TRANSGÉNESIS, METODOS Y APLICACIONES

Daniela Flórez Agudelo1, Edwin Santiago Restrepo Bastidas1

1. Estudiantes de pregrado biología, Facultad de ciencia exactas y naturales.

Universidad de Caldas, Manizales

14 Febrero de 2014

Resumen: La transgénesis como herramienta de la ingeniería genética, has sido ampliamente utilizada con el potencial de transformar todo organismo que posea material genético, desde el reconocimiento de los ácidos nucleicos hasta la primera terapia génica aplicada en humanos, involucra un sin fin de procesos, descubrimientos y nuevas metodologías que actualmente envuelven las transformaciones de diversos organismos (bacterias, plantas, hongos, animales y humanos). En esta revisión se fundamenta en los métodos y aplicaciones que se obtienen a partir de estos organismos genéticamente modificados (OGM), muchos de ellos involucrados en mejoramiento nutritivo, resistencias a plagas, vacunas comestible, la creación de proteínas recombinantes, entre otras.

Palabras clave: Transgénesis, metodología, Organismo genéticamente modificados, aplicaciones.

Abstract: Transgenesis as a tool for genetic engineering has been widely used with the potential to transform the entire organism that possesses genetic material from the recognition of nucleic acids applied to the first human gene therapy, involving a myriad of processes, discoveries and new methodologies that currently involve transformations of various organisms (bacteria, plants, fungi, animals and humans). This review is based on the methods and applications derived from these genetically modified organisms (GMOs), many of them involved in nutritional improvement, resistance to pests, edible vaccines, creating recombinant proteins, among others.

Keywords: Transgenesis, metodology, genetically modified organisms, application.

1. Introducción

La existencia de la creciente demanda de productos básicos para la supervivencia humana (por ejemplo: la floreciente necesidad de vacunas económicas, eficientes y seguras (Coku, 2007), aumento notorio de la necesidad de péptidos y proteínas terapéuticas (Almonacid et al., 2005), baja calidad de las tierras cultivadas llevando a malos productos (Ubalua, 2009), entre otras), ha conducido al hombre a buscar respuestas encaminadas en la manipulación genética, una de ella es la ingeniería genética. La transgénesis es una herramienta de la biotecnología moderna, es el proceso de transferencia de genes individuales entre organismos o modificación de los genes de un organismo para suprimir o añadir un rasgo deseado (Ubalua, 2009), según Parmat et al (2011) “La ingeniería metabólica permite el control directo sobre la maquinaria celular del organismo mediante mutagénesis o la introducción de los transgenes”, el Cassette es una porción de ADN que contiene la información de un gen o de varios genes de interés en los cuales se busca agregarlos a un organismo con capacidades elevadas de producción y estabilidad genomica presente en la progenie como sucede en casos de plantas transformadas por Agrobacterium tumefaciens (Shrawat et al.; 2006). Todos los seres vivos pueden sufrir procesos de transgénesis obteniendo así un organismo genéticamente modificado (OGM).

Desde los primeros proceso de transgénesis (1981) en ratones (Peñaranda y Asencio, 2007), ha llevado a investigadores a usarlos para estudio del comportamiento de genes con respectos a enfermedades como la hipertensión (Stec, Davisson yCrut, 1998), algunos organismo modelos como Escherichia coli fueron los primeros en generarles ADN recombinante (1977) para que el mismo

produzca insulina y la hormona de crecimiento reemplazando a los bovinos como antiguos productores (Castañeda et al., 2009; Garrido, 2012). Solo estos pequeños inicios generaron una gran revolución con la capacidad de transformar un sin número de organismo, encaminadas a la producción de vacunas (Coku, 2007), biocombustibles (Hannon et al, 2010), biomonitores, fármacos, alimentos más nutritivos, entre otros. Estos son algunos de los alcances que en la actualidad se han logrado por medio de la transgénesis, se hará mención de alguno de ellos a lo largo de la revisión, incluyendo la historia de la transgénesis, algunos métodos transgénicos actuales en diferentes organismos (animales, plantas y microorganismos) y las aplicaciones que se tiene a partir estos OGM.

2. Historia de la transgénesis

En el siglo XIX un químico llamado Friedrich Miescher encontró un nuevo compuesto, caracterizado por la presencia de fosforo y un pH ácido, a esta sustancia se denominó nucleina, posteriormente (1889) se le acuño el nombre de ácidos nucleicos (Patino, 2006; Castañeda et al., 2009; Gonzalo, 2003), años después se descubrieron las bases nitrogenadas que los forman (1844 Guanina, 1885 Adenina, 1893 Timina, 1894 Citosina y 1900 Uracilo). Ya entrando en el siglo XX exactamente en 1903 Walter Sutton mostro al cromosoma como el transportador del material genético, posteriores estudios determinaron que había herencia ligada al sexo (Thomas Morgan), que los ácidos nucleicos contenían fosfatos, pentosas y bases nitrogenadas (Aaron Theodore), que existen mutaciones producidas artificialmente, tal es el caso de los Rayos X (Herman Müller) (Patino, 2006).

El principio del traspaso del Material genético se determinó parcialmente gracias al experimento de Federic Griffith (1923) que descubrió la existencia de un principio transformante, observando el fenómeno de como cepas avirulentas de la bacteria Streptococcus pneumoniae (Rugosas) por algún motivo se volvían cepas virulentas (lisas) (Patino, 2006), no fue hasta 1944 que Oswald T. Avery y colaboradores encuentran que el principio transformante era la trasferencia de un fragmento de ADN (Castañeda et al., 2009), ya el culmen definitivo de que el ADN era el principio transformante lo lograron los esposos Martha Chase y Alfred Hershey en 1952, el cual experimentaron con el bacteriófago T2 y la bacteria Escherichia coli demostrando al utilizar isotopos radiactivo (ADN 32P y Proteína 35S) que el ADN es la molécula hereditaria (Patino, 2006; Castañeda et al., 2009), en los años 50s Watson y Crick desvelan la estructura molecular del ADN en 1953 basándose en lo encontrado por Erwin Chargaff (complementariedad de las bases nitrogenadas), la controversial foto 51 realizada por R. Franklin y M. Wilkins (muestra que la estructura del ADN es repetida), entre otras (Gonzalo, 2003).

Otros componentes del dogma central de la biología fueron descubiertas, tal es el caso de los tipos de ARN: el ARN ribosomal en 1952, el ARN de transferencia en 1958 y 1960-1961 el ARN mensajero, culminando con el descifrado del código genético. Ya en la década de los 70s se descubre las enzimas de restricción, se da el primer clonaje de genes en vectores (plásmidos), se produce en 1973 el primer organismo con ADN recombinante (Castañeda et al., 2009), se empieza a desentrañar los mecanismos por el cual una bacteria Agrobacterium tumefaciens infecta a las células huéspedes (García, 2012) y en 1975 se funda la primera empresa de ingeniería genética (Genentech Incorporated) y en 1977 implanta en Escherichia coli el gen humano de la somatotropina para que este organismo produzca las hormona de crecimiento humana (Castañeda et al., 2009; Garrido, 2012), otro gran descubrimiento en la ingeniería genética fue realizado por Sanger, Maxam y Gilbert

quienes en sus trabajos publicaron metodologías para la secuenciación de la molécula de ADN (Garrido, 2012).

