UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD …...Espinel (Patóloga), Ing. Edwin Galindo (Estadístico), e Ing. Químico Richard Tamayo Alcívar y al Q.F. Luis Alberto Toala Murillo

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE ODONTOLOGÍA

POSTGRADO

ESPECIALIDAD EN IMPLANTOLOGIA ORAL

ESTUDIO HISTOMORFOMÉTRICO DE LA

REGENERACIÓN ÓSEA UTILIZANDO SULFATO DE

CALCIO Y SULFATO DE CALCIO COMBINADO CON

ALENDRONATO: ESTUDIO EXPERIMENTAL EN CONEJOS

Proyecto de investigación presentado como requisito previo a la obtención del

título de Especialista en Implantología Oral

Autora: Catherine de las Mercedes Tamayo Alcívar

Tutor: Dr. Franklin Eduardo Quel Carlosama

Quito, julio 2017

ii

DERECHOS DE AUTOR

Yo, Catherine de las Mercedes Tamayo Alcívar en calidad de autor del trabajo de

Investigación de tesis realizado sobre “ESTUDIO HISTOMORFOMÉTRICO

DE LA REGENERACIÓN ÓSEA UTILIZANDO SULFATO DE CALCIO Y

SULFATO DE CALCIO COMBINADO CON ALENDRONATO: ESTUDIO

EXPERIMENTAL EN CONEJOS”, por la presente autorizo a la

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR, hacer uso de todos los contenidos

que me pertenecen o de parte de los contenidos de esta obra con fines

estrictamente académicos o de investigación.

Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la autorización,

seguirán vigentes a mi favor, de conformidad establecido con los artículos 5, 6, 8,

19 y además pertinentes de la ley de Prioridad Intelectual y Reglamento.

También, autorizo a la Universidad Central del Ecuador realizar la digitación y

publicación de este trabajo de investigación en el repositorio virtual, de

conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación

Superior.

OD. CATHERINE DE LAS MERCEDES TAMAYO ALCÍVAR

C.I.: 0925778201

[email protected]

iii

APROBACION DEL TUTOR DEL TRABAJO DE TITULACION

Yo, Dr. Franklin Eduardo Quel Carlosama, en mi calidad de tutor del trabajo de

titulación, modalidad Proyecto de Investigación, elaborado por CATHERINE

TAMAYO, cuyo título es: ESTUDIO HISTOMORFOMÉTRICO DE LA

REGENERACIÓN ÓSEA UTILIZANDO SULFATO DE CALCIO Y

SULFATO DE CALCIO COMBINADO CON ALENDRONATO: ESTUDIO

EXPERIMENTAL EN CONEJOS, previo a la obtención del título de

Especialista en Implantología Oral: considero que el mismo reúne los requisitos y

méritos necesarios en el campo metodológico y epistemológico, para ser sometido

a la evaluación por parte del tribunal examinador que se designe, por lo que lo

APRUEBO, a fin de que el trabajo sea habilitado para continuar con el proceso de

titulación determinado por la Universidad Central del Ecuador.

En la ciudad de Quito, a los 30 días del mes de Julio del 2017.

DR. FRANKLIN EDUARDO QUEL CARLOSAMA

TUTOR

C.I: 1711720019

[email protected]

iv

HOJA DE ACEPTACIÓN DEL TRIBUNAL

Fecha: Quito, 12 de Julio de 2017

ESTUDIO HISTOMORFOMÉTRICO DE LA REGENERACIÓN ÓSEA

UTILIZANDO SULFATO DE CALCIO Y SULFATO DE CALCIO

COMBINADO CON ALENDRONATO: ESTUDIO EXPERIMENTAL EN

CONEJOS



Los abajo firmantes miembros del Jurado Calificador APROBAMOS la tesis

titulada: Estudio histomorfométrico de la regeneración ósea utilizando sulfato de

calcio y sulfato de calcio combinado con Alendronato: Estudio experimental en

conejos, que se desarrolló en el área de conocimiento de la especialidad de

Implantología Oral, cuya autora es la Odontóloga Catherine de las Mercedes

Tamayo Alcívar.

PRESIDENTE DEL JURADO CALIFICADOR. DOCENTE DEL INSTITUTO SUPERIOR DE

POSGRADO ODONTOLOGIA

MIEMBRO DEL JURADO CALIFICADOR. DOCENTE DEL INSTITUTO SUPERIOR DE

POSGRADO ODONTOLOGÍA

DRA. FRECIA MORALES

MIEMBRO DEL JURADO CALIFICADOR. DOCENTE DEL INSTITUTO SUPERIOR DE

POSGRADO ODONTOLOGÍA

v

DEDICATORIA

A Dios, mi madre, Aurora Alcívar, mis hermanos, Andrea

y Richard Tamayo, mi tía, María Rodríguez, mi tío,

Ezequiel Tamayo, mi amiga Denisse Sánchez quienes

hicieron posible este sueño.

Catherine de las Mercedes

vi

AGRADECIMIENTOS

Agradezco a mis profesores: Dr. Franklin Quel y Dr.

Kleber Vallejo.

A los Doctores. que me ayudaron en la parte experimental

Dr. José Jaramillo Reinoso (Veterinario) y Dr. Wellington

Octavio Reyes Sillagona (Veterinario) Dr. Francisco

Estrella Vásquez (Patólogo) Dra. Johanna Cevallos

Espinel (Patóloga), Ing. Edwin Galindo (Estadístico), e

Ing. Químico Richard Tamayo Alcívar y al Q.F. Luis

Alberto Toala Murillo (manejo de fármacos).

Al Dr. Gustavo Tello M., Dr. Eduardo Garrido, Dr. David

Arévalo, Dra. Paola Morales, Dra. Luz Torres, Dr. Carlos

Velastegui, Sr. José Enriquez, Sra. Alicia Vélez, Ing.

Fernando Enriquez, Sr. Emiliano Enriquez, Ángel

Enriquez, Carmen Torres, Don Arturo, Dr. David Triana,

Ing. Paul Vásquez, Dra. Paulina Mazón, Dr. Dorian Hugo,

Dra. Karla Toro, Sr. Olmedo Velásquez, Sra. María López

Rosado, Sra. María Velásquez López, Ing. Orlando

Velásquez López.

Catherine de las Mercedes

vii

ÍNDICE DE CONTENIDO

DERECHOS DE AUTOR ...................................................................................... ii

APROBACION DEL TUTOR DEL TRABAJO DE TITULACION ................... iii

HOJA DE ACEPTACIÓN DEL TRIBUNAL ....................................................... iv

DEDICATORIA ..................................................................................................... v

AGRADECIMIENTOS ......................................................................................... vi

ÍNDICE DE CONTENIDO................................................................................... vii

LISTA DE TABLAS ........................................................................................... xiii

LISTA DE FIGURAS .......................................................................................... xiv

LISTA DE GRÁFICOS ....................................................................................... xvi

LISTA DE ANEXOS .......................................................................................... xvii

RESUMEN ......................................................................................................... xviii

ABSTRACT ......................................................................................................... xix

CAPÍTULO I ........................................................................................................... 1

1. INTRODUCCIÓN .......................................................................................... 1

1.1. Planteamiento del problema ..................................................................... 1

1.2. Objetivos .................................................................................................. 3

1.2.1. Objetivo general ................................................................................ 3

1.2.2. Objetivos específicos ........................................................................ 3

1.3. Justificación .............................................................................................. 3

1.4. Hipótesis ................................................................................................... 4

1.4.1. Hipótesis alternativa (H1) ................................................................. 4

1.4.2. Hipótesis nula (H0) ........................................................................... 4

CAPÍTULO II ......................................................................................................... 5

viii

2. MARCO TEÓRICO ........................................................................................ 5

2.1. Histología y fisiología ósea ...................................................................... 5

2.1.1. Células óseas ..................................................................................... 5

2.1.1.1. El osteoblasto ............................................................................. 5

2.1.1.2. El osteocito ................................................................................ 7

2.1.1.3. El osteoclasto ............................................................................. 7

2.1.2. Matriz orgánica ................................................................................. 9

2.1.2.1. El colágeno ................................................................................ 9

2.1.2.2. Proteínas no colágenas ............................................................. 10

2.1.2.3. Factores de crecimiento ........................................................... 11

2.1.3. Fase mineral .................................................................................... 11

2.2. Regeneración ósea .................................................................................. 12

2.2.1. Osteogénesis .................................................................................... 12

2.2.2. Osteoinducción ................................................................................ 13

2.2.3. Osteoconducción ............................................................................. 13

2.3. Remodelación Ósea ................................................................................ 13

2.3.1. Factores de remodelado óseo .......................................................... 14

2.4. Injertos óseos .......................................................................................... 15

2.4.1. Aloinjertos ....................................................................................... 15

2.4.2. Xenoinjertos .................................................................................... 16

2.4.3. Injertos aloplásticos ......................................................................... 17

2.4.3.1. Características generales .......................................................... 18

2.4.3.2. Clasificación de los sustitutos óseos ........................................ 18

2.4.4. Sulfato de calcio .............................................................................. 19

2.4.4.1. Reabsorción y osteogénesis del sulfato de calcio .................... 19

ix

2.4.4.2. Sulfato de calcio y su relación con las proteínas morfogenéticas

y factores de crecimiento ........................................................................... 20

2.5. Bifosfonatos ............................................................................................ 21

2.5.1. Clasificación de los bifosfonatos .................................................... 21

2.5.1.1. Vía intravenosa ........................................................................ 22

2.5.1.2. Vía oral .................................................................................... 22

2.5.2. Mecanismo de acción ...................................................................... 23

2.5.3. Farmacocinética de los bifosfonatos ............................................... 24

2.6. Revisión de la literatura: Sulfato de calcio ............................................. 25

2.6.1. En defectos óseos ............................................................................ 25

2.6.2. Como membrana o barrera .............................................................. 25

2.6.3. En combinación con otros biomateriales ........................................ 25

2.6.4. En aumento de seno maxilar ........................................................... 26

2.6.5. En preservación del reborde alveolar .............................................. 26

2.7. Revisión de la literatura: Alendronato .................................................... 26

2.7.1. Administración local de los bifosfonatos en combinación con

aloinjertos: estudio en humanos .................................................................... 27


aloinjertos ...................................................................................................... 27

CAPÍTULO III ...................................................................................................... 29

3. DISEÑO METODOLÓGICO ....................................................................... 29

3.1. Diseño de la investigación ...................................................................... 29

3.2. Sujetos y tamaño de la muestra .............................................................. 29

3.3. Criterios de inclusión y exclusión .......................................................... 30

3.3.1. Criterios de Inclusión ...................................................................... 30

3.3.2. Criterios de exclusión ...................................................................... 31

3.4. Operacionalización de las variables ....................................................... 32

x

3.5. Estandarización ...................................................................................... 33

3.6. Técnicas e instrumentos de investigación .............................................. 33

3.6.1. Modelo de experimentación ............................................................ 33

3.6.2. Instrumental quirúrgico ................................................................... 34

3.6.3. Material quirúrgico.......................................................................... 35

3.6.3.1. Bondbone ................................................................................. 35

3.6.3.2. Alendronato ............................................................................. 36

3.6.4. Protocolo anestésico pre-quirúrgico ................................................ 37

3.6.5. Protocolo anestésico quirúrgico ...................................................... 37

3.6.6. Protocolo de bioseguridad ............................................................... 37

3.6.7. Técnica quirúrgica ........................................................................... 37

3.6.8. Medicación postoperatoria .............................................................. 43

3.6.9. Procesamiento de las muestras ........................................................ 43

3.6.9.1. Manejo de desechos ................................................................. 46

3.6.10. Análisis estadístico ...................................................................... 46

3.7. Delimitación de la investigación ............................................................ 46

3.7.1. Delimitación espacial y temporal .................................................... 46

3.7.2. Delimitación de las unidades de observación ................................. 47

3.7.3. Limitaciones de la investigación ..................................................... 47

3.8. Aspectos bioéticos .................................................................................. 47

3.8.1. Beneficio y consideraciones bioéticas ............................................ 47

3.8.2. Confidencialidad ............................................................................. 48

3.8.3. Protección de la población vulnerable ............................................ 48

3.8.4. Riesgos potenciales ......................................................................... 48

3.8.5. Beneficios potenciales ..................................................................... 49

3.8.6. Idoneidad ética ................................................................................ 49

xi

3.8.7. Declaración de conflicto de interés ................................................. 49

CAPÍTULO IV ...................................................................................................... 50

4. ANALISIS DE RESULTADOS ................................................................... 50

4.1. Resultados .............................................................................................. 50

4.1.1. Grupo G1: Control Negativo (Regeneración Fisiológica) .............. 50

4.1.2. Grupo G2: Regeneración ósea con Sulfato de Calcio ..................... 52

4.1.3. Grupo G3: Sulfato de Calcio con Alendronato ............................... 54

4.2. Análisis histomorfométrico .................................................................... 62

4.2.1. Análisis histomorfométrico de la regeneración ósea fisiológica .... 62

4.2.2. Análisis histomorfométrico de la regeneración ósea con sulfato de

calcio 64

4.2.3. Análisis histomorfométrico de la regeneración ósea con sulfato de

calcio y alendronato ...................................................................................... 66

4.3. Análisis de las Variables Cuantitativas .................................................. 68

4.3.1. Análisis de la variable osteoblastos................................................. 68

4.3.2. Análisis de la variable osteoclastos ................................................. 70

4.4. Análisis de las Variables Cualitativas .................................................... 71

4.4.1. Análisis de la variable osteocitos .................................................... 71

4.4.2. Análisis de la variable neovascularización ..................................... 73

4.4.3. Análisis de la variable fibrosis ........................................................ 74

4.4.4. Análisis de la variable hueso inmaduro .......................................... 76

4.4.5. Análisis de la variable calcificación ................................................ 77

4.5. Discusión ................................................................................................ 79

CAPÍTULO V ....................................................................................................... 81

5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ............................................ 81

5.1. Conclusiones .......................................................................................... 81

xii

5.2. Recomendaciones ................................................................................... 82

BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................. 83

xiii

LISTA DE TABLAS

Tabla 1 Cuadro comparativo de los diferentes injertos óseos ............................... 21

Tabla 2 Bifosfonatos orales nombre comercial y presentación ............................ 22

Tabla 3 Clasificación de los bifosfonatos según su composición química ........... 23

Tabla 4 Regeneración Ósea Fisiológica ................................................................ 57

Tabla 5 Regeneración ósea con sulfato de calcio.................................................. 58

Tabla 6 Regeneración ósea con sulfato de calcio y alendronato ........................... 58

Tabla 7 Tablas Comparativa de Regeneración ósea del grupo control y

regeneración ósea del grupo sulfato de calcio combinado con alendronato ......... 59

Tabla 8 Resumen estadístico ................................................................................. 60

Tabla 9 Valores de osteoblastos obtenidos en los 3 tipos de tratamiento ............. 68

Tabla 10 Análisis de la varianza para osteoblastos ............................................... 68

Tabla 11 Valores de osteoclastos obtenidos en los 3 tipos de tratamiento ........... 70

Tabla 12 Análisis de la varianza para osteoclastos ............................................... 70

Tabla 13 Valores de osteocitos obtenidos en los 3 tipos de tratamiento ............... 71

Tabla 14 Prueba Ji Cuadrado para los osteocitos .................................................. 72

Tabla 15 Variable neovascularización .................................................................. 73

Tabla 16 Prueba Ji Cuadrado para la neovascularización ..................................... 74

Tabla 17 Análisis de la variable fibrosis ............................................................... 74

Tabla 18 Prueba Ji Cuadrado para la fibrosis........................................................ 75

Tabla 19 Análisis de la variable hueso inmaduro ................................................. 76

Tabla 20 Prueba Ji Cuadrado para hueso inmaduro .............................................. 77

Tabla 21 Análisis de la variable calcificación....................................................... 77

Tabla 22 Prueba Ji Cuadrado para calcificación ................................................... 78

xiv

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Representación estadística ...................................................................... 30

Figura 2 Conejo experimental ............................................................................... 34

Figura 3 Formato comercial del biomaterial ......................................................... 36

Figura 4 Formato comercial del fármaco .............................................................. 36

Figura 5 Anestesia del modelo experimental ........................................................ 38

Figura 6 Proceso de afeitado del conejo ............................................................... 38

Figura 7 Antisepsia con yodopovidona ................................................................. 38

Figura 8 Incisión del tejido ................................................................................... 40

Figura 9 Separación de los tejidos ........................................................................ 40

Figura 10 Defecto creado con la trefina ................................................................ 40

Figura 11 Trefina con hueso autólogo .................................................................. 41

Figura 12 Revoluciones usadas con el Motor Surgic AP ...................................... 41

Figura 13 Defecto creado para que regenere fisiológicamente ............................. 41

Figura 14 Defecto creado para que regenere con sulfato de calcio ....................... 42

Figura 15 Defecto creado para que regenere con sulfato de calcio y alendronato 42

Figura 16 Sutura de los tejidos .............................................................................. 42

Figura 17 Fémur del conejo .................................................................................. 44

Figura 18 Corte del bloque de hueso..................................................................... 44

Figura 19 Médula y hueso seccionados ................................................................ 45

Figura 20 Hueso sumergido en formol en envase estéril ...................................... 45

Figura 21 Microscopio y cámara Olympus ........................................................... 45

Figura 22 Placas histológicas ................................................................................ 46

Figura 23 Corte histológico - Defecto óseo creado en conejo regenerado

fisiológicamente a las 6 semanas. Técnica de tinción hematoxilina-eosina.

Magnificación 4x. ................................................................................................. 62


fisiológicamente a las 6 semanas. Técnica hematoxilina-eosina. Magnificación

40x ......................................................................................................................... 62

xv



10x ......................................................................................................................... 63



40x ......................................................................................................................... 63

Figura 27 Corte histológico - Defecto óseo creado en conejo regenerado con

sulfato de calcio a las 6 semanas. Técnica hematoxilina-eosina. Magnificación 4x

............................................................................................................................... 64


sulfato de calcio a las 6 semanas. Técnica hematoxilina-eosina. Magnificación

40x ......................................................................................................................... 64


sulfato de calcio a las 6 semanas. Técnica hematoxilina-eosina. Magnificación 4x

............................................................................................................................... 65


sulfato de calcio a las 6 semanas. Técnica hematoxilina-eosina. Magnificación

40x ......................................................................................................................... 65


sulfato de calcio y alendronato a las 6 semanas. Técnica hematoxilina-eosina.

