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Trabajo Practico N°3Trabajo Practico N 3
Cultivo de microorganismos en elCultivo de microorganismos en el
laboratoriolaboratorio
¿Para qué cultivar microorganismos?Para estudiarlos
P é?¿Por qué?Porque es un microorganismo nuevo no caracterizado. Porque tienen
i t i ló i i d t i l ( li t lá t t )importancia ecológica, industrial (alimentos: lácteos, cerveza, etc.),
biotecnológica (producción de compuestos, obtención de genes de interés) y
porque causan enfermedades.p q
¿Cómo?¿Imitando en el laboratorio las condiciones del ambiente natural del
microorganismo, utilizando medios de cultivos y condiciones que sustenten el
crecimiento.
¿Qué factores influencian el crecimiento bacteriano en la naturaleza?
Factores nutricionales
Factores ambientales (físicos)
Factores nutricionales:
Carbono: CO2, compuestos orgánicos.
Nitrógeno: NH3, NO3-, N2, compuestos orgánicos nitrogenados (aminoacidos,
bases nitrogenadas)
Fósforo: PO3-
Azufre: H2S, SO4-, compuestos orgánicos azufrados.
Potasio, magnesio, sodio, calcio, hierro.
El t t C M M Ni Z tElementos traza: Cu, Mo, Mn, Ni, Zn, etc
Factores de crecimiento: vitaminas, aminoacidos, purinas y pirimidinas
¿Qué factores influencian el crecimiento bacteriano en la naturaleza?
Factores ambientales
Temperatura
T ófil 50 60 °C
Disponibilidad de agua (osmolaridad)Termófilos: 50-60 °C
Mesófilos: 20-40 °C
Psicrófilos: 10-20 °C
Halófilos discretos 1-6 % NaCl
Halófilos moderados 6-15 % NaCl
Halófilos extremos 15 30 % NaClHalófilos extremos 15-30 % NaCl
Halotolerantes
pH
Oxígeno
Aerobios estrictos
A bi f lt ti Acidófilos 1.0 - 5.0
Neutrófilos 5.5 - 8.5
Alcalófilos 9 0 10 0
Anaerobios facultativos
Microaerófilos
Anaerobios aerotolrenates Alcalófilos 9.0 - 10.0Anaerobios estrictos
Varias preguntas al cultivar un microorganismo:Varias preguntas al cultivar un microorganismo:
¿Es aerobio, anaerobio facultativo, microaerófilo, anaerobio?
¿Qué sustratos puede utilizar como fuente de carbono y energía?¿ y g
¿Qué formas de nitrógeno puede utilizar?
¿Requiere suplementos nutricionales?¿Requiere suplementos nutricionales?
¿Requiere luz como fuente de energía?
¿Puede crecer sobre un sustrato inorgánico?
¿Cuál es su temperatura óptima de crecimiento?
¿Tolera concentraciones altas de sal?
M di d lti
¿Cómo sustentamos el crecimiento en el laboratorio?
Medios de cultivos
Los medios de cultivo son una mezcla equilibrada denutrientes que en concentraciones adecuadas y concondiciones físicas óptimas permiten un buen crecimiento delos microorganismos.
Fuente de carbono y energía (glucosa o cualquier otro compuesto carbonado)
Fuente de nitrógeno azufre fósforoFuente de nitrógeno, azufre, fósforo
NaCl
Buffer
Agua
Líquidos (caldos)q ( )Sólidos (agar 1,5 %)Semisólidos (agar 0,6 %)
Según la consistencia
Obtención de cultivos puros – Breve historia
1876 Koch Cultivo de MO en medio solido (gelatina y rodajas
de papa) para asegurar cultivos puros.
Postulados de Koch:
1. El microorganismo debe estar presente en todos los individuos con la mismaenfermedadenfermedad.
2. El microorganismo debe ser recuperado del individuo enfermo y poder seraislado en medio de cultivo.
3. El microorganismo proveniente de ese cultivo debe causar la mismaenfermedad cuando se lo inocula a otro huésped
Robert Koch
enfermedad cuando se lo inocula a otro huésped.4. El individuo experimentalmente infectado debe contener el micoorganismo.
