UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS …repositorio.ug.edu.ec/bitstream/redug/4756/1/MENDEZMantuanoMarcel.pdf · universidad de guayaquil facultad de ciencias agrarias tesis

UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

TESIS DE GRADO

PREVIA A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE

INGENIERO AGRÓNOMO

TEMA

“EFECTOS DE CINCO DOSIS DE QUITOSANO PARA EL

ESTABLECIMIENTO in vitro DEL PLÁTANO DOMINICO HARTÓN

(Musa AAB Simmonds) EN LA ZONA DE DAULE”

AUTOR:

MARCEL OSWALDO MÉNDEZ MANTUANO

DIRECTORA DE TESIS:

ING. AGR. LAURA PARISMORENO RIVAS

DAULE – ECUADOR

2014

i

UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

La presente tesis de grado titulada: “EFECTOS DE CINCO DOSIS

DE QUITOSANO PARA EL ESTABLECIMIENTO in vitro DEL

PLÁTANO DOMINICO HARTÓN (Musa AAB Simmonds) EN LA

ZONA DE DAULE”, realizada por el egresado Marcel Oswaldo Méndez

Mantuano, bajo la dirección de la Ing. Agr. Laura ParisMoreno Rivas,

ha sido aprobada y aceptada por el Tribunal de Sustentación como requisito

previo para obtener el título de:

INGENIERO AGRÓNOMO

TRIBUNAL DE SUSTENTACIÓN

ii

Guayaquil, 11 de julio del 2014

CERTIFICADO DEL GRAMÁTICO

Ing. Carolina Castro Mendoza, con domicilio ubicado en la ciudad de

Guayaquil, por el presente certifico que he revisado la Tesis de Grado

elaborada por el Sr. Marcel Oswaldo Méndez Mantuano, con C.I.

092534026-7, previa a la obtención del TÍTULO DE INGENIERO

AGRÓNOMO, cuyo tema es: “EFECTOS DE CINCO DOSIS DE

QUITOSANO PARA EL ESTABLECIMIENTO in vitro DEL

PLÁTANO DOMINICO HARTÓN (Musa AAB Simmonds) EN LA

ZONA DE DAULE”.

La tesis de grado arriba señalada ha sido escrita de acuerdo a las normas

gramaticales y de sintaxis vigentes de la Lengua Española.

Ing. Carolina Castro Mendoza

C.I. 0919052175

N° Registro SENESCYT: 1006-11-1071409

iii

DEDICATORIA

“No temas, porque yo estoy contigo; no desmayes, porque yo soy tu

Dios que te esfuerzo; siempre te ayudaré, siempre te sustentaré con la

diestra de mi justicia” (Isaías 41:10).

Cuando alcanzamos nuestras metas más anheladas, no debemos olvidar a

quienes nos ayudaron a llegar a la misma; es por esto que dedico este

triunfo académico a:

Dios primeramente, por ser el pilar que sostiene mi vida y todos mis

ideales, ya que sin su infinita bondad nada podría ser posible.

A mis padres Narcisa Mantuano Holguín y Oswaldo Méndez Mosquera,

que desde mi niñez han sido ejemplos de superación, responsabilidad y de

virtudes inigualables; además de apoyarme desinteresadamente en todos

mis planes y proyectos.

A mi sobrina Angélica Abigail, ya que me ha transmitido valor, alegría y

fortaleza, además de ser un símbolo de lucha y fuerza a pesar de las

circunstancias difíciles que le ha tocado superar.

A mi sobrino Kalev Isaías, el miembro más joven de la familia y parte

importante de ella.

A mis hermanos Eliana y David.

iv

A mis familiares y amigos.

A mis hermanos en la fe de la Iglesia Evangélica Alianza de Daule.

Y a las futuras generaciones.

Dios les bendiga y prospere grandemente.

v

AGRADECIMIENTO

“Una actitud de agradecimiento tiene el poder de convertir las

dificultades en oportunidades, los problemas en soluciones, las pérdidas en

ganancias y además expande nuestra visión y nos permite descubrir todo

aquello que era invisible para nosotros debido a nuestra actitud

limitadora” (Louise L. Hay).

Desde estas palabras quiero agradecer a quienes de una u otra forma han

contribuido a este trabajo, ya que sin su valioso aporte esto no hubiera sido

posible.

A la Ing. Agr. Laura ParisMoreno Rivas, ya que primeramente me

permitió realizar este ensayo en el Laboratorio AGROVITROPARIS de su

propiedad, además por sus constantes sugerencias durante el desarrollo del

mismo, por sus aportes de conocimientos, por su amistad y cariño.

Al Ing. Agr. Eison Valdiviezo Freire, quien, con su acertada orientación

me guió en la parte estadística de la presente tesis.

A todos quienes fueron mis maestros durante el período de tiempo que

estuve en las aulas de la Universidad, ya que sin sus valiosas enseñanzas

esto sólo hubiera sido una utopía.

A todos aquellos que a lo largo de la realización de este trabajo me han

ayudado, compartiendo sus conocimientos y experiencias.

vi

A mi familia y amigos por estar a mi lado en todo momento y no perder

la confianza en mí.

A todos, ¡muchísimas gracias!

vii

RESPONSABILIDAD

La responsabilidad de los resultados, conclusiones y

recomendaciones del presente trabajo de investigación

pertenecen exclusivamente al autor.

Marcel Oswaldo Méndez Mantuano

C.I. 092534026-7

Teléfono celular: (+593) 0991979474

E-mail: [email protected]

viii

REPOSITORIO NACIONAL EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA

FICHA DE REGISTRO de tesis TÍTULO Y SUBTITULO: EFECTOS DE CINCO DOSIS DE QUITOSANO PARA EL ESTABLECIMIENTO

in vitro DEL PLÁTANO DOMINICO HARTÓN (Musa AAB Simmonds) EN LA ZONA DE DAULE.

AUTOR Marcel Oswaldo Méndez Mantuano

TUTOR: Ing. Agr. Laura ParisMoreno Rivas.

REVISORES:

Ing. Agr. Pedro Vera Asang, D.D.S.

Ing. Agr. Carlos Ramírez Aguirre, MSc.

INSTITUCIÓN:

UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD:

CIENCIAS AGRARIAS

CARRERA: Ingeniería Agronómica

FECHA DE PUBLICACIÓN: Julio/2014

N. DE PAGS: 130

ÁREAS TEMÁTICAS:

Biotecnología, Cultivos Anuales.

PALABRAS CLAVE:

Plátano, Dominico Hartón, in vitro, micropropagación, quitosano, contaminación, cormos, brotes, repique, Daule.

RESUMEN:

La presente investigación se realizó de enero a junio del 2014, en el cantón Daule, Provincia del Guayas, en el

laboratorio de cultivos de tejidos in vitro de la empresa AGROVITROPARIS, que se encuentra ubicada entre las

coordenadas geográficas 1º 51' 37,77" (Latitud Sur), 79º 58' 34,42" (Longitud Occidental) y a 15 m.s.n.m.

El estudio tuvo como objetivo la regeneración in vitro del plátano “Dominico Hartón” (Musa AAB Simmonds),

probando cinco dosis de quitosano, ya que éste ayudaría en la reducción de contaminación por hongos y bacterias;

además promovería el desarrollo de los explantes en cada una de las etapas de la micropropagación.

Se utilizaron los cormos (hijos espada) del plátano Dominico Hartón, cuyas plantas madres presentaron buenas

características agronómicas; éstos se los colocó en frascos con nutrimentos necesarios para su desarrollo y las

dosis de quitosano a evaluar (2,5g/L; 5g/L; 10g/L; 15g/L; 20g/L; 0g/L).

Posteriormente, se los repicó para cinco generaciones (L). En la cuarta generación (L4) se evaluó el número de

brotes que se regeneraron por explante y finalmente en el último repique (L5) se seleccionaron al azar 60 brotes

(10 por tratamientos), para evaluar variables como: número de hojas, número de raíces y longitud de las plántulas.

El tratamiento cuatro (T4) fue el que menor porcentaje de contaminación presentó en la evaluación acumulada

con 15g/L de quitosano; en cuanto al desarrollo foliar, radicular y de elongación de las plántulas; ninguno de los

tratamientos mostró significancia estadística.

Se concluyó que el quitosano ayudó a disminuir la contaminación pero no mejora el desarrollo de los explantes ni

disminuye el necrosamiento de los mismos.

N. DE REGISTRO (en base de datos): N. DE CLASIFICACIÓN:

DIRECCIÓN URL (tesis en la web):

ADJUNTO URL (tesis en la web):

ADJUNTO PDF: SI NO

CONTACTO CON AUTOR/ES: Teléfono: 0991979474

E-mail: [email protected]

CONTACTO EN LA INSTITUCION: Nombre: Universidad de Guayaquil – Ciencias Agrarias

Teléfono: 2288040

E-mail: www.ug.edu.ec/facultades/cinciasagrarias.aspx

mailto:[email protected]

ix

ÍNDICE GENERAL

Págs.

I. INTRODUCCIÓN .................................................................................... 1

1.1 OBJETIVO GENERAL ................................................................................ 3

1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................... 4

II. REVISIÓN DE LITERATURA ............................................................ 5

2.1 CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA ................................................................ 5

2.1.1 Morfología del plátano ................................................................... 5

2.1.2 Características del cormo o rizoma del plátano .............................. 6

2.2 CULTIVO IN VITRO ................................................................................... 7

2.2.1 Etapas del cultivo in vitro ............................................................... 8

2.2.1.1 Etapa cero: selección del material vegetal ............................... 9

2.2.1.1.1 Fase de desinfección ........................................................... 9

2.2.1.1.2 Medio de cultivo ............................................................... 11

2.2.1.2 Etapa uno: fase de establecimiento ......................................... 13

2.2.1.3 Etapa dos: fase de multiplicación ........................................... 13

2.2.1.4 Etapa tres: fase de enraizamiento ........................................... 14

2.2.1.5 Etapa cuatro: aclimatación de las plántulas enraizadas .......... 15

2.2.2 Experiencia de cultivos in vitro en musáceas ............................... 15

2.2.3 Principales problemas en el cultivo in vitro ................................. 16

2.2.3.1 Contaminación ........................................................................ 17

2.2.3.2 Oxidación fenólica .................................................................. 18

2.3 QUITOSANO .......................................................................................... 18

2.3.1 Propiedades del quitosano (según Lárez, 2008) ........................... 20

2.3.1.1 Actividad bactericida .............................................................. 20

2.3.1.2 Actividad fúngica ................................................................... 22

2.3.1.3 Estimulador del crecimiento ................................................... 24

2.3.2 Proceso químico para la obtención de la quitina .......................... 24

III. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................... 26

3.1 UBICACIÓN DEL EXPERIMENTO ............................................................. 26

3.2 DATOS GEOGRÁFICOS ........................................................................... 26

3.3 DATOS CLIMÁTICOS .............................................................................. 26

x

3.4 DURACIÓN DEL EXPERIMENTO .............................................................. 27

3.5 MATERIALES Y EQUIPOS ....................................................................... 27

3.5.1 Materiales de laboratorio .............................................................. 27

3.5.2 Equipos ......................................................................................... 28

3.5.3 Material vegetal ............................................................................ 28

3.5.4 Material químico para la propagación o medio de cultivo ........... 28

3.5.4.1 Macronutrientes MS ............................................................... 28

3.5.4.2 Micronutrientes ms ................................................................. 29

3.5.4.3 Quelatos de hierro MS ............................................................ 29

3.5.4.4 Vitaminas Morel ..................................................................... 30

3.5.4.5 Sacarosa .................................................................................. 30

3.5.4.6 Phytagel .................................................................................. 31

3.5.5 Material experimental ................................................................... 31

3.6 UNIDAD DE OBSERVACIÓN .................................................................... 31

3.7 CONSIDERACIONES PARA LA MICROPROPAGACIÓN IN VITRO ................. 31

3.7.1 Esterilización de los explantes ...................................................... 32

3.7.2 Factores físicos ............................................................................. 32

3.7.3 Área estéril .................................................................................... 32

3.8 PROCEDIMIENTOS REALIZADOS EN EL EXPERIMENTO ........................... 33

3.8.1 Etapa 0 (día 1) ............................................................................... 33

3.8.2 Etapa 1 (desde el día 1 hasta el día 27) ......................................... 33

3.8.3 Etapa 2 (desde el día 28 hasta el día 111) ..................................... 34

3.8.4 Etapa 3 (desde el día 112 hasta el día 140) ................................... 35

3.8.5 Factor de multiplicación ............................................................... 36

3.9 FACTORES EN ESTUDIO ......................................................................... 36

3.9.1 Descripción de tratamientos ......................................................... 36

3.10. DISEÑO EXPERIMENTAL ..................................................................... 37

3.10.1 Análisis de varianza .................................................................... 37

3.11 VARIABLES Y MÉTODOS DE EVALUACIÓN ........................................... 37

3.11.1 Número de explantes libres de contaminación ........................... 37

3.11.2 Número de brotes regenerados por explantes ............................. 38

3.11.3 Número de hojas por explantes .................................................. 38

3.11.4 Número de raíces por explantes .................................................. 38

3.11.5 Longitud de la plántula ............................................................... 38

3.11.6 Porcentaje total de necrosis por oxidación ................................. 39

xi

IV. RESULTADOS EXPERIMENTALES ............................................. 40

4.1 PORCENTAJE DE CONTAMINACIÓN EN LA ETAPA 1 ................................ 40

4.1.1 Número de explantes nuevos y porcentaje de contaminación en la

etapa 2 .................................................................................................... 41

4.1.1.1 Primer repique o primera generación “L1” (día 28 al 48) ...... 41

4.1.1.2 Segundo repique o segunda generación “L2” (día 49 al 69) .. 42

4.1.1.3 Tercer repique o tercera generación “L3” (día 70 al 90) ........ 43

4.1.1.4 Cuarto repique o cuarta generación “L4” (día 91 al 111) ...... 44

4.1.1.5 Quinto repique o quinta generación “L5” (día 112) ............... 45

4.1.1.5.1 Porcentaje de contaminación en “L5” (día 112 al 140) ... 46

4.2 NÚMERO DE BROTES POR EXPLANTE EN “L4” ....................................... 47

4.3 NÚMERO DE HOJAS POR EXPLANTES EN “L5” ....................................... 48

4.4 NÚMERO DE RAÍCES POR EXPLANTE EN “L5” ........................................ 50

4.5 LONGITUD DE LA PLÁNTULA EN “L5” ................................................... 51

4.6 PORCENTAJE DE NECROSIS POR OXIDACIÓN .......................................... 52

V. DISCUSIÓN ........................................................................................... 53

5.1 CONTAMINACIÓN ................................................................................. 53

5.2 BROTES ................................................................................................ 60

5.3 HOJAS .................................................................................................. 62

5.4 RAÍCES ................................................................................................. 63

5.5 LONGITUD DE PLÁNTULAS .................................................................... 63

5.6 OXIDACIÓN .......................................................................................... 64

VI. CONCLUSIONES ............................................................................... 66

VII. RECOMENDACIONES .................................................................... 67

VIII. RESUMEN ........................................................................................ 68

IX. SUMARY .............................................................................................. 70

X. LITERATURA CITADA ..................................................................... 72

XI. ANEXOS ............................................................................................... 86

XII. FIGURAS DE ANEXOS .................................................................. 98

xii

ÍNDICE DE CUADROS

Págs.