Magnificación 4x .................................................................................................. 66


sulfato de calcio y alendronato a las 6 semanas. Técnica hematoxilina-eosina.

Magnificación 40x ................................................................................................ 66


fisiológicamente a las 6 semanas. Técnica hematoxilina-eosina. Magnificación 4x

............................................................................................................................... 67



40x ......................................................................................................................... 67

xvi

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1 Análisis de la media de osteoblastos ..................................................... 69

Gráfico 2 Análisis de la media de osteoclastos ..................................................... 71

Gráfico 3 Nivel de osteocitos según el tipo de tratamiento .................................. 72

Gráfico 4 Nivel de neovascularización según el tipo de tratamiento .................... 73

Gráfico 5 Presencia de fibrosis según el tipo de tratamiento ................................ 75

Gráfico 6 Presencia de hueso inmaduro según el tipo de tratamiento .................. 76

Gráfico 7 Presencia de calcificación según el tipo de tratamiento........................ 78

xvii

LISTA DE ANEXOS

Anexo A Protocolo de Bioseguridad de acuerdo al M.S.P. del Ecuador .............. 89

Anexo B Protocolo de Manejo de Desechos de acuerdo al M.S.P. del Ecuador .. 91

Anexo C Aspectos Bioéticos ................................................................................. 93

Anexo D Declaración de Conflicto de interés....................................................... 98

Anexo E Certificado del Veterinario y el Anátomo-patólogo .............................. 99

Anexo F Registro sanitario del sulfato de calcio bifásico en el Ecuador ............ 101

Anexo G Registro sanitario del Alendronato en el Ecuador ............................... 103

Anexo H Proceso para la obtención del Fármaco dada por el Ingeniero Químico y

el Químico Farmacéutico .................................................................................... 104

Anexo I Pruebas de análisis estadísticos ............................................................. 106

Anexo J Muestras procesadas. ............................................................................ 109

xviii

Tema: Estudio histomorfométrico de la regeneración ósea utilizando sulfato de

calcio y sulfato de calcio combinado con Alendronato: Estudio experimental en

conejos.



Quito, julio, 2017

RESUMEN

Introducción: Los bifosfonatos son fármacos con un amplio espectro de

indicaciones cuya principal capacidad es la inhibición de la función osteoclástica.

El sulfato de calcio bifásico es un injerto aloplástico que posee las ventajas del

sulfato del calcio sin sus desventajas. El objetivo de este estudio fue determinar la

eficacia de la regeneración ósea utilizando sulfato de calcio bifásico combinado

con Alendronato. Metodología: Se utilizaron 20 conejos machos andinos entre

1,5 a 2,5kg., con una muestra de 30 fémures, divididos en 3 grupos: G1 control

negativo, G2 con sulfato de calcio bifásico y G3 con sulfato de calcio bifásico

combinado con alendronato en los cuales se realizó una incisión de 2,5cm para

crear defectos de 5mm de diámetro con una profundidad de 1.5 mm. Todos los

animales fueron sacrificados a la sexta semana. Los resultados se obtuvieron a

través de estudios histomorfométricos. Resultados: Según el análisis entre grupos

el estudio demostró para osteoblastos: p = 0,078; osteoclastos: p = 0,260;

osteocitos: p = 0,830; fibrosis: p = 0,076; hueso inmaduro: p = 0,355 y

calcificación: p = 0,659 (no significativos). Mientras que para la variable

neovascularización fue de p = 0.010 (significativo). No se observó diferencia

estadísticamente significativa en osteoblastos y osteoclastos entre los grupos, sin

embargo, en el grupo G3 se observó mayor formación de osteoblastos y

osteoclastos. Conclusiones: No existe una diferencia importante en la

regeneración ósea entre el sulfato de calcio y el sulfato de calcio combinado con

alendronato.

PALABRAS CLAVES: REGENERACIÓN ÓSEA/ INJERTO ALOPLÁSTICO/

ALENDRONATO / BIFOSFONATOS/ OSTEOCONDUCCIÓN.

xix

“Histomorphometric study of bone regeneration using calcium sulfate and

calcium sulfate combined with Alendronate: Experimental study in rabbits”

Author: Catherine de las Mercedes Tamayo Alcívar


Quito, julio, 2017

ABSTRACT

Introduction: Biphosphonates are drugs with a broad spectrum of indications

whose main capacity is the inhibition of osteoclastic function. Biphasic calcium

sulfate is an alloplast graft that possesses the advantages of calcium sulfate

without its disadvantages. The objective of this study was to determine the

efficacy of bone regeneration using biphasic calcium sulfate combined with

Alendronate. Methodology: Twenty male Andean rabbits between 1.5 and 2.5kg

were used, with a sample of 30 femurs; the animals were divided into 3 groups:

G1 negative control, G2 with biphasic calcium sulfate and G3 with biphasic

calcium sulfate combined with alendronate in which an incision of 2.5cm was

made to create defects of 5mm in diameter with a depth of 1.5mm. All animals

were sacrificed at six weeks. The results were obtained through

histomorphometric studies. Results: According to the analysis among the groups,

the study showed: for osteoblasts: p = 0.078; Osteoclasts: p = 0.260; Osteocytes: p

= 0.830; Fibrosis: p = 0.076; Immature bone: p = 0.355 and calcification: p =

0.659 (not significant). On the other hand, for the variable neovascularization it

was p = 0.010 (significant). No statistically significant difference was observed in

osteoblasts and osteoclasts among the groups; however in the G3 group there was

a higher formation of osteoblasts and osteoclasts. Conclusions: There is no

significant difference in bone regeneration between calcium sulfate and calcium

sulfate combined with alendronate.

KEY WORDS: BONE REGENERATION / ALLOPLASTIC GRAFT /

ALENDRONATE / BIPHOSPHONATES / OSTEOCONDUCTION.

1

CAPÍTULO I

1. INTRODUCCIÓN

Durante décadas ha sido considerable la demanda de pacientes que acuden a la

consulta para el reemplazo de dientes perdidos, esto implica la colocación de

implantes y su respectiva rehabilitación. La gran mayoría de los pacientes que

presentan edentulismo parcial o total son de edad avanzada; este grupo de

personas cada vez aumenta más alrededor del mundo.

La cantidad y calidad de hueso de estos pacientes se ve afectada por enfermedades

sistémicas tales como: diabetes y osteoporosis y ellos podrían también presentar

un nivel bajo de regeneración ósea, todo esto puede contribuir a niveles bajos en

el éxito de la terapia con implantes.

Por otro lado, el deseo de alcanzar una oseointegración más rápida es común tanto

para pacientes como para profesionales.

Esto ha motivado a la búsqueda y el desarrollo de nuevos materiales y técnicas

que optimicen el proceso de remodelación ósea (1)

, en este sentido es interesante

conocer el uso de bifosfonatos como biomoduladores de hueso en implantología,

esto debido a la habilidad que tiene este fármaco de inhibir la actividad de los

osteoclastos es por ello que estos fármacos han sido usados como tratamientos

largos en enfermedades que desarrollan excesiva reabsorción, tales como la

hipercalcemia, la osteoporosis, la metástasis ósea entre otras. La intención es que

los bifosfonatos se transformen en una influencia positiva en el remodelado óseo.

Hay muchos efectos severos ocasionados por este fármaco aplicado

sistémicamente, la idea principal es desarrollar métodos para poderlo usar de

manera local y de esta forma evitarlos (1)

.

1.1. Planteamiento del problema

Generalmente se requiere un injerto o un sustituto de hueso para ayudar o

completar la reparación de una deficiencia esquelética debida a trauma, tumores o

desarrollo anormal de los maxilares, y así restaurar la función normal del tejido

2

(2,3,4). Actualmente, los materiales más utilizados son el hueso del mismo paciente

(hueso autólogo considerado como el «gold standar» de los injertos óseos) o

hueso de cadáver comercializado a altos costos (hueso alogénico) pero debido a la

limitada disponibilidad asociada a las técnicas de extracción de injerto óseo

autólogo, morbilidad del sitio donador al realizar la cirugía de recolección,

cantidad de hueso y problemas de rechazo, así también la posibilidad de

transmisión de enfermedades al utilizar hueso alogénico hace que se opte por otras

alternativas terapéuticas (5,6,7)

. Recientemente se ha incrementado el interés por el

desarrollo de nuevos materiales que suplan las necesidades de hueso autólogo y

aporten además todas sus ventajas (8)

para de esta manera utilizar un material

ideal que los reemplace y elimine los problemas que se presentan al utilizarlos,

para ello se han realizado investigaciones con diferentes materiales incluyendo

biológicos, polímeros, cerámicos y combinaciones de estos (9,10,11)

, uno de ellos es

el sulfato de calcio que contrario al fosfato de calcio, es reabsorbible y sustituido

por hueso hospedero en un periodo aproximado de 12 semanas, (12)

sin embargo,

sigue siendo una necesidad poder trabajar en tiempos más cortos en la

regeneración ósea.

Varios estudios clínicos de pacientes han demostrado que la administración

sistémica de los bifosfonatos puede reducir las tasas de pérdida del implante

ortopédico que reemplaza a la articulación (13,14,15,16)

, también como prevención

de fracturas en mujeres con osteoporosis (17)

, en tratamientos de mieloma múltiple,

metástasis óseas originadas por tumores principalmente en la mama, el pulmón y

la próstata (18)

pero el tratamiento sistémico compromete a todo el esqueleto, lo

que expone a los pacientes a riesgos asociados de efectos secundarios o reacciones

adversas tales como náuseas, vómitos, dolor epigástrico, dispepsia y osteonecrosis

maxilar. Por lo cual se formula el siguiente problema de Investigación:

¿Cuál es la eficacia de la regeneración ósea utilizando sulfato de calcio y sulfato

de calcio combinado con Alendronato en conejos?

3

1.2. Objetivos

1.2.1. Objetivo general

Determinar la eficacia de la regeneración ósea utilizando sulfato de calcio y

sulfato de calcio combinado con Alendronato en conejos.

1.2.2. Objetivos específicos

i. Establecer la cantidad de osteoblastos y osteoclastos formados en el grupo

G1, G2 y G3

ii. Observar la neovascularización, hueso inmaduro, calcificación y fibrosis

formada en relación al tratamiento aplicado.

iii. Comparar la eficacia de la regeneración ósea utilizando sulfato de calcio y

sulfato de calcio combinado con Alendronato en conejos

1.3. Justificación

El sulfato de calcio tiene períodos de reabsorción variable y oscila de unas

semanas a unos meses. En un modelo experimental de defecto óseo metafisiario

tibial y femoral en corderos, se ha demostrado con aloinjertos y autoinjertos, que

el sulfato de calcio proporciona unos resultados histológicos similares a los

observados con los aloinjertos (19)

. La materia prima con la cual se confecciona es

barata y abundante, se puede combinar con otros materiales como autoinjertos,

aloinjertos, fosfatos de calcio, y vidrios bioactivos, para potenciar sus propiedades

de unión, el volumen y la eficacia de los injertos óseos. También ha servido como

un material de vehículo excelente para los factores de crecimiento y múltiples

drogas, a pesar de estas ventajas, el material no ha gozado de la popularidad de

muchos otros materiales de regeneración, aunque recientemente ha recibido una

atención renovada con propiedades hemostáticas, angiogénicas y de barrera o

membrana para la preservación de rebordes alveolares postexodoncias (20)

; por

otro lado los bifosfonatos se pueden utilizar de manera local ayudando a que no

4

se reabsorba el hueso (21)

. Dentro de los bifofonatos, el alendronato es un

candidato para la aplicación terapéutica, ya que tiene una larga historia de uso

clínico y es ampliamente aceptado en la comunidad médica para el tratamiento de

la osteoporosis.

No existen trabajos en la literatura sobre la efectividad del alendronato y el sulfato

de calcio bifásico lo cual la hace una investigación pionera en el mundo y en

nuestro país sabiendo que, con esto podemos aprovechar sus ventajas y realizar

una regeneración ósea de mejor calidad, menor tiempo y costo.

1.4. Hipótesis

1.4.1. Hipótesis alternativa (H1)

El sulfato de calcio combinado con alendronato tendrá mayor eficacia

regenerativa que el sulfato de calcio.

1.4.2. Hipótesis nula (H0)

El sulfato de calcio combinado con alendronato tendrá menor eficacia

regenerativa que el sulfato de calcio.

5

CAPÍTULO II

2. MARCO TEÓRICO

2.1. Histología y fisiología ósea

Dentro de la histología, el hueso es un tejido conjuntivo mineralizado muy

vascularizado e inervado, estructurado en laminillas de matriz osteoide

calcificada. La conformación de estas laminillas es la que determina que el hueso

sea cortical o esponjoso. Estos dos están constituidos por osteonas. El hueso

cortical o compacto se compone de conductos de Havers recubiertos de laminillas

en disposición concéntrica donde se sitúan los osteocitos. El hueso esponjoso o

trabecular lo constituyen laminillas óseas en forma de red que delimitan cavidades

areolares en cuyo interior se encuentra la médula ósea (22).

Tanto el hueso cortical

como el esponjoso contienen células especializadas, matriz orgánica y fase

mineral.

2.1.1. Células óseas

En el hueso coexisten varios tipos de células. Las células óseas se hallan dentro

del propio tejido óseo o en el estroma conjuntivo de la médula ósea, rico en

células mesenquimales pluripotenciales indiferenciadas o MSC (mesenchymal

stem cells). Desde los trabajos de Friedenstein en 1976 se conoce que estas stem

cells pueden dar origen a cinco estirpes celulares distintas: fibroblastos,

osteoblastos, condroblastos, adipocitos y mioblastos (23)

, en respuesta a diferentes

señales moleculares que inician la cascada de activación de diferentes genes.

2.1.1.1. El osteoblasto

Los osteoblastos son células grandes (20-30 µm), con citoplasma basófilo, de

forma poliédrica y un retículo endoplásmico rugoso de tamaño importante, con un

aparato de Golgi. Proceden de las células mesenquimales pluripotenciales de la

6

médula ósea, endostio, periostio y pericitos perivasculares (24)

.Emiten procesos

citoplasmáticos hacia la matriz, que comunican con la red de osteocitos y con

osteoblastos vecinos. Los osteoblastos y osteocitos se comunican entre sí por

proteínas transmembrana o integrinas, que actúan de enlace entre células o entre

una célula y la matriz extracelular, permitiendo el paso de mensajeros como

calcio, prostaglandinas o citoquinas. En estas células la conexión intercelular es la

Conexina 43 (25)

.Los osteoblastos sintetizan la matriz orgánica o sustancia

osteoide a un ritmo de 2 a 3 µm por día y expresan una enzima característica la

fosfatasa alcalina (ALP), que consiente la mineralización a un ritmo de 1-2 µm

por día. Actualmente, se sabe que:

1. Sintetizan las proteínas colágenas y no colágenas de la matriz orgánica del

hueso.

2. Dirigen la disposición de las fibrillas de la matriz extracelular.

3. Ayudan a la mineralización de la sustancia osteoide, gracias a la fosfatasa

alcalina,

4. Intervienen en la reabsorción llevada a cabo por los osteoclastos a través de la

síntesis de citoquinas específicas y (26).

5. Sintetizan factores de crecimiento.

La vida media de los osteoblastos humanos es de 1 a 10 semanas, al término de

las cuales pueden desaparecer por mecanismos de apoptosis, transformarse en

células limitantes o de revestimiento (bone lining cells) o en osteocitos (15 %) (6)

.

Ambos tipos celulares representan estadíos más avanzados de maduración. Las

células limitantes son células elongadas y planas, sin apenas organelas, con un

núcleo en forma de huso. Pueden expresar los marcadores osteoblásticos

anteriormente citados como sialoproteína ósea, osteopontina, osteonectina, y

fosfatasa alcalina, así como el receptor de parathormona (PTH). Permanecen a lo

largo de la superficie endóstica, formando con el endostio una capa protectora de

la superficie ósea, que juega un papel importante en la activación del remodelado

óseo.

7

2.1.1.2. El osteocito

Una vez mineralizada la matriz, unos pocos osteoblastos quedan atrapados dentro,

transformándose en osteocitos. Los osteoblastos, células limitantes y osteoclastos

se hallan en la superficie ósea, mientras que los osteocitos están en el interior. Los

osteocitos son las células más abundantes del hueso (10 veces más que los

osteoblastos). Poseen forma estrellada y su cuerpo se sitúa en el interior de

lagunas u osteoplasmas y los procesos citoplasmáticos se comunican entre sí a

través de los conductos calcóforos que están llenos de fluido óseo extracelular. De

esta forma, los osteocitos se organizan formando un sincitio de células

interconectadas que representa una única estructura, con la ventaja de que existe

una gran superficie de contacto en el interior y hacia la superficie ósea, para

asegurarse oxígeno y nutrientes. Cuando se produce un trauma en el hueso la

detención de la circulación sanguínea origina hipoxia y necrosis de los osteocitos

que estén a más de 0.1 mm de un capilar intacto (27)

.

Los osteocitos constituyen el estadío final desde la línea osteoblástica y son

incapaces de renovarse. Poseen los mismos marcadores que los osteoblastos, pero

tienen como marcador específico el CD44, receptor de membrana que se expresa

fuertemente en osteocitos y es negativo en osteoblastos y células limitantes.

2.1.1.3. El osteoclasto

Las células encargadas de la reabsorción son los osteoclastos. Se trata de

células grandes (100 µm), ricas en mitocondrias, multinucleadas y vacuolas. Los

osteoclastos contienen fosfatasa ácida tartrato resistente (TRAP), que permite la

desfosforilación de las proteínas, cuya actividad es aprovechada para su

identificación, tanto in vivo como in vitro. Además, poseen receptores para

calcitonina. Los osteoclastos proceden de células madre hematopoyéticas

medulares llamadas “Unidades Formadoras de Colonias de Granulocitos y

Macrófagos” (CFU-GM), precursoras de macrófagos y monocitos (28)

.

8

Los osteoclastos tienen dos especializaciones en la membrana: una zona clara, rica

en microfilamentos, con integrinas que sirven de anclaje a la matriz y un borde en

cepillo, que es donde tiene lugar la reabsorción. Para ello, los osteoclastos se

movilizan hacia la zona a reabsorber y, seguidamente, se fijan a la superficie ósea

mineralizada por el ribete en cepillo sellando los bordes del área mediante las

integrinas. La integrina del osteoclasto, particularmente avβ3, inspecciona la

secuencia ArgGly-Asp (RGD) existente en el colágeno y otras proteínas de la

matriz osteoide. A este nivel el pH es ácido, ya que secretan ácidos (H+)

generados por la anhidrasa carbónica II y enzimas proteolíticas como colagenasas,

metaloproteasas, catepsina K, glucuronidasa, etc (28),

que van a originar la

reabsorción del hueso a través de la solubilización de la matriz orgánica primero y

de la mineral después.