1882 Walter Hesse remplaza la gelatina por Agar-Agar, lo que
permitió el cultivo de microorganismo aislados a mayores
temperaturas.
1887 Julius Richard Petri uno de los ayudantes de Koch ideo
una caja o capsula de vidrio para el cutivo de los microorganismo.
Obtención de cultivos puros
Medio Sólido: permite el crecimiento en superficie de los microorganismos como poblaciones discretas COLONIAS Cultivos puros
Medio líquido: Permite la obtención de gran masa celular. Posibilidad de tili d lú ( t di bi í i f t i )utilizar grandes volúmenes (estudios bioquímicos, fermentaciones).
Medio semisólido: Se utiliza para estudios de movilidad, fermentación.
Tipos de Medios de cultivos
Medio definido o sintético: son los medios que contienen una composición
química definida cuali y cuantitativamente. Se utilizan para el estudio dequímica definida cuali y cuantitativamente. Se utilizan para el estudio de
requerimientos nutricionales y para obtener resultados reproducibles.
Medio complejo medios q e contienen n trientes de composición q ímicaMedio complejo: medios que contienen nutrientes de composición química
variable o no establecida. Son mezclas complejas y poco definidas de
nutrientes. Contienen extractos animales, vegetales e hidrolizados deg
proteínas.
Se utilizan cuando se necesita obtener una amplia gama de microorganismos
Medios complejos
Extracto de carne: Se obtiene a partir de la proteólisis de carne magra sin tendones. Es de alto valor nutritivo.
E t t d l d S bti d l t ió dFuente de Extracto de levadura: Se obtiene de la extracción acuosa de levadura de cerveza. Es rico en vitaminas.
Extracto de malta: Se obtiene a partir de la cebada de malta
Fuente de carbono
Extracto de malta: Se obtiene a partir de la cebada de malta. Rica en carbohidratos y maltosa.
Peptona de carne: Digestión de carne bovina con tripsina o p g ppepsina
Peptona de caseína (tripteína): Tratamiento de caseína con tripsina. Altos contenidos en triptofano.
Fuente de nitrógeno caseína con tripsina. Altos contenidos en triptofano.
Peptona de soja: Digestión de soja con papaína.
Gl l i t t b d
NH4Cl, (NH4)2SO4, aa, bases nitrogenadas
Glucosa, sacarosa o cualquier otro compuesto carbonadoMedio definido
Medio mínimo definido para Bacillus megaterium
Medio definido paraMedio definido para Thiobacillus thiooxidans, un quimiolitoautótrofo del azufre
Medio definido para un quimilitoautotrofo que oxida amonio (Nitrosomas)
Medio definido para un quimiorganoheterótrofo
amonio (Nitrosomas)
Medio complejo para p j pquimiorganoheterótrofo (agar nutritivo)
Medio definido para el crecimiento de bacterias quimioorganoheterótrofas fastidiosas como Neisseria gonorreae
Medio complejo paraMedio complejo para bacterias fastidiosas
Medio complejo para halófilos extremos
Efecto del oxígeno sobre el crecimiento
Atmósferas de incubación
Crecimiento en anaerobiosis
E t f jEstufas y jarras de anaerobiosis (generadores de gases)gases)
Creciemiento en bi iaerobiosis
Medios líquidos: Agitación.
Sólidos: en atmósferaSólidos: en atmósfera normal (78 % N2, 21 % O2, 0,03 % CO2)
Temperatura de incubación
Otros medios de cultivo
Medios enriquecidos: medio que tiene un gran exceso de nutrientes y se utiliza para microorganismos que tienen grandes exigencias nutricionales.
Medios diferenciales: medio que permite revelar características fisiológicas de los microorganismos.
Medios selectivos: medio que sólo permite el crecimiento de un grupo de microorganismos e inhibe el de otros. Permite seleccionar y aislar
Medios de enriquecimiento: Es un medio que permite el desarrollo de
microorganismos a partir de poblaciones mixtas.