A partir de todos estos descubrimientos, en 1981 mediante el uso de genes inyectados de pronúcleos de cigoto se logró una transformación estable en ratones (Peñaranda y Asencio, 2007), se presentaron los primeros reportes científicos de plantas transformadas en 1983 tales como plantas de tabaco, de petunias y girasoles (Valderrama, Isaza y Kafuri, 2005), en ese mismo año se encontraron los puntos clave para el uso de Agrobacterium tumefaciens en el traspaso de genes (Garcia, 2012), en 1985 Kary Mullis inventa la técnica de PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) (Garrido, 2012), Sanford y colaboradores introducen en 1987 el mecanismo de bombardeo de partículas dándole el nombre de “biolistica” (Gonzales, 2013). En 1990 se dio la primera terapia génica por el Dr. French Anderson y colaboradores aplicada a una niña de 4 años (Gonzalo, 2003; Garrido, 2012).

En los años 90s se empieza los procesos de secuenciación de genomas completos empezando por Haemophilus influenzae (1995), de Saccharomy cescerevisiae (1996), del gusano Caenorhabditis elegans (López, 2008) y logrando en 2003 donde tanto entidad pública (Francis Collins) como privada (Craig Venter) secuencian el genoma humano, posteriormente en 2010 se sintetizo químicamente un organismo Mycoplasma capricolum(Garrido, 2012).

3. Tipos de transgénesis, métodos y aplicaciones

3.1. Transgénesis en microorganismos

Los microorganismos para convertir los carbohidratos, compuestos lignocelulosicos y otros desechos en alimentos ricos en proteínas son eficientes debido a su capacidad de crecimiento rápido, ser fácilmente modificados genéticamente, crecer en diferentes ambientes (suspensiones o en sólidos) además de presentar altos contenidos de proteínas entre el 35 al 60% (Ubalua, 2007). Estas grandes características llevo a que estos organismos fueran el primer foco de atención para procesos de transformación genética.

Generalmente los procesos de transformación en microorganismo se dan por electroporación y agentes químicos con choque térmico (Figura 1).Actualmente para organismo recalcitrante como Streptococcus mutans los aminoclays han sido exitosos para transformarlos (Choi et al, 2013).

El proceso de electroporación consiste en la formación de poros en la membrana del organismo de interés, generado por un choque eléctrico de corta duración, que en consecuencia aumenta la permeabilidad de la membrana permitiendo que el ADN de interés (plásmido) entre a la célula, es un proceso reversible. Las células electrocompetentes (cepa) y los plásmidos con los genes de interés son colocados en celdas de electroporación, en condiciones específicas (Reyes et al., 2010). El principal problema con este método es la presencia de alta mortalidad celular (Li et al., 2007).

En la transformación por choque térmico, el objetivo radica en aumentar la temperatura abruptamente aproximadamente a 42 °C (Sha et al., 2011). Según Li et al (2007) “dos elementos claves se utilizan en la transformación del ADN por choque térmico: primero es que las células bacterianas hayan sido tratadas previamente con CaCl2, para hacer la membrana celular más permeable y segundo un ADN circular recombinante (plásmido), un ADN circular con el gen diana a

ser transferido dentro de la célula”, en este proceso el plásmido debe contener un gen de resistencia a antibióticos para la selección de cepas transformadas.

Los aminoclays o 3-aminopropil filosilicatos fue un método creado en 1997, son compuestos que constan de cationes metálicos (generalmente Mg2+ o Ca2+) que son la columna vertebral de la estructura la cual esta intercala por grupos amino unido por enlaces covalente. Estos animoclays forman un complejo con el plásmido (complejo ADN-aminoclay) lo cual facilita la penetración del plásmido por la membrana del organismo. Esta técnica es más efectiva cuando el catión tiene menor tamaño, además que es útil para transformar cepas nativas, como es el caso de Streptococcus mutans (Choi et al, 2013).

Bacteria Plásmido

Poro

Electroporación Choque térmico

42 °C

Ambas técnicas generan poros reversibles en la membrana, vía de entrada para los plásmidos.

Se obtiene las bacterias con el plásmido de interés

Figura 1 Métodos de transformación en microorganismos.

Cassette

C C

3.1.1 Aplicaciones

El primer organismo con ADN quimérico fue realizado por la primera compañía de ingeniería genética (Genentech Incorporated), el cual en 1977 transformaron a Escherichia coli para que produjera la hormona de crecimiento humana (Castañeda et al., 2009; Garrido, 2012). Según Ubalua(2009) “algunos microorganismos son utilizados para producir ingredientes alimentarios tales como ácido acético, ácido cítrico, etanol, niacina, vitamina B 12, goma de xantano, y el glutamato monosódico”.

Los procesos de electroporación se ha realizado para transformar cepas de Agrobacterium tumefaciens, punto importante para los procesos de transformación a partir de este organismo en plantas.

Muchos microorganismo han sido el foco para la generación de vacunas génicas, tal es el caso de Salmonella spp para combatir contra la Vaccinia, Bacillus para el picornavirus y Escherichia coli contra la varicela-zoster (López et al, 2004). Algunas cepas como la S. typhi Ty21a es efectiva contra la fiebre tifoidea y la cepa de V. cholerae produce vacuna contra la cólera (Guillén, Mendieta y Sanoja, 2009).

3.2. Transgénesis vegetal

Según Gonzales (2013) “La transformación genética en plantas presenta varios métodos que permiten la introducción e integración de ADN foráneo en el genoma y así poder seleccionar eficientemente las células transformadas permitiendo la regeneración completa de las mismas”, los métodos básicos para la transgénesis vegetal son mediante Agrobacterium tumefaciens y biolística (Figura 2).

3.2.1Transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens perteneciente a la familia Rhizobiaceae, genero Agrobacterium, es una alfa-proteobacteria (Garcia, 2012),que se presenta naturalmente en el suelo y produce la enfermedad nombrada como “agalla”, que se caracteriza por la neoformación del tejido vegetal de la planta afectada (Gonzales, 2013). Agrobacterium tiene la capacidad de transferir parte de su ADN al genoma de su huésped especialmente en células vegetales (Ziemienowicz, 2013). Principalmente causa el tumor en la mayoría de la dicotiledónea y en algunas monocotiledóneas (García, 2012). La transformación por este organismo ha demostrado ser un método eficaz para la eliminación de genes marcadores a partir de cereales transgénicos, en la regeneración de plantas con número bajo de copias del transgen, además que son más estable en las generaciones y reduce el silenciamiento de genes (Shrawat et al.; 2006).

El traspaso de genes por Agrobacterium tumefaciens a las células vegetales consiste en seis pasos:

(1) Selección del vector (plasmido) y cepa bacteriana.

Desde el descubrimiento de vectores binarios en los cuales un plásmido contenía los genes vir y el otro el ADN-T, han permitido mejorar los sistemas de transformación en plantas, algunos aplicados como pBIN, pCB, pGA y pGreen que se caracterizan en el tamaño, en el número de restricciones del DNA-T, presencia de genes reporteros, orígenes de replicación y el sistema de selección en

bacterias y plantas con respecto al nativo. Algunos plásmidos usados ampliamente son pCAMBIA, pSITE, pBIN, pEND4K, pGPTV, entre otros (García, 2012).

Algunas cepas como LBA 4404 (Shrawatet al., 2006) y EHA 101C58 de Agrobacterium tumefaciens viene conplásmidos (pTiBo542 y pFAJ3000) que contienen resistencia a antibióticos específicos como es el caso de la Kanamicina, Estreptomicina y Espectinomicina como marcador de transformación y otros genes como Intron β-glucuronidasa (uidA) de carácter informador (Hamama et al., 2010).Otras cepas pertenecientes a Agrobacterium de origen Cromosomal C58 son la GV2260, EHA105, EHA101, AGL-1 y de origen Ach5 la cepa LBA 4404 (García, 2012).