Cuadro 1. Composición de los macronutrientes. ....................................... 29

Cuadro 2. Composición de los micronutrientes. ....................................... 29

Cuadro 3. Composición de los quelatos. ................................................... 30

Cuadro 4. Composición de las vitaminas. ................................................. 30

Cuadro 5. Azúcar. ...................................................................................... 30

Cuadro 6. Composición del Phytagel. ....................................................... 31

Cuadro 7. Descripción de los tratamientos. ............................................... 36

Cuadro 8. Análisis de varianza. ................................................................. 37

Cuadro 10. Porcentaje de contaminación de los explantes

hasta los 27 días en la etapa 1 (L0), 2014. ........................................ 40

Cuadro 11. Número de explantes obtenidos en el repique

(L1), porcentaje de contaminación, 2014. ........................................ 41








(L5), 2014. ......................................................................................... 45

Cuadro 16. Porcentaje de contaminación en “L5”, 2014........................... 46

Cuadro 17. Número de brotes en cada uno de los

tratamientos, 2014. ............................................................................ 47

Cuadro 18. Análisis de varianza del número de brotes. ............................ 48

Cuadro 19. Número de hojas por explantes en cada uno de

los tratamientos, 2014. ...................................................................... 48

Cuadro 20. Análisis de varianza del número de hojas. .............................. 49

Cuadro 21. Número de raíces en cada uno de los

tratamientos, 2014. ............................................................................ 50

Cuadro 22. Análisis de varianza del número de raíces. ............................. 51

Cuadro 23. Longitud de las plántulas en cada uno de los

tratamientos, 2014. ............................................................................ 51

xiii

Cuadro 24. Análisis de varianza de la longitud de las

plántulas. ........................................................................................... 52

Cuadro 25. Promedio de los porcentajes de contaminación

en cada uno de los tratamientos. ....................................................... 58

xiv

ÍNDICE DE CUADROS DE ANEXOS

Págs.

Anexo 1: Esquema de micropropagación mediante el uso de

meristemos o brotes apicales (Alonso 2002,

modificado) ....................................................................................... 87

Anexo 2: Croquis del lugar donde se realizó el experimento..................... 88

Anexo 3: Fases del experimento ................................................................. 89

Anexo 4: Prueba de Tukey para número de brotes

(comparación múltiple) ..................................................................... 90

Anexo 5: Prueba de Tukey para número de brotes

(subconjuntos homogéneos) ............................................................. 91

Anexo 6: Prueba de Tukey para número de hojas


Anexo 7: Prueba de Tukey para número de hojas


Anexo 8: Prueba de Tukey para número de raíces


Anexo 9: Prueba de Tukey para número de raíces


Anexo 10: Prueba de Tukey para longitud de plántulas


Anexo 11: Prueba de Tukey para longitud de plántulas


xv

ÍNDICE DE FIGURAS

Págs.

Figura 1. Porcentaje de contaminación total en la etapa 1

(L0) .................................................................................................... 40

Figura 2. Porcentaje de contaminación por tratamientos en

la etapa 1 (L0) ................................................................................... 41

Figura 3. Porcentaje de contaminación en la primera

generación “L1” ................................................................................ 42


la primera generación “L1” ............................................................... 42

Figura 5. Porcentaje de contaminación en la segunda

generación “L2” ................................................................................ 43


la segunda generación “L2” .............................................................. 43

Figura 7. Porcentaje de contaminación en la tercera

generación “L3” ................................................................................ 44


la tercera generación “L3” ................................................................ 44

Figura 9. Porcentaje de contaminación en la cuarta

generación “L4” ................................................................................ 45


la cuarta generación “L4” ................................................................. 45

Figura 11. Porcentaje de contaminación en la quinta

generación “L5” ................................................................................ 46


la quinta generación “L5” ................................................................. 47

Figura 13. Medias del número de brotes por tratamientos ........................ 48

Figura 14. Medias del número de hojas por tratamientos .......................... 49

Figura 15. Medias del número de raíces por tratamientos ......................... 50

Figura 16. Medias de la longitud de las plántulas por

tratamientos ....................................................................................... 52

Figura 17. Porcentaje de necrosis por oxidación ....................................... 52

Figura 18. Porcentaje de contaminación en cada generación .................... 53

xvi

Figura 19. Porcentajes de contaminación en cada

generación por tratamiento. .............................................................. 57

Figura 20. Promedio de los porcentajes de contaminación. ...................... 58

xvii

ÍNDICE DE FIGURAS DE ANEXOS

Págs.

Figura 1A. Recolectando los cormos (hijuelos de espada)

del plátano Dominico Hartón (Musa AAB

Simmonds). Lomas de Sargentillo, 2014. ......................................... 99

Figura 2A. Cormos que servirán de explantes para la

micropropagación. Lomas de Sargentillo, 2014. .............................. 99

Figura 3A. Lavando los cormos provenientes del campo.

Daule, 2014. .................................................................................... 100

Figura 4A. Recudiendo el tamaño de los cormos. Daule,

2014. ................................................................................................ 100

Figura 5A. Cormos puestos en cada uno de los tratamientos

de quitosano. Daule, 2014. .............................................................. 101

Figura 6A. Quitosano empleado en el experimento. Daule,

2014. ................................................................................................ 101

Figura 7A. Cantidad de explantes después del primer

repique o L1. Daule, 2014............................................................... 102

Figura 8A. Explantes después del segundo repique o L2.

Daule, 2014. .................................................................................... 102

Figura 9A. Medios de cultivos con las diferentes dosis de

quitosano para el tercer repique o L3. Daule, 2014. ....................... 103

Figura 10A. Desarrollo de los explantes en la tercera

generación o L3. Daule, 2014. ........................................................ 103

Figura 11A. En la cámara laminar, repicando los cormos.

Daule, 2014. .................................................................................... 104

Figura 12A. Repicando los cormos de L3. Daule, 2014. ......................... 104

Figura 13A. Terminando el repique de los explantes. Daule,

2014. ................................................................................................ 105

Figura 14A. Explante de plátano L4 contaminado por

hongos 1. Daule, 2014. ................................................................... 105

Figura 15A. Explante de plátano L4 contaminado por

hongos 2. Daule, 2014. ................................................................... 106

Figura 16A. Explantes desarrollándose. Daule, 2014. ............................. 106

xviii

Figura 17A. Toma del número de brotes que tiene el

explante de plátano. Daule, 2014. ................................................... 107

Figura 18A. Junto al Ing. Eison Valdiviezo en el

laboratorio AGROVITROPARIS. Daule, 2014. ............................ 108

Figura 19A. Número de brotes que presentaron en la cuarta

generación. Daule, 2014. ................................................................ 108

Figura 20A. Explante con necrosis por bacterias en L4.

Daule, 2014. .................................................................................... 109

Figura 21A. Seis tratamientos y 10 repeticiones para la

toma de las últimas variables en la etapa 3 (L5).

Daule, 2014. .................................................................................... 109

Figura 22A. Desarrollo de las plántulas en la quinta

generación o L5. Daule, 2014. ........................................................ 110

Figura 23A. Plántulas desarrollándose en el día 133 del

experimento. Daule, 2014. .............................................................. 110

Figura 24A. Evaluación de las variables. Daule, 2014. ........................... 111

Figura 25A. Tomando datos de las diferentes variables.

Daule, 2014. .................................................................................... 111

1

I. INTRODUCCIÓN

El cultivo de plátano (Musa AAB) representa un importante sostén para

la socioeconomía y seguridad alimentaria del país; desde este punto de vista

el plátano genera fuentes estables y transitorias de trabajo, además de

proveer permanentemente alimentos ricos en energía a la mayoría de la

población. Actualmente se reportan en el país un total de 144.981 ha de

plátano, de las cuales 86.712 ha están bajo el sistema de monocultivo y

58.269 ha se encuentran asociadas con otros cultivos (INEC, 2011).

La mayor zona de producción de esta musácea es la conocida como el

triángulo platanero, la cual abarca las provincias de Manabí, Santo

Domingo y Los Ríos, con 52.612, 14.249 y 13.376 ha, respectivamente. Las

principales variedades explotadas en estas zonas son el “Dominico”, que se

lo destina principalmente para el autoconsumo y el “Dominico Hartón”

(Musa AAB Simmonds) que se lo destina en su mayor parte a la

exportación, estimándose que anualmente se exportan alrededor de 90.000

TM de este cultivar (INIAP, 2013).

El interés de producir plátano para exportación crece cada día en el

Ecuador, ya que existen oportunidades para ampliar su venta en el mercado

internacional, siempre y cuando se ofrezca un producto de excelente

calidad. Al plátano se lo puede considerar como un producto marginal y

más si se lo compara con el banano, cuyo volumen de exportación es

considerable. Presenta algunas ventajas que los expertos se encargan de

resaltar: menor costo de producción, mejor precio de venta por caja,

2

estabilidad de los precios, mercados alternativos, posibilidad de exportar

durante todo el año y de colocar el rechazo en el mercado interno.

La reproducción asexual de plantas es una técnica muy importante para

la multiplicación in vitro del plátano, debido a la esterilidad de la especie.

En la actualidad, la atención está centralizada en aprovechar las ventajas

que presenta la metodología de propagación rápida mediante el cultivo de

tejidos (Müller & Sandoval, 1986).

El método consiste en cultivar asépticamente el “meristemo”

proveniente de hijuelos, en un medio nutritivo artificial; luego, mediante la

adición de reguladores de crecimiento al medio de cultivo, se estimula la

multiplicación y la obtención de plantas completas debido a la totipotencia

inherente en las células vegetales (Müller & Sandoval, 1986).

La multiplicación in vitro ha permitido la reproducción masiva de la

especie para plantaciones comerciales. Sin embargo, una de las limitantes

para la micropropagación in vitro de Musa spp. ha sido la alta tasa de

contaminación en los explantes en la etapa I del cultivo, debido

principalmente a contaminación endógena, acentuada en zonas tropicales,

donde las condiciones de alta temperatura y pluviosidad hacen que los

microorganismos encuentren un hospedero ideal en esta especie (Ortega et

al., 2011).

Es por esto que surge la necesidad de aplicar nuevas herramientas

biotecnológicas en este importante cultivo, para mejorar la obtención de

plantas destinadas a la producción. Algunas entidades del país ya están

3

realizando propagación in vitro a través de meristemos, lo que garantiza la

obtención de plantas libres de algunas enfermedades vasculares, además

existen cultivos establecidos con estas plantas y los resultados en

rendimiento y calidad de fruta son promisorios.

El plátano es un cultivo importante para la alimentación mundial y

Ecuador no es la excepción. Además, es un rubro de exportación

trascendental y una fuente sustancial de empleo en muchas zonas del país.

Debido a la importancia que tiene el cultivo, es necesario que existan

herramientas confiables para que el agricultor maneje el mismo desde las

primeras etapas de éste, adecuada y rentablemente.

Es por ello que se planteó la necesidad de establecer un adecuado

protocolo de desinfección que proporcionará un establecimiento de

explantes de plátano con bajo porcentaje de contaminación, como fase

inicial para la micropropagación in vitro de la especie a través de sus

“hijuelos”.

1.1 Objetivo general

Evaluar cinco dosis de quitosano para el establecimiento aséptico en

plátano Dominico Hartón (Musa AAB Simmonds).

4

1.2 Objetivos específicos

Determinar la dosis más eficiente de quitosano para evitar la

contaminación de patógenos en los medios de cultivos.

Comprobar si el uso de quitosano mejora el desarrollo de los brotes y

plántulas in vitro del plátano Dominico Hartón (Musa AAB

Simmonds).

Obtener plántulas in vitro de plátano Dominico Hartón (Musa AAB

Simmonds) desarrolladas caulinar y radicularmente.

5

II. REVISIÓN DE LITERATURA

2.1 Clasificación taxonómica

La clasificación del plátano Dominico Hartón es la siguiente, según

Stover & Simmonds, 1987:

Clase: Monocotiledónea (herbácea)

Orden: Escitaminales

Familia: Musaceae

Género: Musa

Especie: Musa AAB Simmonds

Los nombres específicos se han abandonado y actualmente todos son

denominados por el complemento de su genoma. Se considera que existen

tres grupos de clones principales: AAA, AAB, y ABB (A: genoma

acuminata; B: genoma de balbisiana). Incluyendo mutantes somáticos se

encuentran cerca de 500 clones reconocidos, incluyendo también AA, AB,

AABB, AAAB (Faure et al., 1993; citados por Sánchez, 2002).

2.1.1 Morfología del plátano

El plátano es una planta anual, consta de cormo subterráneo (tallo) en el

cual nacen las raíces y los pecíolos de las hojas (pseudotallo); en la parte

superior del cormo está ubicado el meristemo principal el cual produce el

racimo. Cuando el racimo emerge viene protegido por hojas modificadas

llamadas brácteas generalmente de color rojo, y que al desprenderse van

descubriendo los grupos florales tanto masculinos como femeninos,

6

formándose a partir de estas últimas los frutos partenocarpicos y la bellota

(Vergara, 2010).

El desarrollo o llenado de los frutos está condicionado por la

acumulación de pulpa en las paredes internas de la cáscara, el tiempo de

formación del fruto desde la floración hasta la cosecha, fluctúa entre 14 y

18 semanas, punto en el cual el fruto no presenta aumento en peso fresco,

este periodo es afectado por condiciones ambientales que pueden alargarlos

o acortarlos; en la variedad Dominico Hartón el racimo tiene de seis a ocho

gajos pero en edad temprana se reduce a cinco gajos, cortando lo que

llaman la mano falsa para tener entre 25 y 35 frutos de gran tamaño.

Algunos cultivos no producen semilla pero se propagan vegetativamente

por medio de rizomas (Vergara, 2010).

2.1.2 Características del cormo o rizoma del plátano

Se considera que el cormo es el tallo verdadero de la planta, el cual es

subterráneo, con ramificaciones monopódicas de donde se originan las

hojas que parten del meristemo apical o punto vegetativo que se encuentra

en la parte superior del rizoma.