Medios de enriquecimiento: Es un medio que permite el desarrollo de un grupo de microorganismos a partir de una muestra que contiene una gran variedad de microorganismos. Se utiliza un medio selectivo líquido y se incuba bajo determinadas condiciones.
Agar columbiaCNA
Medio muy nutritivo
Contiene peptonas, extractos de
Medio selectivo
S. epidermidis en agar Columbia CNA
levadura y corazón, almidón.
colistin y ácido nalidíxico Inhiben G -
Agar MRS (Man, Rogosa y sharpe)
Medio enriquecido para Lactobacillus.
Poca selectividadContiene
Extratos, peptonas, glucosa, factores de crecimiento (tween 80, Mn, Mg), citrato (inhibición G -)
Lactobacillus lacticus en MRS agar
Levine EMB Agar
Medio para enterobacteriasMedio para enterobacterias
Contiene:
Peptona
diferencial y selectivo
Peptona
Lactosa
Eosina
Permite diferenciar entre los microorganismo capacesde fermentar la lactosa de los que no.
Azul de metileno
No fermentador de lactosa
Fermentador de lactosaFermentador de lactosa, con brillo verde brillante (E. coli )
Mac Conkey AgarMedio para diferenciar enterobacterias
Contiene:
P t
Selectivo y diferencial
E coli
Peptonas
Lactosa
Sales Biliares y cristal violeta E. coliy
Purpura de bromocresol
Lactosa (+) colonias Amarillas
Lactosa ( - ) colonias transparentes
o blancas
ProteusE. coli
Agar sangreMedio enriquecido y diferencialMedio enriquecido y diferencial
Se adiciona al medio sangre.
Permite el crecimiento dePermite el crecimiento de bacterias con requerimientos nutricionales exigentes .
Permite distinguir tres patronesPermite distinguir tres patrones de hemólisis: α β γ
Agar chocolateMedio enriquecido
Agar con el agregado de sangre, calentado suave. Suministra factores de crecimiento para bacterias exigentes. p g(Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrheae)
Haemophilus influenzae
Agar manitol saladoMedio para aislar StaphylococcusMedio para aislar Staphylococcus
Contiene:
Selectivo y diferencial
Peptonas
Manitol
Cl d di 7 5 % ( 0 5 %)Cloruro de sodio 7,5 % (vs 0,5 %)
Rojo fenol
Fermentación manitol acidez Colonias amarillas
No fermentación manitol Colonias rosadas
S.aureus S epidermidis
Baird-ParkerMedio para distinguir Staphyloccocus aureus.
Contiene:
Selectivo y diferencial
Peptonas
Extractos
Se suplementa con yema de huevo emulsionada con telurito de potasio
Cloruro de litio
Glicina
Piruvato de sodio
Glicina + piruvato promueven el crecimiento dePiruvato de sodio crecimiento de Staphyloccocus
S. aureus
S. aureus reducción telurito a telurio, lecitinasa (-) Colonias negro-grisáceo
rodeada por zona clara
S. Epidermidis reducción de telurito, lecitinasa (+)
Colonias negro-grisáceas, sin zona clara
Agar cetrimida Medio para PseudomonasSelectivo, parcialmente dif i l
Contiene:
Peptona
diferencial
Cloruro de magnesio
Sulfato de potasio
Cetrimida (detergente catiónico
P. aeruginosa en agar cetrimida
Cetrimida (detergente catiónico, bromuro de cetiltrimetil amonio)Adición de ácido nalidíxico
Producción de pigmentos pioverdina Colonias amarillo verdosas
piocianina, piorrubina
pioverdina
Agar MosselMedio para aislar Bacillus cereus
C ti
selectivo y diferencial
Contiene:
Peptonas
ExtractosAdición de yema de huevo yt actos
Manitol
Rojo fenol
de huevo y polimixina B
Bacillus cereus: no es capaz de utilizar el manitol (M -), produce la exo-enzima lecitinasa (L+)
Colonias rosadas con precipitado blanco
e a ec asa ( )
Saphilococcus aureus: es capas de utilizar manitol (M +), no producel i l i i (L )
Colonias amarillas con precipitado blanco
la exoenzima lecitinasa (L-)p p
Salmonella y Shigella AgarM di l ti dif i l S l ll Shi llMedio selectivo y diferencial para Salmonellas y Shigellas
Contiene
Peptonas
Salmonella typhimurium
p
Extractos
Lactosa
Sales biliares y verde brillante
Citrato férrico
Tiolsulfato sódico
Rojo neutroShigella flexneri
Salmonella, producción de ác. sulfìdrico, lactosa (-)
Colonias transparentes con centro negro
Shi ll l t ( ) C l i t tShigella, lactosa (-) Colonias transparentes
E. coli, lactosa (+) Colonias rosadas a rojas
Indicadores de pH
ROJO NEUTRORango de pH: 6.8-8.0 (rojo a amarillo)
AZUL DE BROMOTIMOLAZUL DE BROMOTIMOLRango de pH: 6-7.6 (amarillo a azul).
