Tema: 13 CINÉTICA ENZIMÁTICA : REACCIONES REVERSIBLES

1.Reversibilidad en el mecanismo de Michaelis-Menten: Ecuación de velocidad reversible

2. Relación de Haldane

3. Validez de la asunción del estado estacionario

Hasta ahora, en todos los modelos cinéticos estudiados, hemos considerado que la última reacción era irreversible, …..

k1 k2

E + S === ES --------- E + P k-1

…… sin embargo, esta última reacción también puede ser reversible, y de hecho en la mayoría de las reacciones

bioquímicas lo es.

1. Reversibilidad en el mecanismo de Michaelis-Menten

k1 k2

E + S === ES === E + P k-1 k-2

Ecuación de velocidad para reacciones reversible

Es evidente que el mecanismo de Michaelis-Menten, tal y como lo hemos venido usando, es incompleto, y que debemos considerar

también la reversibilidad de la última reacción. Con lo que el nuevo modelo tendrá la siguiente forma.

k1 k2

E + S === ES === E + P k-1 k-2

d(ES)/dt = k1[E][S] + k-2[E][P] – k2[ES] – k-1[ES]

y considerando condiciones de estado estacionario, tendremos:

d(ES)/dt = 0Luego,

k1[E][S] + k-2[E][P] – k2[ES] – k-1[ES] = 0

d[ES]/dt = k1[E][S] + k-2[E][P] – k2[ES] – k-1[ES] = 0

k1([Eo] – [ES])[S] + k-2([Eo] – [ES])[P] – (k2 + k-1)[ES] = 0

k1[Eo][S] – k1[ES][S] + k-2[Eo][P] – k-2[ES][P] = (k2 + k-1)[ES]

k1[Eo][S] + k-2[Eo][P] = (k1[S] + k-2[P])[ES] + (k2 + k-1)[ES] (k1[S] + k-2[P])[Eo] = (k1[S] + k-2[P] + k2 + k-1)[ES]

Despejando [ES],

Intenten despejar [ES]

Recuerden: [E] = [Eo] – [ES]

1221

21

kkPkSk

EoPkSkES

Como se trata de una reacción reversible, la velocidad neta a la que se forma el producto, P, será igual a la velocidad en el

sentido directo () menos la velocidad en el sentido inverso ():

v = k2[ES] – k-2[E][P]

k1 k2

E + S ES E + P k-1 k-2

PESEokESkv )(22

Sustituyendo el valor de [ES]:

Sumando estas fracciones, y poniendo denominador común, obtenemos un numerador que una vez simplificado conduce a la

siguiente expresión:v

PkkPkSk

EoPkSkEok

kkPkSk

EoPkSkkv )(

1221

212

1221

212

1221

2121

kkPkSk

PEokkSEokkv

En el caso particular en el que [P] = 0,

(dividir numerador y denominador por k1).

¿Les recuerda esta ec. alguna otra?

k1k2[Eo][S] – k-1k-2[Eo][P]v = ------------------------------------------ (k1[S] + k-2[P] + k2 + k-1)

Ecuación exactamente igual a la obtenida con la aproximación del estado estacionario de Brigg y Haldane.

SKm

SVv

max

121

21

kkSk

SEokkv

1

12

2

kkk

S

SEokv

¿Qué forma tomara la ecuación de velocidad (reversible) cuando [S] = 0? .

Si bien, con pleno rigor, [S] debería sustituirse por [So] ya que para [P] = 0, la [S] = [So]

NOTA: Es importante tener en cuenta que esta simplificación es posible porque [P] = 0, y no porque hayamos hecho asunción alguna sobre k-2, ya que k-2[P] = 0 si [P] = 0,

independientemente del valor de k-2.

1221

2121

kkPkSk

PEokkSEokkv

En el caso particular en el que [S] = 0,

dividir numerador y denominador por k-2

k1k2[Eo][S] – k-1k-2[Eo][P]v = ------------------------------------------ (k1[S] + k-2[P] + k2 + k-1)

Ecuación exactamente igual a la obtenida con la aproximación del estado estacionario de Brigg y Haldane.

