sustratos para la peroxidasa de rabano son en general una mezcla entre el sustrato especifico H2O2 y un cromógeno o segundo sustrato, que cambia de color al ser oxidado por el O2 liberado. Los sustratos más conocidos incluyen o-fenilendiamina (OPD) y tetrametilbenzidina (TMB). Para la fosfatasa alcalina el sustrato más popular es el p-nitrofenilfosfato (pNPP) del que se genera el o-nitrofenol de color amarillo.

Lavados

El lavado se utiliza para retirar los reactantes no unidos, se realizan pasos de lavado con una solución como buffer fosfato salino (PBS) a pH 7.2 o con un detergente como el Tween 20.

Análisis del producto coloreado

Algunas reacciones pueden ser visualizadas en forma óptica por el cambio de color, cuando solo se requiera conocer si el resultado es positivo o negativo para el problema en cuestión. Si se necesita conocer la cantidad de color generado en la reacción, se recurre a la medición de la intensidad de color mediante un espectrofotómetro. Para cada color debe estandarizarse la longitud de onda a la cual se presenta máxima absorción. Para el OPD, la lectura se hace a 495 nm, el TMB se lee a 450 nm y el o- nitrofenol muestra máxima absorbancia a una longitud de onda de 405 – 414 nm

Expresión de resultados

Una vez cuantificado el color resultante, este valor debe transformarse en un dato que permita comprender el resultado final de la prueba. Para esto, se dispone de varias formas, dependiendo de las necesidades y de los recursos disponibles. Por ejemplo puede determinarse la concentración del analito en peso (mg a ng). Otro método común es determinar el promedio de las absorbancias de muestras de individuos que no sufran estas patologías y establecer un punto de corte, agregándole el valor a las medias 2 o 3 desviaciones estándar. Ser considera positiva aquella muestra que se encuentre por encima al punto de corte y negativo cuando este por debajo.

Los valores arrojados de la prueba de ELISA se presentan en unidades internacionales sobre mililitros (UI/ml) o ug/ml dependiendo de lo que se esta determinando.

Estos valores se obtienen en títulos de absorbancia o de densidad óptica (DO) y de ahí se extrae un punto de corte. El valor del punto de corte o límite de positividad se calcula a partir de las absorbancias promedio de los controles negativo y positivo.

Los resultados positivos indican DO mayores al punto de corte e implican la presencia de anticuerpos contra el virus.

Interpretación

Reactiva:

Indica valores positivos, lo que significa que se detectaron anticuerpos y es necesario confirmar su especificidad pues la prueba puede ser realmente reactiva o falsamente reactiva. Normalmente se debe realizar otra prueba de detección de anticuerpos y si esta resulta reactiva se debe hacer una prueba confirmatoria como el Western blot.

No reactiva

Indica valores negativos, lo que significa que no se encontraron anticuerpos detectables en el momento de la prueba. Es necesario tener en cuenta el llamado "período de ventana" y analizar la necesidad o conveniencia de repetir la prueba posteriormente.

El período de ventana o ventana inmunológica se refiere al tiempo en el que una persona infectada tarda en desarrollar los anticuerpos al virus. De esta manera, se expresa como el tiempo que se transcurre desde el momento del ingreso del virus al organismo y la producción de anticuerpos detectables. (3 meses máximo)

Si este periodo de ventana inmunológica aún no ha transcurrido totalmente es necesario realizarse otra prueba a los 3 meses para tener la plena seguridad de que esta primer prueba no es lo que se llama un -falso negativo- es decir que salga negativo porque el cuerpo aún no ha reaccionado a la presencia del virus, es decir no ha creado anticuerpos y la prueba de sangre lo que analiza es si ya hay o no hay anticuerpos.

No es posible hacer el diagnóstico mediante el ELISA o las pruebas normales de detección de anticuerpos en el periodo de ventana.

