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UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA
FACULTAD DE RECURSOS NATURALES RENOVABLES
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA AMBIENTAL
PRÁCTICA PRE PROFESIONAL
EVALUACIÓN DE CRECIMIENTO DE MICELIO DE HONGOS DE
PUDRICIÓN BLANCA CON CAPACIDAD PARA BIODEGRADAR EN
CONDICIONES DE LABORATORIO
Ejecutor : COLQUIER CORONADO, GRACE KAMLEE
Línea de investigación : RECURSOS GENETICOS
Asesor : Dr. LADISLAO RUIZ RENGIFO
Lugar de ejecución : LABORATORIO DE MICOLOGÍA Y TECNOLOGÍA
DE LA PROPAGACIÓN
Duración del trabajo : Agosto a octubre del 2017
Tingo María - Perú
2017
INDICE
I. INTRODUCCIÓN ....................................................................................... 1
II. REVISIÓN DE LITERATURA .................................................................... 3
2.1. Hongos ................................................................................................ 3
2.1.1.Generalidades de los hongos ..................................................... 4
2.1.2.Hongos de pudrición blanca ....................................................... 5
2.1.3.Hongos de pudrición blanca como biodegradadores ................. 6
2.1.4.Taxonomía de Pleurotus ostreatus y Pleurotus djamor .............. 7
2.2. Metales pesados ................................................................................. 8
2.2.1.Preocupación por los metales pesados ...................................... 8
2.3. Compuestos xenobióticos y su degradación por hongos
ligninoliticos ......................................................................................... 9
2.4. Mecanismos copartícipes en el proceso de biorremoción de
metales .............................................................................................. 10
2.4.1.Mecanismos físico químicos ..................................................... 10
2.4.2.Adsorción ................................................................................. 11
a) pH ................................................................................................. 12
b) Temperatura ................................................................................. 12
2.4.3.Mecanismos de resistencia ...................................................... 13
a) Mecanismos fisiológicos y genéticos ............................................ 13
b) Mecanismos enzimáticos ............................................................. 14
2.5. Aplicaciones de hongos ligninolíticos en la remoción de metales
pesados ............................................................................................. 15
2.7. Medios de cultivo ............................................................................... 18
2.7.1.Generalidades respecto a la composición de los medios de
cultivo ........................................................................................ 18
2.7.2.Condiciones físico-químicas de los medios de cultivo .............. 19
a) Temperatura ................................................................................. 19
b) Humedad ...................................................................................... 19
c) pH…………. ................................................................................. 19
d) Oxígeno ........................................................................................ 20
2.7.3.Principales tipos de medios de cultivo ...................................... 20
a) Medios sólidos .............................................................................. 20
b) Medios semisólidos ...................................................................... 21
c) Medios líquidos............................................................................. 21
2.7.4.Utilización de medios de cultivo sólidos para caracterización
de cepas de hongos comestibles ............................................. 21
2.7.5.Incubación ................................................................................ 23
III. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................... 24
3.1. Lugar de ejecución .......................................................................... 24
3.1.1.Condiciones climáticas ............................................................. 24
3.1.2.Zona de vida ............................................................................. 24
3.2. Materiales, equipos y herramientas .................................................... 25
3.2.1.Material biológico ....................................................................... 25
3.2.2.Materiales de laboratorio .......................................................... 25
3.2.3.Equipos .................................................................................... 25
3.2.4.Insumos .................................................................................... 25
3.3. Metodología ....................................................................................... 26
a) Acondicionamiento del área física del laboratorio ........................ 26
b) Esterilización de materiales de vidrio y accesorios....................... 26
c) Preparación del medio de cultivo.................................................. 26
Agar Papa Dextrosa .......................................................................... 26
Agar Extracto de Malta ...................................................................... 27