Respecto a la osteoclastogénesis actualmente se sabe que los osteoblastos son

fundamentales para la formación de osteoclastos. Así, el factor estimulante de las

colonias de macrófagos (M-CSF) producido por los osteoblastos es pedido en las

primeras fases de la osteoclastogénesis para la formación de células gigantes

multinucleadas. Los conocimientos actuales acerca de la regulación de la

osteoclastogénesis se basan en la existencia de 3 moléculas clave: el RANKL

(ligando situado en la superficie de osteoblastos y pre-osteoblastos), la RANK

(receptor del anterior situado en la membrana de osteoclastos y pre-osteoclastos) y

la OPG (osteoprotegerina, proteína sintetizada por osteoblastos y pre-

osteoblastos) (26,29)

.El RANKL (receptor activator of NFkBligand) antiguamente

llamado ODF (osteoclast differentiation factor) es una citoquina transmembrana

perteneciente a la familia del factor de necrosis tumoral (TNF) (26)

. La interacción

entre RANKL y su receptor RANK produce una activación de la diferenciación y

de la actividad osteoclástica, aumentando la reabsorción, asimismo, los efectos del

RANKL tanto in vivo, como in vitro son inhibidos por la osteoprotegerina (OPG),

proteína circulante producida por los osteoblastos y pre-osteoblastos perteneciente

a la superfamilia de los receptores de TNF (30)

. Cuando se unen OPG y RANKL se

inhibe la unión de RANKL a RANK y se inhibe la diferenciación osteoclástica.

9

Por ello OPG, RANK y RANKL son importantes reguladores de la

osteoclastogénesis.

2.1.2. Matriz orgánica

La matriz orgánica o sustancia osteoide constituyen un tercio del peso óseo. Está

formada principalmente por proteínas, entre las que destaca el colágeno (90%). La

matriz representa gran importancia en el conjunto del sistema óseo, siendo

indiscutible este hecho cuando aparecen enfermedades del colágeno como la

osteogénesis imperfecta. No obstante, actualmente debe considerarse a la matriz

mineralizada extracelular como algo más allá que un reservorio de calcio y

fósforo, ya que constituye una reserva de proteínas que participan en la regulación

de la diferenciación celular y en la integridad y función del tejido óseo (31)

.

2.1.2.1. El colágeno

El 90% de la matriz extracelular (MEC) está constituida por colágeno, sobre todo

tipo I (>95%) y tipo V (<5%). También se ha comprobado la presencia en

pequeñas proporciones de colágeno tipo III, relacionado con las fibras de Sharpey

y tipo XII, formado bajo estrés mecánico. En la molécula de colágeno se halla la

secuencia Arg-Gly-Asp (RGD), que es reconocida por las integrinas de superficie

de las células óseas(32)

.Contiene característicamente, los aminoácidos hidroxilisina

e hidroxiprolina siendo, este último, un marcador específico de todos los fenotipos

de colágeno y estando sus valores de excreción urinaria en relación directa con la

tasa de reabsorción ósea (33)

. Las fibras de colágeno se aseguran mediante puentes

de hidrógeno entre aminoácidos y a través de la formación de puentes de

piridinolina, entre las hidroxilisinas y lisinas. No obstante, el colágeno no tiene

gran afinidad por el calcio, por lo que son otras las proteínas implicadas en el

depósito mineral.

10

2.1.2.2. Proteínas no colágenas

Entre ellas destacan:

Proteoglicanos

Constituyen el 10% de las proteínas no colágenas. Son moléculas de gran tamaño.

En la matriz osteoide hay cuatro tipos de proteoglicanos: Biglicano y decorina: de

molécula más pequeña, éstas proceden de una duplicación genética, esta proteína

es un componente del tejido conectivo y se acopla a las fibrillas de colágeno tipo

I, tomando un papel muy importante en el ensamblaje de la matrix extracelular.

Hialuronano: de molécula grande, es un componente de la matrix extracelular, que

promueve la motilidad celular, la adhesión y la proliferación celular y el

Condroitín Sulfato, de mólecula también grande, está presente en la células que

rodean la matriz extracelular, en tejido conectivo, tendones cartílago, piel vasos

sanguíneos, ligamentos (34)

.

Proteínas con ácido γ-carboxi-glutámico

Son la osteocalcina (OCN) y la proteína de la matriz con ácido γ-

carboxiglutámico. Este ácido es un aminoácido que liga calcio y necesita vitamina

K para su síntesis. La osteocalcina es una pequeña proteína de la matriz

sintetizada por los osteoblastos y plaquetas, dependiente de las vitaminas D y K.

Constituye el 15% de las proteínas no colágenas de la matriz y contiene tres restos

de ácido γ-carboxiglutámico. Sus niveles plasmáticos se han estimado como uno

de los marcadores bioquímicos de la osteogénesis, relacionándose con el número

y actividad de los osteoblastos. (35)

.

11

Glicoproteínas

Son la osteonectina, la fosfatasa alcalina y las proteínas con el tripéptido RGD

(Arg-Gly-Asp). La osteonectina es una glicoproteína con gran afinidad por el

colágeno tipo I, por el calcio y por la hidroxiapatita. Constituye el 25% de las

proteínas no colágenas. Se cree que interviene en la regulación de la adhesión

celular entre la matriz y las células. En el hueso es necesaria para la

mineralización normal. La fosfatasa alcalina es una enzima que libera fosfato

inorgánico a partir de ésteres fosfóricos, necesario para la mineralización. Existen

varias isoenzimas y, entre ellas la ósea, se ha considerado un buen marcador de la

actividad osteoblástica. (35)

.

Proteínas procedentes del plasma

Se encuentran en la matriz orgánica ósea en mayor proporción que en el plasma.

Son la albúmina y la a2-SH-glicoproteína, posiblemente relacionadas con la

incorporación del calcio a la matriz osteoide. (35).

2.1.2.3. Factores de crecimiento

Son polipéptidos sintetizados en el propio hueso o procedentes de otros lugares

(hígado, plaquetas, etc.), que participan en la diferenciación, crecimiento y

proliferación de las células de forma autocrina o paracrina (35).

2.1.3. Fase mineral

Finalmente, el elemento mineral del hueso representa el 65% del peso óseo. Está

formado por calcio, fosfato y carbonato (en proporciones de 10:6:1) en forma de

pequeños cristales de hidroxiapatita Ca10 (PO4)6(OH)2 y, en menor cantidad hay

magnesio, sodio, potasio, manganeso y flúor. El plasma se encuentra

sobresaturado de calcio y fósforo respecto a la hidroxiapatita, por lo que debe

haber sustancias que inhiban la mineralización. Las proteínas con capacidad

12

adhesiva favorecen la mineralización, mientras que los proteoglicanos, magnesio,

ATP y pirofosfato la inhiben. (35)

2.2. Regeneración ósea

La regeneración es la respuesta que consigue la restitución e integración del tejido

tras un trauma, al contrario de la reparación, donde el tejido que se forma es un

tejido cicatricial, con características diferentes al original. Es decir, el hueso es el

único tejido del organismo, a excepción del tejido embrionario, que se restaura

totalmente tras una lesión. (36)

. La regeneración ósea causa una respuesta en la que

están implicados los vasos sanguíneos, las células y la matriz extracelular. Desde

los estudios de Trueta (37)

, se sabe de la importancia de los vasos sanguíneos en la

osteogénesis. Tras un trauma, se ocasiona una respuesta inflamatoria y un

hematoma inicial, con plaquetas, hematíes y fibrina. Las células del coágulo

liberan factores de crecimiento y interleuquinas, originando la migración de

macrófagos, linfocitos, precursores de osteoclastos y células mesenquimales

pluripotenciales. Estas señales moleculares promueven la diferenciación hacia

células fibroblastos, endoteliales, condroblastos y osteoblastos, dando origen a un

nuevo tejido fibrovascular, que reemplazará al coágulo inicial. Todo ello está

regido por una cadena de complejas interacciones entre citoquinas y factores de

crecimiento. En este proceso va a ser fundamental el aporte vascular, la

mineralización y la síntesis proteica.

2.2.1. Osteogénesis

La deposición de nuevo hueso por parte de estas células osteogénicas donde

generalmente es un proceso en el que solo participa el organismo y no tiene tanto

protagonismo el biomaterial. Existen dos tipos de osteogénesis: osteogénesis a

distancia en donde el tejido óseo se forma desde la superficie del hueso

circundante y osteogénesis de contacto en donde la formación de tejido óseo se

produce desde la superficie del implante. En la osificación es imprescindible el

correcto rol de las células, los vasos sanguíneos y la matriz extracelular (38)

.

13

2.2.2. Osteoinducción

Estas moléculas cabe dividirlas en dos grupos: por una parte, el de los factores de

diferenciación, que corresponde a las proteínas morfogenéticas (BMP), y

representan a aquellas proteínas que pueden promover la diferenciación de células

mesenquimales indiferenciadas en líneas osteoblásticas. El otro grupo de

inducción, que son proteínas que están involucradas en el metabolismo óseo pero

que no influyen en la indiferenciación de líneas celulares: proveen el desarrollo

del tejido óseo, como son el PDGF, FGF, IGF, EGF, TGF, Y VEGF. La fuente de

estas proteínas son los injertos autólogos, el plasma rico en factores de

crecimiento y las BMPs obtenidas mediante técnicas de ingeniería genética. (39)

.

2.2.3. Osteoconducción

Depende de la matriz celular insoluble, es decir son los materiales que hacen de

guía para el crecimiento óseo y que consienten que se deposite hueso nuevo; es el

caso de la hidroxiapatita, sulfato de calcio, las cerámicas de calcio, fibrinas,

fosfatos de calcio, hueso desmineralizado, y también las nuevas superficies de los

implantes (39).

2.3. Remodelación Ósea

El remodelado óseo se puede dividir en diferentes fases:

1. Fase quiescente: el hueso se encuentra en condiciones de reposo. (40)

2. Fase de activación: esta fase comienza gracias a la retracción de los

osteoblastos maduros elongados existentes en la superficie endostal y la

digestión de la membrana en dicha superficie por la acción de las

colagenasas. Al quedar así expuesta la superficie mineralizada se produce la

atracción de células osteoclásticas y sus precursores desde los vasos

próximos. (40)

.

14

3. Fase de resorción: en esta fase los osteoclastos comienzan a disolver la

matriz mineral y a descomponer la matriz osteoide. Este proceso finaliza por

la actividad “carroñera” de los macrófagos y permite la liberación de los

factores de crecimiento contenidos en la matriz (40)

.

4. Fase de nueva formación: simultáneamente en las zonas reabsorbidas se

produce el fenómeno de agrupamiento de preosteoblastos, atraídos por los

factores de crecimiento liberador de la matriz ósea que actúan como

quimiotácticos y estimulan su proliferación (40)

.

5. Fase de mineralización: el osteoide comienza a mineralizarse en esta fase,

seguida de nuevo por una fase quiescente o de descanso (40)

.

2.3.1. Factores de remodelado óseo

1. Factores genéticos: son determinantes ya que entre el 60 y el 80% de la masa

ósea se encuentra determinada genéticamente (41)

.

2. Factores mecánicos: la actividad física es fundamental para el desarrollo del

hueso. Así, la acción muscular transmite tensión al hueso, activando

osteocitos y osteoblastos para estimular la formación ósea. Por el contrario, la

falta de actividad muscular tiene un efecto deletéreo sobre el hueso y acelera

la reabsorción ósea (42)

.

3. Factores vasculares: la vascularización es fundamental para el remodelado

óseo ya que permite el acceso de células sanguíneas, glucosa, oxígeno, iones,

hormonas minerales y factores de crecimiento al entorno óseo (42)

.

4. Factores nutricionales: Este factor puede ser modificado. Se necesita un

mínimo de calcio para permitir la mineralización que se cifra en unos 1200

mg. diarios hasta los 25 años; después y hasta los 45 no debe ser inferior a 1

gr y tras la menopausia debe ser por lo menos 1500 mg al día. Asimismo, se

conoce que hábitos tóxicos como tabaco, cafeína, alcohol y exceso de sal

contribuyen a la aparición de osteopenia.

15

5. Factores hormonales: el desarrollo normal del esqueleto está condicionado

por el correcto funcionamiento del sistema endocrino, fundamentalmente de

la hormona somatotropina GH (hormona de crecimiento) y las hormonas

calciotropas, entre ellas la parathormona (PTH), la calcitonina y los

metabolitos de la vitamina D. Estas hormonas actúan a distancia de su lugar

de producción (efectos endocrinos), pero también regulan la síntesis y acción

de factores locales que intervienen directamente en el metabolismo óseo

(efectos autocrinos y paracrinos). Las hormonas más importantes que

intervienen en la fisiología ósea son: Hormonas tiroideas, PTH

(parathormona), Calcitonina, 1,25(OH)2 vitamina D3 o Calcitriol,

Andrógenos, Estrógenos, Progesterona, Insulina, Glucocorticoides y

Hormona de crecimiento (GH) (43)

.

6. Factores locales: el remodelado óseo está regulado por varios factores

locales, entre los que destacan las citoquinas, factores de crecimiento y las

proteínas de la matriz ósea, como moduladores de la acción de hormonas

calciotropas entre otros factores que afectan al metabolismo óseo (42)

.

2.4. Injertos óseos

Existen varias familias de sustitutos óseos, la mayoría de origen sintético y

algunos de origen biológico. La elección del modo de relleno se realiza según

muchos criterios, como la etiología, el estado local, el volumen que debe

rellenarse, la edad del paciente, etc (44)

.

2.4.1. Aloinjertos

Un aloinjerto óseo consiste en la utilización de un hueso proveniente de un

individuo de la misma especie (44).

Los aloinjertos se someten en primer lugar a un lavado y una detersión mecánica a

presión, para eliminar los restos tisulares, celulares y medulares. Este tratamiento

inicial permite limpiar las celdillas intertrabeculares, lo que facilita su

16

colonización por el blastema de regeneración y la osteoconducción. Luego se les

realizan varios tratamientos químicos, codificados conforme a las normas

europeas, que permiten una desproteinización parcial y una deslipidación, que

tienen además, una acción específica sobre los virus y los agentes infecciosos de

tipo priónico y agentes transmisibles no convencionales. Todas y cada una de

estas etapas diferentes intervienen en la inactivación del injerto al reducir la carga

viral potencial (44)

.

2.4.2. Xenoinjertos

Los xenoinjertos consisten en hueso provinente de un donante de una especie

diferente a la del receptor, osteoconductores. Sus ventajas son la abundancia y

facilidad de extracción. Los procedimientos de preparación que se utilizan en la

actualidad se dirigen a eliminar cualquier antigenicidad, a la vez que se conservan

cualidades biológicas del tejido óseo. (44,45,46)

.

Algunos xenoinjertos se someten a un tratamiento a muy alta temperatura,

correspondiente a una ceramización, que los transforma en una cerámica de

hidroxiapatita idéntica a las hidroxiapatitas sintéticas a las que se puede asemejar.

(47).

Los sustitutos óseos provienen por lo general de bovinos, por lo que se ha

sugerido la posibilidad de transmisión al ser humano de encefalopatía

espongiforme bovina (EEB), debida a priones. La infectividad no parece

detectable difiere según los tejidos; el hueso forma parte de la clase IV, en la que

se considera que la infectividad no parece detectable, que es más teórico que real.

En este proceso, los animales se someten a un control veterinario idéntico al de

los animales destinados a la alimentación humana (47).

Las diferentes etapas de tratamiento limitan a continuación de forma considerable,

e incluso anulan, el riesgo de contagio. En una primera fase, el hueso se corta y se

somete a un tratamiento mecánico que elimina la mayoría de los restos celulares.

17

A continuación, se somete a distintos tratamientos químicos que permiten una

desproteinización más o menos completa, una deslipidación y, por último, una

inactivación viral contra los priones. Estas extracciones se realizan por la

asociación de diclorometano, de betamercaptoetanol y de úrea, según métodos que

varían en función de los fabricantes, pero cuyos principios generales son

idénticos. Por último, este tratamiento se termina con una esterilización mediante

irradiación (47).

Después de los tratamientos, los xenoinjertos presentan una arquitectura ósea

similar a la del hueso esponjoso humano. La red trabecular está constituida por la

red colágena y fase mineral. Los distintos procedimientos de fabricación no

parecen alterar las propiedades mecánicas, que son comparables a las del hueso

humano esponjoso, con una resistencia a la compresión del orden de 8MPa. Estos

sustitutos óseos están disponibles en diferentes formas estandarizadas:

fragmentos, bloques, cuñas, cilindros, etc. Se conservan a temperatura ambiente

(47).

2.4.3. Injertos aloplásticos

Se obtienen a partir de la síntesis química, por lo que no poseen riesgos

microbiológicos indicados en el apartado de los sustitutos de origen óseo (47)

.

Estos sustitutos óseos sintéticos pueden estar compuestos por hidroxiapatita,

fosfato tricálcico, sulfato cálcico o una combinación de estos minerales. Las

dimensiones del poro, la técnica de fabricación, las propiedades mecánicas la

cristalinidad y la tasa de reabsorción pueden variar, los sustitutos óseos sintéticos

comparten diversas ventajas sobre los auto y aloinjertos, incluyendo, la facilidad

para su esterilización, la ilimitada disponibilidad y su la facilidad para almacenaje.

Sin embargo, presentan diversas limitaciones, como la variabilidad en su carácter

osteoconductor, las diferencias entre la repoblación celular de las diferentes

matrices, los efectos potencialmente adversos sobre el remodelado óseo normal,

los aspectos comerciales relacionados con su utilización. (48)

.

18

2.4.3.1. Características generales

Todo material a emplear como sustituto óseo debe cumplir una serie de requisitos:

Estructuralmente similar al hueso.

Fácil manejo.

Relación coste / efectividad adecuada.

Bioabsorción.

Biocompatibilidad.

Osteoconducción / Osteoinducción.

La bioabsorción viene determinada por su degradación y disolución química

mediada por células que ocurre en condiciones ácidas. Va a depender

principalmente de la composición química del material, superficie total,

porosidad, así como de las condiciones locales. La respuesta bioactiva depende

del intercambio iónico con el hueso huésped y los fluidos orgánicos. En el proceso

de degradación, el sustituto óseo libera iones de fósforo y de calcio que al

difundirse localmente estimulan la osteogénesis. (49)

.