(2) Construcción del Cassette

El Cassette contiene los genes de interés además del promotor, terminador (Secuencias poli A) y secuencias pegajosas (Sticky ends) que la enzima de restricción especifica reconocerá, son los que forma el material genético que Agrobacteriumintroducirá en el genoma vegetal. Hay dos formar en que se puede construir un Cassette:

(a) Consisten en tomar antecedentes del gen de interés (buscar secuencia ya estandarizadas en el Genbank u otra base de datos) por medio bioinformáticos.

(b) Consiste en determinar experimentalmente un gen de interés el cual se le realizaran estudios moleculares para posterior secuenciación.

Después se reconoce la secuencia y se manda a crear el Cassette para su posterior integración al vehículo (plásmido).

(3) Clonaje del Cassette en plásmido

En la integración del plásmido con el Cassette se busca que este produzca grandes cantidades de copias, la cepa generalmente utilizadas es la Escherichia coli, la cual se encarga con su maquinaria celular producir la clonación del plásmido, a lo largo del proceso estas cepas son colocadas en un medio de selección, además de realizarse un proceso molecular (PCR) para determinar si el plásmido de interés está en la cepa (Reyes et al., 2010).

(4) Transformación de Agrobacterium

Para transformar la cepa de Agrobacterium, primero se extrae de Escherichia coli los plásmidos clonados, para que después por procesos de electroporaciónse le introduzcan a Agrobacterium.En un acaso particular utilizaron alícuotas (1mg) que contenía el plásmido de interés y se añadieron 100ml de células de Agrobacterium en un medio LB (Luria Bertani) y posterior a la transformación se confirma la presencia del Cassette por asilamiento de ADN y análisis de restricción(Shrawat et al.; 2006). Se realiza proceso de selección (Resistencia a antibiótico).

(5) Transformación Vegetal

(a) Preparación de Agrobacterium

Generalmente la preparación de las cepas transformadas de Agrobacterium se da en medio LB, que consiste en tres componentes principalmente, un mineral NaCl, la triptona (fuente de péptidos

pequeños y aminoácidos) y extracto de levadura (subproducto de la digestión de Saccharomy cescerevisiae (Garboza et al., 2011), además de contener el antibiótico respectivo. En el caso de las cepas LBA4404 (pUAGB7) y LBA4404 (pYF133) estas se incuban durante 3 dias a 28°C, para posteriormente ser recogidas y aplicadas al co-cultivo con el material vegetal a transformar(Shrawat et al., 2006).

(b) Preparación de tejido vegetal

El tejido a utilizar puede provenir de muchas partes de la plantas desde disco de hojas (Hamama et

al., 2010), semillas (Chaudhury et al., 2006), embriones (Shrawat et al., 2006), entre otras. Al tejido seleccionado se le hace un proceso de esterilización y se le corta en porciones específicas para que Agrobacteriumpueda infectarlo.

(c) Inoculación / Infección

Tanto la preparación de Agrobacteriumy el material vegetal se reúnen en un recipiente donde ocurrirá la infección (paso del transgen al genoma de la planta), se realiza un medio de selección con el antibiótico especifico. Shrawat y colaboradores (2006) utilizaron entre 40 y 50 embriones inmaduros que sumergieron en 10-15 ml de medio de co-cultivo líquido (PL-CL) que contiene células de Agrobacterium en la densidad de 109 células / ml, todo lo anterior se colocó en una placa de Petri de un diámetro de 100 mm.

El tiempo de exposición a la infección es un factor primordial para lograr una tasa de transformación alta, la mayoría de las especies el óptimo tiempo de infección es de 48-72h (Ziemienowicz, 2013).

(d) Inducción de genes vir

La maquinaria molecular que posee Agrobacterium tumefaciens ha sido ampliamente estudiada, este organismo posee grupos de genes que le permite reconocer la célula vegetal y de allí transportar su ADN-T e integrarlo al genoma del huésped, el objetivo de este sistema resulta en suprimir el sistema inmune de la planta (Pitzschke y Hirt, 2010).

Generalmente los portales de entrada para Agrobacterium tumefaciens son heridas en el individuo, estas heridas provocan la formación de fenoles y azucares, señales que la proteína VirA reconoce, luego un mecanismo de activación (fosforilacion) hacia VirG genera la posterior expresión de los genes vir (virA, virB, virC, virD, virE, virF y virG), la proteína VirD2 captura el ADN-T y lo saca del plásmido para transportarlo, las proteínas VirB1-11 genera pequeños puentes entre la bacteria y la célula vegetal, estos puentes son la entrada de los factores vir (virE2.virE3 y virF) y el paso del ADN.T, cuando los factores vir se encuentra en la célula vegetal se unes a VirB1-11 que lleva el ADN-T, para posteriormente conducirlo a la integración en el genoma vegetal (Pitzschke y Hirt, 2010).

(e) Selección / Regeneración vegetal

El proceso de selección usualmente se utiliza Kanamicina, timentina, estreptomicina, entre otras. Al presentarse el traspaso del Cassette al genoma vegetal este adquiere la resistencia al antibiótico de selección, de allí determinar que células fueron transformadas. Para los procesos de regeneración diferenciadas por los requerimientos individuales de la planta ya transformadas, se concibe tres posibilidades ya sea por organogénesis (Shrawat et al., 2006), callogénesis y embriogénesis.

Permiten empezar la formación de callos, o estructuras diferenciadas que en su genoma tiene ADN foráneo, se inducen mecanismo de crecimiento y enraizamiento hasta la presentación de una plántula para ser llevada después a un invernadero.

(6) Confirmación molecular del transgen

Los procesos moleculares determinan la presencia de un gen de interés, generalmente se llevan a cabo procesos de amplificación de secuencias especificas (PCR) (Chaudhury et al., 2006; Hamama

et al., 2010), otros autores optan por otras herramientas como análisis por restricción (Southern blot) (Shrawat et al., 2006), aplicadas a ARN (Northern blot) y a proteínas (Western blot).

3.2.2. Transformación mediada por biolística.

La técnica de biolística (balística biológica) es un método que consiste en el bombardeo de microproyectiles de oro o tungsteno de tamaño de 1.3 µm cubiertos con el ADN de interés, el cual es lanzado a la célula para transformarla, estas micropartículas son aceleradas por pólvora, helio o aire comprimido (Gonzales, 2013),

La transformación mediada por biolística consiste en cinco pasos:

(1) Selección de partículas

Para la selección de la partícula se busca una compuesto inerte que no interaccione con el ADN, oro o tungsteno aproximadamente 1.3 µm de tamaño son los más usados (Thomson, 2004; Gonzales, 2013). Algunas plantas son susceptibles al tungsteno (toxico), por ende se tiende a utilizar el oro (Clark y Pazdernik, 2012).

(2) Construcción del Cassette

La construcción del Cassette es igual que el presentado en Agrobacterium tumefaciens.

(3) Preparación de la partículas/Bombardeo

Todo el equipo consiste en varias partes,la inserción del Cassette a las partículas es una de ellas, generalmente consiste en desinfectar las partículas, precipitar el plásmido sobre ella (contiene ADN, Partículas de tungsteno, CaCl2), centrifugar las muestras, todo el proceso se realiza en una cámara de flujo laminar.Las muestras vegetales previamente tratadas se colocan en una caja de Petri en el sistema de flujo de partículas, este contiene la pistola donde se cargara y dispara las partículas, una manguera del paso del aire o helio y una malla para direccionar la ráfaga de partículas hacia las células a transformar (Chavarri et al., 2004).

(4) Selección/Regeneración de células vegetales (in vitro)

Después del bombardeo, las células son transferidas a un medio de selección que contiene el antibióticoespecífico. Las células embrionarias bombardeadas son transferidas a un medio B5 durante 3 meses, subcultivadas una vez al mes (Chavarri et al., 2004), posterior a ellos las células transformadas ya sean por organogénesis, callogénesis o embriogénesis, se empiezan a diferenciar, formar plántulas para luego pasarlas al invernadero.