d) Plaqueado .................................................................................... 27
e) Siembra de la cepa en los medios de cultivo ............................... 28
3.4. Datos registrados .............................................................................. 29
3.4.1.Crecimiento radial del micelio ................................................... 29
3.4.2.Caracterización morfológica macroscópica de las colonias. .... 30
Tipo de crecimiento ................................................................................. 30
Textura .................................................................................................... 30
Color ........................................................................................................ 30
3.5. Procesamiento de resultados ............................................................ 31
IV. RESULTADOS ........................................................................................ 32
4.1. Determinar la velocidad de crecimiento de micelio de los hongos
de pudrición utilizando dos medios de cultivo. .................................. 32
4.2. Caracterizar las colonias de hongos de pudrición blanca
propagadas en dos tipos de medios de cultivo sólido ....................... 38
V. DISCUSIÓN ............................................................................................. 40
VI. CONCLUSIONES .................................................................................... 43
VII. RECOMENDACIONES ............................................................................ 44
XIII. REFERENCIA BIBLIOGRÁFICAS ............................................................ 45
INDICE DE CUADROS
Cuadro Página
1. Evaluación de las características morfológicas de colonias de los
hongos. .................................................................................................... 30
2. Velocidad de crecimiento radial de micelio y promedio cm/día de los
hongos de pudrición blanca en distintos medios. .................................. 323
3. Características morfológicas del micelio de los hongos aislados en
medios nutritivos. ..................................................................................... 39
INDICE DE FIGURAS
Figura
1. Acción de degradación de los hongos de pudrición blanca de lignina,
celulosa y hemicelulosa en la pared celular de la madera. ...................... 17
2. (A) Medio de cultivo industriales (B) Preparación de medio de cultivo. . 277
3. Plaqueado de medios de cultivo. .......................................................... 288
4. Medición radial de crecimiento de micelio del hongo en placas Petri
con medio de cultivo. ............................................................................... 29
5.Crecimiento diario de micelio (cm) de Pleurotus ostreatus
FTM-220.1 ............................................................................................. 344
6.Crecimiento diario de micelio (cm) de Pleurotus ostreatus FTM-220.2. . 344
7.Crecimiento diario de micelio (cm) de Pleurotus ostreatus FTM-220.3 .. 355
8.Crecimiento diario de micelio (cm) de Pleurotus djamor. ....................... 355
9.Crecimiento diario de micelio (cm) de Polyporus craterellus. ................. 366
10. A: Pleurotus ostreatus FTM-220.3 (C3); B: Pleurrotus ostreatus FTM-
220.2 (C2); C: Pleurotus ostreatus FTM-220.1 (C1); D: Pleurotuss
djamor, E: Polyporus craterellus. Fotos cortesía del Dr. Ladislao Ruiz. 377
11.Vista parcial del laboratorio de Micología y Tecnología de la
propagación. .......................................................................................... 461
12.Estufa esterilizando en seco materiales de vidrio y utensilios. .............. 461
13. Micelio en crecimiento de los hongos evaluados. ................................ 462
1
I. INTRODUCCIÓN
El interés del ciudadano por el medio ambiente, ha ido creciendo a
lo largo del último cuarto de siglo XX a medida que nos hemos dado cuenta de
que los recursos de la biósfera, ese gran ecosistema que nos acoge, son
limitados, por lo que una buena gestión de estos recursos es imprescindible
para garantizar la supervivencia del hombre en el planeta. El aumento de la
población, genera un mayor consumo de energía, alimentos, y materiales, lo
que conlleva un incremento de los residuos urbanos e industriales y por
añadidura de la contaminación medioambiental. La atenuación natural se
puede describir como el conjunto de procesos físicos, químicos y biológicos,
que espontáneamente ocurren en un espacio determinado, con posterioridad a
la aparición de la contaminación en el mismo (MORENO, 2004).
Sin embargo, en muchos casos, la atenuación natural no se
produce con la celeridad y eficacia suficientes para evitar los riesgos inherentes
que poseen estos contaminantes para la salud humana o el medio ambiente,
derivados de la existencia de un espacio contaminado y es por lo tanto
necesario realizar acciones de saneamiento o recuperación.
A partir de esto, es necesaria la implementación de tecnologías no
convenciales que ofrezcan accesibilidad y soluciones pragmáticas en los
procesos de remediación de cuerpos de agua y suelos contaminados.
2
Los hongos de Pudrición blanca, por medio de la secreción de
enzimas extracelulares, son capaces de degradar compuestos de estructura
tan compleja como la lignina. Estos hongos han sido estudiados a su vez para
la degradación de otros tipos de compuestos recalcitrantes que difícilmente
pueden ser degradados mediante otros tratamientos (LÓPEZ, 2005).