Las muestras que den absorbancia mayores o iguales al punto de corte se consideran positivas para inmunoglobulina M (IgM), en el caso de una infección temprana e inmunoglobulina G (IgG), para el caso de una infección tardía. Para ver reflejada la infección tardía debe repetirse el titulo de IgG, veinte (20) días mas tarde, para determinar el aumento significativo de este valor. En caso de mantenerse constante el titulo, se consideraría negativa la producción de anticuerpos contra el antígeno y por consiguiente se interpreta como ausencia de ese antígeno.

INMUNOFLUORESCENCIA:

CONCEPTO:

Técnica que emplea anticuerpos conjugados a fluorocromos, que al ser excitados con la energía de una determinada longitud de onda son capaces de emitir energía de una longitud de onda mayor. Consiste en una reacción ag-ac que se hace visible por la incorporación de un colorante fluorescente, (isotiocianato de fluoresceína o tetrametil rodamina) al anticuerpo, al ocurrir la reacción se expone a la luz ultravioleta emitida por el microscopio y se evidencia por el fenómeno de la inmunofluorescencia.

Fluorocromos

Cuando la luz es absorbida por ciertas moléculas denominadas fluorocromos, la energía de los fotones puede ser trans -ferida a electrones, que asumen un nivel de energía mayor. Cuando el electrón retorna a su estado de energía vibracio -nal original (nivel de energía menor del estado exitado) algo de la energía se libera dentro de los 10 -15 seg como energía calórica. La energía remanente se libera luego de pocos nanosegundos como un fotón de menor energía que el fotón ini -cial. Este fenómeno se conoce como fluorescencia y la eficiencia se describe con el término de rendimiento cuántico.

Las longitudes de onda que son capaces de que una molécula fluoresca se llaman espectro de excitación y las longitudes de onda donde se emite la fluorescencia se llaman espectro de emisión. El espectro de emisión es ligeramente desplaza -do a una longitud de onda superior que el espectro de excitación.

El isocianato de fluoresceína(FITC) y la fluoresceína muestran una fluorescencia verde manzana bajo la luz ultravioleta y la rodamina anaranjado brillante

La intensidad de la fluorescencia depende de las características fisícas del medio. Algunos fluorocromos son más fluores-centes en medio acuoso (ej. FITC), mientras que otros lo son en medios no polares (ej.dimetilamino naftaleno). El espec-tro característico de la fluorescencia también depende del pH.

Ventajas de la inmunofluorescencia:

- Rapidez en la obtención de datos- Las pequeñas muestras de ag pueden ser fácilmente encontradas- No se necesita esterilizar- Alta posibilidad e dar un diagnostico correcto- Su uso no es solo exclusivo para la identificación de microorganismos, puede ser usada en otros estudios inmu-

nológicos.

Desventajas:

- Equipos y reactivos muy costosos- Necesita personal especializado y debidamente entrenado- Sus resultados no son 100% seguros (como cualquier otra prueba serológica)

FUNDAMENTO:

Compuestos fluorescentes + Anticuerpos = Conjugados

Debe tener:

Fluorescencia intensa Reacción específica con los antígenos

Esto depende de:

Calidad y concentración de los Acs en el suero Propiedades de la sustancia fluorescente Modificaciones que ambos pueden sufrir en el acople

También influyen:

Intensidad de marcación Homogeneidad de marcación Presencia en el conjugado de otras moléculas marcadas

Equipo:

Microscopio con condensador de campo oscuro Fuente luminosa con bombillo de mercurio que produzca luz u.v Se necesita que la luz pase por varios filtros, uno para emitir luz que excite el fluorocromo y otro que excluya la

luz excitante. La fluorescencia alcanza la máxima excitación a 490 nm y emite luz fluorescente alrededor de 520 nm. Las lámparas mas utilizadas son las de tungsteno y mercurio.

Tipos de microscopios usados:

Según la forma en que los especímenes sean estimulados:

- De luz transmitida- De luz incidente: más modernos y mucho más usados

Ver video: http://www.biocientifica.com.ar/es_arg/index.php?option=com_content&view=article&id=42&Itemid=44

TIPOS de inmunofluorescencia:

I.F directa:

Se usa para hallar ag directamente en la muestra, se emplean anticuerpos muy específicos contra el ag marcados con la sustancia fluorescente. Se usa también en la detección de linfocitos y sus subpoblaciones utilizando acs monoclonales. Es una técnica que consiste en demostrar la presencia de un antígeno mediante reacción directa con un anticuerpo específico marcado con colorante fluorescente.