El tallo está formado por muchos entrenudos cortos, cubiertos

externamente por la base de las hojas y de los nudos brotan las raíces

adventicias. Un cormo bien desarrollado puede tener de 25 a 40 cm de

diámetro y pesar de 6,9 a 11,5 kg de acuerdo con el clon y la edad de la

planta.

7

Durante la emisión de hojas se producen los hijos que son yemas

laterales que salen del cormo original, opuestas a cada hoja en un ángulo de

180 grados de la posición original.

Las yemas vigorosas que forman nuevos retoños ocupan toda la longitud

del entrenudo y distorsionan el nudo inicialmente circular a causa de su

crecimiento (Mejía et al., 2000).

2.2 Cultivo in vitro

El cultivo de tejidos vegetales es una técnica que consiste en emplear

una porción de planta denominada explante, y brindarle todas las

condiciones ambientales para que pueda expresar su “potencial intrínseco o

inducido” (Roca & Mroginski, 1991; citados por Jadán et al., 2010).

Esta técnica es conocida como propagación in vitro porque se lleva a

cabo en frascos o recipientes transparentes, se desarrolla en condiciones

estériles empleando una dieta balanceada de nutrientes y hormonas,

contenida en un medio de cultivo que busca la regeneración de órganos,

tejidos e incluso plantas enteras (Abdelnour & Escalant, 1994; citados por

Jadán et al., 2010).

Esta técnica constituye una herramienta de propagación vegetativa, y al

igual que en otros casos, la descendencia presenta las mismas características

que la planta madre, es decir, son clones de la planta que la originaron,

hecho que no ocurre por la vía sexual donde se originan individuos únicos

(Abdelnour & Escalant, 1994; citados por Jadán et al., 2010).

8

El éxito de esta técnica radica en la capacidad de desdiferenciar a las

células del explante y devolverles su capacidad de multiplicarse y

especializarse en cualquier tipo de tejido (Cubero, 2003; citado por Jadán et

al. 2010).

El cultivo in vitro de tejidos vegetales presenta una serie de ventajas,

frente a los métodos de propagación convencionales; entre éstas se pueden

incluir: obtención de miles de plantas a partir de una planta madre;

reducción del tiempo necesario para la multiplicación de una planta;

reducción de las áreas físicas empleadas para la multiplicación, así como la

reducción de costos; estricto control sobre las condiciones de sanidad del

material multiplicado; facilidades en el transporte de material vegetal

incluso de un país a otro, pues las restricciones aduaneras son mucho

menores y la posibilidad de reproducir especies de las cuales existan pocos

individuos (Roca & Mroginski, 1991; citados por Jadán et al. 2010).

2.2.1 Etapas del cultivo in vitro

La micropropagación comprende una serie de eventos que pueden

agruparse en cinco etapas claramente definidas (Anexo 1): la etapa cero en

la que se selecciona el material vegetal con el que se va a trabajar; la etapa

uno o de establecimiento, en la cual se establece un cultivo primario; la

etapa dos o de multiplicación, en la que se busca obtener la mayor cantidad

de plántulas; la etapa tres o de enraizamiento, donde se busca volver a la

planta autotrófica y capaz de sobrevivir en condiciones de campo; y, la

etapa cuatro o de transferencia final al campo (Roca & Mroginski, 1991;

citados por Jadán et al. 2010).

9

2.2.1.1 Etapa cero: selección del material vegetal

Uno de los factores determinantes en el éxito del cultivo in vitro de una

especie es el origen del explante a utilizarse, éste puede variar de acuerdo al

objetivo de la técnica de cultivo in vitro a utilizarse.

Existen factores que deben ser tomados en cuenta como son: el origen de

la planta madre y las condiciones en las que se desarrolló, pues, plantas de

campo pueden ofrecer mayores inconvenientes que plantas de invernadero;

la edad de la planta madre, porque no hay que olvidar que el material

vegetal obtenido tendrá la misma edad biológica que la planta madre y por

último, el estado fisiológico de la planta madre pues ésta debe encontrarse

en buenas condiciones nutritivas, metabólicas y de sanidad para proveer

material vegetal de óptimas características (Abdelnour & Escalant, 1994;

citados por Jadán et al. 2010 ).

Una vez que se haya determinado cuál es la mejor planta para iniciar el

cultivo, es necesario seleccionar el explante a usarse, lo cual depende de: el

tipo de cultivo a iniciarse, el propósito del cultivo y la especie vegetal con

la cual se trabajará (George et al., 2008; citados por Jadán et al. 2010).

2.2.1.1.1 Fase de desinfección

Uno de los principales factores que contribuyen al establecimiento de

cultivos asépticos es la desinfección exitosa de la superficie del explante a

emplearse, debido a que si sobre el explante persiste algún microorganismo,

ya sea hongo o bacteria, éstos destruirían el cultivo pues compiten con el

10

explante por los nutrientes del medio, siendo ellos más exitosos por sus

altas tasas de multiplicación y desarrollo acelerado (Roca & Mroginski,

1991; citados por Dávila, 2011).

En la actualidad existe una serie de agentes químicos que aportan a la

desinfección de un material vegetal, dentro de estos agentes se pueden

mencionar a: alcohol al 70 %; hipoclorito de sodio en concentraciones de

entre 1 % y 3 %, cuya principal fuente es el cloro comercial; otros

desinfectantes usados menos frecuentemente son el hipoclorito de calcio y

el cloruro de mercurio; cabe recalcar que este último es de naturaleza tóxica

y no se remueve fácilmente de la superficie del explante (Roca &

Mroginski, 1991; citados por Jadán et al. 2010).

En ocasiones es útil incluir en el protocolo de desinfección el empleo de

un tensoactivo como es el Monooleato de polioxietilensorbitan (Tween 20),

en concentraciones no mayores a 0,1 %, siempre y cuando se use antes de

aplicar alcohol (Roca & Mroginski, 1991; citados por Jadán et al. 2010).

La función del tensoactivo o detergente es romper la tensión superficial

y permitir que los agentes químicos estén en mejor contacto con el explante

(Abdelnour & Escalant, 1994; citados por Jadán et al. 2010).

Mientras se realiza la desinfección debe buscarse eliminar la totalidad de

microorganismos, sin afectar la integridad del explante y su viabilidad. No

es posible establecer un mismo protocolo de desinfección para cualquier

explante de cualquier especie, éste debe ser diseñado en función de varios

factores (Roca & Mroginski, 1991; citados por Jadán et al. 2010).

11

2.2.1.1.2 Medio de cultivo

Una vez que se ha determinado el objetivo de cultivo in vitro es

necesario seleccionar un medio de cultivo que contenga todos los nutrientes

necesarios para obtener la respuesta deseada; además de los componentes

del medio de cultivo es muy importante la forma en la que éste se prepara

(Roca & Mroginski, 1991; citados por Jadán et al. 2010).

Es necesario tener en cuenta que el material vegetal sólo va a crecer en

un medio que le suministre todos los nutrientes necesarios, generalmente un

medio de cultivo contiene una solución de sales que aportan con macro y

micronutrientes esenciales, acompañados por vitaminas, reguladores de

crecimiento, aminoácidos y una fuente de carbono (George et al., 2008;


Para un crecimiento adecuado, el medio de cultivo debe contener altas

cantidades de elementos como: nitrógeno (N), potasio (K), calcio (Ca),

fósforo (P), magnesio (Mg) y azufre (S); estos son los denominados

macronutrientes. Adicionalmente, se requiere de pequeñas cantidades de

elementos como: hierro (Fe), níquel (Ni), cloro (Cl), manganeso (Mn), zinc

(Zn), boro (B), cobre (Cu) y molibdeno (Mo); estos son conocidos como

microelementos o elementos traza. Estos elementos junto al carbono (C),

oxígeno (O) e hidrógeno (H) se conocen como esenciales (George et al.,

2008; citados por Jadán et al. 2010).

El medio de cultivo también es fuente de sustancias orgánicas en forma

de carbohidratos que reemplaza al carbono que las plantas toman del

12

ambiente como materia prima para iniciar la fotosíntesis (George et al.,

2008; citados por Jadán et al. 2010).

La fuente de carbono es muy importante porque escasos cultivos son

autótrofos en condiciones in vitro, es por ello que el medio de cultivo debe

incluir una fuente de carbono como la sacarosa o cualquier otro azúcar


Las vitaminas son un elemento más del medio de cultivo, entre las que

se encuentran la tiamina o vitamina B1, el ácido nicotínico o niacina y la

piridoxina o vitamina B6; éstas, junto al mioinositol, son consideradas

esenciales en muchos casos; sin embargo, no todas las vitaminas pueden ser

consideradas totalmente esenciales o inútiles, su ausencia o presencia en el

medio y sus concentraciones dependen de la especie vegetal y el tipo de

cultivo que se esté desarrollando (George et al., 2008; citados por Jadán et

al. 2010).

En lo que se refiere al agente gelificante, la cantidad del mismo está en

función de la clase de medio de cultivo que se desee preparar, usándose

concentraciones desde 0,6 % hasta 1 % (Roca & Mroginski, 1991; citados

por Jadán et al. 2010).

Entre los reguladores de crecimiento más comúnmente usados están las

auxinas: ácido dicloro fenoxiacético (2,4-D), ácido naftalenacético (ANA),

ácido indolacético (AIA), ácido indolbutírico (AIB); las citoquininas:

kinetina (KIN), benzilamino purina (BAP), zeatina (ZEA); y las giberelinas

como el ácido giberélico (AG3). Éstas pueden usarse por separado o juntas,

13

guardando un balance de acuerdo a lo que se pretenda obtener del cultivo


Existen además otros componentes que pueden o no incluirse en el

medio de cultivo, entre ellos se encuentran: el agua de coco, extracto de

levadura, extracto de tubérculos de papá, glicina o cisteína como fuentes de

nitrógeno, así como otros aminoácidos (Roca & Mroginski, 1991; citados


2.2.1.2 Etapa uno: fase de establecimiento

Una vez que se cuenta con el material vegetal desinfectado y los medios

de cultivo preparados y estériles se da inicio a la etapa de establecimiento,

en la cual el explante es introducido en el medio de cultivo bajo condiciones

de asepsia total, generalmente, en cámaras de flujo laminar que reduzcan al

mínimo las posibilidades de contaminación del explante o del medio de

cultivo. Luego de esta operación los frascos que contienen a los explantes

son llevados a la sala de incubación donde permanecerán hasta presentar

algún cambio, necrosis o contaminación (Roca & Mroginski, 1991; citados


2.2.1.3 Etapa dos: fase de multiplicación

Si la fase de introducción fue superada con éxito y el explante responde

adecuadamente a los componentes del medio de cultivo y a las condiciones

de incubación, es posible observar la formación de tejido nuevo en el

explante; este tejido puede ser fragmentado y trasladado a nuevos medios

14

de cultivos en el cual podrá seguir desarrollándose, dando lugar a la

formación de tejido indiferenciado o formación de brotes.

En cualquiera de los dos casos el tejido nuevo permite reproducir el

explante inicial dando lugar a la multiplicación que alcanza niveles

exponenciales.

De modo general, se emplean medios de cultivo diferentes en las fases

de introducción y multiplicación de cualquier especie, con el fin de

conseguir una organización celular adecuada (Cubero, 2003; citado por

Jadán et al. 2010).

2.2.1.4 Etapa tres: fase de enraizamiento

Luego de la etapa de multiplicación es necesario dar paso al proceso de

enraizamiento en los brotes propagados in vitro, lo cual requiere, en la

mayoría de los casos, el traspaso a un medio de cultivo nuevo.

Existe una serie de modificaciones que puede tener dicho medio, con el

objetivo de inducir la emisión de un sistema radicular, entre las que se

encuentran: disminución de la concentración de sales, cambio en el balance

hormonal a favor de auxinas exógenas, eliminación de citoquininas

exógenas o disminución de la fuente de carbono (Roca & Mroginski, 1991;


15

2.2.1.5 Etapa cuatro: aclimatación de las plántulas enraizadas

Una vez que las plántulas tengan un adecuado sistema radicular, estas

son trasladas a invernadero donde tienen que hacer frente a una serie de

factores adversos para los cuales no están preparadas fisiológicamente.

Las plántulas han crecido y desarrollado en ambientes con humedades

relativas muy altas por lo que sus estomas no son funcionales de modo

parcial o completamente; adicionalmente, las plántulas no cuentan con

cutícula que es una capa cerosa que impide la pérdida de agua y la

desecación de las plántula (Castillo, 2004; citado por Jadán et al. 2010).

2.2.2 Experiencia de cultivos in vitro en musáceas

La micropropagación ha sido usada para reproducir en forma masiva el

banano y plátano. La propagación clonal rápida fue la principal aplicación

de la técnica del cultivo de tejidos vegetales en Musa; otras aplicaciones

importantes han sido la erradicación de enfermedades y la conservación e

intercambio de germoplasma (Robles & Mora, 1996; citados por López,

2010).

En Musa, la escasez de plántulas para el establecimiento de nuevas

plantaciones y la utilización de propágulos infectados con virus y en

especial por nemátodos, representan una seria desventaja.

Mediante el cultivo de tejidos en Musa es posible transferir al campo

material sano, disponer del material de siembra en cualquier época del año,

16

multiplicar aceleradamente genotipos deseables, transportar fácilmente los

propágulos y uniformizar las plantaciones y cosecha (Robles & Mora, 1993;

citados por López, 2010).

Los primeros reportes de plantas del género Musa producidas por cultivo

in vitro, vinieron de Taiwán y China a principio de los años 70´s (Robles &

Mora, 1993; citado por López, 2010). A partir de 1980, un amplio rango de

especies y cultivares de Musa han sido propagadas con éxito mediante el

cultivo in vitro de ápices (López, 2010).

En musáceas, la micropropagación ha sido obtenida por diferentes vías,

mediante el cultivo de embriones cigóticos (Cronauer & Krikorian, 1988;

Escalant & Teisson, 1988); tejido foliar y rizoma (Novak et al., 1989);

meristemos altamente proliferantes o escalpos (Dhed’a et al., 1991) y a

partir de flores masculinas (Ma, 1991) y femeninas (Grapin et al., 1998).

Estas dos últimas técnicas han sido las más exitosas, lo cual ha

permitido el establecimiento de suspensiones celulares embriogénicas

(SCE), la regeneración, germinación de embriones, el desarrollo de plantas

y su evaluación en campo.