2.4.3.2. Clasificación de los sustitutos óseos

Cerámicas fosfocálcicas.

Hidroxiapatita.

Fosfatos tricálcicos.

Cementos fosfocálcicos.

Sulfato cálcico.

Colágeno.

Materiales Osteoinductores:

Matriz ósea desmineralizada (DBM).

Proteína ósea morfogenética (BMP).

Factores de crecimiento.

19

2.4.4. Sulfato de calcio

El sulfato de calcio (SC) se encuentra en una posición única en el universo de

materiales renovables. Tiene una historia más larga de uso clínico que la mayoría

de los biomateriales disponibles actualmente y es ampliamente reconocido como

un material bien tolerado, con aplicaciones en la regeneración ósea. Sufre casi

reabsorción completa en vivo, sin provocar una significativa respuesta

inflamatoria, una propiedad deseable compartida por pocos sustitutos óseos (20)

.

2.4.4.1. Reabsorción y osteogénesis del sulfato de calcio

El sulfato de calcio se reabsorbe progresivamente de forma centrípeta,

conjuntamente a la regeneración ósea. El período de reabsorción es variable y

oscila de unas semanas a unos meses (19)

.La regeneración ósea se realiza

progresivamente desde la periferia hacia el centro, a medida que tiene lugar la

reabsorción, de un modo muy distinto al de los fosfatos de calcio. La propiedad

osteoconductiva del sulfato de calcio se describe como la habilidad de este

material para promover una fuente de iones inorgánicos que estimulen el

crecimiento óseo. Aunque los iones inorgánicos suficientes para la reparación de

los defectos puedan ser proporcionados por la reabsorción osteoclástica del hueso

en los bordes de los defectos, esto puede no ocurrir cuando se trata de un defecto

grande y la pérdida de hueso es extensa. Consiguientemente el injerto de sulfato

de calcio en defectos grandes puede acelerar la cicatrización cediendo la presencia

de osteoblastos funcionales y la producción suficiente de matriz orgánica. Una vez

implantado el sulfato de calcio en el cuerpo, se disuelve en iones de calcio y

sulfato. Los iones de calcio se combinan con los iones fosfato a partir de los

fluidos del cuerpo para formar fosfato de calcio esto forma una red

osteoconductiva de apatita biológica que promueve el crecimiento óseo en el

defecto. Estudios de espectroscopia infrarroja mostraron que el nuevo material

depositado es principalmente hidroxiapatita carbonatada, el cual es similar a la

apatita presente de forma natural en el hueso. (50)

. Los iones de calcio son

20

liberados durante la disolución del SC. Aumentos locales en la concentración de

iones de calcio puede afectar la génesis y función de los osteoblastos, y puede

actuar como un estímulo a la diferenciación de los osteoblastos. El metafosfato de

calcio se ha demostrado que estimula la diferenciación osteoblástica de las células

del estroma de la médula ósea. (50).

2.4.4.2. Sulfato de calcio y su relación con las proteínas

morfogenéticas y factores de crecimiento

Walsh y cols. utilizaron técnicas de inmunohistoquímica para identificar el

crecimiento de varios factores de crecimiento en defectos femorales esponjosos

llenos con bolitas de sulfato de calcio. Se observó aumento de las

concentraciones de las proteínas morfogenéticas óseas (BMP) -2, BMP-7, factor

de crecimiento transformante-b (TGF-b), y el factor de crecimiento derivado de

plaquetas (PDGF), todos los cuales desempeñan un papel en la regeneración del

tejido conjuntivo. En conjunto, estos resultados sugieren que el SC no actúa

simplemente como un relleno inerte, pero puede desempeñar un papel más activo

en la osteogénesis (51)

. Otro evento importante del sulfato de calcio es que sufre

una degradación en el defecto y una disminución local en el pH. Esta caída del pH

produce una desmineralización de las paredes del defecto con liberación de

factores de crecimiento óseo. Estudios recientes indican que hay una mayor

expresión de proteína morfogenética ósea-2 (BMP-2), BMP-7, el TGF-beta y

PDGF-BB en defectos óseos cuando sulfato de calcio se utiliza como un injerto de

hueso. Todos estos factores de crecimiento estimulan la formación y el desarrollo

de hueso nuevo. Originalmente el sulfato de calcio fue percibido sólo como

relleno de defectos, pero tiene muchos estudios recientes demostrados que el

sulfato de calcio es biocompatible, biodegradable, osteoconductivo, seguro y no

es tóxico (52,53)

.

21

Tabla 1 Cuadro comparativo de los diferentes injertos óseos

Fuente: López, J,Alarcón,M. Sulfato de calcio: propiedades y aplicaciones clínicas. (20)

.

2.5. Bifosfonatos

Los bifosfonatos son medicamentos sintéticos análogos del pirofosfato inorgánico

que tienen una alta afinidad por el calcio. Son utilizados para prevenir la aparición

de posibles complicaciones óseas (como fracturas patológicas, metástasis ósea o

hipercalcemia) en patologías como la enfermedad de Paget, mieloma múltiple,

cáncer de próstata, mama y pulmón, y también en osteogénesis imperfecta y

displasia fibrosa. Los bifosfonatos orales, que son menos potentes, son utilizados

fundamentalmente en el tratamiento de la osteoporosis tras la menopausia en

mujeres (54)

.

2.5.1. Clasificación de los bifosfonatos

Los bifosfonatos se pueden clasificar en dos grandes grupos según su vía de

administración:

AUTOINJERTO ALOINJERTO SULFATO

DE CALCIO FOSFATO

DE CALCIO GLASS

BIOACTIVO OSTEOCONDUCTIVO SI SI SI SI SI

BIOCOMPATIBLE SI SI SI SI SI DEGRADACIÓN LENTA LENTA COMPLETO LENTA LENTA HEMOSTÁTICO NO NO SI NO NO ANGIOGÉNICO DEBIL NO FUERTE NO NO

BARRERA-MEMBRANA NO NO SI NO NO

LIBERACIÓNFACTOR CRECIMIENTO NO NO SI NO NO

DISPONIBILIDAD LIMITADA ILIMITADA ILIMITADA ILIMITADA ILIMITADA TRANSMISIÓN ENFERMEDAD NO POSIBLE NO NO NO

22

2.5.1.1. Vía intravenosa

Se administra pamidronato o ácido zoledrónico que se utilizan para la prevención

de metástasis en los procesos cancerosos. El ácido zoledrónico es 100 veces más

potente que el pamidronato. Este fármaco surgió con el fin de renovar al

pamidronato con la ventaja de que se aplica menos tiempo (infusiones de 15

minutos) pero se ha demostrado que la necrosis aparece antes y es más frecuente.

(55).

2.5.1.2. Vía oral

Se administran el alendronato, risedronato y otra larga lista de derivados para el

tratamiento de la osteoporosis, puesto que su potencia es muchísimo menor que la

de los medicamentos citados anteriormente. La potencia varía en función del

derivado suministrado (55)

.

Tabla 2 Bifosfonatos orales nombre comercial y presentación

Fuente: Santolaya D. Osteonecrosis por Bifosfonato. (55)

.

Se estima que más del 50% de la dosis de los bifosfonatos intravenosos se

incorpora dentro de la matriz ósea, comparado con los bifosfonatos orales donde

solo estaría disponible menos de un 1% (55).

Los bifosfonatos también pueden clasificarse según su composición química en

dos subgrupos, los que contienen nitrógeno y los que no. Los bifosfonatos que no

PRINCIPIO ACTIVO(NOMBRE COMERCIAL)

DOSIFICACIÓN/FORMA

ETIDRONATO(DIDRONEL) 200mg/400mg comp

CLODRONATO(BONEFOS) 400/800mg comp 60mg/ml ampolla

TILUDRONATO(SKELID) 200mg comp

ALENDRONATO(FOSAMAX) 5/10/35/40/70mg comp 70 mg/75ml

solución oral

IBANDRONATO(BONIVIA) 2,5/150mg comp 3mg/3ml viales

23

contienen nitrógeno, dentro de su estructura química, tienen una menor potencia,

no tienen efecto antitumoral y no causan tantas necrosis. Son potentes inhibidores

de los osteoclastos por lo que son utilizados en osteoporosis debido a su menor

potencia (55)

.

Tabla 3 Clasificación de los bifosfonatos según su composición química

Fuente: Santolaya D. Osteonecrosis por Bifosfonato (55).

2.5.2. Mecanismo de acción

Se han propuesto dos mecanismos moleculares básicos responsables de los efectos

de estos fármacos sobre la función osteoclástica que permiten su clasificación:

1. Los bifosfonatos que no contienen nitrógeno (etidronato, clodronato y

tiludronato), aquellos de primera generación, se unen a moléculas de ATP

que, incorporadas en osteoclastos, llegan a ser citotóxicas para estas células,

alterando su función celular y produciendo su apoptosis (56)

.

2. Los bifosfonatos nitrogenados, llamados de segunda y tercera generación

(pamidronato, alendronato, ibandronato, risedronato y zolendronato) son más

potentes que los anteriores. Inhiben a la farnesil pirofosfatasa sintasa y otros

pasos finales de la vía intracelular del mevalonato, cuyo producto final es el

colesterol (57)

.

CONTIENEN NITRÓGENO (NBPs)

NO CONTIENEN NITRÓGENO (NON NBPs)

ALENDRONATO CLODRONATO

IBANDRONATO ETIDRONATO

INCADRONATO TILENDRONATO

ALPADRONATO

PAMIDRONATO

RISENDRONATO

ZOLENDRONATO

24

2.5.3. Farmacocinética de los bifosfonatos

Los bifosfonatos, especialmente los aminobisfosfonatos como el alendronato, el

risedronato, el ibandronato o el zoledronato, son antirresortivos potentes, por lo

que detienen de forma intensa y mantenida, incluso después de varios años, los

marcadores de resorción a la vez que aumentan de forma significativa la densidad

mineral ósea. Los estudios preclínicos y también experimentales han demostrado

que después de su absorción los bifosfonatos son almacenados en el hueso o

eliminados rápidamente por la orina, con una mínima acumulación en los tejidos

no calcificados. En el caso del alendronato, tras una única dosis el 50% del

fármaco va a quedar retenido en el esqueleto ya en la primera semana de

tratamiento mientras que el otro 50% va a ser excretado por la orina. Luego de

ello, la retención es mucho más lenta y progresiva de manera que en el sexto mes

se alcanza una retención esquelética del 67%. Conjuntamente, la eliminación renal

también es lenta y progresiva, de manera que después de varios años aún va

eliminándose el fármaco, estimándose una vida media terminal de más de 10 años.

Después de su fijación en la hidroxiapatita del hueso y de efectuar su efecto

antirresortivo, como consecuencia de la osteoformación, el alendronato queda

alojado en la matriz ósea, y permanece allí un tiempo probablemente inactivo. Sin

embargo, más adelante, a consecuencia de la resorción ósea parte del alendronato

alojado en hueso con alto recambio óseo vuelve a liberarse para volver a ser

activo y continuar su efecto antirresortivo. De hecho, en la propia ficha técnica del

alendronato se remarca que si el tratamiento se discontinúa después de 10 años (a

una dosis de 70mg/sem), la liberación esquelética promedio a la circulación sería

aproximadamente la misma que se produciría por una administración oral a dosis

de 2,5mg/día. Por esta razón se ha sugerido que la retención esquelética de los

bifosfonatos podría contribuir a su efecto prolongado, aún después de ser

discontinuados, como por ejemplo ocurre en la enfermedad de Paget. (58)

.

25

2.6. Revisión de la literatura: Sulfato de calcio

2.6.1. En defectos óseos

Nick M. Tovar y cols (53)

, colocaron sulfato de calcio de grado médico

hemihidratado con hueso liofilizado en un perro con defecto profundo periodontal

en un paciente con enfermedad periodontal avanzada para reparar y regenerar el

defecto. El análisis de las radiografías a los 5 meses mostró que el hueso se había

regenerado completamente.

2.6.2. Como membrana o barrera

El uso del sulfato de calcio como barrera fue propuesto inicialmente por

Sottosanti en 1993 (59)

, este autor sugirió un protocolo de tratamiento combinando

el sulfato de calcio con aloinjerto óseo congelado desmineralizado (AODSC) y

seco como material de injerto en defectos óseos. En este estudio, el autor

describió los resultados de cuatro casos clínicos que fueron tratados con el injerto

de sulfato de calcio con el AODSC asociados a la barrera de sulfato de calcio.

Estos materiales fueron utilizados en lesiones infraóseas periodontales en el

relleno del alvéolo postextracción y en la inmovilización inicial de un implante

colocado en un alvéolo postextracción. El autor afirmó que el sulfato de calcio

usado como barrera retardó la migración de los tejidos epitelial y conjuntivo para

el interior de las lesiones, enfatizó la necesidad de estudios clínicos controlados

para analizar detalladamente y comparar esta terapia con otras.

2.6.3. En combinación con otros biomateriales

Anson en 1996, relató en su experiencia clínica de cuatro casos de pacientes

tratados con la técnica propuesta por Sottosanti. El autor colocó el complejo de

sulfato de calcio y AODSC asociados a la barrera de sulfato de calcio en defectos

óseos periodontales. Se realizaron exámenes radiográficos en los que se observó

aumento de radiopacidad de todas las regiones tratadas. El autor realizó una serie

26

de consideraciones enalteciendo las cualidades del sulfato de calcio utilizado

como barrera. Estos resultados fueron corroborados por Conner en 1996, en su

estudio clínico.

2.6.4. En aumento de seno maxilar

Dario De Leonardis y Gabriele E. Pecora en el año 2000 (60)

., en un estudio

prospectivo sobre el aumento del seno maxilar utilizando sulfato de calcio

hemihidratado como material de relleno óseo en procedimientos de elevación de

seno maxilar de 57 pacientes, divididos en 2 grupos, grupo test de 50 senos, grupo

en el que se colocó el sulfato de calcio en forma de masilla por capas endurecidas

para poder lograr formación de hueso vital para permitir la integración de los

tejidos con los implantes endo-óseos y apoyar las restauraciones de prótesis en

desdentados del maxilar posterior. En el grupo control de 15 senos se colocó

sulfato de calcio de forma no estratificada. Estos resultados y algunos más revelan

buena formación de tejido clínica y radiográficamente.

2.6.5. En preservación del reborde alveolar

Shi y cols., en el 2007 (61)

, utilizaron sulfato de calcio sin y con plasma rico en

plaquetas (PRP) como relleno en sitios de post extracción extracción en perros. La

adición de PRP mejora la cicatrización temprana de las heridas, pero no fue

estadísticamente significativa que el SC solo. Ambos grupos con SC fueron

superiores a la extracción que el grupo sin relleno.

2.7. Revisión de la literatura: Alendronato

En el 2005 von Knoch et al. (62)

, dijeron los bifosfonatos pueden hacer proliferar y

madurar a los osteoblastos e inhibir la apoptosis, incrementando la formación

ósea.

27

En el 2006 Iwata et al. (62)

, concluyeron que los bifosfonatos suprimen la actividad

osteoblástica en los sitios de remodelado óseo esto ha sugerido que las altas dosis

de bifosfonatos podía causar un efecto citotóxico sobre los osteoblastos.


aloinjertos: estudio en humanos

En el 2006 Kesteris y Aspenberg (62)

, impregnaron ibandronato sobre un

aloinjerto, se realizó un seguimiento durante 24 meses comparándolos con el

grupo control y en el grupo de bifosfonatos no se observó pérdida ósea

reduciéndose el riesgo de fracaso. Mientras que en el grupo control a los 3 meses

el injerto manifestó parcial pérdida ósea. Sin embargo, el estudio a largo plazo no

es significativo por lo que se recomienda más estudios y con mayor tiempo de

seguimiento.


aloinjertos

En el 2007 (62)

, Jakobson et al. usaron alendronato impregnado con aloinjerto en

perros. Los resultados fueron comparados con aloinjertos impregnados y no

impregnados con bifosfonatos. Estos resultados mostraron que la formación de

nuevo hueso fue inhibida en el grupo control. Sin embargo, el alendronato

incrementó la fijación biomecánica y la preservación del aloinjerto.

En el 2009 Agholme y Aspenberg (62)

, realizaron un estudio en ratas probando

cantidades de alendronato, esta cantidad fue de 2mg/ml y fue utilizada sobre

aloinjertos utilizando el bifosfonato diluido y sin diluir, se demostraron efectos

positivos en la formación ósea tempranamente. No hubo diferencias entre los dos

grupos de bifosfonatos o efectos negativos sobre el injerto óseo. Sus resultados

demostraron protección del injerto e incremento de formación ósea en los grupos

con alendronato.

28

En el 2010 Jacobsen et al. (62)

, dijeron que altas dosis de bifosfonatos han

ocasionado efectos negativos en la formación ósea.

En el 2012 Mathijssen et al. (62)

, realizaron un estudio sobre el efecto de dosis de

los bifosfonatos, en 25 cabras se crearon 8 defectos con aloinjerto impreganado

con diferente dosis de alendronato 0.5, 1, 2 y 10mg/ml en donde se rectificó que a

dosis mayores efectos negativos sobre el hueso se darán. Una posible explicación

de formación ósea puede ser la rápida remodelación por los osteoclastos. En los

injertos que no han sido tratados con bifosfonatos, los osteoblastos forman nuevo

hueso sin embargo los osteoclastos inmediatamente reabsorben este hueso. Esto

no sucede con los injertos tratados con bifosfonatos.

Los estudios han sugerido que los bifosfonatos podrían influenciar un efecto

positivo sobre la formación ósea y la remodelación y consecuentemente una mejor

fijación ósea del implante en humanos.

Debido a los efectos ocasionados al utilizar bifosfonatos sistémicos se han

realizado investigaciones para lograr su uso local, la intención es que los

bifosfonatos influencien positivamente en el remodelado óseo alrededor del

implante sin causar efectos sistémicos (1)

.

No hay evidencia científica del uso del sulfato de calcio combinado con

alendronato en la literatura.

29

CAPÍTULO III

3. DISEÑO METODOLÓGICO

3.1. Diseño de la investigación

Este fue un estudio de modelo experimental; ya que se experimentó en animales

distintos materiales para determinar la eficacia de la regeneración ósea.

Fue un estudio comparativo, ya que se establecioron las causas o factores de

riesgo de determinados problemas comparando dos grupos, algunos de los cuales

experimentaron el problema.