I.F Indirecta:

Se usa para encontrar la presencia de a.c específicos contra un determinado microorganismo, el ac puede ser del tipo M, G, A y se evidencian mediante un anti-anticuerpo marcado con la sustancia fluorescente.

Es una técnica de doble capa en donde se aplica el anticuerpo sin marcar directamente sobre el sustrato de tejido y se visualiza por tratamiento con un suero anti-inmunoglobulina conjugado con fluorocromo.

El proceso consta de dos etapas: en la primera se fijan sobre un portaobjetos los antígenos que constituyen el substrato conocido específico (células que contiene virus, T. gondii, T. pallidum, etc.) sobre él se coloca el suero de quien se sospecha la presencia de anticuerpos específicos, si la reacción es positiva se dará formación de complejo antígeno-anticuerpo no visible ya que el anticuerpo no estaba marcado. En la segunda etapa se debe obtener una anti-inmunoglobulina humana marcada, que reaccionará con el anticuerpo del complejo producido en la primera etapa. La anti-inmunoglobulina se obtiene así: de una mezcla de varios sueros de personas normales, se precipitan las globulinas (anticuerpo), están globulinas son inoculadas a un organismo (conejos, cabras), el organismo producirá antiglobulinas humanas que se marcan con fluoresceína o cualquier otro de los colorantes. Este anticuerpo marcado se unirá al anticuerpo humano no marcado de la primera etapa que en esta momento se puede considerar como un antígeno, dando reacción positiva de fluorescencia solamente si en la primera etapa se produjo unión entre el antígeno fija en la placa y el anticuerpo presente en el suero humano que estamos evaluando. La técnica indirecta tiene como ventajas que la inmunofluorescencia es más brillante que la detección directa debido a que varias anti-inmunoglobulinas fluorescentes se pueden unir a cada una de las moléculas de Antígeno-anticuerpo presentes en la primera capa, además dado que el proceso de conjugación es largo, se ahorra tiempo cuando se estudian varios sueros para la determinación de anticuerpo ya que sólo es necesario prepara un único reactivo marcado : la anti-inmunoglobulina.

Microfluorometría de flujo:

También llamado citometria de flujo con separación, permite el análisis y la separación de muestras basado tanto su florescencia como en sus propiedades de dispersión de luz. Para su análisis las células se introducen en suspensión en un contenedor, por vibración se separa las células a la hacer que pasen por un rayo laser basado en sus diferencias al dispersar la luz o por su emisión de fluorescencia tras la excitación con el rayo.Muy usado en la cuantificación exacta de subpoblaciones, además puede separar la muestra por sus cargas y las distribuye en contenedores separados.

INTERPRETACION:

Directa:

- Al utilizarse un anticuerpo marcado contra un determinado antígeno se puede conocer si el organismo está in-fectado con este virus, bacteria, etc. lo que se denota por la formación de un complejo ag-ac que es visible con microscopio.

Indirecta:

- dado que en este caso lo que se marca es un antisuero para reconocer la presencia de anticuerpos específicos contra antígeno en un huésped, la formación de un complejo que es visible al microscopio de fluorescencia in-forma que existen anticuerpos específicos para determinado antígeno.

PRECIPITACIÓN:

Reacción en la cual un anticuerpo y un antígeno soluble interactúan formando un precipitado visible, es de tipo secundaria, en este tipo una sola unión entre ac-ag no es suficiente, se necesitan varias para que se forme un entrecruzamiento de muchas moléculas de ag.ac lo que formara un precipitado, esto se da en cantidades iguales de ac-ag.Si hay mucho anticuerpo se unirá a una unidad antigénica sin lograr el entrecruzamiento (prozona)Si hay mucho antígeno o poco anticuerpo habrá muchos sitios libres de unión de a.g y tampoco habrá entrecruzamiento (post-zona).