2.2.3 Principales problemas en el cultivo in vitro

Cada uno de los pasos necesarios en el proceso de cultivo in vitro tiene

sus problemas específicos, aunque algunos de ellos se pueden implicar en

dos o más etapas (Debergh & Read, 1991). Los principales problemas son:

la contaminación de los explantes y la oxidación fenólica (Alonso, 2002).

17

2.2.3.1 Contaminación

Las contaminaciones pueden causar pérdidas económicas muy

importantes dentro de la técnica de cultivo in vitro. La contaminación, más

que matar a los explantes directamente, invade el cultivo haciendo que el

explante no sea apto para su micropropagación (Debergh & Read, 1991;

citados por Recalde, 2007).

La mayor parte de los contaminantes en el cultivo de tejidos proceden de

la planta donadora. Al establecer los cultivos y dependiendo del explante

que se utilice, se pueden transmitir microorganismos de la superficie del

explante o de su interior.

Con el cultivo de meristemos se pueden eliminar la mayoría de los

organismos; sin embargo, en el caso de hojas, peciolos y tallos casi todos

los microorganismos en el tejido pueden transmitirse (Bhojawani &

Razdab, 1996; citados por Recalde, 2007). Por lo tanto, es conveniente

analizar las plantas madres de las cuales proceden los explantes en

búsqueda de individuos limpios.

Los principales microorganismos asociados a las superficies de las

plantas son: hongos, levaduras, bacterias y molicutes (fitoplasmas,

espiroplasmas y organismos relacionados). Muchos de estos

microorganismos se pueden eliminar mediante esterilizaciones

superficiales. Los microorganismos endófitos que se pueden desarrollar en

las plantas pueden ser: virus, viroides, bacterias, micoplasmas y hongos, y

18

pueden afectar de forma inter o intracelular (Toro, 2004; citado por

Recalde, 2007).

Las plantas contaminadas pueden tratarse mediante termoterapia y/o

cultivo de meristemos, o también aplicando productos antifúngicos,

antibióticos y antivíricos a las plantas durante la desinfección del material

vegetal, aunque en ocasiones estos compuestos químicos pueden tener

efectos bioestáticos más que biocidas (Trujillo, 2004; citado por Recalde,

2007).

2.2.3.2 Oxidación fenólica

La producción de compuestos fenólicos se estimula cuando las plantas se

exponen a situaciones de estrés como pueden ser los daños mecánicos que

se producen al aislar los explantes de la planta madre (Debergh & Read,

1991; citados por Recalde, 2007).

Las superficies de corte de muchos explantes comienzan a decolorarse

justo después de cortarlas. Los explantes completos o partes de ellos

frecuentemente continúan oscureciéndose cuando se introducen en el

recipiente de cultivo y exudan sustancias que producen a su vez el

oscurecimiento del medio (George, 1996; citado por Recalde, 2007).

2.3 Quitosano

El quitosano es un compuesto biodegradable y no tóxico. Es un polímero

policatiónico que contiene más de 5.000 unidades de glucosamina; es un

19

compuesto derivado de la quitina en forma parcialmente desacetilada 2-

amino2-deoxy-β-D-glucosa (Pastor de Abram, 2004; citado por García,

2010).

Sus cargas positivas le confieren numerosas propiedades fisiológicas y

biológicas, con un gran potencial y amplio intervalo de uso en la industria

farmacológica, médica y agrícola (Liu et al., 2004; Bautista et al., 2005;

citados por García, 2010).

Este compuesto posee propiedades antifúngicas, ya que en previos

estudios in vitro se observó que inhibió el crecimiento micelial,

esporulación y germinación de varios hongos.

Otros estudios también reportaron que el quitosano no sólo afectó el

crecimiento y desarrollo del patógeno, sino que también indujo cambios

morfológicos, alteraciones estructurales y desorganización molecular de las

células de algunos hongos fitopatógenos e incluso bacterias (El-Ghaouth et

al., 1997; Ait-Barka et al., 2004; citados por García, 2010).

La interacción de quitosano-membrana genera afectaciones en la

integridad de membrana e inclusive se ha observado en bicapas de lípidos y

provoca la formación transitoria de agujeros por donde podrían liberarse

proteínas (Hong et al., 2006; citados por García, 2010).

20

2.3.1 Propiedades del quitosano (según Lárez, 2008)

2.3.1.1 Actividad bactericida

La carga positiva que se desarrolla en el quitosano en medio ácido (pH <

5), debido a la protonación del grupo amino presente en cada una de sus

unidades glucosamina, lo hace soluble en medio acuoso, diferenciándolo de

su polímero matriz quitina, y, según muchos autores, confiriéndole también

mayor actividad biocida (Papineau et al., 1991; Helander et al., 2001;

Devlieghere et al., 2004).

Los mecanismos de acción por los cuales el quitosano (con distintos

grados de acetilación), y por extensión sus derivados, ejercen dicha

actividad no han sido dilucidados completamente; sin embargo, hay algunos

mecanismos propuestos para explicar acciones específicas, como por

ejemplo:

La interacción electrostática entre el quitosano cargado positivamente

(polielectrolito catiónico) y algunas bacterias con membranas

celulares cargadas negativamente (Gram negativas como la

Echerichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus

typhimurium, etc.) altera significativamente las propiedades de

barrera de la membrana exterior del microorganismo (Helander et al.,

2001).

Algunos autores han propuesto que la formación del complejo

polielectrolito bloquea físicamente la membrana celular externa del

microorganismo, impidiendo el flujo normal de

21

nutrimentos/desechos, provocando la muerte bacteriana (Chung et

al., 2004).

La interacción electrostática entre los grupos NH3+ del policatión y

los grupos fosforilos (Fernández et al., 2003) de los fosfolípidos

presentes en la membrana celular de bacterias Gram negativas causa

daños en ésta, provocando la salida de material intracelular (Liu et

al., 2004).

En este sentido se han realizado estudios espectroscópicos de la

salida de dicho material, el cual absorbe en la región ultravioleta (270

nm).

Más recientemente, Chung & Chen (2008), han determinado que la

salida del material intracelular bacteriano se ve favorecida por grados

de acetilación más altos, tanto en bacterias Gram negativas (E. coli)

como en Gram positivas (Staphylococcus aureus).

Para algunas bacterias Gram positivas (como S. aureus y Bacillus

cereus) que carecen de cargas negativas en la membrana celular, el

quitosano ha mostrado actividad incluso mayor, en algunos casos,

que para bacterias Gram negativas.

En el caso de S. aureus recientemente se ha planteado la posibilidad

de que la membrana celular de estos microorganismos tenga poros lo

suficientemente grandes como para que el quitosano logre entrar al

interior de las células (Li et al., 2007) y alterar funciones vitales de

éstas.

Su interacción con el ADN, por ejemplo, podría inhibir la replicación

del ARNm y la síntesis de proteínas (Hadwiger et al., 1986;

22

Sudarshan et al., 1992) y su efecto quelante podría disminuir la

concentración de algunos metales necesarios en procesos enzimáticos

(Cuero et al., 1991).

Sin embargo, otros autores creen que la longitud de persistencia del

quitosano cargado positivamente es demasiado grande para poder

pasar al interior de las células (Chung et al., 2003).

La interacción selectiva del quitosano con trazas de metales pudiera

inhibir la producción de toxinas y el crecimiento microbiano

(Sudarshan et al., 1992). En este sentido se conoce bien que el

quitosano puede ejercer una acción quelante bien específica (Varma

et al., 2004).

2.3.1.2 Actividad fúngica

La actividad fungicida del quitosano se ha estudiado, tanto in vitro (El-

Ghaouth et al., 1992) como in vivo (Li & Yu, 2001; Yu et al., 2007). El

quitosano inhibe multitud de especies de hongos, exceptuando, o siendo

menos efectivo con aquellas que lo poseen en sus paredes celulares (Roller

& Covill, 1999; Allan & Hardwiger, 1979).

Los hongos que poseen quitosano como componente de sus paredes

celulares deberían ser menos sensibles a la aplicación de dosis razonables

de éste por dos razones: (a) la presencia natural de quitosano en las paredes

celulares no genera efectos adversos para el microorganismo, y, (b) las

interacciones electrostáticas del quitosano añadido (exógeno), cargado

positivamente, deberían verse menos favorecidas con paredes celulares que

23

poseen quitosano endógeno que cuando éstas poseen material con cargas

negativas.

Estos estudios han dejado claros los principales requerimientos que

deben satisfacerse para lograr una mayor efectividad fungicida del

biopolímero.

Los más importantes son:

Existe una alta correlación entre la concentración de quitosano

aplicada y la inhibición fúngica; por ello, para una buena efectividad,

se deberá encontrar la dosis adecuada en cada situación.

Existen evidencias de que la sensibilidad de los hongos patógenos

hacia el quitosano puede cambiar en los diferentes estadios de su

desarrollo.

Por ejemplo, en el trabajo de Liu et al. (2007), se reporta que el

quitosano es mejor inhibidor de la germinación de Penicillium

expansum que la de Botrytis cinerea, contrariamente a lo que se

observó en el crecimiento micelial de estas especies.

De manera similar, un estudio reciente ha mostrado que el quitosano

es más efectivo sobre los conidios que sobre las hifas de algunos

hongos fitopatógenos (Palma et al., 2008).

En general, estos resultados son similares a los reportados para otros

agentes fungicidas, como por ejemplo, el caso reportado por Everett

et al. (2005), quienes encontraron que la germinación de esporas de

Botryosphaeria parva fue menor con la aplicación del agente

24

fluazinam que la de Colletotridum gloeosporioiodes, pero ocurrió lo

contrario para la inhibición del crecimiento micelial.

2.3.1.3 Estimulador del crecimiento

En términos generales, la aplicación de quitosano ha mostrado efectos

positivos en el crecimiento de las plantas, tanto en la estimulación de la

germinación de semillas como en el crecimiento de partes de la planta como

raíces, retoños y hojas.

En algunos casos, se ha observado que la estimulación de la germinación

de semillas por tratamiento con quitosano ha logrado elevar el porcentaje de

germinación a los niveles requeridos para la certificación (Bhaskara et al.,

1999).

2.3.2 Proceso químico para la obtención de la quitina

La α-quitina se obtiene comercialmente del exoesqueleto de cangrejos y

camarones. El exoesqueleto tiene como componentes principales quitina,

carbonato de calcio y proteínas. También contiene pigmentos y grasa en

pequeñas cantidades. La quitina es muy estable a los ácidos y álcalis y no es

soluble en disolventes ordinarios.

Por lo tanto, se puede aislar como un producto que permanece después

de la descomposición con ácido y álcali de las otras sustancias presentes en

el exoesqueleto.

25

El exoesqueleto primero se limpia y trata con ácido para remover el

carbonato de calcio. Para la desmineralización generalmente se utiliza HCl,

HNO3, H2SO3, CH3COOH o HCOOH, pero el HCl es el preferido durante 1

a 48 horas, a temperaturas que varían de 0 a 100 °C. El HCl durante el

proceso también disminuye el peso molecular de la quitina.

El exoesqueleto descalcificado se corta en pequeños pedazos o se

pulveriza y se desproteiniza con tratamientos alcalinos. La solución alcalina

penetra en los intersticios de la matriz del caparazón para romper el enlace

entre las proteínas y la quitina.

Típicamente se trata con soluciones acuosas de NaOH durante 1 a 72

horas a temperaturas que varían de 65 a 100 °C. La quitina se obtiene como

un polvo blanquecino. El tratamiento alcalino, además, produce

desacetilación en la molécula de quitina. También se pueden utilizar

métodos complementarios al tratamiento ácido-base. Por ejemplo, la

degradación enzimática de las proteínas con proteasas en condiciones

suaves. Sin embargo, después del tratamiento permanece proteína residual

de entre 1 a 7 % y el tiempo de reacción es más largo comparado con el

método químico (Osuna, 2012).

26

III. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1 Ubicación del experimento

La presente investigación se llevó a cabo en el laboratorio de cultivos de

tejidos in vitro de la empresa AGROVITROPARIS, ubicada en:

Provincia: Guayas

Cantón: Daule

Dirección: Av. Piedrahita y Jaime Roldós, Mz. 434

Número telefónico: 042797639

3.2 Datos geográficos

La empresa está localizada al noreste del cantón, a una altitud de 15

m.s.n.m y en un terreno de topografía plana, con una Latitud Sur de 1º 51'

37,77" S (613866.52 UTM)1/

y una Longitud Occidental de 79º 58' 34,42"

W (9794326.09 UTM)1/

.

3.3 Datos climáticos

La temperatura media anual es de 28 oC, tiene una precipitación media

anual de 1.607,86 mm; con una humedad relativa anual de 76 %2/

y una

humedad relativa máxima del 84 %2/

(enero) y una mínima del 66 %

(diciembre)2/

.

1/Fuente: http://www.mundivideo.com/coordenadas_chrome.htm (2014)

2/Fuente: Instituto Nacional de Meteorología e Hidrología (INAMHI, 2013)

27

3.4 Duración del experimento

El inicio del ensayo se lo realizó en la tercera semana de enero del 2014

y culminó a inicios de junio del mismo año.

3.5 Materiales y equipos

3.5.1 Materiales de laboratorio

Cajas de petri

Hojas de bisturí

Autoclave

Agujas

Mechero

Medio de cultivo MS

Hidróxido de sodio

Agua destilada estéril

Alcohol al 75 %

Gradilla

Micropipeta

Agitador magnético

Tirillas de tornasol

Papel kraf

Papel de aluminio

Marcador permanente

Phytagel

Monooleato de polioxietilensorbitan (Tween 80)

28

Hipoclorito de sodio (Cloro)

Cloruro de mercurio

Sulfato de Cobre Pentahidratado (Phyton)

Frascos de cristal

3.5.2 Equipos

Cámara vertical

Estereoscopio

Balanza de precisión

Refrigeradora

Estanterías con lámparas fluorescentes

3.5.3 Material vegetal

Para este estudio se utilizó como material vegetal de inicio cormos (de

espada) de plátano Dominico Hartón (Musa AAB Simmonds), recolectado

en la Hcda. La Lorena, que se encuentra en el Rcto. Las Cañas, cantón

Lomas de Sargentillo (Guayas).

3.5.4 Material químico para la propagación o medio de cultivo

3.5.4.1 Macronutrientes MS

Como medio de cultivo se usó la fórmula de Murashige & Skoog (MS,

1962) para macronutrientes; el mismo que estaba constituido por los

siguientes reactivos químicamente puros, y son:

29

Cuadro 1. Composición de los macronutrientes.