3.2. Sujetos y tamaño de la muestra

Se utilizaron 20 conejos andinos machos adultos de entre 1.5 kg a 2,5 Kg de peso

que cumplieron con los criterios de inclusión y que luego fueron divididos en

grupos de acuerdo a las variables independientes más un grupo control.

En nuestro caso, el número de grupos es k = 3, puesto que en 3 grupos se realizó

la comparación experimental. Determinamos n, bajo los siguientes parámetros:

α= Probabilidad de ocurrencia de un error de tipo I, del 95%.

β= Probabilidad de ocurrencia de un error de tipo II, del 80%

El tamaño muestral se obtuvo resolviendo la ecuación probabilística:

[

] , donde

[ ] es la función de distribución de una ley ji-cuadrado no central y

es la función de distribución de una ley ji-cuadrado usual.

30

λ es un parámetro que depende del tamaño muestral n.

Esta ecuación probabilística se resuelve con el empleo de software especializado;

en este caso se empleó el programa Minitab, ver 16.

Como muestra el gráfico, la muestra mínima recomendada es de 7 unidades por

grupo experimental; para mayor seguridad, tomamos 10.

Figura 1 Representación estadística

Fuente: Ing. Edwin Galindo

Ante las posibles pérdidas se incrementó un 30% adicional al cálculo y para que

sean grupos comparativos similares se estableció el número de 10 para cada grupo

siendo la muestra de 40 fémures de los 20 conejos andinos machos adultos.

3.3. Criterios de inclusión y exclusión

3.3.1. Criterios de Inclusión

Conejos andinos machos adultos entre 1,5Kg y 2,5Kg.

No presentaron ninguna enfermedad somática.

Pertenecieron a un mismo lugar de crianza.

31

3.3.2. Criterios de exclusión

Animales con enfermedades sistémicas.

Animales con infecciones posoperatorias.

Animales fallecidos.

32

3.4. Operacionalización de las variables

Variable Definición

operacional Clasificación Tipo Unidad de medida Escala de medición

Osteoblasto

Células del hueso

encargadas de

sintetizar la matriz

ósea, por lo que están

involucradas en el

desarrollo y el

crecimiento de los

huesos.

Cuantitativa

continua Independiente

cantidad de osteoblastos formados en los grupos G1,

G2, G3

0-20

Osteoclasto

Célula multinucleada,

móvil, gigante, que

degrada, reabsorbe y

remodela huesos

Cuantitativa

continua Independiente

cantidad de osteoclastos formados en los grupos G1,

G2, G3

0-20

Osteocito

Células que se forman

a partir de la

diferenciación de los

osteoblastos

Cualitativa

ordinal Independiente Abundantes, moderados, escasos. 1,2,3

Neovascularización Formación de nuevos

vasos

Cualitativa

ordinal Dependiente Abundantes, moderados, escasos 1,2,3

Fibrosis Desarrollo en exceso

de tejido conectivo

Cualitativa

ordinal Dependiente Ausente, Presente 1, 2

Hueso Inmaduro

Hueso primario,

disposición de las

fibras de colágeno I

que se organizan al

azar de forma irregular

Cualitativa


Calcificación Formación de

hidroxiapatita

Cualitativa


33

3.5. Estandarización

Se seleccionaron a los conejos mediante los criterios de inclusión con los debidos

cuidados en la Clínica Biomedicina Veterinaria Las Lomas por un Médico

Veterinario Zootecnista con diplomado en Anestesiología y Cirugía Veterinaria en

la Universidad Central del Ecuador, Especialista en Clínica y Cirugía Veterinaria

en la U.N.A.M.(México), Patología, Medicina Interna y Biológica en la U.T.M.;

el trabajo histomorfométrico fue realizado en el Hospital de la Policía Área de

Patología por un Anátomo-patólogo, especializado en la Universidad Central de

Quito, Coordinador del Área de Patología del Hospital de la Policía con

conocimientos en el estudio de hueso y de una estudiante de la Especialidad de

Implantología Oral de la Universidad Central de Quito quien tiene conocimientos

de regeneración ósea.

Se comenzó con la creación de defectos siguiendo los criterios de Eli E. Machetei

DMD (2013) para comparar la efectividad regenerativa entre el sulfato de calcio

y el sulfato de calcio combinado con alendronato a la sexta semana se sacrificaron

a los animales a cargo del Veterinario, luego se realizó el estudio de las muestras

por el Anátomo-patólogo bajo microscopía óptica y finalmente se analizaron los

resultados mediante una estadística descriptiva e interferencial.

3.6. Técnicas e instrumentos de investigación

3.6.1. Modelo de experimentación

Los conejos son unos animales de gran tamaño utilizados habitualmente para

ensayos en laboratorios. La similitud entre la fisiología del conejo y del humano

han hecho de este mamífero un buen modelo para la investigación de ciertas

enfermedades humanas.

En este estudio experimental se utilizaron 20 conejos andinos machos adultos con

una edad entre 20 y 22 meses y con un peso entre 1,5-2,5 Kg.

34

Los animales permanecieron en la clínica (ver Certificado de Clínica en Anexo E)

en buenas condiciones de salud y bajo la supervisión de una persona capacitada

para su cuidado. Habitaron en jaulas individuales a una temperatura ambiente de

22-30°C fueron alimentados con comida balanceada para conejos (150-200g/día y

con agua a demanda).

Se utilizaron 40 fémures, que fueron divididos en 3 grupos: G1 control negativo,

G2 con sulfato de calcio bifásico y G3 con sulfato de calcio bifásico combinado

con alendronato.

Figura 2 Conejo experimental

Fuente: Catherine Tamayo

3.6.2. Instrumental quirúrgico

Se utilizaron los siguientes materiales:

Jeringa de Anestesia

Mango de bisturí N°3

Molt 9

Tijera metzenbaum

Porta-agujas

Pinza Adson con y sin diente

Pinza Kelly Curva

Pocillo quirúrgico

Separador de tejidos

Trefina

35

3.6.3. Material quirúrgico

Motor NSK Surgic AP

Cloruro de sodio al 0.9%

Sutura reabsorbible (Vicryl 5.0)

Sutura no reabsorbible (Seda 4.0)

Campos y bata quirúrgica

Gorro

Guantes quirúrgicos

Mascarilla

Hoja de bisturí 15C

Jeringuilla descartable

Gasas

Yodopovidona

Máquina para afeitar

3.6.3.1. Bondbone

BONDBONE®.-Es un innovador material sintético para injertos óseos. Se

compone de sulfato de calcio bifásico, un acreditado material cuya

biocompatibilidad, osteoconductividad y biorreabsorbilidad están ampliamente

documentadas. Fragua rápidamente y sus propiedades físicas no se ven afectadas

por la presencia de sangre o saliva. La cantidad de compuesto utilizada en la

investigación fue de 0,25cc para los dos grupos de muestra.

El Registro Sanitario se encuentra detallado en el Anexo F.

36

Figura 3 Formato comercial del biomaterial

Fuente: http://www.mis-

implants.com/Products/Regenerative-

Solutions/Bone-Grafting-

Materials/BONDBONE.aspx

3.6.3.2. Alendronato

La sal sódica del ácido alendrónico ha sido el producto empleado en el trabajo,

como solución de alendronato de sodio, fórmula genérica de la casa Comercial La

Santé con su fórmula química C4H13NNaO7P2.

La concentración de compuesto utilizada en la investigación fue de 2mg/ml para

los dos grupos de muestra. (Anexo H).

El Registro Sanitario se encuentra detallado en el Anexo G.

Figura 4 Formato comercial del

fármaco

Fuente: https://www.google.com.ec/search?q=la+

sante+alendronato+ecuador&source=lnms

&tbm=

http://www.mis-implants.com/Products/Regenerative-Solutions/Bone-Grafting-Materials/BONDBONE.aspx




37

3.6.4. Protocolo anestésico pre-quirúrgico

Atropina 0,1mg/kg

3.6.5. Protocolo anestésico quirúrgico

Sedación intramuscular con:

Xilazina 10% 1mg/kg

Ketamina 20-40mg/ml

Local: Lidocaina al 2%

3.6.6. Protocolo de bioseguridad

Se tuvieron en cuenta todas las normas de bioseguridad de acuerdo al Ministerio

de Salud del Ecuador, ver Anexo A.

3.6.7. Técnica quirúrgica

Luego de haber estabulado a los animales durante 1 mes aproximadamente. Se

inició con la experimentación para ello los animales estuvieron previamente en

ayunas durante un período de 6 horas posteriormente se realizó la inducción

anestésica, se procedió a afeitar la zona quirúrgica y a realizar la antisepsia con

yodopovidona.

38

Figura 5 Anestesia del modelo

experimental Fuente: Catherine Tamayo

Figura 6 Proceso de afeitado del conejo


Figura 7 Antisepsia con yodopovidona


Se efectuó un abordaje de 2,5cm de forma lateral longitudinal al eje de cada fémur

con una hoja de bisturí 15c y mango N°3, se separaron los tejidos con la pinza

Kelly y las tijeras metzenbaum, una vez que llegamos al periostio lo separamos

con una molt 9, luego se realizó una ventana en la diáfisis del hueso con una

39

trefina de 5.0 de diámetro y cuya profundidad fue de 1,5mm con un motor NSK

Surgic AP a 800 rpm con abundante irrigación de cloruro de sodio al 0.9%. En los

20 conejos se crearon 3 grupos con 10 muestras cada uno:

10 Conejos:

G1 Control Negativo, defecto óseo que regeneró fisiológicamente en:

10 fémures derechos.

G2 Defecto óseo que regeneró con sulfato de calcio en:

10 fémures izquierdos.

10 conejos restantes:

G3 Defecto óseo que regeneró con sulfato de calcio combinado con alendronato

en:

10 fémures izquierdos.

Adicionalmente, se crearon 10 defectos óseos en los fémures derechos de esos 10

animales con el fin de tener una padronización en el número de heridas

quirúrgicas, stress y reacción fisiológica del animal, para que nuestros resultados

no sean afectados.

De esos 20 fémures de control negativo fueron seleccionados aleatoriamente 10

fémures mediante software para aleatorización.

La cantidad de sulfato de calcio fue estandarizada de 0,25cc y la cantidad del

alendronato fue de 2mg/ml por defecto.

Se procedió a cerrar la herida con hilos de sutura en dos planos.

40

Figura 8 Incisión del tejido


Figura 9 Separación de los tejidos


Figura 10 Defecto creado con la trefina


41

Figura 11 Trefina con hueso autólogo


Figura 12 Revoluciones usadas con el Motor Surgic AP


Figura 13 Defecto creado para que regenere

fisiológicamente


42

Figura 14 Defecto creado para que regenere con

sulfato de calcio


Figura 15 Defecto creado para que regenere

con sulfato de calcio y alendronato


Figura 16 Sutura de los tejidos


43

3.6.8. Medicación postoperatoria

Antibiótico Inyectable shotapen (penicilina más Streptomicina) 1ml cada 10-20Kg

(IM) y ketoprofeno 0.1ml/Kg por animal (por 5días luego de la intervención).

3.6.9. Procesamiento de las muestras

Luego de haber transcurrido las 6 semanas se sacrificaron a los animales previa

sedación con pentobarbitalsodico 100 mg / kg intracardíaca, posteriormente se

realizó la desarticulación del fémur se separaron los tejidos blandos y se realizó el

corte del bloque regenerado con los distintos materiales.

Luego fue fijado en formol bufferado al 10% por 24 horas en envases estériles y

fueron enviados al Área de Patología del Hospital de la Policía, una vez allí se los

descalcificó con OSTEOMOLL (MERCK).

Las muestras fueron procesadas en el equipo Leica ASP300, el que está

compuesto por doce recipientes, distribuidos de la siguiente forma: 2 con etanol

de 80 %, 2 con etanol de 96%, 3 con etanol de 100% o absoluto, 3 con xilol y dos

con parafina líquida que penetra los tejidos. Además, las muestras fueron

introducidas en un cestillo metálico que se desplaza automáticamente.

Para comenzar la inclusión se programó el procesador de la siguiente forma: a los

dos primeros recipientes se les da un tiempo de dos horas, a los ocho siguientes un

tiempo de una hora y media, y a los dos últimos con parafina, se les da un tiempo

de dos horas. Luego se realizaron cortes longitudinales de 5µm con un

micrótomo; 3 por cada muestra.

Las fijaciones se realizaron con hematoxilina y eosina introduciendo los

especímenes secuencialmente en tres vasos que contienen xiloles durante 5

minutos con el fin de eliminar la parafina que todavía queda en el tejido. Fueron

sumergidas y pasadas por tres vasos que contienen alcoholes absolutos y por un

44

tiempo de 5 minutos en cada recipiente. Fueron teñidos con Hematoxilina por 1

minuto, se lavaron con agua, se introdujeron en agua amoniacal (para eliminar

residuos de parafina y otros contaminantes como suciedad) y se sacaron

inmediatamente para lavar con agua corriente. Se tiñeron en Eosina por 20

segundos, se lavaron con agua y por último se realizó el montaje de la lámina con

resina sintética.

Se procedió a analizar las muestras en el microscopio óptico OLYMPUS BX53

(Tokio, Japón) con cámara OLYMPUS DP73 cuyo programa fue CellSens

Estándar Olympus (certificado del Anátomo-patólogo Anexo E)

Figura 17 Fémur del conejo


Figura 18 Corte del bloque de hueso


45

Figura 19 Médula y hueso seccionados


Figura 20 Hueso sumergido en formol en envase

estéril


Figura 21 Microscopio y

cámara Olympus


46

Figura 22 Placas histológicas


3.6.9.1. Manejo de desechos

Los elementos biológicos fueron desechados de acuerdo a las normas del

Ministerio de Salud del Ecuador que se detallan en el Anexo B.

3.6.10. Análisis estadístico

Los datos fueron transportados en el programa de Microsoft Excel y procesados

con el programa SPSS para realizar el análisis estadístico de la base de datos; se

emplearon los programas SPSS versión 22 y MINITAB, versión 16 con un nivel

de significancia de 5%. Se emplearon la prueba de Análisis de la varianza y Chi-

cuadrado.

3.7. Delimitación de la investigación

3.7.1. Delimitación espacial y temporal

El estudio se llevó a cabo en la clínica: Biomédica Veterinaria Las Lomas que

cumple con los estándares del ministerio de salud pública y quienes estuvieron al

cuidado de los animales durante el pre, trans y post quirúrgico del trabajo

experimental que duró 6 semanas.

47

3.7.2. Delimitación de las unidades de observación

Se escogieron 20 conejos con 10 muestras por grupo teniendo un total de 40

muestras como fue descrito anteriormente (ver Numeración 3.6.7). Al contar cada

una de estas con el mismo número se evitó problemas en el análisis de resultados.

El estudio histomorfométrico fue realizado por un Anátomo-opatólogo mediante

microscopia óptica contabilizando el número de células y luego se realizó el

estudio estadístico respectivo. La finalidad fue determinar la eficacia de la

regeneración ósea utilizando sulfato de calcio y sulfato de calcio combinado con

Alendronato.

3.7.3. Limitaciones de la investigación

Dentro de las limitaciones del estudio tenemos la profundidad del defecto. Como

se describe en el ítem 3.2 se incrementó un 30% adicional por posibles pérdidas

de animales de experimentación.

3.8. Aspectos bioéticos

Los aspectos bioéticos estuvieron bajo los preceptos del Código ético del Centro

de Ciencias de la Salud de la Universidad del estado de Colorado, USA y de la

Academia Suiza de Ciencias Médicas detallados en el Anexo C.

3.8.1. Beneficio y consideraciones bioéticas

Conforme a los aspectos bioéticos nombrados en la numeración 3.8 el presente

estudio representa un beneficio para mejorar las condiciones de vida y salud

humana, es por esto que se justifica el uso de animales en la experimentación.

La cirugía se realizó bajo las más estrictas normas de asepsia en el quirófano de la

Veterinaria Biomédica Las Loma, y controlando el dolor antes, durante y después

48

del procedimiento experimental, así como también el cuidado general y

alojamiento de los animales de experimentación cumplió los siguientes requisitos:

Se proporcionó condiciones adecuadas de alojamiento, medio ambiente,

alimentación y bebida.

Los animales no permanecieron estabulados varios a la vez. Se les facilitó

libertad de movimiento.

Se limitó al máximo cualquier restricción que les impida satisfacer sus

necesidades fisiológicas y etológicas.

Un profesional competente supervisó el bienestar y el estado de salud de los

animales.

Los medios en las instalaciones garantizaron que cualquier sufrimiento o

defecto del animal fuese subsanado rápidamente.

Su sacrificio no fue doloroso.

3.8.2. Confidencialidad

La investigación no se realizó en humanos por lo que la confidencialidad no

aplica.

3.8.3. Protección de la población vulnerable

La investigación no se realizó en humanos por lo que la protección de la

población vulnerable no aplica.

3.8.4. Riesgos potenciales

Los riegos potenciales de esta investigación fueron los elementos biológicos los

cuales fueron desechados de acuerdo a las normas del Ministerio de Salud del

Ecuador que se detallan en el Anexo B.

49

3.8.5. Beneficios potenciales

La investigación procuró resaltar los beneficios en la regeneración ósea utilizando

sulfato de calcio combinado con alendronato frente al sulfato de calcio, dentro de

los principales beneficios tenemos: obtener una eficacia en la regeneración ósea,

en menor tiempo y un injerto sintético de menor costo.

3.8.6. Idoneidad ética

El presente estudio tuvo como objetivo dar fe y veracidad de los conocimientos

técnicos, científicos y éticos sobre la regeneración en Implantología Oral por parte

del Doctor Franklin Eduardo Quel Carlosama Docente de la Universidad Central

de Quito del Ecuador, Facultad de Odontología Cirujano Oral, orientador de tesis,

con una amplia experiencia en Odontología dichos conocimientos son

considerados como idóneos para la representación de la coautoría del tema:

Estudio histomorfométrico de la regeneración ósea utilizando sulfato de calcio y

sulfato de calcio combinado con alendronato: Estudio experimental en conejos,

por parte de la Srta. Estudiante egresada de la especialidad de Implantología Oral

CATHERINE DE LAS MERCEDES TAMAYO ALCÍVAR, la investigadora

estuvo calificada sobre los pasos a seguir, debido a la experiencia del tutor. De

igual manera los estudios histomorfométricos fueron llevados a cabo por parte del

Dr. Francisco Estrella Anátomo-Patólogo del Hospital de la Policía con amplia

experiencia en este tipo de estudios.

3.8.7. Declaración de conflicto de interés

La Declaración de conflictos de interés se detalla en el Anexo D.