(5) Confirmación molecular del transgen

Los procesos de reconocimientos de secuencias especificas (transgen) es igual a la presentada por Agrobacterium tumefaciens.

Planta de interés

Agrobacterium tumefaciens Biolística

Cepa bacteriana

Vehículo (plásmido) Selección de partícula (1)

(a) Bioinformática Construcción del Cassette (b) Experimentación (2)

(3) Clonación del plásmido (3) Preparación de partículas (4) Transformación de Agrobacterium (Plásmido) (5) Transformación de Planta

- Preparación del M. Vegetal - Preparación de Agrobacterium - Infección (4) Selección/Regeneración - Inducción de genes vir - Regeneración

(6) (5)Convenciones

Gen de selección (antibiótico)

Genes vir Planta transgénica

Figura 2. Pasos para la transformación mediante Agrobacterium tumefaciens y biolística

Stickyend

Stickyend

Promotor Terminador (PoliA)TRANSGEN

Reconocimiento del transgen por Técnicas moleculares (PCR,

Southernblot, Northernblot, entre otras.)

3.2.3 Aplicaciones

La transformación en plantas ha sido ampliamente utilizada en la formación de cultivos transgénicos para mejorar características como valor nutricional (Ubalua, 2009), resistencia a plagas (Dale et al., 2002), pigmentación floral (Hamama et al., 2010), producción de fármacos (Coku, 2007; Almonacid et al., 2005) y como biomonitores (Ziemienowicz, 2013). Algunos organismo como algas han sido genéticamente modificadas tal es el caso de Chlamidomonas reinhardtii (Radakovits et al., 2010), Nannochloropsis sp (Anandarajah et al, 2012),Dunalliela tertiolecta (Georgianna et al, 2012) y Phaedodactylum Tricornutum (Radakovits, Eduafo and Posewitz, 2010), encaminadas en mejorar la producción de biocombustibles.

La resistencia a plagas fue uno de los primeros focos para procesos de transgénesis, el ejemplo más nombrado es el caso del Bacillus thuringiensis (Bt) que es una bacteria del suelo inofensiva que produce una toxica letal para ciertos insectos (Dale et al., 2002) y que ha sido ampliamente utilizado como agente biológico para el control de plagas debido a la producción de proteínas (insecticidas), una de estas proteínas es codificada por el gen (Cry) que produce endotoxinas deltas el cual fue transferido a Zea mays (Belzile, 2002).

Los procesos de transformación genéticas se han aplicado a mejorar el valor nutricional de algunos alimento, estas transformaciones mediante Agrobacterium tumefaciens han permitido aumentar los niveles de Beta-carotenos en canola, soya y maíz, aumentar la composición de aceites y aumentar los niveles de vitamina A en el arroz (Ziemienowicz, 2013).

En la horticultura la transgénesis mediada por Agrobacterium tumefacienstiene un gran potencial y ahora hay algunos ejemplos de variedades transgénicas ornamentales que están disponible tales como Hydrangeamacrophylla (Hamama et al., 2010), Clavel (Dianthuscaryophylus), Crisantemos (Dendranthemax glandiflora),Orquideas (Cymbidium spp., Oncidium, Phalaenopsis), Petunia (Petunia hybrida), Rosa (Rosa hybrida) (Ziemienowicz, 2013).

Los logros obtenidos por la trasformación de plantas mediada por Agrobacterium tumefaciens según Ziemienowicz (2013) “han permitido la producción de varias proteínas, tales como anticuerpos recombinates (planticuerpos) y vacunas comestibles, por ejemplo: enterotoxina de Escherichia coli, proteínas de la capside del virus de Norwalk, el antígeno de superficie de la hepatitis B, proteínas del virus de la fiebre aftosa por la alfalfa transgénica”, al utilizar papa transgénica como transportador de anticuerpos facilita su uso (Ziemienowicz, 2013), evitan la contaminación por patógenos humanos como puede ocurrir en los cultivos de células de mamíferos además de que estos organismos (plantas) producen mayores cantidades de proteínas, actualmente, las vacunas contra el ántrax y virus de la rabia se están produciendo en plantas (Coku, 2007). Otras aplicaciones de plantas transformadas se muestran en la figura 3.

En la transformación de algas, un caso particular se presentó en el alga roja Phaedodactylum Tricornutum, el cual por biolística se le transfirió los transgenes a cepas P. Tricornutum (CCMP632), estos genes codifican thioesterasa implicadas en la formación de TAGs (triacilgliceroles), como resultado se dio una mayor acumulación de lípidos de cadenas cortas (ácidos láurico y mirística), útil para la formación de TAGs, pero con un crecimiento celular más lento con respecto a la cepa nativa (Radakovits, Eduafo and Posewitz, 2010).

Figura 3. Aplicaciones de plantas transgénica

3.3 Transgénesis animal

En los animales superiores, la información genéticase transmite por reproducción sexual. Es lo que seconoce como transmisión genética vertical. Sin embargo, en 1981, Gordon y Ruddle demostraron la integración y transmisión estables (a través de la línea germinal) de genes inyectados en pronúcleos de cigotosde ratón obtenidos por fecundación “in vitro”. Eran los primeros ratones transgénicos. Es decir, se tratabade una transmisión genética horizontal, que se denominó transgénesis.

El paso siguiente consistió en probar que tambiénse podían obtener ratones transgénicos que incorporaran en su genoma un gen (transgén) de otra especie. Así, en 1982, Palmiter y col. obtuvieron ratones transgénicos gigantes al inyectar en el pronúcleo de un cigoto de ratón el gen de la rata que codifica la hormona del crecimiento. Incluso, estos mismos investigadores, obtuvieron también ratones transgénicos gigantes cuando el transgén introducido, que codificaba la hormona del crecimiento, era de origen humano (Peñaranda y Asensio, 2007).

3.3.1 Microinyección pronuclear

En la década del 80 ocurrió un importante avance en la tecnología de animales transgénicos que marcó el curso de la investigación en este campo por al menos dos décadas. Gordon y

Alimentos con mayor nivel nutritivo

Biomonitores

Mayor productividad

Proteínas recombinantes

Evita el uso de agroquímicos

colaboradores describieron una técnica donde el ADN desnudo fue inyectado en el pronúcleo de un ovocito de ratón recientemente fertilizado, el que posteriormente se transfirió a hembras receptoras sincronizadas. Este experimento demostró que era posible usar un plásmido recombinante como vector para transferir genes foráneos directamente hacia el embrión (Narbon, 2008).

Esta técnica consiste en extraer óvulos de hembras en las que se ha inducidouna superovulación y han sido fertilizadas “invivo”, o bien se fertilizan posteriormente “in vitro”. Utilizando un microscopio, con una micropipeta, se inmoviliza el óvulo fecundado y se inyecta en unode sus pronúcleos una solución que contiene muchas copias del transgén. Posteriormente, estos óvulos fecundados y microinyectados se introducen en madres receptoras, previamente sincronizadas hormonalmente, para gestarlos, aplicando la técnica de la transferencia de embriones. Finalmente, los recién nacidos son examinados paraver si en ellos se ha producido la incorporación del transgén.

Figura 4. Microinyección de DNA en ovocito fertilizado.- pipeta de sujeción; -ovocito fertilizado en el que evidencian los dos pronúcleos (rojo y

verde); - pipeta de inyección, a través de la cual se inyecta la solución que contiene el DNA del transgén de interés en uno de los pronúcleos.