PKmp

PVv

max

2

12

1

kkk

P

PEokv

122

12

kkPk

PEokkv

Kmp

* La anterior ecuación …

la “ecuación reversible general” de la ecuación de velocidad de Michaelis-Menten.

Esta ecuación, respecto de las anteriores, presenta la ventaja de que no se refiere a ningún tipo de mecanismo concreto, y puede

considerarse como puramente empírica.

De hecho existen mecanismos cinéticos mucho más complejos que los que hemos considerado hasta ahora, y que conducen a

ecuaciones totalmente equivalentes a la que hemos obtenido más arriba.

1221

2121

kkPkSk

PEokkSEokkv

2. Relación de Haldane

Cuando una reacción química está en equilibrio, la velocidad de reacción neta es cero, ya que la velocidad de formación () es

igual a la velocidad de descomposición (), y así, si denominamos [Seq] y [Peq] a las concentraciones del S y del P en el equilibrio, sustituyendo en la “ecuación reversible general”:

Para que esta ec. sea = 0 basta con que:

1221

2121

kkPkSk

PEokkSEokkv

eqeq

eqeq

reordenando,

obtenemos,(k1k2[Eo][Seq] = k-1k-2 [Eo][Peq])

(k1k2[Eo][Seq] – k-1k-2 [Eo][Peq]) = 0

k1k2/k-1k-2 = [Eo][Peq]/[Eo][Seq]

k1k2/k-1k-2 = [Peq]/[Seq]

k1k2 --------- k-1k-2

k-1k2 --------- k-1k2

KmP

= 1 x --------- KmS

k2 x ------ k-1

kcat

k-cat

Luego,

k1k2/k-1k-2 = (kcat KmP)/(k-cat KmS) = [Peq]/ [Seq] = Keq

kespecif./k-especif. = Keq

kcat KmP

---------------- = kespecif. x 1/k-especif. =[Peq]/ [Seq] = Keq KmS k-cat

k1k2 --------- k-1k-2

k-1k2 --------- k-1k2

KmP

= ---------

1 x --------- KmS

k2 x ------ k-1

kcat

k-cat

* Esta relación es válida para cualquier mecanismo reversible y que contemple la formación de un sólo complejo intermedio.

* Para mecanismos más complejos, que contemplen la formación de más de un complejo intermedio se obtienen relaciones más

complejas pero similares.

Relación, muy importante en la cinética enzimática y que se conoce como relación de Haldane.

Permite conocer la constante de equilibrio de la reacción a partir de constantes cinéticas

- La relación de Haldane nos permite obtener la constante de equilibrio, Keq, de la reacción a partir de las constantes cinéticas .

Y por extensión, podemos, también calcular el valor de G’º de la reacción a partir de las constantes cinéticas enzimáticas, ya que:

G’º = -RT ln Keq

Relación de Haldane.

Las constantes cinéticas son fáciles de calcular experimentalmente.

3. Validez de la asunción del estado estacionario

En la deducción de la ecuación de Michaelis-Menten, hemos supuesto que se “alcanzaba un estado estacionario”, en el que

d[ES]/dt = 0.

¿Lo aceptamos tal cual? NO

La ecuación:

d[ES]/dt = k1([Eo] – [ES])[S] – k-1[ES] – k2[ES]

es integrable por sí, si consideramos que [S] es constante.

k1 k2

E + S === ES --------- E + P k-1

NOTA: es instructivo intentar obtener una ecuación de velocidad bajo estas condiciones, es decir, sin admitir la existencia de un

estado estacionario, sobre todo porque esto nos ayudará a entender la validez de esta asunción.