50

CAPÍTULO IV

4. ANALISIS DE RESULTADOS

4.1. Resultados

La interpretación de los resultados entregados por el Patólogo fue descrita en base

a los criterios observados: regeneración ósea (porcentaje estimado de acuerdo a

formación de osteoblastos) osteocitos y neovascularización

(abundantes/moderados/escasos), fibrosis, hueso inmaduro y calcificación

(presente/ ausente).

Los resultados se organizaron por grupo: G1 (control negativo), G2 (regeneración

ósea con sulfato de calcio) y G3 (sulfato de calcio con alendronato) y por el

número de muestras.

Para el análisis cuantitativo se tomó en cuenta la formación de osteoblastos y

osteoclastos por conducto de Havers en intervalo del 0 al 20.

4.1.1. Grupo G1: Control Negativo (Regeneración Fisiológica)

Individuo 1:

Fémur izquierdo: no se observó presencia osteoblastos, osteoclastos, ni

osteocitos, la neovascularización fue escasa, se observó ausencia de fibrosis y

calcificación, se observó presencia de hueso inmaduro.

Fémur derecho: no se observó presencia de osteoblastos, se observó 2

osteoclastos, los osteocitos y la neovascularización fueron escasas, se observó

ausencia de fibrosis, se observó presencia de hueso inmaduro y calcificación.

51

Individuo 2:

Fémur Izquierdo: se observó 6 osteoblastos por conducto de Havers y 1

osteoclasto, hubo abundantes osteocitos, la neovascularización fue escasa, se

observó presencia de fibrosis y hueso inmaduro y ausencia de calcificación.

Fémur derecho: se observó 5 osteoblastos por conducto y 7 osteoclastos, hubo

abundantes osteocitos, la neovascularización fue moderada, se observó presencia

de fibrosis y de hueso inmaduro y hubo ausencia de calcificación.

Individuo 3:

Fémur izquierdo: Se observó 15 osteoblastos por conducto, no hubo

osteoclastos, hubo abundantes osteocitos, la neovascularización fue moderada,

hubo ausencia de fibrosis, hubo hueso inmaduro y calcificación.

Fémur derecho: no se observó osteoblastos, no se observó osteoclastos, los

osteocitos fueron abundantes, la neovascularización fue moderada, no hubo

fibrosis ni calcificación hubo hueso inmaduro.

Individuo 4:

Fémur izquierdo: se observó 2 osteoblastos por conducto, no hubo osteoclastos,

los osteocitos fueron abundantes, la neovascularización fue moderada, no hubo

fibrosis ni calcificación, no se observó hueso inmaduro.

Fémur derecho: se observó 20 osteoblastos por conducto y 1 osteoclasto, los

osteocitos fueron abundantes, la neovascularización fue escasa, no hubo fibrosis

ni calcificación, hubo hueso inmaduro.

52

Individuo 5:


los osteocitos fueron abundantes, la neovascularización fue escasa, hubo ausencia

de fibrosis y calcificación, se observó hueso inmaduro.

Fémur derecho: no se observó osteoblastos ni osteoclastos, los osteocitos fueron

abundantes, la neovascularizaión fue modereada, hubo presencia de hueso

inmaduro y calcificación, no hubo fibrosis.

4.1.2. Grupo G2: Regeneración ósea con Sulfato de Calcio

Individuo 1

Fémur Izquierdo: no se observó osteoblastos por conducto, ni osteoclastos, los

osteocitos fueron escasos, la neovascularización fue moderada, hubo hueso

inmaduro no hubo calcificación ni fibrosis.

Fémur derecho: se observó 20 osteoblastos por conducto y 11 osteoclastos, hubo

abundantes osteocitos, la neovascularización fue abundante, hubo presencia de

fibrosis y hueso inmaduro, no se observó calcificación.

Individuo 2

Fémur izquierdo: no se observó osteoblastos ni osteoclastos, los osteocitos

fueron escasos, la neovascularización fue escasa, no hubo fibrosis ni calcificación,

se observó hueso inmaduro.

Fémur derecho: no se observó osteoblastos, osteoclastos, ni osteocitos, la

neovascularización fue moderada, no se observó fibrosis, se observó hueso

inmaduro y calcificación.

53

Individuo 3

Fémur izquierdo: se observó 4 osteoblastos por conducto, dos osteoclastos, los

osteocitos fueron abundantes, la neovascularizacion fue moderada, hubo presencia

de fibrosis, hueso inmaduro y calcificación.

Fémur derecho: se observó 1 osteoblasto por conducto, no hay osteoclastos, los

osteocitos fueron abundantes, la neovascularización fue moderada, hubo presencia

de fibrosis, hueso inmaduro y calcificación.

Individuo 4



fibrosis ni calcificación, hubo hueso inmaduro.

Fémur derecho: se observó 10 osteoblastos por conducto, no hubo osteoclastos,


fibrosis, se observó hueso inmaduro y calcificación.

Individuo 5

Fémur izquierdo: se observó 4 por osteoblastos por conducto, no hubo

osteoclastos, los osteocitos fueron abundantes, la neovascularización fue

moderada, no hubo fibrosis, se observó hueso inmaduro y calcificación.

Fémur derecho: se observó 10 osteoblastos por conducto y 2 osteoclastos, los

osteocitos fueron abundantes, la neovascularización fue moderada, hubo fibrosis,

hueso inmaduro y calcificación.

54

4.1.3. Grupo G3: Sulfato de Calcio con Alendronato

Individuo 1

Fémur izquierdo: se observó 20 osteoblastos por conducto y 6 osteoclastos, los

osteocitos y la neovascularización fueron abundantes, hubo fibrosis y hueso

inmaduro no hubo calcificación.


osteocitos y la neovascularización fueron abundantes, hubo fibrosis, no hubo

hueso inmaduro ni calcificación.

Individuo 2

Fémur izquierdo: se observó 20 osteoblastos por conducto y 1 osteoclasto, los

osteocitos y la neovascularización fueron abundantes, hubo ausencia de fibrosis y

calcificación, hubo hueso inmaduro.



inmaduro, no hubo calcificación.

Individuo 3



inmaduro, no hubo calcificación.


los osteocitos fueron moderados, la neovascularización fue abundante, no hubo

fibrosis ni calcificación, hubo hueso inmaduro.

55

Individuo 4


osteocitos fueron escasos, la neovascularización fue moderada, no hubo fibrosis,

hubo hueso inmaduro y calcificación.

Fémur derecho: no se observó osteoblastos, hubo 9 osteoclastos, los osteocitos

fueron escasos, la neovascularización fue moderada, no hubo fibrosis, se observó


Individuo 5


osteocitos fueron abundantes, la neovascularización fue moderada, hubo fibrosis y

hueso inmaduro, no hubo calcificación.


osteocitos fueron escasos, la neovascularización fue abundante, hubo fibrosis y


Individuo 6


los osteocitos fueron escasos, la neovascularización fue moderada, hubo fibrosis,


Fémur derecho: se observó 15 osteoblastos por conducto, hubo 5 osteoclastos,

los osteocitos fueron escasos, la neovascularización fue abundante, hubo fibrosis


56

Individuo 7


los osteocitos fueron abundantes, la neovascularización fue moderada, hubo

fibrosis, hueso inmaduro y calcificación.



fibrosis y hueso inmaduro no hubo calcificación.

Individuo 8

Fémur izquierdo: no se observó osteoblastos ni osteoclastos, los osteocitos

fueron abundantes, la neovascularización fue moderada, no hubo fibrosis ni

calcificación, hubo hueso inmaduro.


osteocitos fueron abundantes, la neovascularización fue moderada, hubo fibrosis

y hueso inmaduro, no hubo calcificación.

Individuo 9:

Fémur izquierdo: se observó 8 osteoblastos por conducto y 3 osteoclastos, hubo

abundantes osteocitos, la neovascularización fue moderada, hubo fibrosis y hueso

inmaduro no hubo calcificación.

Fémur derecho: se observó 10 osteoblastos por conducto y no hubo osteoclastos,


fibrosis y hueso inmaduro no hubo calcificación.

57

Individuo 10:



hueso inmaduro no hubo calcificación.




Tabla 4 Regeneración Ósea Fisiológica

Muestra Grupo Regeneración

1 G1 0%

2 G1 0%

3 G1 30%

4 G1 25%

5 G1 75%

6 G1 0%

7 G1 10%

8 G1 100%

9 G1 20%

10 G1 0%

Total 26% Fuente: Investigación. Autor: Catherine Tamayo

Podemos concluir que en el grupo G1 la regeneración ósea promedio alcanzada

fue del 26%.

58

Tabla 5 Regeneración ósea con sulfato de calcio


1 G2 0%

2 G2 100%

3 G2 0%

4 G2 0%

5 G2 20%

6 G2 5%

7 G2 75%

8 G2 50%

9 G2 20%

10 G2 50%


En el grupo G2 la regeneración ósea promedio alcanzada fue del 32%.

Tabla 6 Regeneración ósea con sulfato de calcio y alendronato


1 G3 100%

2 G3 100%

3 G3 75%

4 G3 40%

5 G3 75%

6 G3 25%

7 G3 75%

8 G3 0%

9 G3 40%

10 G3 70%


En el grupo G3 la regeneración ósea promedio alcanzada fue del 60%.

59

Tabla 7 Tablas Comparativa de Regeneración ósea del grupo control y regeneración ósea

del grupo sulfato de calcio combinado con alendronato


1 G1 0%

2 G1 0%

3 G1 30%

4 G1 25%

5 G1 75%

6 G1 0%

7 G1 10%

8 G1 100%

9 G1 20%

10 G1 0%



1 G4 100%

2 G4 50%

3 G4 25%

4 G4 0%

5 G4 75%

6 G4 75%

7 G4 20%

8 G4 25%

9 G4 50%

10 G4 60%


Haciendo una comparación entre el grupo G1 y el grupo de control negativo

realizado en el fémur derecho del grupo experimental G3 al que denominaremos

G4, podemos apreciar una mejor regeneración ósea pudiendo sospechar que hubo

una migración del fármaco a dicha lesión.

60

Tabla 8 Resumen estadístico

Localización Tratamiento Área de fractura/

espesor

Osteoblastos por campo20x/promedio

conductos Havers Osteoclastos Osteocitos Neovascularización Fibrosis

Hueso

inmaduro Calcificación

Fémur

izquierdo Alendronato 1,5 cm 90 / promedio 15 por conducto 4 Abundantes Abundante Presente Presente Ausente

Fémur derecho Alendronato 0,1 cm 25/promedio 5 por conducto 0 Moderado Abundante Ausente Presente Ausente

Fémur derecho Alendronato 0,15 cm 0 9 Escasos Moderada Ausente Presente Presente

Fémur

izquierdo Alendronato 1,08 cm 170/ promedio 20 por conducto 1 Abundantes Abundante Ausente Presente Ausente

Fémur

izquierdo Alendronato 0,3 cm 105/promedio 15 por conducto 4 Abundantes Moderada Presente Presente Ausente

Fémur

izquierdo Alendronato 0,24cm 60/promedio 10 por conducto 7 Abundantes Abundante Presente Presente Ausente

Fémur

izquierdo Alendronato 0,31 cm 120/ promedio 20 por conducto 6 Abundantes Abundante Presente Presente Ausente

Fémur derecho Alendronato 0,8 cm 150/25 promedio 25 por conducto 3 Abundantes Abundante Presente Ausente Ausente

Fémur

izquierdo Alendronato 0,29 cm 48/promedio 8 por conducto 2 Escasos Moderada Ausente Presente Presente

Fémur derecho Alendronato 0,7 cm 90/promedio 15 por conducto 15 Escasos Abundante Presente Presente Ausente

Pierna izquierda

Alendronato 0,17 cm 30/promedio 5 por conducto 0 Escasos Moderada Presente Presente Presente

Fémur derecho Alendronato 0,25 cm 50/promedio 15 por conducto 4 Escasos Abundante Presente Presente Ausente

Fémur derecho Alendronato 0,21 cm 30/promedio 5 por conducto 5 Abundantes Moderada Presente Presente Ausente

Fémur derecho Alendronato 0,13cm 60/promedio 10 por conducto 0 Abundantes Moderada Presente Presente Ausente

Fémur izquierdo

Alendronato 0,16cm 48/promedio 8 por conducto 3 Abundantes Moderada Presente Presente Ausente

Fémur derecho Alendronato 0,2cm 24/promedio 4 por conducto 0 Abundantes Moderada Presente Presente Ausente

Fémur

izquierdo Alendronato 0,13cm 30/promedio 15 por conducto 0 Abundantes Moderada Presente Presente Presente

Fémur izquierdo

Alendronato 0,15cm 0 0 Abundantes Moderada Ausente Presente Ausente

Fémur

izquierdo Alendronato 0,35cm 140/promedio 14 por conducto 20 Abundantes Moderada Presente Presente Ausente

61

Fémur derecho Alendronato 0,34 cm 120/promedio 12 por conducto 4 Abundantes Moderada Presente Presente Ausente

Fémur derecho Reg. Ósea 0,5cm 30/promedio 5 por conducto 7 Abundantes Moderada Presente Presente Ausente

Fémur derecho Reg. Ósea 0.16cm 60/promedio 20 por conducto 1 Abundantes Escasa Ausente Presente Ausente

Fémur

izquierdo Reg. Ósea 0,26cm 10/promedio 2 por conducto 0 Abundantes Moderada Ausente Presente Ausente

Fémur

izquierdo Reg. Ósea 0,1cm 18/promedio 6 por conducto 1 Abundantes Escasa Presente Presente Ausente

Fémur derecho Reg. Ósea 0,16cm 0 0 Abundantes Moderada Ausente Presente Ausente

Fémur

izquierdo Reg. Ósea 0,19cm 50/promedio 15 por conducto 0 Abundantes Moderada Ausente Presente Presente

Fémur

izquierdo

Regeneración

ósea 0,1 cm 0 0 0 Escasa Ausente Presente Ausente

Fémur derecho Regeneración

ósea 0,15 cm 0 2 Escasos Escasa Ausente Presente Presente

Fémur derecho Regeneración

ósea 0,17 cm 0 0 Abundantes Moderada Ausente Presente Presente

Fémur

izquierdo

Regeneración

ósea 0,94cm 45/promedio 4 por conducto 0 Abundantes Escasa Ausente Presente Ausente

Fémur derecho Sulfato de calcio 0,09 cm 0 0 0 Moderada Ausente Presente Presente

Fémur

izquierdo Sulfato de calcio 0,82 cm 0 0 Escasos Moderada Ausente Presente Ausente

Fémur

izquierdo Sulfato de calcio 0,09cm 0 0 Escasos Moderada Ausente Presente Ausente

Fémur derecho Sulfato de calcio 0,9 cm 120/promedio 20 por conducto 11 Abundantes Abundante Presente Presente Ausente

Fémur derecho Sulfato de calcio 0,11 cm 2/promedio 1 ´por conducto 0 Abundantes Moderada Presente Presente Presente

Fémur

izquierdo Sulfato de calcio 0,15cm 25/promedio 4 por conducto 2 Abundantes Moderada Presente Presente Presente

Fémur izquierdo

Sulfato de calcio 0,26cm 40/promedio 15 por conducto 0 Abundantes Moderada Ausente Presente Ausente

Fémur

izquierdo Sulfato de calcio 0,14cm 24/promedio 4 por conducto 0 Abundantes Moderada Ausente Presente Presente

Fémur derecho Sulfato de calcio 0,19cm 50/promedio 10 por conducto 0 Abundantes Moderada Ausente Presente Presente

Fémur derecho Sulfato de calcio 0,10cm 40/promedio 10 por conducto 2 Abundantes Moderada Presente Presente Presente

Fuente: Investigación. Autor: Catherine Tamayo

62

4.2. Análisis histomorfométrico

4.2.1. Análisis histomorfométrico de la regeneración ósea fisiológica

Fémur izquierdo

No encontramos osteoblastos por conducto de Havers, osteoclastos, ni osteocitos,

la neovascularización fue escasa, se observó hueso inmaduro, no hubo fibrosis ni

calcificación.

Figura 23 Corte histológico - Defecto óseo creado en

conejo regenerado fisiológicamente a las 6 semanas.

Técnica de tinción hematoxilina-eosina. Magnificación

4x.

Fuente: Dr. Francisco Estrella

Figura 24 Corte histológico - Defecto óseo creado

en conejo regenerado fisiológicamente a las 6

semanas. Técnica hematoxilina-eosina.

Magnificación 40x


63

Fémur derecho

No encontramos osteoblastos por conducto de Havers, hubo presencia de 2

osteoclastos, los osteocitos y la neovascularización fueron escasas, hubo hueso

inmaduro y calcificación, no hubo fibrosis.

Figura 25 Corte histológico - Defecto óseo creado en conejo

regenerado fisiológicamente a las 6 semanas. Técnica

hematoxilina-eosina. Magnificación 10x



regenerado fisiológicamente a las 6 semanas. Técnica



64

4.2.2. Análisis histomorfométrico de la regeneración ósea con sulfato

de calcio

Fémur izquierdo

Encontramos 24 osteoblastos por conducto de Havers, no hubo presencia de

osteoclastos, hubo abundantes osteocitos, la neovascularización fue moderada, se

observó presencia de hueso inmaduro y calcificación, no hubo fibrosis.


conejo regenerado con sulfato de calcio a las 6 semanas.

Técnica hematoxilina-eosina. Magnificación 4x



en conejo regenerado con sulfato de calcio a las 6

semanas. Técnica hematoxilina-eosina.

Magnificación 40x


65

Fémur derecho

Encontramos 1 osteoblastos por conducto de Havers, no hubo presencia de

osteoclastos, hubo abundantes osteocitos, la neovascularización fue moderada,

hubo presencia de hueso inmaduro, calcificación y fibrosis.


regenerado con sulfato de calcio a las 6 semanas. Técnica




regenerado con sulfato de calcio a las 6 semanas. Técnica



66

4.2.3. Análisis histomorfométrico de la regeneración ósea con sulfato

de calcio y alendronato

Fémur izquierdo

Encontramos 20 osteoblastos por conducto de Havers, hubo 1 osteoclasto, hubo

abundantes osteocitos y neovascularización, se observó hueso inmaduro no hubo

calcificación ni fibrosis.

Figura 31 Corte histológico - Defecto óseo

creado en conejo regenerado con sulfato de

calcio y alendronato a las 6 semanas. Técnica




en conejo regenerado con sulfato de calcio y

alendronato a las 6 semanas. Técnica



67

Fémur derecho

Encontramos 25 osteoblastos por conducto de Havers, se observó 3 osteoclastos,

hubo abundantes osteocitos y neovascularización, se observó presencia fibrosis

no hubo calcificación ni hueso inmaduro.