ROJO DE FENOL
AZUL DE TIMOLR d H 1 2 2 8 ( j ill ) 8 0 9 6 ( ill l)
ROJO DE FENOLRango de pH: 6.8-8.2 (amarillo a rojo)
Rango de pH: 1.2-2.8 (rojo a amarillo) y 8.0-9.6: (amarillo a azul).
PURPURA DE BROMOCRESOLRango de pH: 5.2-6.8 (amarillo a púrpura)Rango de pH: 5.2 6.8 (amarillo a púrpura)
ROJO DE CRESOLRango de pH: 7.2-8.8 (amarillo a rojo).
Técnicas básicas de i bi l ímicrobiología
Siembra en placa:Agotamiento por estríaAgotamiento por estría
Obtención de colonias aisladas
Siembra en agar ginclinado
Inoculaciones en medio solido en tubos
Pasaje de cultivos líquidos
Siembra por extensión y por vertido de placa
Siembra por extensión con espátula de Drigalsky
Medida del crecimiento
Por masa celularPor masa celular
1) Determinación del peso seco /húmedo
2) Determinación del N total : proteico o no proteico
3) Determinación de componentes celulares: ADN, ARN, proteínas
4) Métodos turbidimétricos (densidad óptica)
Medición de la turbidez: métodos espectofotométricos
λ = 600 nm
Curva de calibración
Medida del crecimiento
Por medida del número de individuosPor medida del número de individuos
1) Recuento directoCámara de Petroff-Hauser (para bacterias)Cámara de Petroff Hauser (para bacterias)Cámara de Thomas (para levaduras)
2) Contadores electrónicos de partículas (Contador Coulter)
3) Recuento de viables en placa
4) Recuento de viables sobre filtro en placa
Recuento directo de microorganismos al microscopio
Cámara de Petroff-Hausser
muestra
Área total: 1 mm2
Altura: 0,02 mm
Volumen: 0,02 mm3 = 0,00002 cm3
Nº cél/ml = promedio cél x 25 x 5 104
Recuento de células viables: método de recuento en placa
UFC/ml= N/ (vol x dil)( )
Problemas de Diluciones• DO = 0 35• DO600= 0,35
0,1 DO = 5x108 bact/ml
V final de cada dilución será de 0,1 mlV final de cada dilución será de 0,1 ml
• Un cultivo de E. coli crece en fase logarítmica y tiene una DO de 0,6g y ,
unidades. Se sabe que cuando el cultivo tiene una DO de 0,4 unidades, la
concentración bacteriana es de 1x108 bacterias/ml. ¿Qué dilución haría y
qué volumen sembraría para realizar el recuento de viables cuando la DO
es 0.6 U?.
Conservación de cultivos puros (axénicos)(axénicos)
Preservar la viabilidad y estabilidad genética. Evitar la
En estría sobre agar inclinado en Solo unos meses
contaminación
gheladera (5ºC)
Solo unos meses
Congelados a -20 ºC, –70 ºC ó - De meses a años196 ºC en caldo con 20 % glicerol u otrocrio persevante (por ejemplo leche)
De meses a años
Liofilizados Tiempos largosLiofilizados Tiempos largos
Los repiques sucesivos NO son un método de conservaciónLos repiques sucesivos NO son un método de conservaciónde microorganismos