3.3.2 Vectores virales

Son todos aquellos que han sido obtenidos a partir de un virus, tratando de eliminar sus características patológicas y adaptarlos a una nueva función como transportadores de material genético heterólogo. Pretenden aprovechar las ventajas que aportan los virus como vectores naturales que han sufrido procesos de evolución complejos a lo largo de millones de años para optimizar su función de introductores de material genético en las células que invaden. Para modificar un virus y transformarlo en un vector de transferencia génica en animales, el primer paso es bloquear su capacidad de propagación eliminando los genes responsables de su replicación. El segundo paso es la eliminación de parte del genoma viral para crear espacio para introducir el material genético de interés (gen o genes, más los elementos de control) (Narbon, 2008).

Las partículas virales silvestres no se pueden emplear directamente como vectores de expresión, es necesario convertirlos en virus deficientes en su replicación dentro de la célula diana. De esta forma, el vector viral sólo se podrá multiplicar en las células de empaquetamiento, que son líneas celulares modificadas que tienen la propiedad de ensamblar a los virus y producir partículas virales que poseen los genes quecodifican para las proteínas virales y para el gen de interés (Legorreta-Herrera, 2012).

Los vectores lentivirales que contienen el gen de la proteína fluorescente verde se han utilizado con éxito para seleccionar embriones transgénicos antes de la transferencia a una madre sustituta. Los vectores lentivirales han dado como resultado la eficiencia de la transgénesis de 80 % en ratones, 46 % en ratas, 70 % en los cerdos, y 100 % en el ganado vacuno. La alta eficiencia de la transgénesis lentiviral en ambos modelos animales y ganado, hacen que el procedimiento de esta tecnología tenga un interés de probar una modificación genética en ratones, y más tarde ampliarlo en el ganado (Ramos, 2010).

3.3.3 Transferencia de genes mediada por esperma (SMGT)

En 1989, se describió por primera vez un nuevo método parala generación de animales transgénicos, la transferencia de genes mediada por esperma (SMGT), la cual consiste en la introducción de ADN foráneo en gametos masculinos antes del proceso de fertilización (Peñaranda y Asensio, 2007), se basa en la capacidad intrínseca de los espermatozoides de unirse e internalizar DNA exógeno que, posteriormente, podrá ser transferido alhuevo durante la fertilización.

Esta habilidad de los espermatozoidespor capturar DNA exógenofue descubierta en 1971, pero el hallazgo,con sus importantes implicaciones,fue ignorado durante cerca de 20 años.La transferencia génica mediada por esperma en vertebrados se ha desarrollado y sufrido muchos cambios en los últimos años. La incubación de las células espermáticas con ADN foráneo seguida de fertilización in vitro o in vivo ha generado conejos, cerdos, ratones, ovejas, vacas, peces, pollos transgénicos. La definición y el establecimiento de los protocolos según la especie a transformar son y será un tema valioso en biotecnología (Narbon, 2008).

Extracción del eyaculado ADN

Obtención de semen transgénico

Inyección intracitoplasmatica de esperma transgénico en ovocitos de ratón, seguida de cultivo de cigotos hasta en embriones en estadio de blastocisto.

Gestación de embriones por hembras sincronizadas

Estudio de la progenie y selección de fundadores

Descendencia

Figura 5. Producción de ratones modificados genéticamente mediante SMGT

3.3.4 Gene targeting

La microinyección es un método para generar animales transgénicos muy ineficiente, debido a que conlleva la integración aleatoria del gen foráneo en el genoma receptor con consecuencias, el transgén se introduce en el genoma receptor deforma aleatoria, por lo que sólo en un pequeño porcentaje se sitúa en el lugar adecuado para conseguiruna buena expresión en el animal transgénico. No todos los animales que nacen han incorporadoa su genoma el transgén (no son transgénicos, por tanto), el gen exógeno puede insertarse en un lugar erróneo, por ejemplo en medio de un gen del genoma receptor, interrumpiéndolo y causando su mutación y, con ello, la muerte del embrión o alteraciones en el animal transgénico nacido. Se produce un patrón variable de expresión del genexógeno en la progenie transgénica, a menudo enmosaico (Peñaranda, 2007).

La técnica de “gene targeting” evita esos problemas, al generar una modificación genética dirigida, específica y controlada, basada en la introducción o en la eliminación de DNA en lugares precisos del genoma, utilizando la recombinación homóloga de esas secuencias de DNA foráneas con los genes autóctonos.

Esta técnica requiere la utilización de células madre embrionarias (ES “cells”, “embrionic stem cells”), que son pluripotentes y que, una vez modificadas genéticamente, son inyectadas en blastocistos para generar embriones quimera (Asensio, 2007).

3.3.5 Aplicaciones

Desde el principio de los tiempos, el hombre ha pretendido cambiar las características de los animales domésticos queriendo añadir aquellas que mejoraban sus condiciones como animales de compañía, de producción, de trabajo o de abasto, mediante la elección de los más aptos y el cruzamiento de los ejemplares que mostraban mejores características: mayor producción de leche o carne o más fuerza y resistencia. Se escogían aquellos ejemplares con características deseables, apareándolos entre sí y con su descendencia, para conservar los rasgos de interés, recurriendo al mestizaje cuando se advertía la aparición de características fenotípicas indeseadas debido al parentesco (Peñaranda y Asensio, 2007).

Luego de algunos problemas iniciales, el desarrollo y comercialización de cultivos modificados genéticamente registró un crecimiento importante, pero los productos originados de animales de granja modificados genéticamente no han aparecido a los principales sistemas de producción de alimentos. Aunque se han introducido experimentalmente más de 50 transgenes diferentes en animales de granja, estas iniciativas requieren todavía unos conocimientos técnicos considerables y no son tan habituales como en el caso de las plantas (Narbon, 2008).

Hoy en día, gracias a la reproducción asistida y a la biotecnología, se planea y dirigen los procesos reproductivos, se transfierenlos rasgos deseados y se apura la mejora genética. El intervalo intergeneracional puede disminuirse sensiblemente gracias a la combinación de la inseminación artificial, que es la más antigua y utilizada de las técnicas de reproducción asistida, con las técnicas más recientes como son: el estro sincronizado, la superovulación, la extracción de óvulos de hembras sexualmente inmaduras aun fuera de la época de cría, o la producción de embriones “in vitro” y la transferencia de embriones. Además, es viable seleccionar el sexo de la progenie con semen sexado para la inseminación; se puede desarrollar la selección genética de individuos mediante marcadores moleculares asociados a caracteres de interés. (Asensio, 2007).

En el ganado, por razones económicas, los cigotos para la microinyección de ADN se producen después de ovarios. Mientras que esta fuente de cigotos es barata y fácilmente disponible en cantidades casi ilimitadas, tiene la desventaja en que no se conoce el desarrollo de los animales donantes. En cabras, el método de elección para la generación de animales transgénicos ha sido la microinyección de cigotos producidos in vivo recuperados del oviducto 15-20 h después de la hora estimada de la fertilización. En este método, las cabras de los donantes se superovularon, inseminadas o apareadas luego de la detección de calor, y el oviducto se vacía para recoger los presuntos cigotos. Aunque los resultados de este método en cigotos de alta capacidad de desarrollo, el procedimiento se caracteriza por una gran cantidad de variabilidad en el número de pronúcleos (NP) cigotos etapa recuperados por donante. (Baldassarre, 2002).

El uso de vectores lentivirales ha permitido altas tasas de transgénesis en ambos modelos animales y ganado, reduciendo así los costes de producción de animales transgénicos, y permitido la transgénesis para la producción de proteínas recombinantes. Aunque la transgénesis lentiviral tiene un gran potencial para la producción de grandes cantidades de proteínas recombinantes en la leche de ganado transgénico, aún hay varios obstáculos que deben ser superados.