68

4.3. Análisis de las Variables Cuantitativas

(Anexo I)

4.3.1. Análisis de la variable osteoblastos

Primero, hagamos un resumen estadístico de los valores obtenidos, de acuerdo al

tratamiento empleado.

Tabla 9 Valores de osteoblastos obtenidos en los 3 tipos de tratamiento

Osteoblastos (%) N Mínimo Máximo Media Desviación

estándar

Fisiológica 10 0 20 5.20 6.957

Con Sulfato de Calcio 10 0 20 6.40 7.058

Con Sulfato de Calcio Y

Alendronato

10 0 20 12.00 6.532

Total 30 0 20 7.87 7.267 Fuente: Ing. Edwin Galindo

Ahora vamos a comparar las medias de los 3 conjuntos de datos, para determinar

si existen diferencias entre ellas. Lo haremos mediante una prueba ANOVA.

1. Hipótesis nula: Los tres tipos de tratamiento genera el mismo porcentaje de

osteoblastos.

2. Hipótesis alternativa: Al menos uno de los tratamientos genera un porcentaje

de osteoblastos diferente al resto.

3. Estadístico de prueba. Mediante el programa SPSS, se encontró:

Tabla 10 Análisis de la varianza para osteoblastos

ANOVA

Suma de cuadrados gl Media cuadrática F Sig.

Entre grupos 263.467 2 131.733 2.805 0.078

Dentro de grupos 1268.000 27 46.963

Total 1531.467 29


69

4. Decisión: Puesto que Sig. = 0. 078 > 0.05, aceptamos la hipótesis nula.

5. Interpretación: Los 3 tratamientos dieron niveles similares de osteoblastos.

A pesar de que no hemos encontrado diferencias estadísticas significativas,

veamos el gráfico del análisis de medias.

Gráfico 1 Análisis de la media de osteoblastos


Vemos que los 3 valores de las medias están dentro de la banda limitada por las

líneas rojas, lo que nos dice que, estadísticamente, los 3 tratamientos proporcionan

los mismos resultados.

Sin embargo, apreciamos que la media de las mediciones realizadas con sulfato de

calcio y alendronato da como resultado una media mayor.

70

4.3.2. Análisis de la variable osteoclastos

Tabla 11 Valores de osteoclastos obtenidos en los 3 tipos de tratamiento

Osteoclastos (%) N Mínimo Máximo Media Desviación estándar

Fisiológica 10 0 7 1.10 2.183

Con Sulfato de Calcio 10 0 11 1.50 3.440

Con Sulfato de Calcio Y Alendronato 10 0 20 4.00 5.981

Total 30 0 20 2.20 4.238


La prueba ANOVA es la siguiente:

1. Hipótesis nula: Los tres tipos de tratamiento genera el mismo porcentaje de

osteoclastos.

2. Hipótesis alternativa: Al menos uno de los tratamientos genera un porcentaje

de osteoclastos diferente al resto.

3. Estadístico de prueba. Mediante el programa SPSS, se encontró:

Tabla 12 Análisis de la varianza para osteoclastos

ANOVA

Suma de cuadrados gl Media cuadrática F Sig.

Entre grupos 49.400 2 24.700 1.415 0.260

Dentro de grupos 471.400 27 17. 459

Total 520.800 29


4. Decisión: Puesto que Sig. = 0. 260 > 0.05, aceptamos la hipótesis nula.

5. Interpretación: Los 3 tratamientos dieron niveles similares de osteoclastos.

71

Gráfico 2 Análisis de la media de osteoclastos


4.4. Análisis de las Variables Cualitativas

(Anexo I)

4.4.1. Análisis de la variable osteocitos

Tabla 13 Valores de osteocitos obtenidos en los 3 tipos de tratamiento

Osteocitos

Tipo de regeneración ósea Abundantes Escasos Total

Fisiológica 8 2 10

Con Sulfato de Calcio 7 3 10

Con Sulfato de Calcio Y Alendronato 8 2 10

Total 23 7 30


72

Gráfico 3 Nivel de osteocitos según el tipo de tratamiento


Queremos probar si la presencia de osteocitos está relacionada con el tipo de

tratamiento.

1. Hipótesis nula: El nivel de presencia de osteocitos no está relacionado con el

tipo del tratamiento.

2. Hipótesis alternativa: El nivel de presencia de osteocitos si está relacionado

con el tipo del tratamiento.

3. Estadístico de prueba. Mediante el programa SPSS, se elaboró la prueba ji-

cuadrado:

Tabla 14 Prueba Ji Cuadrado para los osteocitos

Valor gl Sig. asintótica

Ji-cuadrado de Pearson 0.373 2 0.830


4. Decisión: Puesto que Sig. = 0.830 > 0.05, aceptamos la hipótesis nula.

73

5. Interpretación: No se pudo afirmar que el nivel de presencia de osteocitos esté

relacionado con el tipo de tratamiento.

4.4.2. Análisis de la variable neovascularización

Tabla 15 Variable neovascularización

Neovascularización

Tipo de regeneración ósea Abundantes Moderados Escasos Total

Fisiológica 0 5 5 10

Con Sulfato de Calcio 1 9 0 10

Con Sulfato de Calcio Y

Alendronato

2 8 0 10

Total 3 22 5 30 Fuente: Ing. Edwin Galindo

Gráfico 4 Nivel de neovascularización según el tipo de tratamiento


Queremos probar si el nivel de neovascularización está relacionado con el tipo de

tratamiento.

74

1. Hipótesis nula: El nivel de neovascularización no está relacionado con el tipo

del tratamiento.

2. Hipótesis alternativa: El nivel de neovascularización si está relacionado con el



cuadrado:

Tabla 16 Prueba Ji Cuadrado para la neovascularización




4. Decisión: Puesto que Sig. = 0.010 < 0.05, aceptamos la hipótesis alternativa.

5. Interpretación: Se puede afirmar que el nivel de neovascularización sí estuvo

relacionado con el tipo de tratamiento empleado.

4.4.3. Análisis de la variable fibrosis

Tabla 17 Análisis de la variable fibrosis

Fibrosis

Tipo de regeneración ósea Ausente Presente Total

Fisiológica 8 2 10



Total 17 13 30


75

Gráfico 5 Presencia de fibrosis según el tipo de tratamiento


Se desea comprobar si el nivel de fibrosis está relacionado con el tipo de

tratamiento.

1. Hipótesis nula: El nivel de fibrosis no está relacionado con el tipo del

tratamiento.

2. Hipótesis alternativa: El nivel de fibrosis si está relacionado con el tipo del

tratamiento.


cuadrado:

Tabla 18 Prueba Ji Cuadrado para la fibrosis





76

5. Interpretación: Se puede afirmar que el nivel de fibrosis no estuvo

relacionado con el tipo de tratamiento empleado.

4.4.4. Análisis de la variable hueso inmaduro

Tabla 19 Análisis de la variable hueso inmaduro

Hueso inmaduro


Fisiológica 1 9 10



Total 1 29 30


Gráfico 6 Presencia de hueso inmaduro según el tipo de tratamiento


El propósito es comprobar si la formación de hueso inmaduro está relacionada con

el tipo de tratamiento.

77

1. Hipótesis nula: La formación de hueso no está relacionada con el tipo del

tratamiento.

2. Hipótesis alternativa: La formación de hueso si está relacionada con el tipo del

tratamiento.

Tabla 20 Prueba Ji Cuadrado para hueso inmaduro

Estadístico de prueba. Prueba ji-cuadrado: Valor gl Sig. Asintótica




4. Interpretación: Se puede afirmar que la formación del hueso inmaduro no

estuvo relacionada con el tipo de tratamiento empleado.

4.4.5. Análisis de la variable calcificación

Tabla 21 Análisis de la variable calcificación

Calcificación


Fisiológica 6 4 10



Total 18 12 30


78

Gráfico 7 Presencia de calcificación según el tipo de tratamiento


El propósito es averiguar si la presencia de calcificación está relacionada con el

tipo de tratamiento.

1. Hipótesis nula: La presencia de calcificación no está relacionada con el tipo

del tratamiento.

2. Hipótesis alternativa: La presencia de calcificación si está relacionada con el


3. Estadístico de prueba. Prueba ji-cuadrado:

Tabla 22 Prueba Ji Cuadrado para calcificación

Valor gl Sig. Asintótica




5. Interpretación: No se puede afirmar que la presencia de calcificación estuvo

relacionada con el tipo de tratamiento empleado.

79

4.5. Discusión

El propósito de este estudio fue determinar la eficacia de la regeneración ósea

utilizando sulfato de calcio y sulfato de calcio combinado con Alendronato,

demostrando así que la regeneración ósea fue mejor en el grupo G3 que en el

grupo G1 y el G2 sin llegar a ser estadísticamente significativos a las seis

semanas, concordando con Cuirán Et al (63)

., quien realizó un estudio sobre el

efecto local de la aplicación de bifosfonatos sobre implantes miniscrew colocados

en perros, observando formación de hueso cortical estadísticamente significativo

alrededor de los implantes del grupo control después de 8 semanas que alrededor

del resto en los que se colocó bifosfonato, contrariamente a la situación observada

en hueso trabecular. Los autores concluyeron que los bifosfonatos tuvieron

efectos positivos sobre el hueso trabecular que sobre el hueso cortical; esto puede

explicar los resultados estadísticos obtenidos en este estudio, de la misma forma

en el estudio de M. B. Guimarães (1)

de la influencia de la aplicación local de

alendronato sódico en gel en la colocación de implantes de titanio se concluyó que

en el grupo experimental hubo una menor oseointegración y un notable cambio en

la calidad ósea a los 28 días comparado con el grupo control, dicho estudio

también fue realizado en hueso cortical de conejos.

Cabe recalcar que para este estudio se utilizó 2mg/ml de alendronato, este tema es

muy controversial puesto que de ello depende el éxito de la regeneración ósea;

Manzano-Moreno et al (64)

, en su estudio reportaron que los bifosfonatos no

nitrogenados requieren de concentraciones más altas para alcanzar efectividad en

la inhibición osteoclástica, por el contrario los bisfosfonato nitrogenados en

concentraciones menores llegan a cumplir con esta función; sin embargo la

dosificación sigue siendo un tema muy discutido; en un revisión de N.M.C.

Mathijssen (62)

, sobre la combinación de bifosfonatos con aloinjertos para la

colocación de implantes, se habla de forma general de la dosificación de los

bifosfonatos, concluyendo que los 2mg/ml de Alendronato incrementan la

formación ósea evitando de esta manera efectos perjudiciales en la fisiología del

80

osteoblasto, otros autores como, Jackosen et. al y Agholme (62)

y Aspenberg (62)

en

sus estudios concuerdan con lo mismo.

La efectividad de regeneración ósea en el grupo G2 tampoco obtuvo resultados

estadísticamente significativos en nuestro estudio, sin embargo, fue menor que el

grupo G3.

Como ya se había mencionado no hay en la literatura estudios sobre el sulfato de

calcio combinado con alendronato como biomaterial utilizado en la regeneración

ósea, en esta investigación no se encontró restos de alendronato ni de sulfato de

calcio a las 6 semanas.

Cabe mencionar que en este estudio utilizamos un grupo control adicional al cual

denominamos G4 para comparar ambos grupos con la finalidad de observar

mayor efectividad regenerativa y dar pie a la sospecha de posible migración del

fármaco, esto también es considerable en nuestro estudio y abre camino a futuras

investigaciones.

Pese a haber obtenido resultados estadísticamente irrelevantes; recordemos que

sólo hemos utilizado un tipo de bifosfonato y una sola dosis a un solo tiempo por

tanto es necesario futuras investigaciones sobre este tema.

81

CAPÍTULO V

5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

5.1. Conclusiones

De las pruebas estadísticas, podemos deducir que:

No hay diferencias en las medidas de los porcentajes de osteoblastos y

osteoclastos en los 3 tipos de tratamientos.

De todas maneras, se puede apreciar que en el tratamiento con sulfato de

calcio y alendronato, el porcentaje de osteoblastos y osteoclastos es

levemente mayor, sin que la diferencia llegue a ser estadísticamente

significativa.

Respecto al nivel de osteocitos, no se pudo comprobar que existía una

relación con el tipo de tratamiento empleado.

En cambio, al analizar la variable neovascularización se pudo comprobar que

si existe relación entre el tipo de tratamiento y el nivel de vascularización. Se

aprecia que cuando hay presencia de sulfato de calcio, los niveles son

abundante o moderado.

No se pudo apreciar una relación entre la presencia de fibrosis y el tipo de

tratamiento empleado.

Tampoco se determinó relación entre la presencia de hueso inmaduro y el tipo

de tratamiento; es más, en los tres casos se constató la presencia de este

elemento en casi las mismas cantidades.

Respecto a la variable calcificación, los tres tratamientos la generaron en

proporciones similares.

Se aprecia una mejor regeneración ósea entre el grupo G1 y el Control

negativo del grupo G3 lo que conlleva a sospechar de una migración del

fármaco al sitio de la lesión.

82

5.2. Recomendaciones

Se recomienda el cambio del modelo experimental, debido a que el conejo

genera demasiado estrés y por consiguiente es muy delicado lo que aumenta

la tasa de mortalidad en la parte experimental.

Debemos ahondar en el tiempo experimental dentro de la investigación con el

fin de saber cómo reacciona a largo plazo el grupo experimental.

Es necesario cambiar la cantidad de fármaco administrada para conocer dosis

eficientes para la regeneración ósea.

Se deben realizar de 2 a tres tiempos para tener resultados más eficientes.

Se debería utilizar otro tipo de injertos considerando mayormente a los

osteoinductores.

Se debería realizar la experimentación en hueso esponjoso para obtener

resultados comparables con el tipo de hueso utilizado.

83

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89

ANEXOS

Anexo A Protocolo de Bioseguridad de acuerdo al M.S.P. del Ecuador

• Conservar el ambiente de trabajo en óptimas condiciones de higiene.

• No se debe guardar alimentos en las neveras ni en los equipos de refrigeración

de sustancias contaminantes o químicos.

• Las condiciones de temperatura, iluminación y ventilación de los sitios de

trabajo deben ser confortables.

• Maneje todo paciente como potencialmente infectado. Las normas universales

deben aplicarse con todos los pacientes que reciben atención hospitalaria

• Lávese cuidadosamente las manos antes y después de cada examen clínico o de

cualquier otro procedimiento asistencial.

• Utilice en forma sistemática guantes de látex en procedimientos que conlleven

manipulación de elementos biológicos o químicos y cuando maneje instrumental o

equipo contaminado en la atención de pacientes antes de quitárselos se debe

proceder a lavarlos con jabón.

• Utilice un par de guantes por cada procedimiento y/o cada por paciente.

• Absténgase de tocar con las manos enguantadas alguna parte de su cuerpo y de

manipular objetos diferentes a los requeridos durante el procedimiento.

• Emplee respirador y gafas durante procedimientos que puedan generar

salpicaduras o gotitas aerosoles de sangre u otros líquidos corporales.

• Use mandil impermeable en aquellos procedimientos en los que pueda

producirse salpicaduras, aerosoles o derrames importantes de sangre u otros

líquidos orgánicos.

• Los elementos de protección personal serán utilizados únicamente en el área de

trabajo específico

• Prohibido deambular con ropa de trabajo a todo el personal que tenga contacto

directo con pacientes, (mandil, pijamas, overol) fuera del área hospitalaria.

• Mantenga la ropa de trabajo y los elementos de protección personal en óptimas

condiciones de aseo, en un lugar seguro y de fácil acceso.

90

• Evite la atención directa de pacientes si usted presenta lesiones exudativas o

dermatitis serosas, hasta que éstas hayan desaparecido.

• Si presenta alguna herida, por pequeña que sea, cúbrala con esparadrapo.

• Mantenga actualizado su esquema de vacunación del Ministerio de Salud del

Ecuador

• Las normas de asepsia deben ser empleadas en todo procedimiento sanitario.

• Realizar desinfección y limpieza a las superficies, equipos de trabajo al final de

cada procedimiento y al finalizar la jornada de trabajo.

• Todo equipo, que requiera reparación técnica, debe ser llevado a mantenimiento,

previa limpieza y / o desinfección por parte del personal encargado del servicio de

origen.

• En caso de derrame o contaminación accidental de sangre u otros líquidos

corporales sobre superficies de trabajo, cubra con papel u otro material

absorbente; luego vierta hipoclorito de sodio al 10% y sobre la superficie

circundante, dejando actuar durante 30 minutos; después realice limpieza con

agua y jabón. El personal encargado dicho procedimiento debe utilizar guantes,

respirador y mandil.

• En caso de exposición accidental a sangre y/o fluidos corporales lavar el área

con abundante agua y jabón.

• No se permite el uso de teléfonos celulares en áreas críticas (Quirófanos, área de

procesamiento de muestras en los laboratorios) por constituirse en una fuente de

trasmisión de microorganismos patógenos.

91

Anexo B Protocolo de Manejo de Desechos de acuerdo al M.S.P. del Ecuador

• Los objetos corto punzantes serán manejados con estricta precaución y serán

depositados en recipientes especiales que deben estar ubicados en cada servicio,

dando cumplimiento al Reglamento de Desechos Infecciosos del Ministerio de

Salud.

• No se trasvasará objetos cortopunzantes utilizados de un recipiente a otro.

• No se doblará o partirá la hoja de bisturí o agujas.

• No se reutilizará el material contaminado como agujas, jeringas y hojas de

bisturí.

• La ropa y lencería no desechable contaminada con sangre, fluidos corporales

será enviada a la lavandería en bolsa plástica roja.

Todo tejido o víscera, se debe manejar como potencialmente infectado

• Utilice mandil, delantal de caucho grueso, guante de neopreno, gafas, mascarilla

cuando realice procedimientos con vísceras o tejidos.

• Todas las superficies y herramientas de trabajo, como sierras, cinceles, tijeras o

cuchillos deben colocarse en una solución de hipoclorito de sodio durante 20

minutos, luego lavarse con agua y jabón y esterilizarse.

• Coloque el material anatomo - patológico a desechar (tejidos, biopsias, etc.) en

bolsa plástica roja, rotulándola como “Desechos infecciosos Material

Anatomopatológico”, sellarla y entregarla al personal del aseo para su disposición

final.