Este trabajo propone un seguimiento al crecimiento diario de 3
especies de hongos de pudrición blanca, Pleurotus ostreatus cepa 1, Pleurotus
ostreatus cepa 2, Pleurotus ostreatus cepa 3, Pleurotus djamor y Polyporus
craterellus, para conocer la optimización y eficiencia en tiempo, al mismo
tiempo revisar los antecedentes.
1.1. Objetivo general
- Evaluar el crecimiento de micelio de hongos de pudrición blanca con
capacidad para biodegradar metales pesados y xenobióticos, en
condiciones de laboratorio, tingo maría.
1.2. Objetivos específicos
• Determinar la velocidad de crecimiento radial de micelio de hongos de
pudrición blanca utilizando dos medios de cultivo sólido en laboratorio.
Caracterizar las colonias de hongos de pudrición blanca propagadas en dos
tipos de medios de cultivo sólido.
3
II. REVISIÓN DE LITERATURA
2.1. Hongos
Los hongos se han ubican tradicionalmente al reino vegetal, a
pesar de que no tienen clorofila, tejidos especializados, ni flores. No fue sino
hasta hace aproximadamente apenas unas décadas, cuando se empezó a
aceptar la idea de que los hongos son organismos independientes de las
plantas y aunque químicamente están muy relacionados con los animales,
forman un grupo aparte, el llamado Reino de los Hongos o Reino Fungi. La
pared celular de los hongos generalmente está compuesta por quitina como la
de los animales y no por lignina y celulosa como los vegetales. Además, los
hongos almacenan glicógeno y no almidón como sucede entre los animales. El
hecho de que los hongos formen un reino independiente, se basa en que tienen
características propias y a su vez una mezcla curiosa de vegetales y animales
(GUZMÁN, 2000).
Todos los hongos son heterótrofos, es decir, requieren materia
orgánica preformada que utilizan como fuente de energía y de carbono para la
síntesis de estructuras celulares. Debido a la rígida pared celular, no pueden
fagocitar el alimento; más bien, absorben nutrientes simples y solubles que
obtienen mediante la degradación de polímeros complejos con enzimas
4
extracelulares que liberan al medio (Hickman, 1997; citados por ROSALES,
2010).
2.1.1. Generalidades de los hongos
La micología es la ciencia que estudia los hongos. Se ha demostrado
que los hongos son el grupo de organismos más numeroso en la Tierra
después de los insectos. En efecto, se calcula que hay más de 150,000
especies de hongos, por lo que su impacto en el medio es enorme. La
diversidad de estos organismos, favorece que se desarrollen en un sin fin de
hábitats, por lo que bien se dice que los hongos están en todas partes
(GUZMÁN, 2000; ROBLEDO, 2006).
Los hongos son organismos unicelulares, pluricelulares o di mórficos
que carecen de clorofila, por lo tanto, son heterótrofos, es decir, obtienen sus
alimentos por absorción y el componente principal de sus paredes celulares es
la quitina. El talo o cuerpo vegetativo en los hongos filamentosos está
constituido por filamentos delgados llamados hifas, las que presentan
crecimiento apical y en conjunto integran el micelio.
Los hongos se dividen en microscópicos y macroscópicos. En el
caso de los hongos macroscópicos, el micelio está representado por la masa
de apariencia y por lo regular blanquecino que forma un cuerpo de
reproducción. Dentro de los hongos macroscópicos se encuentran los
Ascomycetes y Basidiomicetes, los cuales representan una reproducción
asexual y/o sexual. Los hongos macroscópicos son también llamados hongos
5
macromycetes y presentan distribución cosmopolita debido a que pueden
desarrollarse en cualquier tipo de clima, existiendo variedad de géneros que
pueden crecer entre 4 y 60 °C, desde el nivel del mar hasta por encima de los
4000 msnm y en diferentes tipos de maderas (Koneman, 1997; Stamets, 2003;
citados por HERNÁNDEZ y LÓPEZ, 2009).