Este tipo de prueba requiere grandes cantidades de ag y ac y no es muy sensible.

FUNDAMENTO:

Al mezclar cantidades suficientes de Ag soluble con Acs específicos, la interacción Ag-Ac puede dar lugar a una red capaz de ser visualizada como un precipitado. Esa red de la que hablamos, no es otra cosa que grandes complejos inmunes (CI) formados por la interacción Ag-Ac. Tal como se observa en la figura, cuando se agregan concentraciones crecientes de Ag soluble a una cantidad fija de suero conteniendo Acs específicos, a medida que la cantidad de Ag agregado aumenta, la cantidad de precipitado se incrementa hasta alcanzar un máximo, luego del cual declina.

En un extremo de la curva de precipitación, cuando se agregan pequeñas cantidades de Ag, los CI se forman en exceso de Ac. En el otro extremo, al agregar grandes cantidades de Ag, los CI se forman en exceso de Ag siendo pequeños y probablemente constituidos por una molécula de Ac y dos de Ag. Entre estas dos situaciones extremas se encuentra la zona de equivalencia, en donde la relación Ag-Ac permite la formación de grandes redes de CI que precipitan.

La reacción de precipitación depende de la VALENCIA del Ac y del Ag. La valencia del Ac da idea del número de sitios que posee para reconocer al Ag. De esta manera:

- La asociación entre Ac bivalentes y Ag multivalentes permite la formación de CI precipitantes. El Ag multivalen-te puede presentar un sólo epitope repetido o varios epitopes distintos.

- La asociación entre Ac bivalentes y Ag monovalentes (un único epitope no repetido) no permite la formación de CI precipitantes.

La formación del precipitado se da en dos fases:

1. Rápida formación de los complejos Ag-Ac. 2. Los complejos se agregan formando micelas o redes que al alcanzar determinado tamaño precipitan.

CLASIFICACION:

Precipitación en medios líquidos

Esta reacción se produce en dos etapas. En la inicial, que se desarrolla rápidamente y es influida muy poco por la tempe-ratura y los electrolitos, se forman los complejos Ac/Ag primarios. A medida que el tiempo transcurre, esos complejos iniciales se agregan, originando micelas de diferentes tamaños, las que finalmente precipitan. Algunos complejos no al-canzan a hacerlo y quedan en solución.

La temperatura acelera esta segunda etapa, siendo además electrolitodependiente.Es mucho más lenta que la inicial, puede durar minutos, e incluso horas, para que se complete.La formación de agregados es una consecuencia de la bivalencia de los anticuerpos y la multivalencia de los antígenos. Con haptenos monovalentes o antígenos que poseen un solo determinante antigénico por molécula, la precipitación no se produce. Un hecho muy particular lo constituyen los anticuerpos monoclonales, que en su mayor parte no muestran actividad precipitante. Ello se debe a que en muchos casos, especialmente cuando están dirigidos contra macromoléculas en solu -ción, reconocen a un único epitope no repetido, lo que les impide formar agregados. La formación de estos diferentes complejos ha sido explicada mediante la llamada teoría del enrejado, que considera que la composición del precipitado formado es una consecuencia del modo en que anticuerpo y antigeno se han unido. Dada la bivalencia del anticuerpo y multivalencia del antigeno, las posibilidades de combinación varían según que en la mezcla exista exceso de antigeno, exceso de anticuerpos o equivalencia de ambos.En la zona de exceso de antigeno, los complejos son solubles.Si bien la precipitación en medios líquidos es muy útil para la identificación de antígenos y anticuerpos, teniendo en cuenta lo anteriormente expuesto en lo relativo a la formación de los precipitados, la misma puede usarse con fines cuantitativos y constituye un buen método para la medida de la concentración de los anticuerpos presentes en un suero. Puede usarse también para medir niveles de antígeno.Precipitación en medios gelificados

Las macromoléculas pueden difundir libremente a través de geles; dicha difusión esta limitada por la concentración del gel. Empleando soportes adecuados, en especial aquellos que como base tienen agar disuelto en electrolitos, es posible hacer migrar antígenos y anticuerpos de modo que al encontrarse interaccionen. Pueden utilizarse también geles con base de pectina, alginatos, pliacrilamida y aun tiras de acetato de celulosa gelatinizado.