Para el ganado, la posibilidad de elegir embriones transgénicos antes de su transferencia a la madre de alquiler es un tema muy importante, ya que ahorraría tiempo, trabajo y dinero al eliminar la transferencia de embriones no transgénicas. La probabilidad de la selección temprana de embriones de ratones transgénicos que llevan un gen valioso se explora, utilizando GFP como marcador de selección. Por consiguiente, se diseña y construye un vector lentiviral que contiene dos casetes de expresión: la primera contiene la secuencia codificante para el dominio extracelular de la glicoproteína E2 del virus de la PPC, bajo el control de un promotor específico mamaria. El segundo casete de expresión contiene la secuencia de codificación para GFP guiado por el promotor temprano de SV40. La glicoproteína E2 se selecciona específicamente entre VPPC, ya que en estudios anteriores, esta molécula se expresó de manera muy eficiente en la glándula mamaria de cabras translúcidas con vectores adenovirales. Obtenida de la leche glicoproteína E2 era un antígeno excelente, con inmunidad sólida y duradera en los cerdos vacunados. Por lo tanto, la glicoproteína E2 era un excelente modelo que se expresa en la leche, y su producción a gran escala en el ganado transgénico es uno los principales objetivos. El promotor de SV40 es seleccionado para dirigir la expresión de la GFP, en lugar de un promotor más fuerte común (por ejemplo, CMV o PGK), con el fin de reducir la competencia por los factores de transcripción, y por lo tanto minimizar la interferencia con el promotor específico de tejido (Ramos, 2010).

Los ratones transgénicos se usan ampliamente en la investigación biomédica para estudiar la expresión génica, la biología del desarrollo, y los modelos de terapia génica (Van Keuren, 2009).

La investigación sobre BAC (cromosoma artificial bacteriano), transgenes de expresión directa de genes a niveles fisiológicos con la misma temporización y de expresión de los patrones de desarrollo como los genes endógenos en modelos de animales transgénicos. En ratones transgénicos ha dado lugar a la identificación de las mutaciones genéticas que causan enfermedades y a la identificación de elementos reguladores de genes; los transgenes de BAC con las instrucciones genéticas necesarias para la expresión de genes cell specific directa se pueden modificar de modo que las proteínas o los reporteros se expresan en las poblaciones de células definidas. El método más rápido y eficaz para generar BAC ratones transgénicos es la microinyección directa de ADN BAC en el pronúcleo de los huevos fertilizados de ratón, BAC transgénesis mediante microinyección es un método eficaz y eficiente para producir modelos de ratones genéticamente modificados. Preguntas comunes sobre microinyección BAC pronuclear incluyen 1) el mejor método para purificar el ADN de BAC para la microinyección, 2) la mejor amortiguación microinyección, 3) la concentración de ADN microinyección más eficaz, y 4) si ADN lineal o circular microinyección molécula es más eficiente, la microinyección de ADN BAC a una concentración de 0,5 ng / ul asegura una alta supervivencia de los huevos, las tasas de natalidad razonables, y la transgénesis eficaz (Van Keuren, 2009).

3.4. Transgénesis en humanos

En el año 2000, investigadores de la Universidad del Sur de Florida confirmaron que el tejido fetal puede sobrevivir después de haber sido establecido en el cerebro de pacientes con Enfermedad de Huntington, y que este tejido se conserva libre de la enfermedad. Los pacientes que adoptaron un trasplante presentaron una mejoría de su estado, lo que propone que el trasplante de neuronas fetales u otras células puede, algún día, brindar un tratamiento que modifique la vida a los enfermos de Huntington, una enfermedad degenerativa cerebral para la que no hay cura. Igualmente podría aplicarse a otras enfermedades cerebrales o de la médula espinal.

Tras dos años de evaluación, los pacientes recibieron un injerto de células nerviosas fetales humanas en la zona derecha, y tras un año, en la zona izquierda del cuerpo estriado. Los resultados finales se valoraron un año después. La evaluación de los efectos fueron conducidos mediante una serie de pruebas neurológicas y psiquiátricas. Estos resultados se relacionaron con un grupo de control de 22 pacientes no tratados que se encontraban en una fase parecida de la enfermedad, y que fueron propósito de seguimiento en paralelo. Igualmente se elaboraron repetidas pruebas con resonancia magnética (MRI) y tomografía de emisión de positrones (PET) para determinar la actividad metabólica.

Estas neuronas se adquieren de abortos fetales en el primer trimestre de su evolución. Se sacan del estriado, un núcleo repetidor central en el cerebro y son trasplantados en el área dañada del cerebro de los pacientes.

Los pacientes que recibieron un trasplante presentaron mejoría de su estado, lo que propone que el trasplante de neuronas fetales u otrascélulas puede, algún día, brindar un tratamiento que cambie la vida a los enfermos de Huntington. Además podría aplicarse a otras enfermedades cerebrales o de la médula espinal.

Se pudo deducir que estos injertos sobrevivirán conectados con el cerebro, y no serán rechazados dijo el Dr. Thomas B. Freeman, director médico del "Center for Aging and Brain Repair de la USF y

quien dirigió esta investigación.

Samberg realizo un primer trasplante de estas características en animales en 1983. Siete años después, el equipo revelo un estudio que determinaba que el tejido fetal sobrevivía una vez que se había trasplantado en los cerebros de enfermos de Parkinson, y que estos pacientes mejoraban.

Aplicaron los mismos principios al Huntington, y tres años después instauraron las neuronas en el cerebro del primero de siete pacientes. Uno de ellos murió de un ataque al corazón lo que permitió la autopsia. Esta mostró que las neuronas se habían conectado con éxito en el cerebro y estaban proliferando. Y se pudo ver de qué forma los injertos se integraban en el cerebro (Horrobin, 2000).

Lax-101: proyecto de investigación en la enfermedad de Huntington

Laxdale, una compañía de investigación con base en Stirling (Escocia), desarrollo un nuevo enfoque en la gestión de enfermedades del sistema nervioso como la enfermedad de Huntington (EH). El Profesor Vaddadi desarrollo un estudio en ratones que llevan el gen humano de la enfermedad de Huntington (ratones transgénicos) y un ensayo controlado con placebo en diecisiete pacientes que estaban en la fase intermedia de la enfermedad. El Dr Basant Puri, del Hospital de Hammer Smith en Londres, realizo un ensayo controlado con placebo en siete pacientes que fueron hospitalizados y que requerían atención las 24 horas. El Profesor Vaddadi, trabajando conjuntamente con John Drago, Jerry Clifford y John Waddington, descubrio que cuando se aplico a los ratones transgénicos una sustancia que tenía LAX-bi desde su nacimiento, estos ratones no presentaban movimientos patológicos, que en estos suele aparece a las 30-40 semanas de edad. En los dos estudios con pacientes que se realizaron en Australia y en Londres, se observo que en el grupo placebo, la mayoría de los pacientes padecían un deterioro durante el curso del estudio, mientras que en los grupos tratados con el fármaco, una gran parte de los pacientes mostró mejoría. El éxito queda demostrado debido a que pocos pacientes en el grupo placebo se mantuvieron estables o mejoraron un poco, mientras que solo muy pocos pacientes en el grupo LAX-191 sufrieron un deterioro (Horrobin,2000).

Científicos norteamericanos crean el primer mono que incorpora un gen de otra especie

ANDi es el nombre de un mono Rhesus que nació el 20 de octubre del año 2000 en un centro de investigación de primates en Oregon (EE UU). Sus cuidadores confirmanque su comportamiento con sus dos compañeros de su edad, es normal. Sin embargo, sus células tienen un gen más, procedente de una medusa. ANDi fue primer primate modificado genéticamente. Sus creadores consideran que los primates transgénicos se empleen como modelos animales más cercanos al hombre que los ratones para el estudio de enfermedades.