Nombres: Fórmula química Concentración en mg/L

Nitrato de amonio NH4NO3 1.650,00

Nitrato de potasio KNO3 1.900,00

Cloruro de calcio CaCl2 . 2H2O 332,02

Sulfato de magnesio MgSO4 . 7H2O 80,70

Fosfato de potasio monobásico KH2PO4 170,00

3.5.4.2 Micronutrientes ms

Se usó la fórmula de Murashige & Skoog (ms, 1962). Estuvo constituido

por los siguientes reactivos químicamente puros:

Cuadro 2. Composición de los micronutrientes.


Yoduro de potasio KI 0,83

Ácido bórico H3BO3 6,20

Sulfato de manganeso MnSO4 . 4H2O 22,30

Sulfato de zinc ZnSO4 . 7H2O 8,60

Molibdato de sodio Na2MoO4 . 2H2O 0,25

Sulfato cúprico CuSO4 . 5H2O 0,025

Cloruro de cobalto CoCl2 . 6H2O 0,025

3.5.4.3 Quelatos de hierro MS

Se usó el de Murashige & Skoog (MS, 1962), estando constituido de los

siguientes elementos:

30

Cuadro 3. Composición de los quelatos.

Nombres: Fórmula química Concentración en g/L

Sulfato ferroso FeSO4 . 7H2O 5,57

Ácido etilendiamintetracético disodio Na2 . EDTA . 2H20 7,45

3.5.4.4 Vitaminas Morel

Fueron usadas según la fórmula de Morel (1950), y estuvieron

constituidas por las siguientes vitaminas:

Cuadro 4. Composición de las vitaminas.


Pantotenato de calcio (vitamina B5) C18H32CaN2O10 1,00

Mio-inositol (vitamina B8) C6H12O6 100,00

Ácido nicotínico (vitamina B3) C21H27N7O14P2 1,00

Piridoxina HCL (vitamina B6) C8H11NO3 1,00

Tiamina (vitamina B1) C12H17N4OS+ 1,00

Biotina (vitamina B7) C10H16N2O3S 0,01

3.5.4.5 Sacarosa

Como fuente de carbohidrato, se aplicó azúcar común en la siguiente

concentración:

Cuadro 5. Azúcar.

Nombre: Fórmula química Concentración en g/L

Sacarosa (azúcar) C12H22O11 30

31

3.5.4.6 Phytagel

Los explantes fueron colocados en el interior de la superficie de un gel

acuoso solidificado, éste le dio la dureza a los medios de cultivos.

Cuadro 6. Composición del Phytagel.

Nombre: Fórmula química Concentración en g/L

Phytagel C6H12O6 + sphingomonas elodea 2

3.5.5 Material experimental

Se probó el quitosano ya que éste teóricamente serviría para reducir la

contaminación de patógenos y ayudaría al desarrollo de los brotes y de las

plántulas.

3.6 Unidad de observación

Los frascos que, para el inicio fueron utilizados, poseían un volumen de

capacidad de 100 ml (4,5 cm de diámetro y 6 cm de altura), sellados con

una lámina de aluminio y envuelto en plástico transparente, donde se

dispensaron 20 ml de medio de cultivo y las dosis de quitosano a estudiar.

3.7 Consideraciones para la micropropagación in vitro

Para el éxito de esta técnica de propagación masiva se necesitaron ciertas

consideraciones que no pudieron ser alteradas u omitidas.

32

3.7.1 Esterilización de los explantes

Fue indispensable realizar una asepsia rigurosa utilizando el

desinfectante cloruro de mercurio (HgCl2), hipoclorito de sodio (cloro) y

monooleato de polioxietilensorbitan (tween 80).

3.7.2 Factores físicos

Los factores físicos que se tomaron en cuenta son: la temperatura, la cual

va en los intervalos de 20 a 25 ºC (se estableció la temperatura idónea de

acuerdo con la exigencia de los explantes); la luz, la cual fue requerida para

la fotosíntesis de los explantes verdes cultivados in vitro, además la

luminosidad fue indispensable para regular ciertos procesos morfológicos,

la misma que fluctuó en las intensidades normales contenidas en las

lámparas fluorescentes tubulares de 40 w, a base de neón.

3.7.3 Área estéril

Fue necesario trabajar con toda la limpieza posible y disponer de una

cámara aséptica, la cual debió ser limpiada con alcohol y ponerse a

funcionar una hora antes de su utilización. Además, se usó el tubo de luz

ultravioleta (UV) para que funcione fuera de las horas de servicio, ya que

éste ayudó a controlar la asepsia del área. Esta cámara aséptica debió estar

equipada con mecheros de alcohol, que se utilizaron para flamear los

instrumentos colocados con alcohol (bisturí, cuchillas, pinzas y agujas),

recipientes estériles (cajas de Petri, frascos), papel de filtro y agua destilada.

33

Los medios de cultivo y agua destilada fueron estelarizados en la

autoclave a 15 lbs/in2 (103,4 Kpa) a 121

oC de temperatura durante 20

minutos.

3.8 Procedimientos realizados en el experimento

3.8.1 Etapa 0 (día 1)

Los cormos de plátanos fueron tomados de plantas madres de buen

aspecto agronómico, donde se seleccionaron 18 cormos; luego, se

eliminaron las raíces y los restos de tierra para que finalmente sean lavados

con abundante agua.

3.8.2 Etapa 1 (desde el día 1 hasta el día 27)

En el laboratorio las muestras fueron reducidas a un tamaño aproximado

de 5 cm. Para su desinfección éstas se sumergieron en solución de

hipoclorito de sodio al 20 % y una solución de agua destilada estéril al 80 %

durante 20 minutos.

Seguidamente se pasaron con otro enjuague de cloruro de mercurio (3

gotas/500 ml) dentro de la cámara y finalmente fueron lavados con

abundante agua estéril. Se realizaron más cortes longitudinales y

transversales, reduciendo su tamaño hasta llegar a 10 mm x 10 mm.

Posteriormente, se los sembró uno en cada frasco con medio de cultivo

Murashige & Skoog (MS), agregándoles cisteína y citocininas. En esta

34

etapa ya se les adicionaron las distintas dosis de los tratamientos de

quitosano a estudiar (ítem 3.9.1).

La formulación química que se colocó en cada frasco en esta etapa fue:

Macronutrientes (MS)

Micronutrientes (ms)

Quelatos de hierro (MS)

Vitaminas (Morel)

Sacarosa (azúcar)

Phytagel

pH (5,6)

Quitosano (5 dosis + testigo)

+

28 mg/L de cisteína

2 mg/L de BAP (citocinina – benziladenina)


En esta fase los brotes que se alargaron y ensancharon, además que se

encontraron libres de patógenos contaminados y sobrevivieron a la

oxidación, fueron repicados (divididos) cada 20 días, hasta llegar a la 5ta.

generación de explantes (una generación por cada repique). Esta etapa

difirió de la anterior ya que se le adicionó auxinas y se aumentó la

concentración de citocininas para que ayudaran en la proliferación del

tejido. Las concentraciones químicas usadas fueron las siguientes:



35


Vitaminas (Morel)

Sacarosa (azúcar)

Phytagel

pH (5,6)


+

0,025 mg/L de ANA (auxina - ácido naftalenacético)

5 mg/L de BAP (citocinina - benziladenina)


En esta etapa se continuó el repique de brotes y se escogió al azar 10

muestras con cada uno de los tratamientos que sobrevivieron para evaluar

cada variable, las que determinaron la eficacia o no del quitosano en la

micropropagación del plátano, induciéndolos químicamente a producir

órganos (hojas, raíces). La formulación del medio fue:




Vitaminas (Morel)

Sacarosa (azúcar)

Phytagel

pH (5,6)


36

3.8.5 Factor de multiplicación

En todas las generaciones que fueron repicadas, el factor de

multiplicación fue dos, es decir, se intentó que de cada explante que pase a

la siguiente generación emitan dos brotes únicamente.

3.9 Factores en estudio

Se probaron cinco dosis de quitosano y un testigo que sirvió de

referencia.

3.9.1 Descripción de tratamientos

Se evaluaron las dosis de quitosano para determinar cuál de ellas fue la

más recomendable para evitar la contaminación en cada uno de los

tratamientos y si mejoró el desarrollo de los brotes y plántulas in vitro del

plátano Dominico Hartón (Musa AAB Simmonds).

Cada dosis estuvo dada para un litro de medio de cultivo

(macronutrientes, micronutrientes, quelatos de hierro, vitaminas, sacarosa,

gel y hormonas).

Cuadro 7. Descripción de los tratamientos.

Dosis evaluadas (g/L)

Quitosano T1: 2,5 T2: 5,0 T3: 10,0 T4: 15,0 T5: 20,0 T6: 0

37

3.10. Diseño experimental

Para el análisis estadístico se utilizó el Diseño Completamente al Azar,

con seis tratamientos y 10 réplicas de cada uno. En comparación de las

medias se aplicó la prueba de Tukey al 5 % de probabilidad y el cálculo de

coeficiente de variación se expresó en porcentajes.

3.10.1 Análisis de varianza

Cuadro 8. Análisis de varianza.

F. de V. GL

Tratamiento t – 1; (6 – 1) 5

Error (N – 1) – (t – 1); (59 – 5) 54

Total N – 1; (60 – 1) 59

3.11 Variables y métodos de evaluación

En las etapas 1 y 2

3.11.1 Número de explantes libres de contaminación

Las variables que se midieron dependieron de las etapas del cultivo, por

ejemplo, en las etapas 1 y 2 se calculó cada 20 días el porcentaje de

contaminación de los brotes con la siguiente fórmula:

38

Como contaminación se tomó en cuenta los explantes con síntomas de

hongos, bacterias, oxidación o levaduras.

3.11.2 Número de brotes regenerados por explantes

Se midió el número de brotes por explante dentro de la unidad

experimental (frasco), a los 111 días de iniciada la siembra.

En la etapa 3

3.11.3 Número de hojas por explantes

Se contó el número de hojas desarrolladas que presentó cada plántula en

cada unidad experimental, a los 140 días.

3.11.4 Número de raíces por explantes

Para la evaluación de esta variable se tomaron en cuenta las plántulas

que al menos formaron una raíz de 0,5 cm a los 140 días de iniciado el

cultivo in vitro en todos los tratamientos.

3.11.5 Longitud de la plántula

Se midió la altura de las plántulas en centímetros, desde la base hasta su

extremo apical, a los 140 días.

39

3.11.6 Porcentaje total de necrosis por oxidación

Del total de explantes que fueron contaminados, se contabilizó el

número de aquellos que hayan muerto exclusivamente por la necrosis

originada de la oxidación; esta variable se la medió al finalizar el ensayo, es

decir, a los 140 días, por medio de la siguiente fórmula:

40

IV. RESULTADOS EXPERIMENTALES

4.1 Porcentaje de contaminación en la etapa 1

Para el inicio del ensayo se tomaron tres domos de plátano para cada uno

de los seis tratamientos de quitosano (incluido el testigo), teniendo una

población de 18 domos. Se evaluó la contaminación hasta los 27 días de

haber sido sembrados, cuyos resultados son los siguientes:

Cuadro 10. Porcentaje de contaminación de los explantes hasta los 27 días

en la etapa 1 (L0), 2014.

Trat.

Número de

explantes en

cada

tratamiento

Contaminados

hasta los 27 días

(%)

Número de

explantes

contaminados

T1 3 33 1

T2 3 33 1

T3 3 0 0

T4 3 0 0

T5 3 0 0

T6 3 33 1

∑ = 18 ∑ = 3

Figura 1. Porcentaje de contaminación total en la etapa 1 (L0)

0

100

no contaminados contaminados

83

17

41

Figura 2. Porcentaje de contaminación por tratamientos en la etapa 1 (L0)

4.1.1 Número de explantes nuevos y porcentaje de contaminación en la

etapa 2

A partir del día 28 se empezó el repique de los explantes que quedaron

en la etapa anterior.

4.1.1.1 Primer repique o primera generación “L1” (día 28 al 48)

Cuadro 11. Número de explantes obtenidos en el repique (L1), porcentaje

de contaminación, 2014.

Trat. A* B* Contaminados hasta

los 48 días (%)

Número de explantes

contaminados

T1 2 4 50 2

T2 2 4 25 1

T3 3 5 20 1

T4 3 5 0 0

T5 3 6 17 1

T6 2 4 25 1

∑ = 15 ∑ = 28 ∑ = 6 A* = número de explantes de la etapa anterior.

B* = número de explantes que salieron con el repique.

0

20

40

T1 T2 T3 T4 T5 T6

33 33

0 0 0

33

42

Figura 3. Porcentaje de contaminación en la primera generación “L1”

Figura 4. Porcentaje de contaminación por tratamientos en la primera

generación “L1”

4.1.1.2 Segundo repique o segunda generación “L2” (día 49 al 69)




los 69 días (%)


contaminados

T1 2 4 25 1

T2 3 5 40 2

T3 4 8 25 2

T4 5 9 22 2

T5 5 10 20 2

T6 3 6 33 2



0

100


79

21

0

50

T1 T2 T3 T4 T5 T6

50

25 20

0

17 25

43

Figura 5. Porcentaje de contaminación en la segunda generación “L2”

Figura 6. Porcentaje de contaminación por tratamientos en la segunda


4.1.1.3 Tercer repique o tercera generación “L3” (día 70 al 90)




los 90 días (%)


contaminados

T1 3 6 17 1

T2 3 6 17 1

T3 6 11 27 3

T4 7 13 15 2

T5 8 16 13 2

T6 4 8 13 1



0

100


74

26

0

50

T1 T2 T3 T4 T5 T6

25 40

25 22 20

33

44

Figura 7. Porcentaje de contaminación en la tercera generación “L3”

Figura 8. Porcentaje de contaminación por tratamientos en la tercera


4.1.1.4 Cuarto repique o cuarta generación “L4” (día 91 al 111)




los 111 días (%)


contaminados

T1 5 10 0 0

T2 5 10 10 1

T3 8 16 13 2

T4 11 22 0 0

T5 14 27 7 2

T6 7 13 8 1



0

100


83

17

0

50

T1 T2 T3 T4 T5 T6

17 17 27

15 13 13

45

Figura 9. Porcentaje de contaminación en la cuarta generación “L4”

Figura 10. Porcentaje de contaminación por tratamientos en la cuarta


4.1.1.5 Quinto repique o quinta generación “L5” (día 112)

Cuadro 15. Número de explantes obtenidos en el repique (L5), 2014.

Trat. A* B*

T1 10 20

T2 9 18

T3 14 27

T4 22 43

T5 25 47

T6 12 25

∑ = 92 ∑ = 180 A* = número de explantes de la etapa anterior.