d[ES]/k1[Eo][S] – (k1[S] + k-1 + k2)[ES] = dt

Resolviendo, obtenemos,

at

kkSk

ESkkSkSEok

)(

(ln

211

2111

)(

ln

)(

(ln

211211

211 11

kkSk

SEokt

kkSk

ESkkSkSEok

Calculando el valor de la constante a

,

)(

ln

)(

(ln

211211

211 11

kkSk

SEokt

kkSk

ESkkSkSEok

tkkSk

SEok

ESkkSkSEok

tkkSkSEokESkkSkSEok

SEoktkkSkESkkSkSEok

)((

ln

)(ln(ln

ln)((ln

211211

211211

211211

1

1

11

11

que simplificando y reordenando nos da

Operando y tomando exponenciales a ambos lados, tendremos,

y resolviendo para [ES],

- ((k1[S] + k-1 + k2)[ES]/(k1[Eo][S])) = -1 + e– (k1[S] + k-1 + k2)t

((k1[S] + k-1 + k2)[ES]/(k1[Eo][S])) = 1 - e– (k1[S] + k-1 + k2)t

(k1[S] + k-1 + k2)[ES] = (k1[Eo][S]) (1 - e– (k1[S] + k-1 + k2)t)

tkkSkeSEok

ESkkSkSEok )211(211

1

1 (

)(

)1)((

21

)(

1

2111

kkSk

eSEokES

tkkSk

La velocidad de reacción, como sabemos, viene dada por.v= k2[ES]- Sustituyendo,

v = k2[Eo] ((k1[S]) (1 - e– (k1[S] + k-1 + k2)t))/(k1[S] + k-1 + k2)

Y dividiendo por k1 numerador y denominador,

k2[Eo] ([S] (1 - e– (k1[S] + k-1 + k2)t)) v = ---------------------------------------------- [S] + (k-1 + k2)/ k1)

Km

Vmax

)(

)1)((

21

)(

221

2111

kkSk

eSEokkESkv

tkkSk

Luego,

Vmax ([S] (1 - e– (k1[S] + k-1 + k2)t)) v = ---------------------------------------------- [S] + Km

Cuando en esta ecuación, t se hace muy grande (t -> ), el término exponencial tiende a e-, es decir a cero, y la ecuación anterior se transforma en una ecuación exactamente igual a la

de Michaelis-Menten.

Ahora bien, el que el término exponencial pueda llegar a ser despreciable dependerá también en gran parte del valor de (k1(S) + k-1 + k2), así pues,desde un punto de vista real, ¿cuánto tiene

que vale t para que esto se cumpla?

¿Qué hará falta para que esta ecuación sea igual a la que obtuvimos a partir de la presunción de estado estacionario?

= 0

Un sencillo calculo, demuestra que para valores de t > 5 ms (5 10-3 s)

El término exponencial tiene un valor < 0,01

Veámoslo,Si admitimos para (k1(S) + k-1 + k2) un valor de 1000 s-1, valor por otro lado razonable desde un punto de vista práctico, obtendremos:

-para t =4 ms -> e-4 = 0,018-para t = 5ms -> e-5 = 0.007

* En otras palabras, tras unos pocos de milisegundos, ambas ecuaciones son prácticamente indistinguibles

desde un punto de vista práctico.

En la deducción de esta última ecuación hemos supuesto que la [S] era constante, lo que no es totalmente cierto, pues al

comenzar la reacción S comienza a consumirse.

Sin embargo, si partimos de una situación en la que [S] >> [Eo], como generalmente hacemos cuando trabajamos en condiciones

de estado estacionario, la cantidad de S consumido durante el tiempo en que tarda en alcanzarse el estado estacionario, es

insignificante, por lo que podemos despreciarlo sin miedo alguno a cometer o introducir algún error o inexactitud.

RESUMEN

Con la condición de estado estacionario se pueden obtener una ecuación cinética que describe los procesos enzimáticos reversibles

1221

2121

kkPkSk

PEokkSEokkv

Se convierte en una ecuación cinética irreversible cuando se utilizan concentraciones de Productos igual a cero

Relación de Haldane

Permite conocer la constante de equilibrio de la reacción a partir de constantes cinéticas Esta relación es válida para cualquier mecanismo reversible y que contemple la formación de un sólo complejo intermedio

Keqk

k

espec

espec

Se ha demostrado la validez del modelo del sistema estacionario