Fue el resultado 224 intentos para lograr el primer primate modificado genéticamente. Se habían modificado muchos mamíferos, desde ratones a ovejas, pero nunca primates (mamíferosentre los que se incluye al ser humano). Los científicos de Oregon consideran que ANDI es el primer paso para lograr modelos animales más parecidos al ser humano en los que se pueden estudiar la función de los genes y las características de enfermedades y sus posibles tratamientos. Sin embargo, otros expertos dicen que queda mucho camino por recorrer antes de que los monos puedan utilizarse rutinariamente en los laboratorios como se utilizan actualmente los ratones

transgénicos.

El gen extra que tiene ANDI proviene de las medusas y se emplean como marcador ya que las células que lo contienen brillan al observarlas. Es un gen que no hace nada pero se identifica fácilmente. ANDI, han explicado los científicos, no brilla, y ni siquiera sus células lo hacen, pero el análisis genético de células de diversas partes de su organismo ha proporcionado ratificar que contienen el gen marcador. Los científicos no saben por qué no expresa el gen de forma que sea visible, y piensan que de pronto se exprese cuando crezca, aunque también es posible que esté ya esté produciendo la proteína correspondiente pero en muy poca cantidad. Ellos tampoco han demostrado todavía que el mono vaya a transmitir su modificación genética a sus descendientes y ni siquiera que su esperma sea transgénico (Ruiz de Elvira, 2000).

Una bacteria ayuda a fabricar orejas humanas

La celulosa bacteriana, creada por ciertos de microbios, como la bacteria Gluconacetobacter xylinus, está compuesta por fibrillas de unos 30 nanómetros (mil millonésimas de metro), un grosor parecido al de las fibras de colágeno que constituye los cartílagos. "Es una sustancia muy parecida a la celulosa de los árboles o las fibras del algodón", asegura Martínez.

La celulosa bacteriana, no puede ser degradada por el cuerpo humano, mientras las vacas carecen de mecanismos para digerir la celulosa. Es un material ideal para preparar injertos humanos.

Con la celulosa bacteriana, el equipo de Gatenholm fabrica una estructura con forma de oreja, en un proceso que dura 18 días. Sobre esta estructura, los investigadores ponen células madre adulta, obtenida de médula ósea humana, y células de cartílago, conseguidas de narices de donantes que han sido sometidos, por ejemplo, a operaciones de cirugía estética. En dos meses desde el comienzo, las células han proliferado para armar una oreja humana, lista para trasplantar (Ansede, 2013).

4. Discusión y conclusiones

Grandes descubrimientos despertaron la curiosidad humana que llevo tanto a la genética iniciada por Mendel y la biología molecular por Warren Weaver a ser herramientas fundamentales para entender la naturaleza química de la herencia. A partir de ahí se inició la época (años 50s en adelante) de grandes descubrimientos que marcaron y transformaron ideas de ciencia ficción en realidad, y que solo hoy es palpable susimportancia aplicaciones.

Muchos organismos han sido transformados al igual que los métodos de transgénesis, actualmente Agrobacterium tumefaciens no es utilizado exclusivamente para transgénesis en plantas, se han transformados hongos como Aspergillus niger, Trichoderma reesei, Paracoccidiodes brasiliensis, entre otros (Valderrama, Isaza y Kafuri, 2005), siendo el único organismo en poder transformar un organismo perteneciente a otro reino. Agrobacterium ha sido el método más desarrollado y estudiado, debido a su relativa simplicidad para desarrollar plantas transgénicas de gran valor comercial, pero aún se debe abordar problemas tales como: transformar plantas de valor comercial (organismos recalcitrantes), evitar la integración al azar, poder agregar transgenes mutiples y la estabilidad del transgen en la herencia (Ziemienowicz, 2013).

La expectativa de alimentos derivados de animales transgénicos de granja no ha sido bien recibida por los consumidores. Algunas personas prefieren las plantas transgénicas que los animales transgénicos. La experimentación con animales y su alteración es menos aceptable y tiene repercusiones más amplias. Varias culturas y religiones restringen o prohíben el consumo de ciertos alimentos derivados de animales. Sin embargo, la ingestión o inyección de ciertos productos farmacéuticos derivados de animales transgénicos parece más aceptable para el público.

A medida que se vayan perfeccionando las técnicas de transferencia génica en animales, junto con otras técnicas del proceso igualmente importantes (mejoramiento de los constructos), se podrán obtener mayores y más seguras aplicaciones en las diferentes áreas en las que se ha venido trabajando los últimos años.

Las técnicas que se están empleando para transgénesis en humanos es un avance para la evolución, como se pudo leer en el artículo presentado, células de fetos contra enfermedades degenerativas como lo es Huntington, sirve para que las personas que sufren esta enfermedad presenten una mejoría y para aquellas con alguna anomalía en su cuerpo, pueda ser reemplazada por una en buenas condiciones ya que por medio de la transgénesis estas adoptan células que no son degradadas por el cuerpo humano y es más factible para injertos.

Ahora tenemos la capacidad de transformar muchos organismos, antes se inició con el reconocimiento de una sustancia con características especiales (ADN), ahora las secuenciamos, las estandarizamos y las pasamos a un organismo de interés. Estos esfuerzos y logros permitirán seguir mejorando para obtener respuestas, que concluyan en una transformación eficiente, segura tanto para humanos como para el ambiente y útil para el sostenimiento u equilibro entre las especies.

Bibliografía

ALMONACID, F. B., WIRTH, S., SEGRETIN, M. E., & MORGENFELD, M. (2005). Las plantas como fábricas de proteínas terapéuticas. Biotecnologia. pp 40-43

ANANDARAJAH, K., MAHENDRAPERUMAL, G., SOMMERFELD, M., & HU Q. (2012). Characterization of microalga Nannochloropsis sp. mutants for improved production of biofuels.Applied Energy, 96, pp 371–377.

BALDASSARRE, H., WANG, B., KAFIDI, N., GAUTHIER, M., NEVEU, N., LEPOINTE, J., SNEEK, L., LEDUC, M., DUGUAY, F., ZHOU, J.F, LAZARIS, A., KARATZAS, C.N. (2003). Production of transgenic goats by pronuclear microinjection of in vitro produced zygotes derived from oocytes recovered by laparoscopy. Theriogenology, 59, 831 – 839.

BELZILE, F. J. (2002). Transgenic, transplastomic and other genetically modified plants: a Canadian perspective. Biochimie, 84, pp 1111–1118.

CHAUDHURY, D., MADANPOTRA, S., JAIWAL, R.,SAINI, R., KUMAR, P. A., JAIWAL, P. A. (2007). Agrobacterium tumefaciens-mediated high frequency genetic transformation of an Indian cowpea (Vignaunguiculata L. Walp.) cultivar and transmission of transgenes into progeny.PlantScience 172, pp 692–700.

CHAVARRI, M.; VEGAS, A., ZAMBRANO, A. Y., &  DEMEY, J. R. (2004). Transformación de embriones somáticos de mango por biobalística. INCI, 29(5), pp 261-266. ISSN 0378-1844

CHOI, HYOUNG-AN., LEE, YOUNG-CHUL., LEE, JIN-YOUNG., SHIN, HYUN-JAE., HAN, HYO-KYUNG., & KIM, GEUN-JOONG.(2013). A simple bacterial transformation method using magnesium- and calcium-aminoclays.Journal of MicrobiologicalMethods, 95, pp 97–101.