0

100


94

6

0

10

20

T1 T2 T3 T4 T5 T6

0

10 13

0

7 8

46

4.1.1.5.1 Porcentaje de contaminación en “L5” (día 112 al 140)

De los 180 explantes obtenidos en el último repique, se seleccionaron 10

de cada tratamiento (60 explantes en total), para medir las variables de:

número de hojas, número de raíces y longitud de la plántula.

Adicionalmente, se evaluó también la contaminación en esta etapa, dando

los siguientes resultados:

Cuadro 16. Porcentaje de contaminación en “L5”, 2014.

Trat. Número de

explantes

Contaminados

hasta los 140 días

(%)


contaminados

T1 10 0 0

T2 10 0 0

T3 10 0 0

T4 10 10 1

T5 10 0 0

T6 10 0 0

∑ = 60 ∑= 1

Figura 11. Porcentaje de contaminación en la quinta generación “L5”

0

100


98

2

47

Figura 12. Porcentaje de contaminación por tratamientos en la quinta


4.2 Número de brotes por explante en “L4”

Esta variable se la tomó a los 111 días de haber iniciado el experimento,

a 10 explantes de cada uno de los seis tratamientos tomados al azar ya que

había una población de 92 explantes en total. Mostrando los siguientes

datos:

Cuadro 17. Número de brotes en cada uno de los tratamientos, 2014.

T1 T2 T3 T4 T5 T6

R1 3 3 3 3 5 6

R2 3 3 3 3 4 6

R3 2 3 2 4 5 5

R4 3 3 3 3 3 4

R5 3 2 2 4 5 5

R6 3 3 3 3 5 4

R7 2 3 3 4 4 4

R8 3 2 2 3 4 3

R9 2 3 3 3 5 4

R10 3 3 3 2 3 5

∑ 27 28 27 32 43 46

X 2,7 2,8 2,7 3,2 4,3 4,6

0

5

10

T1 T2 T3 T4 T5 T6

0 0 0

10

0 0

48

Figura 13. Medias del número de brotes por tratamientos

Cuadro 18. Análisis de varianza del número de brotes.

F. de V. G.L. S.C. C.M. F. “C” F. “T”

5% (*) 1% (**)

Tratamiento 5 36,3 7,26 16,40** 2,39 3,38

Error 54 23,9 0,44

Total 59 60,18

C.V (%) = 20 X= 3,38

4.3 Número de hojas por explantes en “L5”

Esta variable se la evaluó a los 140 días de haber iniciado el

experimento, a los 10 explantes de cada uno de los seis tratamientos.

Cuadro 19. Número de hojas por explantes en cada uno de los tratamientos,

2014.

T1 T2 T3 T4 T5 T6

R1 3 3 3 3 3 3

R2 3 2 2 2 3 3

R3 2 3 2 3 4 2

R4 3 3 3 3 3 3

0

5

T1 T2 T3 T4 T5 T6

2,7 a 2,8 a 2,7 a 3,2 a

4,3 b 4,6 b

* Promedios con la misma letra no difieren estadísticamente entre sí (Tukey α 0,05)

49

R5 3 2 3 3 3 2

R6 2 2 3 0 3 3

R7 3 2 3 2 2 3

R8 3 3 2 3 2 3

R9 3 3 2 3 3 3

R10 3 4 3 3 3 2

∑ 28 27 26 25 29 27

X 2,8 2,7 2,6 2,5 2,9 2,7

Figura 14. Medias del número de hojas por tratamientos

Cuadro 20. Análisis de varianza del número de hojas.

F. de V. G.L. S.C. C.M. F. “C” F. “T”

5% (*) 1% (**)

Tratamiento 5 1,0 0,2 0,5NS

2,39 3,38

Error 54 21,6 0,4

Total 59 22,6

C.V (%) = 24 X= 2,68

2,2

2,4

2,6

2,8

3

T1 T2 T3 T4 T5 T6

2,8 2,7

2,6

2,5

2,9

2,6

50

4.4 Número de raíces por explante en “L5”

Esta variable se la tomó a los 140 días de haber iniciado el experimento

a 10 explantes de cada uno de los seis tratamientos tomados al azar,

teniéndose los siguientes datos:

Cuadro 21. Número de raíces en cada uno de los tratamientos, 2014.

T1 T2 T3 T4 T5 T6

R1 3 4 3 3 4 3

R2 4 3 3 3 3 5

R3 5 3 4 3 3 4

R4 2 3 4 4 4 3

R5 4 4 3 4 3 3

R6 3 3 3 0 4 4

R7 3 2 3 5 3 5

R8 3 5 5 5 5 3

R9 4 4 3 3 3 3

R10 4 2 3 2 3 3

∑ 35 33 34 32 35 36

X 3,5 3,3 3,4 3,2 3,5 3,6

Figura 15. Medias del número de raíces por tratamientos

3

3,5

4

T1 T2 T3 T4 T5 T6

3,5

3,3 3,4

3,2

3,5 3,6

51

Cuadro 22. Análisis de varianza del número de raíces.

F. de V. G.L. S.C. C.M. F. “C” F. “T”

5% (*) 1% (**)


2,39 3,38

Error 54 49,5 0,92

Total 59 50,58

C.V (%) = 28 X= 3,42

4.5 Longitud de la plántula en “L5”

Esta variable se la evaluó a los 140 días de haber iniciado el

experimento, a los 10 explantes de cada uno de los seis tratamientos.

Cuadro 23. Longitud de las plántulas en cada uno de los tratamientos,

2014.

T1 T2 T3 T4 T5 T6

R1 5,3 4,7 3,8 4,0 3,9 4,6

R2 4,8 4,4 4,2 3,8 5,2 5,1

R3 3,8 4,2 5,5 3,7 3,9 5,0

R4 4,9 5,2 3,9 5,2 4,7 5,3

R5 5,1 5,1 4,4 3,5 4,7 4,6

R6 3,6 3,7 4,6 0 4,8 5,0

R7 3,9 4,0 4,9 5,4 4,9 3,8

R8 4,1 3,6 5,2 5,3 5,4 4,3

R9 5,5 3,9 5,1 4,8 3,7 4,2

R10 5,0 3,5 4,9 3,6 4,7 5,1

∑ 46 42,3 46,5 39,3 45,9 47

X 4,6 4,2 4,65 3,9 4,6 4,7

52

Figura 16. Medias de la longitud de las plántulas por tratamientos

Cuadro 24. Análisis de varianza de la longitud de las plántulas.

F. de V. G.L. S.C. C.M. F. “C” F. “T”

5% (*) 1% (**)


2,39 3,38

Error 54 37,72 0,70

Total 59 42,35

C.V (%) = 19 X= 4,44

4.6 Porcentaje de necrosis por oxidación

Se contabilizaron 37 explantes muertos en total de las cinco

generaciones; de ellos nueve murieron por la oxidación espontánea, es

decir, no se comprobó la presencia de hongos o bacterias, teniendo el

siguiente porcentaje:

Figura 17. Porcentaje de necrosis por oxidación

0

5

T1 T2 T3 T4 T5 T6

4,6 4,2 4,65 3,9

4,6 4,7

0

100

Hongos/bacterias Oxidación

76

24

53

V. DISCUSIÓN

5.1 Contaminación

En cada una de las generaciones del cultivo in vitro se obtuvieron

distintos porcentaje de contaminación, como se lo muestra en la siguiente

figura:

Figura 18. Porcentaje de contaminación en cada generación

Dichos resultados discrepan notablemente con otros experimentos

realizados; como por ejemplo, los resultados de porcentaje de

contaminación señalados por Uzcátegui et al. (2010) quien reportó que la

presencia de agentes contaminantes resultó el 25 % para los explantes de

Musa AAB cv. Hartón, usando un protocolo de desinfección de una

solución de agua y jabón azul por 5 minutos, enjuagados con agua destilada

e inmediatamente introducidos en una solución de hipoclorito de sodio al

20 % durante 20 minutos.

Otros resultados conseguidos en plátano a nivel nacional son los

obtenidos en Musa balbisiana AAB (plátano var. Maqueño), realizados por

0

10

20

30

L0 L1 L2 L3 L4 L5

17 21

26

17

6 2 P

orc

enta

je

Generaciones de explantes

54

Canchignia et al. (2008) en la Universidad Técnica de Quevedo, quienes

mencionaron que para el establecimiento aséptico de yemas de plátano

Maqueño, con el tratamiento 30 % de cloro durante 10 minutos más 0,15 %

de bicloruro de mercurio por 7 minutos, el porcentaje de contaminación fue

de 54 %.

Florio et al. (2010) reportó que tuvo un 12 % de contaminación en

plátano cv. ‘Hartón Gigante’ (Musa AAB), usando el protocolo de

desinfección para los cormos con jabón iodado antiséptico (Iosep®) al 3 %

durante 10 min en agitación constante; solución de fungicida Benlate®

(4

g/L) con adherente Tween 20® (30 gotas por litro) durante 10 min; solución

de bactericida y fungicida Kasumín®

(4 ml/L) con Tween 20® (30 gotas por

litro) por 15 minutos e hipoclorito de sodio (5,25 i.a) al 10 % durante 20

minutos; después de cada paso mencionado se realizaron tres lavados

consecutivos con agua destilada. Esto se lo hizo en un medio líquido con

soporte puente Heller.

Si únicamente tomamos en cuenta el porcentaje de contaminación de la

primera etapa del experimento, es decir, cuando se establecieron los

explantes provenientes de los cormos de plátano hasta los 27 días que duró

la misma, tenemos que el porcentaje de 17 % (Figura 1), es inferior a los

reportados por Uzcátegui et al. (2010); con 25 % de explantes

contaminados, y a los de Canchignia et al. (2008) con 54 % de explantes

contaminados.

Sin embargo, este mismo porcentaje es alto si se lo compara al de Florio

et al. (2010) que reportó 12 % de contaminación y al de Canchignia &

55

Ramos (2004), que al trabajar con plátano Barraganete y aplicando 20 % de

cloro y 0,1 % de bicloruro de mercurio alcanzaron un 100 % de explantes

sanos.

Estos resultados (17 % de contaminación) superan a los de Orellana

(1994), quien trabajando con ápices caulinares de banano “Gran Enano” y

usando un protocolo de desinfección sólo con hipoclorito de sodio al 3 %,

obtuvo elevados porcentajes de contaminación de los explantes de hasta

30 %.

Igualmente, superan a los reportados por Van den Houwe et al. (2004),

quienes al aplicar un protocolo de desinfección basado en etanol al 70 % e

hipoclorito de sodio al 2 %, obtuvieron 20 y 30 % de contaminación

bacteriana en los ápices de 5 mm y 50 % en los de 10 mm en cultivares de

banano “Gran Enano” y “Pisang Palembang”, respectivamente.

Otro factor que pudo ser determinante en la contaminación es el tamaño

de los explantes que fueron sembrados en la primera etapa del

establecimiento del cultivo in vitro, para este caso de plátano Dominico

Hartón (Musa AAB Simmonds), ya que se realizó el corte de los cormos

hasta dejarlos de aproximadamente 10 mm x 10 mm, pero Pérez et al.

(2006) y Colmenares & Giménez (2007) señalaron, que la longitud óptima

de los ápices caulinares para el cultivo in vitro de bananos (AAA) y

plátanos (AAB) debe encontrarse en un rango de 3 a 5 mm y cultivados en

medios sólidos, principalmente para evitar el incremento de la

contaminación por organismos patógenos.

56

Es decir, el tamaño de los explantes pudo influir en una mayor

contaminación de los mismos. Otras investigaciones han señalado la

influencia del tamaño del explante inicial en la incidencia de contaminación

y se ha comprobado en experimentos que en la medida que el tejido es más

pequeño y más cercano al meristema apical, las poblaciones de

microorganismos, disminuyen (García et al., 2002).

La contaminación de manera general se presentó en todas las

generaciones (L), principalmente en la segunda generación (L2) con un

26 % de todos sus explantes contaminados como lo demuestra la Figura 18,

los mismos que fueron desechados.

Esto quizás se debió a la época lluviosa en la que se realizó el

experimento, ya que esto habría provocado la proliferación de agentes

contaminantes (especialmente hongos) en el ambiente, los cuales llegaron

hasta el área de transferencia o lugar de siembra aséptica de los explantes.

Realizando un análisis individual de los tratamientos en la primera etapa

del cultivo, antes del primer repique, hay una tendencia clara que los

tratamientos T1, T2 y T6 (los que menos dosis de quitosano tuvieron

2,5g/L; 5,0g/L; 0g/L, respectivamente) son los únicos que presentaron

contaminación ya sea fúngica o bacterial (Cuadro 10, Figura 2).

Además, en la primera generación (L1) se reafirma esta tendencia ya que

el tratamiento uno (T1) presenta una contaminación del 50 % de sus

explantes (Cuadro 11, Figura 4). Posteriormente, en la segunda generación

(L2) los tratamientos T4 y T5 con más dosis de quitosano (15,0g/L y

57

20,0g/L) son los que menos porcentajes de contaminación presentaron, 22

% y 20 % respectivamente.

En la tercera generación de explantes (L3), los tratamientos T4, T5 y T6

fueron los que menos presencia de patógenos mostraron.

En la cuarta generación (L4), los tratamientos T1 y T4 no demostraron

ninguna apariencia de contaminación por hongos o baterías en ninguno de

sus explantes.

Figura 19. Porcentajes de contaminación en cada generación por

tratamiento.

Por último, en la quinta generación (L5) solamente el tratamiento cuatro

(T4) mostró un explante infectado por hongos, de sus diez repeticiones.

33

50

25

17

0 0

33

25

40

17

10

0 0

20

25 27

13

0 0

17 20

13

7

0

33

25

33

13

8

0 0

10

20

30

40

50

60

L0 L1 L2 L3 L4 L5

Po

rcen

taje

Generaciones

T1

T2

T3

T4

T5

T6

58

El promedio de los porcentajes determinó que el tratamiento cuatro (T4)

es el que menor porcentaje de contaminación presentó de manera general en

todas las generaciones.

Cuadro 25. Promedio de los porcentajes de contaminación en cada uno de

los tratamientos.

T1 T2 T3 T4 T5 T6

L0 33 33 0 0 0 33

L1 50 25 20 0 17 25

L2 25 40 25 22 20 33

L3 17 17 27 15 13 13

L4 0 10 13 0 7 8

L5 0 0 0 10 0 0

∑ 125 125 85 47 57 112

X 20,83 20,83 14,17 7,83 9,50 18,67

Figura 20. Promedio de los porcentajes de contaminación.

Según el Cuadro 25 y la Figura 19, el tratamiento cuatro (T4) tiene un

menor porcentaje de contaminación acumulada; es decir 15,0 g/L de

quitosano inhibieron la mayor cantidad de agentes contaminantes de los

explantes y medios de cultivos.