Los precipitados que se originan se visualizan como nítidas bandas de precipitación, que permanecerán estables mien -tras un mayor aflujo de moléculas de los reactivos no provoquen su redisolución.Se han descrito numerosas técnicas cualitativas y cuantitativas basadas en este principio, entre las que pueden citarse la difusión simple monodimensional, difusión doble monodimensional, difusión doble bidimensional, difusión radial, etc..

a.Difusión simple:

Se realiza en un soporte-lamina, caja de petri u otro recipiente y se le agrega agarosa para inmudifusion, cuando esto se solidifica se le abren dos huecos equidistantes en los cuales se ubican el ag y en el otro el ac.Se incuba entre 24 y 72 hrs. Durante este tiempo los reactivos migran en el gel.

b. inmunodifusion doble (outhterlony):

los pozos se abren en posición de margaritase puede comparar la identidad de ag o ac vecinos.Se pueden dar reacciones de:Identidad: las líneas de precipitación forman un arco continuoNo identidad: las líneas se cruzanIdentidad parcial: semiarco con una espuela, algunos ag.ac se reconocen y otros no.

Con esta técnica puede tenerse una idea de las relaciones entre los pesos moleculares de los antígenos y anticuerpos reaccionantes. Trabajando con concentraciones óptimas de Ag y de Ac, si la banda de pecipitación formada es recta, in -dica que los pesos moleculares de ambos son muy próximos. Si la banda es cóncava con especto al reservorio del antí -geno, señala que el peso molecular de éste es superior al del anticuerpo, siendo menor en el caso en que la banda pre-sente convexidad.Cuando uno de los antígenos analizados tiene algún componente capaz de dar una reacción cruzada con el anticuerpo elaborado por el otro (identidad parcial), las bandas de precipitación de ambos sistemas se unen y funden parcialmente en una banda, apareciendo una prolongación o espolón en la correspondiente al antígeno que se empleó para la obten-ción del antisuero. Esto indica que en este antígeno hay componentes antigénicos no compartidos con el restante.

c. inmunodifusion radial:

el antisuero es colocado en el agar y el ag en pozos abiertos sobre el gel.Mientras el ag se difunde un anillo de precipitación se forma alrededor del pozo en el punto de equivalencia.Al ser estas pruebas cuantitativas se presentan según controles de concentración conocida con los cuales se elabora una curva en la que se extrapola el valor del suero problema. El hallazgo de este valor permite identificar patologías en las cuales se ve claramente el aumento o disminución de lo que se quiera determinar.

Técnicas inmunoelectroforeticas:

Se usa electroforesis y precipitación en la identificación de ag y ac.Se necesita que los ag migren mientras que los ac no se muevan o lo hagan muy poco, de esta forma se da la interacciona g-ac

a.Inmunoelectroforesis:

separación electroforética en gel de los ag de la muestra, seguida de una inmunodifusion frente antisueros específicos.Entre 24 y 48 horas después se observan las bandas de precipitación de la reacción ag-ac y los geles se pueden lavar y colorear.Utilizados en analizar proteínas séricas.

b. inmunoelectroforesis en cohete:

los mismos fundamentos de inmunodifusion radialse usa para el estudio de elementos de concentración desconocida.Consiste en el transporte electroforético de proteínas antigénicas a un ac especifico, a un PH en el que permanece inmóvil frente al flujo d electronesArea debajo de la punta del cohete es directamente proporcional a la concentración del ag.La agarosa mas usada es la mediana electroendosmosis.

c. inmunoelectroforesis cruzada:

los anticuerpos se separan por electroforesis de zona en gel de agarosa. Después sucede una segunda electroforesis perpendicular a la primera n el mismo gel que tiene los ac.

d. contrainmunoelectroforesis:

el ag debe estar cargado negativamente y el ac positivamente (efecto electroendesmotico) así que al aplicarse una corriente eléctrica migraran en sentido contrario, aceleraran su encuentro y la formación de una línea de precipitación. Muy sensible y fácilmente observable.