CLARK, P. & PAZDERNIK, P. (2012). Biotechnology. London (UK). Update Edition. Press Academic Cell. pp 405-406. ISBN: 978-0-12-385063-8

COKU, A. (2007). Molecular Farming of Vaccines from Transgenic Plants.MMG 445 Basic Biotechnology eJournal, 3, pp 110-116..DALE, P. J., CLARKE, B., & FONTES, E. M. (2002). Potential for the environmental impact of transgenic crops (Review).Naturebiotechnology, 20, pp 567-574.

GARBOZA, F., FRONTADO, R., NOGUERA, N., ÁVILA, H., OJEDA, L., RAMÍREZ, TRIANA, J. N., TRIANA, & F. (2011). Uso de medios alternativos a base de hidrolizado de caseína y extracto de Aspergillus niger y su efecto sobre la expresión genética de una cepa de Escherichiacoli. Rev. Soc. Ven. Microbiol, 31(2), pp 138-143. ISSN 1315-2556.

GARCIA J, DORA J. (2012). Transformación genética de guanábana (Annonamuricata L.)Vía Agrobacterium tumefaciens. Tesis. Universidad Tecnológica de Pereira. pp 132

GARRIDO, A. T. (2012). Fundamentos de la transgénesis. Serie Bioquímica y Biología Molecular, 5(4), pp 1-30. ISSN: 1989-3620

GEORGIANNA, D. R., HANNON, M. J., MARCUSCHI, M., WU, S., BOTSCH, K., LEWIS, A. J., HYUN, J., MENDEZ, M., MAYFIELD, S. P. (2013). Production of recombinant enzymes in the marine alga Dunaliellatertiolecta.AlgalResearch, 2, pp 2–9.

GONZÁLEZ M, I. G. (2013). Métodos de transformación en plantas mediado por Agrobacterium tumefaciens y bombardeo de partículas “biolística”. pp 1-12.

GONZALO, C. (2003). Aproximación histórica a la biología molecular a través de sus protagonistas, los conceptos y la terminología fundamental.Panace@, 4(12), pp 168-179.

GUILLÉN, D., MORENO-MENDIETA, S., & RODRÍGUEZ-SANOJA, R. (2009). Microorganismos y Virus: Herramientas Clave para el Desarrollo de Vacunas. BioTecnología, 13(1), pp 23-40.

HAMAMA, L., VOISINE, L., PELTIER, D., & BOCCON-GIBOD J. (2011). Shoot regeneration and genetic transformation by Agrobacterium tumefaciens of Hydrangea macrophylla Ser. leaf discs. ScientiaHorticulturae, 127, 378–387.

LEGORRETA, M., MARTINEZ, F., HERNANDEZ, F., ZENTELLA, A. (2012). Los vectores virales y la transgénesis. VERTIENTES Revista Especializada en Ciencias de la Salud, 15(1):5-14.

LI, S., ANDERSON, L. M., YANG, JUI-MING., LIN L., YANG & H. (2007). DNA transformation via local heat shock.APPLIED PHYSICS LETTERS, 91, pp 013902-1 -013902-3.

LOPEZ, M., MALLORQUIN, P., PARDO, R., & VEGA, M. (2004). Vacunas de nueva generación. Genoma España Salud humana, pp 25. ISBN: 84-609-1993-5

NARBON, F., (2008). Transferencia génica en animales. [Versión electrónica]. Recuperado el 6 de Febrero de 2014, de http://www.uned.es/experto-biotecnologia-alimentos/TrabajosSelecc/PatriciaNarbon.pdf.

PARMAR, A., SINGH, N. K., PANDEY, A., GNANSOUNOU, E., & MADAMWAR, D.(2011). Cyanobacteria and microalgae: A positive prospect for biofuels. Bioresource Technology, 102, pp 10163–10172.

PARTIDO, L. C., CASTAÑEDA S, A. N., & RODRIGUEZ-ARNAIZ, R. (2009). De la genética a la genomica. Revista Fuente, 1(1), pp 7-12.

PATINO, P. JAVIER. (2006). Biología de la célula,Primera edición, Editorial biogénesis, Medellin (Colombia). pp 31-36. ISBN: 958-97629-7-2

PEÑARANDA, M., ASENSIO, F. (2007). Animales modificados genéticamente: Técnicas de obtención [Versión electrónica]. Recuperado el 13 de Enero de 2014, dehttp://www.colvema.org/pdf/amg1.pdf

PITZSCHKE, A., & HIRT H. (2010). New insights into an old story: Agrobacterium-induced tumour formation in plants by plant transformation. The EMBO Journal, 29(6), pp 1021–1032.

RADAKOVITS, R., JINKERSON, R. E., DARZINS, A., & POSEWITZ, M. C. (2010). Genetic Engineering of Algae for Enhanced Biofuel Production. EUKARYOTIC CELL, 9(4), pp 486–501.

RADAKOVITS, R., EDUAFO, P. M., POSEWITZ, M. C. (2010). Genetic engineering of fatty acid chain length in Phaeodactylum tricornutum. Metabolic Engineering, 13, pp 89–95.

RAMOS, O., PRIETO, Y., GÓMEZ, S., PARRA, N., SUAREZ, L., JIMÉNEZ, S., AND TOLEDO, J. (2011). Dual promoter lentiviral vector generates transgenic mice expressing E2-CSFV glycoprotein in their milk, but impairs early identification of transgenic embryos. Theriogenology, 75, 1280: 1289.

REYES, B. G., M. DEL C., HORCASITAS M, M. DEL C., RAMOS R, EMMA G., CASTOLO, A. A., VARGAS, J. P., GUZMÁN, O. G., & CALVA, G. C. (2010). Clonación del cDNA del gen de la insulina humana en raíces aéreas de Brassicaoleracea varitalica(brócoli). Revista CENIC Ciencias Biológicas, 41.ISSN: 0253-5688.

THOMSON, J. A. (2004). Genetic engineering of plants.Biotechnology.

SHA, J., WANG, Y., WANG, J., REN, L., TU, Q., LIU, W., WANG, X., LIU, A., WANG, L., & WANG J. (2011). Capillary-composited microfluidic device for heat shock transformation of Escherichia coli. Journal of Bioscience and Bioengineering, 112 (4),pp 373–378.

SHRAWAT, A. K., BECKER, D.,& LÖRZ H. (2006). Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation of barley (Hordeumvulgare L.).Plant Science, 172, pp 281–290.

UBALUA A. O. (2007). Cassava wastes: treatment options and value addition alternatives. African Journal of Biotechnology (Review), 6(18), pp 2065-2073.ISSN: 1684–5315

UBALUA A. O. (2009). Transgenic plants: Successes and controversies (Review). Biotechnology and Molecular Biology Reviews, 4(6), pp 118-127. ISSN: 1538-2273.

VALDERRAMA F, A.M., ISAZA, R. A., & KAFURI, L. A. (2005). Transformación de plantas mediada por Agrobacterium: “ingeniería genética natural aplicada”. Rev.Fac.Nal.Agr.Medellín, 58(1), pp 2569-2585.

VAN KEUREN, M., GAVRILINA, G., FILIPIAK, W., ZEIDLER, M, AND SAUNDERS, T. (2009). Generating Transgenic Mice from Bacterial Artificial Chromosomes: Transgenesis Efficiency, Integration and Expression Outcomes.Transgenic Res; 18(5): 769 – 785. Doi: 10.1007/ s112448 - 009- 9271-2.

ZIEMIENOWICZ, A. (2013). Agrobacterium-mediated plant transformation: Factors, applications and recent advances. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology. http://dx.doi.org/10.1016/j.bcab.2013.10.004i