0,00%

5,00%

10,00%

15,00%

20,00%

25,00%

T1 T2 T3 T4 T5 T6

20,83% 20,83%

14,17%

7,83% 9,50%

18,67%

Po

rcen

taje

Tratamientos

59

Este resultado no concuerda con la literatura que indica que los

tratamientos in vitro con quitosano 2 y 3 %, es decir, 20 y 30 g/L, tienen

efectos fungicida (Bautista et al., 2003), pero en este ensayo el mejor

tratamiento (T4) es decir al 1,5 % tuvo un mejor desempeño y los resultados

más promisorios en cuanto a la reducción de contaminación en los cultivos

in vitro de plátano, incluso comparándolo con el tratamiento 5 (T5) al 2 %

de quitosano.

Aunque algunos tratamientos porcentualmente fueron mejor que otros,

esto no indica que se haya demostrado la efectividad del quitosano para la

reducción de patógenos en el cultivo in vitro de plátano, por dos obvias

razones: la primera es que los datos de contaminación fueron muy variables

en todas sus generaciones; es decir, no hubo una constancia en cuanto a la

no contaminación. La segunda, las dosis aplicadas en algunos tratamientos

no están ni cerca de las referidas por otros investigadores.

Esto nos lleva a dar sólo un análisis prematuro si lo que de verdad redujo

la contaminación fue el quitosano u otros aspectos aleatorios.

Ahora, tomando como hipótesis que el quitosano fue el responsable de la

significativa reducción de contaminación, ya que la actividad fungicida del

quitosano se ha asociado desde hace mucho a su carácter catiónico.

La interacción de los grupos amino libres, cargados positivamente en

medio ácido, con los residuos negativos de las macromoléculas expuestas

en la pared de los hongos, cambian la permeabilidad de la membrana

plasmática, con la consecuente alteración de sus principales funciones

60

(Benhamou, 1992). Otras posibles explicaciones de la actividad fungicida

del quitosano se relacionan con la inhibición de la síntesis de algunas

enzimas presentes en los hongos (El-Ghaouth et al., 1992) con ocurrencia

de alteraciones citológicas, como se ha reportado en el caso de B. cinerea,

donde se ha observado en el microscopio la aparición de vesículas y/o

células vacías carentes de citoplasma, después del tratamiento con

soluciones acuosas al 1,75 % de quitosano (Ait-Barka et al., 2004).

5.2 Brotes

En relación al número de brotes por explante, el promedio de todos los

tratamientos fue de 3,38 brotes/explante; sin embargo, el testigo (T6)

mostró un mejor desarrollo de los mismos con 4,6 brotes/explante.

Hay que recordar que se usó la cantidad de BAP más común para este

tipo de investigaciones, es decir de 5 mg/L.

Comparando los resultados con los obtenidos por Florio et al. (2010),

quien, usando la misma cantidad de BAP en un medio líquido sumergido

consiguió en promedio 8,93 brotes/explante; el mismo autor con la misma

concentración hormonal pero en un medio sólido obtuvo 1,56 brotes/

explante a los 45 días de cultivo en la etapa de multiplicación, en el plátano

‘Hartón Gigante’ (Musa AAB).

Hay que mencionar que en esta etapa se usó un medio sólido, es decir, el

valor que servirá de referencia de comparación es el obtenido por Florio et

al. (2010), de 1,56 brotes/explante; por lo tanto, se concluye que todos los

61

tratamientos tuvieron un mejor desempeño en cuanto al número de brotes,

en comparación con los resultados de dichos autores.

También hay que resaltar que se los evaluó a los 20 días después del

repique cuatro (L4) y no a los 45 como citan Florio et al. (2010).

El promedio general obtenido en este experimento de 3,38

brotes/explante difieren de los obtenidos por Arinaitwe et al. (2000),

quienes establecieron una tasa promedio de 10,2 brotes/explante en el

cultivar “Ndiziwemiti”; 9,5 en el cultivar “Kibuzi” y 8,2 en el cultivar

“Bwara”, con una dosis de 5 mg/L de BAP en medio líquido en constante

agitación. Se presume que la diferencia en estos resultados puede atribuirse

a las características propias de cada genotipo y el empleo de equipos

sofisticados.

Estos resultados se asemejan a los obtenidos por Uzcátegui et al. (2010),

quienes mencionaron que en el plátano (Musa AAB cv. Hartón) obtuvieron

en promedio 4 brotes/explante, usando la misma cantidad de citocinina

(5mg/L de BAP).

Comparado con los resultados a nivel nacional obtenidos por Canchignia

et al. (2008), 2,46 brotes/explante en plátano var. Maqueño (Musa

balbisiana), el resultado es porcentualmente superior al mismo.

El mejor resultado lo obtuvo el testigo (T6) sin ninguna dosis de

quitosano, lo que destaca el efecto positivo de las citocininas en promover

62

el crecimiento de los brotes de plátano, más que el del quitosano, siendo

mayor cuando se usa BAP en medio líquido.

Las respuestas se asemejan con lo reportado en bananos (AAA) y

plátanos (ABB), donde BAP fue la citocinina más efectiva en la inducción y

proliferación de los brotes (Arinaitwe et al., 2000; Jambhale et al., 2001;

Muhammad et al., 2006; Colmenares & Giménez, 2007).

5.3 Hojas

El promedio del número de hojas fue de 2,68 de manera global entre

todos los tratamientos, aunque el mejor desarrollo lo mostró el tratamiento

cinco (T5), con un promedio de 2,9 hojas; esto no demostró significancia

estadística con la prueba de Tukey al 5 % (Anexo 6 y 7), lo que comprueba

que entre las dosis dadas ninguna de ellas ayudó al desarrollo foliar de los

explantes.

Comparando los datos con los obtenidos por Florio et al. (2010), quien

obtuvo 5,03 hojas en un medio sólido, estos demostraron ser

estadísticamente inferiores.

Esto contradice a Bhaskara et al. (1999) quien sostiene que en términos

generales, la aplicación de quitosano ha mostrado efectos positivos en el

crecimiento de las plantas, tanto en la estimulación de la germinación de

semillas como en el crecimiento de partes de la planta como raíces, retoños

y hojas.

63

5.4 Raíces

El promedio del número de raíces de 3,42 raíces/explante (entre todos

los tratamientos) tampoco demostró significancia estadística (Anexos 8 y

9), determinándose que ninguna de las dosis indujo a la proliferación de

estas.

Sin embargo, este resultado fue mejor a otros reportados en esta

variable; por ejemplo, a los de Uzcátegui et al. (2010) donde se obtuvieron

tres raíces/explante de Musa AAB cv. Hartón.

El número de raíces se habría incrementado si se le hubiera aplicado al

medio auxinas, ya que según Bidwel (1990), el número de raíces en las

plantas se ve influenciado por las relaciones hormonales en la planta, más

específicamente por las auxinas.

Hay que señalar que el testigo fue el que mayor número de raíces

desarrolló, dándose un promedio de 3,6 raíces/explante.

5.5 Longitud de plántulas

El promedio general obtenido en todos los tratamientos, en la variable

longitud de plántulas fue de 4,44 cm. El testigo (T6) fue el que mejor

desarrollo tuvo con 4,7 cm de promedio en sus explantes, este promedio

discrepa con el obtenidos por Sandoval et al. (1991) donde se obtuvo un

promedio de 10,5 cm de altura por plántulas en plátano “Dominico” (Musa

AAB) y 9,1 cm en plátano “Currare” (Musa AAB), a los 45 días de cultivo.

64

Lo que confirma que el quitosano no ayudó en la elongación de las

plántulas.

5.6 Oxidación

Según la Figura 17, del 100 % de explantes muertos, el 24 % de estos

fue por necrosis causada por oxidación, el restante 76 % lo ocasionaron la

contaminación por hongos o bacterias.

La mortalidad se distribuyó de la siguiente manera:

En L1: 2 explantes con oxidación; 1 en T1 y 1 en T5.




Según los datos expuestos se deduce que, el quitosano no ayudó a evitar

la muerte por necrosis causada por la oxidación fenólica de los explantes,

sino que la pudo haber provocado el mismo producto, ya que el testigo (T6)

el cual no se le adicionó quitosano, en ninguna de sus etapas mostró muerte

de alguno de sus brotes por esta causa.

El porcentaje antes descrito (24 %) coincide con la investigación

realizada por Uzcátegui et al. (2010) quienes reportaron que los ápices de

Musa AAB cv. Hartón obtuvieron una respuesta fisiológica positiva al

establecimiento, con una oxidación fenólica en el grado de moderadamente

oxidado y un porcentaje de muerte por necrosis del 25 %.

65

Hay que señalar que desde el inicio del establecimiento del plátano, se

manifestó oxidación prudencial en la zona de reserva, el resto del explante

mantenía coloración verde con aumento de tamaño y masa vegetativa.

Esto ocurrió en la mayoría de los brotes, indiscriminadamente del

tratamiento que tuvieran, lo que concuerda con Cajacuri (2007), quien

indicó que el plátano Musa AAB cv. Hartón presentan oxidación entre

ligeramente oxidado y moderadamente oxidado para todas las etapas del

cultivo.

Al medio de cultivo de Murashige y Skoog (MS) se le pudo haber

añadido carbón activado para reducir el necrosamiento, ya que el mismo se

ha usado para superar problemas específicos de oxidación los cuales se

asocian con el cultivo de tejidos en musáceas (Roca & Mroginski, 1991).

66

VI. CONCLUSIONES

La dosis que mejor efecto tuvo para evitar la contaminación fue de 15

g/L de quitosano del tratamiento cuatro (T4).

El tratamiento cinco (T5) con 20 g/L del producto evaluado, también

mostró reducción de la contaminación en sus explantes.

Se confirmó con los tratamientos cuatro y cinco la propiedad

antimicótica y antibacteriana del quitosano in vitro.

El quitosano no mostró en ninguno de sus tratamientos que ayuda en

el aumento del número de brotes, ni en el mayor número de hojas, ni

en el desarrollo de las raíces, ni en el aumento en la longitud de las

plántulas; lo que descartaría la propiedad de ser un estimulador de

crecimiento en órganos vegetativos.

Las plántulas regeneradas, a través de este proceso de

micropropagación, se desarrollaron satisfactoriamente tanto caulinar

y radicularmente para continuar con su proceso agronómico de

aclimatación.

67

VII. RECOMENDACIONES

Realizar nuevos ensayos con quitosano y quitina, con otras dosis,

para evaluar si con estas se reduce la contaminación por patógenos y

la oxidación.

Realizar la micropropagación in vitro de plátanos en zonas con

temperaturas menores a los 28 ºC.

Micropropagar el plátano Dominico Hartón en medios líquidos y

sólidos, para verificar en cuál de ellos se logra un mejor desarrollo

caulinar y radicularmente en este cultivar.

Investigar con diferentes tamaños de ápices basales y florales del

plátano Dominico Hartón en condiciones asépticas.

68

VIII. RESUMEN

La presente investigación se realizó de enero a junio del 2014, en el

cantón Daule, Provincia del Guayas, en el laboratorio de cultivos de tejidos

in vitro de la empresa AGROVITROPARIS, que se encuentra ubicada entre

las coordenadas geográficas 1º 51' 37,77" (Latitud Sur), 79º 58' 34,42"

(Longitud Occidental) y a 15 m.s.n.m.

El estudio tuvo como objetivo la regeneración in vitro del plátano

“Dominico Hartón” (Musa AAB Simmonds), probando cinco dosis de

quitosano, ya que éste ayudaría en la reducción de contaminación por

hongos y bacterias; además promovería el desarrollo de los explantes en

cada una de las etapas de la micropropagación.

Se utilizaron los cormos (hijos espada) del plátano Dominico Hartón,

cuyas plantas madres presentaron buenas características agronómicas; éstos

se los colocó en frascos con nutrimentos necesarios para su desarrollo y las

dosis de quitosano a evaluar (2,5g/L; 5g/L; 10g/L; 15g/L; 20g/L; 0g/L).

Posteriormente, se los repicó para cinco generaciones (L). En la cuarta

generación (L4) se evaluó el número de brotes que se regeneraron por

explante y finalmente en el último repique (L5) se seleccionaron al azar 60

brotes (10 por tratamientos), para evaluar variables como: número de hojas,

número de raíces y longitud de las plántulas.

El tratamiento cuatro (T4) fue el que menor porcentaje de contaminación

presentó en la evaluación acumulada con 15g/L de quitosano; en cuanto al

69

desarrollo foliar, radicular y de elongación de las plántulas; ninguno de los

tratamientos mostró significancia estadística.

Se concluyó que el quitosano ayudó a disminuir la contaminación pero

no mejora el desarrollo de los explantes ni disminuye el necrosamiento de

los mismos.

70

IX. SUMARY

This research was conducted from January to June 2014 in the canton

Daule, Guayas Province, in laboratory tissue cultures in vitro

AGROVITROPARIS Company, which is located between the geographical

coordinates 1° 51' 37.77" (Latitude South), 79º 58' 34.42" (West Longitude)

and 15 m.a.s.l.

The study aims to in vitro regeneration of banana "Dominico Harton"

(Musa AAB Simmonds), testing five doses of chitosan, as this would help

in reducing contamination by fungi and bacteria; further promote the

development of the explants in each of the stages of micropropagation.

Corms (children sword) Banana Dominico Harton, plants whose mothers

had good agronomic characteristics were used; these are placed in jars with

the nutrients necessary for their development and evaluate chitosan dose

(2,5 g/L, 5 g/L, 10g/L, 15g/L, 20g/L; 0g/L).

Subsequently, the tolled for five generations (L). In the fourth generation

(L4) the number of shoots regenerated per explant and finally in the last

peal (L5) was assessed 60 randomly selected shoots (10 treatments) to

assess variables such as number of leaves, number of and root length of the

seedlings.

Treatment four (T4) was the lowest percentage of contamination

introduced into the accumulated evaluation with 15g/L of chitosan; as to the

71

leaf, root elongation and development of seedlings; Neither treatment

showed statistically significant.

It was concluded that chitosan helped reduce pollution but does not

improve the development of the explants and decreases necrosis thereof.

72

X. LITERATURA CITADA

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86

XI. ANEXOS

87

Anexo 1: Esquema de micropropagación mediante el uso de meristemos o

brotes apicales (Alonso 2002, modificado)

88

Av.

Pie

dra

hit

a

± 2

50

m.

± 4

50

m.