INTERPRETACION:

Se analiza basándose en la formación de líneas de precipitación, dado que anteriormente se había colocado un control positivo y otro negativo, uno con anticuerpo específicos para el antígeno y el otro con ningún tipo de anticuerpo, la presencia de líneas de precipitación entre la muestra de suero del paciente, y el control negativo con los antígenos indica la presencia de anticuerpos contra este antígeno y por ende la infección en el paciente seria positiva. Si se forma un alinea de precipitación entre el control negativo y la muestra de antígeno significa un daño en la prueba.

AGLUTINACION

CONCEPTO: Proceso por medio del cual se evidencia una reacción antígeno anticuerpo por medio de la formación de grumos permitiendo labores de clasificación y diagnostico. El aglutinante es el término general que se utiliza para describir los anticuerpos que aglutinan las partículas antígenos, existe la posibilidad de transformación de Ag soluble en Ag particulado.Todos los anticuerpos teóricamente pueden aglutinar partículas de antígenos, debido a su elevada valencia, cabe destacar que la IgM es la mas eficiente aglutinando.

APLICACIONES: Este es un método rápido y sencillo usado ampliamente para identificar: virus, bacterias, grupos sanguíneos. Cuando se usan antigenos conocidos se detectan anticuerpos específicos.Presencia de:

Células completas- Bacterias- Protozoos- Eritrocitos

Partículas inertes- Látex- Bentonita

Gelatina

FUNDAMENTO: Para la realización de la prueba se hace necesario la utilización de suero, ya que los anticuerpos que se van a identificar se producen en este como respuesta a una infección. La reacción de la aglutinación se divide en dos fases, la primera en la que se produce el contacto antígeno-anticuerpo sobre la superficie de la partícula (o célula) empleada, y la segunda en la que las partículas se agregan y se puede visualizar la aglutinación. Podría ocurrir que se produjese la primera fase, pero no la segunda, ello se debería a la presencia de anticuerpos incompletos (subaglutinantes o no aglutinantes) que podrían generar falsos negativos. Ello puede solucionarse modificando las condiciones de reacción. Por lo general la prueba de aglutinacion cualitativa se reaiza sobre un porta objeto. Las reacciones de aglutinación pueden ser, además de cualitativas, semicuantitativas, lo cual se consigue empleando diluciones seriadas de antisuero, valorándose como resultado la mayor dilución a la que se produce la aglutinación.

Efecto ProzonaToda prueba de aglutinación que se ve inhibida por exceso de anticuerpos. Alejando cada vez mas la reacción de la zona de equivalencia.Ocasionalmente, se observa que cuando la concentración de anticuerpos es alta (es decir, diluciones bajas), no hay aglutinación y luego, cuando la muestra se diluye, se produce aglutinación. La falta de aglutinación en las altas concentraciones de anticuerpos se llama el efecto de prozona. La falta de aglutinación en el prozona se debe al exceso de anticuerpos resultantes en los complejos de muy pequeñas que no mata a la forma de aglutinación visible.

TIPOS DE AGLUTINACIÓN:

1.- Aglutinación directa

se presenta cuando un antigeno es particualdo - como es el caso de hongos, bacterias y globulos rojos- y entra en contacto con antiacuerpo correspondiente.Se aplica para detección del grupo sérico ABO, en reacciones fébriles para detectar la posible presencia de anticuerpos en sangre humana para estos antígenos

2.- Aglutinación pasivaCuando la molécula antigénica con la que interacciona el anticuerpo específico no forma parte de la estructura nativa de la partícula, sino que se incluye artificialmente en su superficie, la aglutinación que tiene lugar se denomina genéricamente aglutinación pasiva o indirecta. Se utiliza antígeno soluble, que puede encontrarse adherido a partículas insolubles como látex , polietileno o bentonita. Se aplica para determinación de proteinas virales, bacterianas, micóticas, las reacciones con latex para PCR, RA ( factor reumatoide) y prueba de embarazo

a)Aglutinación de látex

Es un método de laboratorio para examinar ciertos anticuerpos o antígenos en una variedad de fluidos corporales, como la saliva, la orina, el líquido cefalorraquídeo o la sangre.