• El material contaminado (como guantes, bolsas, frascos) debe ser depositado en

bolsa roja separado del material anatomopatológico, rotulándola como “Desechos

infecciosos”

• En caso de ruptura del material de vidrio contaminado con sangre u otro fluido

corporal, los vidrios se deben recoger con escoba y pala; nunca con las manos,

desecharlos en los recipientes indicados y aplicar el procedimiento para derrame o

contaminación.

• Los recipientes para transporte de muestras deben ser de material irrompible y

con cierre hermético. Deben tener preferiblemente tapón de rosca.

92

• Para la recolección, envío y transporte de muestras de patología, se debe

disponer de recipientes seguros, con tapa y debidamente rotuladas, si es necesario

se utilizarán medios de almacenamiento de recipientes herméticos de plástico o

acrílicos que detengan fugas o derrames accidentales y que deben ser de fácil

lavado. En caso de contaminación externa accidental del recipiente, éste debe

lavarse con hipoclorito de sodio a 10% y secarse.

93

Anexo C Aspectos Bioéticos

Tomado del Código ético del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad del

estado de Colorado, USA y de la Academia Suiza de Ciencias Médicas.

• Al ser dotado de razonamiento e inteligencia, el hombre es responsable de sus

actos, en los cuales es deber buscar el bienestar de todos los seres vivos que lo

acompañan. La vida enfrenta al hombre con problemas que debe resolver y de esta

forma aumentar el rango y la amplitud de sus conocimientos. Al mismo tiempo,

también es su deber respetar, preservar y cuidar a sus compañeros criaturas, los

animales.

• Las investigaciones experimentales en animales tienen en general una

importancia decisiva para la comprensión de fenómenos vitales. Representan una

forma particular de la antigua práctica del hombre de utilizar animales para su

propio bienestar y preservación. El conocimiento adquirido por la

experimentación en animales le sirve al hombre en la protección de la vida, en el

alivio del dolor y sufrimiento tanto de él como de los propios animales. El

derecho reclamado por el hombre de utilizar a los animales es, de cualquier

manera, inseparable de su obligación de evitar el abuso de este derecho.

• Cuando se utilizan animales vivos en la investigación, enseñanza y pruebas

biológicas debe haber una expectativa razonable de que se va a contribuir al

progreso del conocimiento, al mejoramiento de la salud humana o animal y/o al

bienestar social. El valor relativo de los estudios es de una consideración

particularmente importante, sobre todo en experimentos potencialmente dolorosos

en donde debe haber una supervisión estricta de las normas éticas del bienestar

animal y en donde los beneficios de la investigación estén por encima de

cualquier dolor, malestar o angustia que pudieran ser experimentados por los

animales.

• Es bien conocido que en muchos protocolos de investigación simplemente no

existe alternativa al uso de animales. A pesar de la imperativa social por la

experimentación animal, todos los investigadores tienen la obligación ética de

explorar alternativas por las cuales los animales puedan ser parcial o totalmente

94

reemplazados por otros sistemas biológicos o matemático/computarizado. Cuando

una pregunta de investigación puede ser contestada usando modelos no animales o

con métodos in vitro razonablemente accesibles, los cuales permitan llegar a las

mismas conclusiones científicas; el investigador debe elegir estas alternativas.

• La selección de un adecuado modelo animal es una consideración importante, en

particular en el momento presente, en el cual se enfatiza el uso de modelos

alternativos para la investigación. Es responsabilidad del investigador, por tanto,

seleccionar la especie óptima para un proyecto en particular. Además, el número

de animales utilizados debe ser razonablemente minimizado y coherente con el

conocimiento científico y los estándares estadísticos. Es también responsabilidad

del investigador, considerar el origen del animal y garantizar que todos los

animales utilizados con propósitos de experimentación sean adquiridos

legalmente.

• Cuando los animales son usados en un experimento, el investigador tiene la

obligación ética de buscar la técnica factible menos dolorosa que permita que los

objetivos del proyecto se alcancen adecuadamente. Si el procedimiento está

asociado con dolor, molestia o angustia, es imperativo que el investigador

identifique la frecuencia, magnitud y duración del dolor, así como del malestar y

la angustia consecuente, esto con la finalidad de planear adecuadamente el

tratamiento del dolor.

• En procedimientos potencialmente dolorosos, el investigador debe de tomar

todas las medidas necesarias para identificar y monitorear el dolor además del

malestar y la angustia. En la identificación del dolor, el investigador utilizará los

signos del comportamiento basados en el “patrón normal” de comportamiento de

la(s) especie(s) bajo estudio. En algunas circunstancias se pueden utilizar algunos

parámetros fisiológicos (v.gr. cortisol plasmático, catecolaminas, cuenta de

linfocitos y parámetros cardiovasculares).

• Si un procedimiento causará más que un leve dolor o angustia al animal, estos

deben ser minimizados tanto en intensidad como en duración a través de la

administración de analgésicos, anestésicos y tranquilizantes apropiados. Esto debe

ser ponderado de tal forma que el alivio aplique no solo en el momento en que se

esté efectuando el procedimiento, sino también posterior a éste; es decir hasta el

95

momento en que el dolor haya sido aliviado o reducido a un nivel aceptable de

tolerancia.

• En ningún caso es aceptable que un experimento potencialmente doloroso sea

conducido en un animal consiente ni bajo la influencia de drogas paralizantes o

curariformes, sin el uso concomitante de un anestésico apropiado.

• Está reconocido que en cierto tipo de investigaciones, la administración de

anestésicos apropiados y/o analgésicos comprometerán la validación científica del

experimento. Dichos experimentos deben ser plenamente justificados en términos

del diseño científico y de su valor; y la eliminación de esas drogas deberá basarse

en hechos científicos comprobados y no en simple intuición. Además, dolor,

molestia y niveles de angustia deberán ser monitorizados cuidadosamente. Existe

una limitante en el dolor al que un animal experimental puede ser expuesto.

• Los investigadores deben elegir el punto final del experimento lo más

tempranamente posible en cuanto a su atención de minimizar el dolor y la

angustia. Un animal en el que se observe un estado de dolor intenso el cual no

pueda ser aliviado o reducido a un nivel de tolerancia aceptable, se debe aplicar la

eutanasia inmediatamente.

• Ningún animal deberá ser sometido a múltiples cirugías en tanto se mantenga

con vida, excepto cuando éstas estén interrelacionadas y sean esenciales para el

objetivo primario de la investigación.

• Los procedimientos que involucren sujeción física se usarán en animales

consientes sólo después de que hayan sido consideradas otras alternativas y se

encuentre que éstas sean inadecuadas. Cuando se utilice un método de sujeción, el

animal estar adaptado (condicionado) al dispositivo de sujeción, el cual deberá dar

oportunidad al animal de tomar sus posturas normales. En general, animales

consientes no deben ser sometidos a sujeciones físicas prolongadas.

• Es responsabilidad del investigador garantizar que los cuidados necesarios post-

quirúrgicos sean proporcionados a los animales que lo necesiten. Estos cuidados

deben ceñirse a los estándares internacionales y deberán otorgarse tanto como se

requieran, incluso en horas no hábiles.

96

• La eutanasia es el acto de inducir la muerte sin dolor. Cuando un animal no será

sujeto de eutanasia al finalizar el experimento, es responsabilidad del

investigador, asegurar la correcta disposición final del animal.

• Los procedimientos que involucren el uso de animales deberán ser realizados por

o bajo la supervisión inmediata de un individuo con el perfil profesional adecuado

y que cuente con la experiencia necesaria relativa al proceso experimental.

• Los experimentos con animales son éticamente legítimos si forman parte de la

currícula de facultades y escuelas de alto aprendizaje para estudiantes de

medicina, medicina veterinaria, odontología, química y biología, y en el

entrenamiento de técnicos de laboratorio y personal paramédico, en el entendido

de que no existen, para la adquisición de los conocimientos, opciones alternas que

permitan obtener esos conocimientos.

• Los experimentos en animales no son éticamente legítimos si existen métodos

alternos suficientemente concluyentes para adquirir el conocimiento buscado. Los

experimentos en animales que ya han sido adecuadamente realizados no deben ser

repetidos sin una plena justificación.

El Reemplazo de los Animales en los Experimentos, Reducción del Número y

Refinamiento de la Técnica

Se han establecido las técnicas de reemplazo, reducción y refinamiento,

comúnmente conocidas como las 3R’s, son ampliamente conocidas por todos los

investigadores responsables y no hay discusión sobre el bienestar de los animales

de laboratorio que no se refiera al término y estas son:

Reducción. Se refiere a métodos para obtener niveles comparables de

información a partir del uso de menos animales en los procedimientos científicos

o bien para obtener mayor información con el mismo número de animales.

Refinamiento. Es el aspecto más descuidado del concepto de alternativas y se

refiere a modificaciones en las técnicas para reducir el dolor y el estrés

experimentado por los animales de experimentación.

Reemplazo. Se refiere a la situación en la cual las técnicas que utilizan animales

pueden ser sustituidas por técnicas de laboratorio o de otro tipo. Existen un buen

97

número de ejemplos en los cuales se ha efectuado este reemplazo, ya sea para el

diagnóstico de enfermedades o bien en la constatación y estandarización de

agentes terapéuticos.

Eutanasia en los Animales

Los criterios primordiales para la eutanasia en términos de bienestar animal, son

que el método sea indoloro, consiga una rápida inconsciencia y muerte, requiera

una mínima inmovilización, evite la excitación, sea apropiado para la edad,

especie y salud del animal, debe de minimizar el miedo y el estrés en el animal,

ser fiable, reproducible, irreversible, sencillo de administrar (en dosis pequeñas si

es posible) y seguro para el operador. Y en la medida de lo posible, debe ser

estéticamente aceptable para el operador.

98

Anexo D Declaración de Conflicto de interés

El Tutor, y el Autor, declararon no tener ningún conflicto de interés con la

industria farmacéutica ni con la Casa comercial proveedora del Biomarterial.

DR. FRANKLIN QUEL OD.CATHERINE TAMAYO

TUTOR AUTOR

99

Anexo E Certificado del Veterinario y el Anátomo-patólogo

100

101

Anexo F Registro sanitario del sulfato de calcio bifásico en el Ecuador

102

REGISTROS SANITARIOS TOP DENTAL INTERNACIONAL (MIS

ECUADOR)

DESCRIPCION NRO. DE SOLICITUD CLASIFICACION

ARANCELARIA

NRO EMISION DE

CERTIFICADO

INJERTO, DE

HUESOS

16783673201600000001P 300490290000000001 TTTHB99017M2025

Para conocer la lista de productos que se incluyen en cada uno, se debe ingresar a

este link a través de Internet Explorer y consultar con los datos que arriba les

indicamos:

https://ventanillaunica.aduana.gob.ec/vpt_server/vpt_flex/ctft_inqr.html#

103

Anexo G Registro sanitario del Alendronato en el Ecuador

104

Anexo H Proceso para la obtención del Fármaco dada por el Ingeniero Químico y el Químico

Farmacéutico

Richard Isacc Tamayo Alcívar con C.I. 0925778219 Ingeniero Químico con Reg.

De Senescyt N° 1006-2017-1789267 y Luis Alberto Toala Murillo con C.I.

1312039207 Químico Farmacéutico y Magíster en procesamiento de Alimentos

con Reg. De Senescyt N°1006-10-993781 hemos disuelto 70mg de Ácido

alendrónico en 50ml para poder obtener 2mg/ml, dicha concentración será

utilizada en el proyecto de Investigación titulado ESTUDIO

HISTOMORFOMÉTRICO DE LA REGENERACIÓN ÓSEA UTILIZANDO

SULFATO DE CALCIO Y SULFATO DE CALCIO COMBINADO CON

ALENDRONATO. ESTUDIO EXPERIMENTAL EN CONEJOS, cuyo autor es

la estudiante egresada del posgrado de Implantología Oral CATHERINE DE LAS

MERCEDES TAMAYO ALVÍVAR.

DESCRIPCIÓN FARMACOLÓGICA

356mg de la pastilla 70mg de Alendronato 10,17mg de la pastilla

------------------------- ---------------------------- =

? 2mg de Alendronato Contiene 2mg de Alendronato

Para obtener 50 muestras se multiplica todo por 50

(356mg x 50) (70mgx50) 508, 6mgde pastilla se disuelven en

---------------------- = 50ml de agua destilada para obtener 50

muestras

(2x50) de 2mg/ml

Ing. Quím. Richard Tamayo Alcívar MSc. Q.F. Luis Alberto Toala Murillo

C.I. 0925778219 C.I. 1312039207

Reg. De Senescyt N° 1006-2017-1789267 Reg. De Senescyt N°1006-10-993781

Reg. De Senescyt N° 1018-2016-1779084

105

Proceso secuencial para la obtención del fármaco

Peso equivalente a la pastilla = 70mg de alendronato

Peso equivalente a las 2 pastillas de alendronato para obtención de 50

muestras de 2mg/ml

Solución de Alendronato

Muestras

106

Anexo I Pruebas de análisis estadísticos

Prueba de Análisis de la Varianza (ANOVA) para la igualdad de la media entre

varias muestras.

Cuando se dispone de varios grupos en que se ha divido la población general, es

útil, en primer lugar, determinar si estos grupos tienen características similares o,

por el contrario, son totalmente diferentes.

El Análisis de la Varianza es una metodología estadística que permite comparar la

media de una variable, a lo largo de varios grupos. El procedimiento se resume en

una tabla (Tabla ANOVA), en la cual la última columna se encuentra el nivel de

significación.

Matemáticamente, una prueba ANOVA tiene los siguientes elementos:

1. Hipótesis Nula. Todos grupos tienen la misma media.

2. Hipótesis Alternativa. Al menos uno de los grupos tiene diferente media del

resto.

3. Estadístico de Prueba F. Es un valor, que se obtiene a partir de los datos, que

permitirá determinar si se acepta la hipótesis nula o alternativa.

4. Decisión. De acuerdo al valor del estadístico de prueba, mediante un programa

estadístico se obtiene un valor (denominado Sig.) que se compara con la cifra

0.05=5%, de la siguiente manera:

Si Sig. ≥ 0.05, se acepta la hipótesis nula.

Si Sig. < 0.05, se acepta la hipótesis alternativa.

Prueba de Análisis de Medias (ANOM) para la igualdad de la media entre

varias muestras.

El Análisis de Medias es otra técnica, alternativa al ANOVA, para realizar la

determinación del comportamiento de grupos, ya que con ella no solo se verifica

si los grupos son diferentes, sino es posible hallar cuáles de ellas difieren del

resto.

El resultado de este análisis es un gráfico como el que se halla a continuación.

Aquellos valores que se sitúen dentro de la banda que se encuentra en torno al

punto central se consideran iguales, de manera que sus correspondientes grupos

107

tienen la misma media; por el contrario, los valores de la media que se localicen

fuera de la banda, nos informan que son diferentes del resto (Ver Gráfico).

Prueba ji-cuadrado

Una prueba ji-cuadrado es un procedimiento estadístico que compara la

distribución observada de los datos con su distribución esperada de acuerdo con la

hipótesis nula.

Nosotros emplearemos una prueba ji-cuadrado para probar la asociación o la

independencia entre las modalidades que toman dos variables categóricas.

Para poder realizar una prueba de asociación entre dos variables nominales se

deben organizar los datos en una traba de doble entrada (tabla de contingencia),

que es una tabla de frecuencias que tiene las modalidades de la primera variable

en las filas y las modalidades de la segunda variable en las columnas. Dentro de

cada celda de la tabla se hallan los conteos de los casos que comparten las dos

modalidades a las que pertenece la celda:

Variable B

Variable A C1 C2 C3 C4

F1 N11 N12 N13 N14

F2 N21 N22 N23 N24

F3 N31 N32 N33 N34

Grupo

Mean

4321

60

58

56

54

52

50

51.68

57.92

54.8

Análisis de la MediaAlpha = 0.05

108

Matemáticamente, una prueba ji-cuadrado de asociación tiene los siguientes

elementos:

1. Hipótesis Nula. La variable A (de las filas) es independiente de la variable B

(de las columnas).

2. Hipótesis Alternativa. La variable A y la variable B están asociadas.

3. Estadístico de Prueba χ². Es un valor, que se obtiene a partir de los datos, que

permitirá determinar si se acepta la hipótesis nula o alternativa.

4. Decisión. De acuerdo al valor del estadístico de prueba, mediante un

programa estadístico se obtiene un valor (denominado Sig. asintótica) que se

compara con la cifra 0.05=5%, de la siguiente manera:

Si Sig. bilateral ≥ 0.05, se acepta la hipótesis nula.

Si Sig. bilateral < 0.05, se acepta la hipótesis alternativa.

109

Anexo J Muestras procesadas.

Regeneración Ósea fisiológica

1° Individuo: Fémur

Izquierdo


Izquierdo


Derecho


Derecho 1° Individuo: Fémur

Derecho


Izquierdo


Izquierdo


Derecho


Derecho

110

° 3° Individuo: Fémur

Izquierdo


Izquierdo


Derecho


Derecho


Izquierdo

. 4° Individuo: Fémur

Izquierdo


Derecho


Derecho

111


Izquierdo


Izquierdo


Derecho


Derecho

Regeneración Ósea con Sulfato de Calcio


Izquierdo


Izquierdo


Derecho


Derecho

112


Izquierdo


Izquierdo


Derecho


Derecho


Izquierdo 3° Individuo: Fémur

Izquierdo


Izquierdo


Derecho


Derecho

113


Izquierdo


Izquierdo


Derecho


Derecho


Derecho


Izquierdo


Izquierdo


Izquierdo


Derecho 5° Individuo: Fémur

Derecho

Regeneración Ósea con Alendronato en fémur izquierdo, fémur derecho reg.

Ósea.

114


Izquierdo


Izquierdo


Izquierdo


Derecho


Derecho


Izquierdo


Izquierdo


Izquierdo


Derecho


Derecho

115


Izquierdo


Izquierdo


Derecho


Derecho


Izquierdo


Izquierdo


Izquierdo


Derecho


Derecho

116


Izquierdo


Izquierdo


Derecho


Derecho


Izquierdo


Izquierdo


Izquierdo


Derecho


Derecho


Derecho

117


Izquierdo


Izquierdo


Derecho


Derecho


Izquierdo


Izquierdo


Derecho


Derecho

118


Izquierdo


Izquierdo


Izquierdo


Derecho


Derecho


Izquierdo


Izquierdo


Izquierdo


Derecho


Derecho


Derecho

Documents

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD …...Espinel (Patóloga), Ing. Edwin Galindo (Estadístico), e Ing. Químico Richard Tamayo Alcívar y al Q.F. Luis Alberto Toala Murillo