Vía

Dau

le –

Sta

. Lu

cía

Anexo 2: Croquis del lugar donde se realizó el experimento

Puente de Banife

Municipio de

Daule

Iglesia del Carmen

Paseo Shopping

Daule

CTE - Daule

LABORATORIO

AGROVITROPARIS Lavadora “Pelito”

Iglesia Evangélica

“Momento de Dios”

89

Anexo 3: Fases del experimento

Lab

ores

en

días

1 al

27

28 a

l 48

49 a

l 69

70 a

l 90

91 a

l 111

111

112

al 1

4014

0

Du

raci

ón e

n dí

as27

día

s20

día

s20

día

s20

día

s20

día

s1

día

28 d

ías

1 dí

a

Fec

ha d

e in

icio

y

fina

l

13 d

e en

ero

hast

a el

9 d

e

febr

ero

10 d

e

febr

ero

hast

a

el 2

de

mar

zo

3 de

mar

zo

hast

a el

23

de m

arzo

24 d

e m

arzo

hast

a el

13

de a

bril

14 d

e ab

ril

hast

a el

4 d

e

may

o

4 de

may

o

5 de

may

o

hast

a el

2 d

e

juni

o

2 de

juni

o

Gen

erac

ione

sL0

L1L2

L3L4

L4L5

L5

Eta

pas

Eta

pa 0

y

Eta

pa 1

Var

iabl

esN

úmer

o de

brot

es

Con

tam

inac

ión

y va

riab

les

con

ande

va

Var

iabl

es

con

ande

va

Eta

pa 2

Eta

pa 3

Con

tam

inac

ión

90

Anexo 4: Prueba de Tukey para número de brotes (comparación múltiple)

(I) Tratamientos (J)

Tratamientos

Diferencia de

medias (I-J) Error típico Sig.

Intervalo de confianza al 95 %

Límite inferior Límite superior

1,00

2,00 -,10000 ,29752 ,999 -,9790 ,7790

3,00 ,00000 ,29752 1,000 -,8790 ,8790

4,00 -,50000 ,29752 ,550 -1,3790 ,3790

5,00 -1,60000* ,29752 ,000 -2,4790 -,7210

6,00 -1,90000* ,29752 ,000 -2,7790 -1,0210

2,00

1,00 ,10000 ,29752 ,999 -,7790 ,9790

3,00 ,10000 ,29752 ,999 -,7790 ,9790

4,00 -,40000 ,29752 ,759 -1,2790 ,4790

5,00 -1,50000* ,29752 ,000 -2,3790 -,6210

6,00 -1,80000* ,29752 ,000 -2,6790 -,9210

3,00

1,00 ,00000 ,29752 1,000 -,8790 ,8790

2,00 -,10000 ,29752 ,999 -,9790 ,7790

4,00 -,50000 ,29752 ,550 -1,3790 ,3790

5,00 -1,60000* ,29752 ,000 -2,4790 -,7210

6,00 -1,90000* ,29752 ,000 -2,7790 -1,0210

4,00

1,00 ,50000 ,29752 ,550 -,3790 1,3790

2,00 ,40000 ,29752 ,759 -,4790 1,2790

3,00 ,50000 ,29752 ,550 -,3790 1,3790

5,00 -1,10000* ,29752 ,006 -1,9790 -,2210

6,00 -1,40000* ,29752 ,000 -2,2790 -,5210

5,00

1,00 1,60000* ,29752 ,000 ,7210 2,4790

2,00 1,50000* ,29752 ,000 ,6210 2,3790

3,00 1,60000* ,29752 ,000 ,7210 2,4790

4,00 1,10000* ,29752 ,006 ,2210 1,9790

6,00 -,30000 ,29752 ,913 -1,1790 ,5790

6,00

1,00 1,90000* ,29752 ,000 1,0210 2,7790

2,00 1,80000* ,29752 ,000 ,9210 2,6790

3,00 1,90000* ,29752 ,000 1,0210 2,7790

4,00 1,40000* ,29752 ,000 ,5210 2,2790

5,00 ,30000 ,29752 ,913 -,5790 1,1790

*. La diferencia de medias es significativa al nivel 0.05.

Realizado en: IBM SPSS Statistics 20

91

Anexo 5: Prueba de Tukey para número de brotes (subconjuntos

homogéneos)

Tratamientos N

Subconjunto para alfa =

0.05

a b

1,00 10 2,7000

3,00 10 2,7000

2,00 10 2,8000

4,00 10 3,2000

5,00 10 4,3000

6,00 10 4,6000

Sig. ,550 ,913

Se muestran las medias para los grupos en los subconjuntos

homogéneos.

a. Usa el tamaño muestral de la media armónica = 10,000.


92

Anexo 6: Prueba de Tukey para número de hojas (comparación múltiple)

(I) Tratamientos (J) Tratamientos Diferencia de




1,00

2,00 ,10000 ,28284 ,999 -,7357 ,9357

3,00 ,20000 ,28284 ,980 -,6357 1,0357

4,00 ,30000 ,28284 ,895 -,5357 1,1357

5,00 -,10000 ,28284 ,999 -,9357 ,7357

6,00 ,10000 ,28284 ,999 -,7357 ,9357

2,00

1,00 -,10000 ,28284 ,999 -,9357 ,7357

3,00 ,10000 ,28284 ,999 -,7357 ,9357

4,00 ,20000 ,28284 ,980 -,6357 1,0357

5,00 -,20000 ,28284 ,980 -1,0357 ,6357

6,00 ,00000 ,28284 1,000 -,8357 ,8357

3,00

1,00 -,20000 ,28284 ,980 -1,0357 ,6357

2,00 -,10000 ,28284 ,999 -,9357 ,7357

4,00 ,10000 ,28284 ,999 -,7357 ,9357

5,00 -,30000 ,28284 ,895 -1,1357 ,5357

6,00 -,10000 ,28284 ,999 -,9357 ,7357

4,00

1,00 -,30000 ,28284 ,895 -1,1357 ,5357

2,00 -,20000 ,28284 ,980 -1,0357 ,6357

3,00 -,10000 ,28284 ,999 -,9357 ,7357

5,00 -,40000 ,28284 ,718 -1,2357 ,4357

6,00 -,20000 ,28284 ,980 -1,0357 ,6357

5,00

1,00 ,10000 ,28284 ,999 -,7357 ,9357

2,00 ,20000 ,28284 ,980 -,6357 1,0357

3,00 ,30000 ,28284 ,895 -,5357 1,1357

4,00 ,40000 ,28284 ,718 -,4357 1,2357

6,00 ,20000 ,28284 ,980 -,6357 1,0357

6,00

1,00 -,10000 ,28284 ,999 -,9357 ,7357

2,00 ,00000 ,28284 1,000 -,8357 ,8357

3,00 ,10000 ,28284 ,999 -,7357 ,9357

4,00 ,20000 ,28284 ,980 -,6357 1,0357

5,00 -,20000 ,28284 ,980 -1,0357 ,6357


93

Anexo 7: Prueba de Tukey para número de hojas (subconjuntos

homogéneos)

Tratamientos N


0.05

a

4,00 10 2,5000

3,00 10 2,6000

2,00 10 2,7000

6,00 10 2,7000

1,00 10 2,8000

5,00 10 2,9000

Sig. ,718


homogéneos.



94

Anexo 8: Prueba de Tukey para número de raíces (comparación múltiple)





1,00

2,00 ,20000 ,42817 ,997 -1,0650 1,4650

3,00 ,10000 ,42817 1,000 -1,1650 1,3650

4,00 ,30000 ,42817 ,981 -,9650 1,5650

5,00 ,00000 ,42817 1,000 -1,2650 1,2650

6,00 -,10000 ,42817 1,000 -1,3650 1,1650

2,00

1,00 -,20000 ,42817 ,997 -1,4650 1,0650

3,00 -,10000 ,42817 1,000 -1,3650 1,1650

4,00 ,10000 ,42817 1,000 -1,1650 1,3650

5,00 -,20000 ,42817 ,997 -1,4650 1,0650

6,00 -,30000 ,42817 ,981 -1,5650 ,9650

3,00

1,00 -,10000 ,42817 1,000 -1,3650 1,1650

2,00 ,10000 ,42817 1,000 -1,1650 1,3650

4,00 ,20000 ,42817 ,997 -1,0650 1,4650

5,00 -,10000 ,42817 1,000 -1,3650 1,1650

6,00 -,20000 ,42817 ,997 -1,4650 1,0650

4,00

1,00 -,30000 ,42817 ,981 -1,5650 ,9650

2,00 -,10000 ,42817 1,000 -1,3650 1,1650

3,00 -,20000 ,42817 ,997 -1,4650 1,0650

5,00 -,30000 ,42817 ,981 -1,5650 ,9650

6,00 -,40000 ,42817 ,936 -1,6650 ,8650

5,00

1,00 ,00000 ,42817 1,000 -1,2650 1,2650

2,00 ,20000 ,42817 ,997 -1,0650 1,4650

3,00 ,10000 ,42817 1,000 -1,1650 1,3650

4,00 ,30000 ,42817 ,981 -,9650 1,5650

6,00 -,10000 ,42817 1,000 -1,3650 1,1650

6,00

1,00 ,10000 ,42817 1,000 -1,1650 1,3650

2,00 ,30000 ,42817 ,981 -,9650 1,5650

3,00 ,20000 ,42817 ,997 -1,0650 1,4650

4,00 ,40000 ,42817 ,936 -,8650 1,6650

5,00 ,10000 ,42817 1,000 -1,1650 1,3650


95

Anexo 9: Prueba de Tukey para número de raíces (subconjuntos

homogéneos)

Tratamientos N


0.05

a

4,00 10 3,2000

2,00 10 3,3000

3,00 10 3,4000

1,00 10 3,5000

5,00 10 3,5000

6,00 10 3,6000

Sig. ,936


homogéneos.



96

Anexo 10: Prueba de Tukey para longitud de plántulas (comparación

múltiple)





1,00

2,00 ,37000 ,37375 ,919 -,7342 1,4742

3,00 -,05000 ,37375 1,000 -1,1542 1,0542

4,00 ,67000 ,37375 ,479 -,4342 1,7742

5,00 ,01000 ,37375 1,000 -1,0942 1,1142

6,00 -,10000 ,37375 1,000 -1,2042 1,0042

2,00

1,00 -,37000 ,37375 ,919 -1,4742 ,7342

3,00 -,42000 ,37375 ,869 -1,5242 ,6842

4,00 ,30000 ,37375 ,966 -,8042 1,4042

5,00 -,36000 ,37375 ,927 -1,4642 ,7442

6,00 -,47000 ,37375 ,806 -1,5742 ,6342

3,00

1,00 ,05000 ,37375 1,000 -1,0542 1,1542

2,00 ,42000 ,37375 ,869 -,6842 1,5242

4,00 ,72000 ,37375 ,398 -,3842 1,8242

5,00 ,06000 ,37375 1,000 -1,0442 1,1642

6,00 -,05000 ,37375 1,000 -1,1542 1,0542

4,00

1,00 -,67000 ,37375 ,479 -1,7742 ,4342

2,00 -,30000 ,37375 ,966 -1,4042 ,8042

3,00 -,72000 ,37375 ,398 -1,8242 ,3842

5,00 -,66000 ,37375 ,496 -1,7642 ,4442

6,00 -,77000 ,37375 ,323 -1,8742 ,3342

5,00

1,00 -,01000 ,37375 1,000 -1,1142 1,0942

2,00 ,36000 ,37375 ,927 -,7442 1,4642

3,00 -,06000 ,37375 1,000 -1,1642 1,0442

4,00 ,66000 ,37375 ,496 -,4442 1,7642

6,00 -,11000 ,37375 1,000 -1,2142 ,9942

6,00

1,00 ,10000 ,37375 1,000 -1,0042 1,2042

2,00 ,47000 ,37375 ,806 -,6342 1,5742

3,00 ,05000 ,37375 1,000 -1,0542 1,1542

4,00 ,77000 ,37375 ,323 -,3342 1,8742

5,00 ,11000 ,37375 1,000 -,9942 1,2142


97

Anexo 11: Prueba de Tukey para longitud de plántulas (subconjuntos

homogéneos)

Tratamientos N


0.05

a

4,00 10 3,9300

2,00 10 4,2300

5,00 10 4,5900

1,00 10 4,6000

3,00 10 4,6500

6,00 10 4,7000

Sig. ,323


homogéneos.



98

XII. FIGURAS DE

ANEXOS

99

Figura 1A. Recolectando los cormos (hijuelos de espada) del plátano

Dominico Hartón (Musa AAB Simmonds). Lomas de Sargentillo,

2014.

Figura 2A. Cormos que servirán de explantes para la micropropagación.

Lomas de Sargentillo, 2014.

100

Figura 3A. Lavando los cormos provenientes del campo. Daule, 2014.

Figura 4A. Recudiendo el tamaño de los cormos. Daule, 2014.

101

Figura 5A. Cormos puestos en cada uno de los tratamientos de quitosano.

Daule, 2014.

Figura 6A. Quitosano empleado en el experimento. Daule, 2014.

102

Figura 7A. Cantidad de explantes después del primer repique o L1. Daule,

2014.

Figura 8A. Explantes después del segundo repique o L2. Daule, 2014.

103

Figura 9A. Medios de cultivos con las diferentes dosis de quitosano para el

tercer repique o L3. Daule, 2014.

Figura 10A. Desarrollo de los explantes en la tercera generación o L3.

Daule, 2014.

104

Figura 11A. En la cámara laminar, repicando los cormos. Daule, 2014.

Figura 12A. Repicando los cormos de L3. Daule, 2014.

105

Figura 13A. Terminando el repique de los explantes. Daule, 2014.

Figura 14A. Explante de plátano L4 contaminado por hongos 1. Daule,

2014.

106

Figura 15A. Explante de plátano L4 contaminado por hongos 2. Daule,

2014.

Figura 16A. Explantes desarrollándose. Daule, 2014.

107

Figura 17A. Toma del número de brotes que tiene el explante de plátano.

Daule, 2014.

108

Figura 18A. Junto al Ing. Eison Valdiviezo en el laboratorio

AGROVITROPARIS. Daule, 2014.

Figura 19A. Número de brotes que presentaron en la cuarta generación.

Daule, 2014.

109

Figura 20A. Explante con necrosis por bacterias en L4. Daule, 2014.

Figura 21A. Seis tratamientos y 10 repeticiones para la toma de las últimas

variables en la etapa 3 (L5). Daule, 2014.

110

Figura 22A. Desarrollo de las plántulas en la quinta generación o L5.

Daule, 2014.

Figura 23A. Plántulas desarrollándose en el día 133 del experimento.

Daule, 2014.

111

Figura 24A. Evaluación de las variables. Daule, 2014.

Figura 25A. Tomando datos de las diferentes variables. Daule, 2014.

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