La muestra se envía a un laboratorio donde se mezcla con gotas de látex cubiertas con un anticuerpo o un antígeno específico. Si la sustancia sospechosa está presente, las gotas de látex se agruparán (aglutinarse).

Los valores normales revelan que no hay aglutinación, Si hay compatibilidad antígeno-anticuerpo, se presentará aglutinación.

b) Aglutinación de partículas de gelatina

c)Hemaglutinación indirecta o pasiva

Determinación de grupos sanguíneos por hemoaglutinación Algunos virus tienen la propiedad de aglutinar eritrocitos de mamíferos o aves permitiendo identificarlos y cuantificarlos. Grupos virales: orto y paramixovirus, alfa y flavirus, coronavirus, Mycoplasma gallisepticum. La glucoproteina sirve como el sitio de recepción para la hemoaglutinina y como sustrato para la neuraminida-sa viral. La hemoaglutinación ocurre cuando la hemoaglutinina actúa de manera reciproca con un receptor especifico en la superficie del eritrocito

Prueba rutinaria de laboratorio, q emplea principios básicos de aglutinación para determinar presencia de aglutinógenos de superficie eritrocitarios

proceso de la muestra Extracción venosa y recolecta en tubo (EDTA) Centrifugación (5minutos a 400 g) Conservación (temperatura optima ) Solución salina ( 1L de agua + 8.5 gr de NaCl) Buffer fosfato

Técnica: Lavado y obtención de glóbulos en solución Centrifugado Lavado ( 2 a 3 veces) suspensión de glóbulos rojos al 3% (1gota globulos y 30 gotas de solucion salina)

Determinación en tubo o micro placas añadir Antisuero ( anti a, anti b, anti d) (10 uL) Añadir Glóbulos en solución al 3% ( 1 gota :50uL) Evaluar

Lavado (se considera como punto critico) Sustraer en tubo paquete globular Enrazar con sln salina Centrifugación (2 minutosa 250g) Repetir tres veces el mismo proceso

PRUEBA DE INHIBICION DE LA HEMAGLUTINACION HI Los anticuerpos contra los virus hemoaglutinantes inhiben la hemaglutinacion al bloquear los lugares de unión. Esta prueba se usa para: Identificar el virus, para medir concentraciones de Ab. Titulo: mas alta dilución que Inhibe la Hemaglutinacion por el No. de DHA Para la interpretación considerar: Método y vía de vacunación. Tipo de vacuna. Edad y fecha de vacunación. Enfermedades inmunosupresoras.

Posibles causas de error: Conservación incorrecta, Formación de pilas, Muestra contaminada, Auto anticuerpo y anticuerpos, Técnica incorrecta.

INTERPRETACIÓNSi al término del periodo de reacción o sea en un tiempo dado no existiese ningún signo visible de aglutinación, se interpretaría como una reacción negativa a ese antisuero.

En cambio, si la reacción es positiva se observa que las particulas aglutinan en segundos

Por ejemplo: Determinación de grupo sanguineo:

Se considera de grupo A si el fenómeno de aglutinación se aprecia solo en la gota a la que se agrego el suero anti A; grupo B si solo hay reacción con al antiB; AB en caso de que la aglutinación suceda en ambas gotas; y O si no se evidencia reacción en ninguna.

VENTAJAS: Muy utilizadas.

Sencillas.

Rápidas.

Cuali o cuantitativas

Económicas

DESVENTAJAS

Muy sensibles.

Reacciones hetero-especificas.

Aglutinación depende de:

Relación Ag-Ac

Temperatura

pH