2.1.2. Hongos de pudrición blanca
Estos hongos, además de ser los principales causantes de la
degradación de la madera, son más numerosos que los hongos de pudrición
café; están representados en basidiomicetos y ascomicetos (DÁVILA y
VÁSQUEZ, 2001). La nominación de hongos de la PB, deriva de su capacidad
de mineralización de la lignina y sus derivados que le da a la madera un
aspecto blanquecino (Pointing, 2001; citados por ROSALES, 2010), estos
hongos realizan una función natural esencial en la conversión de lignina.
El mayor grupo de hongos causantes de pudrición blanca pertenece
a la clase Basidiomicetes, que comprende cientos de especies que causan
pudrición en coníferas y latifoliadas en todo el mundo. También, algunos
hongos pertenecientes a la clase Ascomicetes y, particularmente a los géneros
Daldinia, Hypoxylon, Ustulina y Xilaria, producen pudrición blanca en
latifoliadas (Eaton et al, 1993; citados por MORALES, 2006).
6
2.1.3. Hongos de pudrición blanca como biodegradadores
Los hongos basidiomicetes de pudrición blanca son los únicos
organismos que poseen la capacidad de degradar lignina completamente en
CO2 y H2O. Bajo condiciones ligninoliticas, los hongos de pudrición blanca
producen enzimas extracelulares (peroxidasas y oxidasas) y un metabolito
secundario (veratril alcohol). De todos los grupos de microorganismos
ligninoliticos, los basidiomicetes de pudrición blanca son probablemente los
más eficientes y los más estudiados. Durante la acción de los HPB en la
degradación de los componentes estructurales de la madera, es posible
distinguir tres procesos: el primero es la alteración simultánea de los
constituyentes de la pared celular (holocelulosa y lignina); otro tipo de proceso
es la degradación de la lignina y luego holocelulosa, y por último la
modificación primeramente de holocelulosa y posteriormente la lignina. Las
especies latifoliadas, en general, son más susceptibles a la pudrición blanca
que las coníferas (Eaton et al, 1993, citados por MORALES, 2006).
Además, tienen potencial en la eliminación de xenobióticos con
estructura química similar a la lignina tales como: aromáticos, nitro aromáticos,
aromáticos policíclicos, herbicidas, pesticidas, detergentes clorofenoles y
colorantes (Pointing, 2001; citados por ROSALES, 2010). Principalmente estas
enzimas son una fenoloxidasa (lacasa) y dos peroxidasas (manganeso
peroxidasa (MnP) y lignina peroxidasa (LiP)), esenciales para la degradación
de la lignina. Sin embargo, para lograr su completa mineralización estas
enzimas generalmente se combinan con otros procesos que requieren la
7
presencia de otras enzimas, incapaces de la degradación de lignina por ellas
mismas. (Wesenberg et al., 2003, citado por MÉNDEZ, 2013). La producción
de enzimas del tipo fenol-oxidasas es lo que distingue a los hongos de
pudrición blanca (HPB) de los demás basidiomicetes degradadores de madera
y causantes de otros tipos de pudrición (Eaton et al, 1993, citados por
MORALES, 2006).
2.1.4. Taxonomía de Pleurotus ostreatus y Pleurotus djamor
De acuerdo a Venturella 2007 y CABI 2008; citado por
MARTINEZ, 2012, la clasificación taxonómica de Pleurotus ostreatus y
Pleurotus djamor es:
Reyno : Fungi
División : Basidiomycota
Clase : Basidiomycete
Orden : Agaricales
Familia : Pleurotaceae
Género : Pleutorus
Especies: Pleurotus ostreatus (Jack. Ex Fr) Kumm,
Pleurotus djamor (Fries) Boedjin.Sin.
8
2.2. Metales pesados
La tabla periódica incluye unos 70 elementos metálicos, y de ellos
59 pueden ser considerados “metales pesados”, que son aquellos con peso
atómico mayor que el del hierro (55,85 g/mol). Son todos aquellos que tienen
una densidad mayor de 5 g/cm3, poseen una conductividad eléctrica alta, son
dúctiles, la mayoría son elementos de transición con capacidad para formar
compuestos que pueden o no sufrir actividad redox. Se incluyen el Cd, Cr, Cu,
Fe, Mn, Mo, Co, Hg, Ni, Pb, Al y Se (WEAST, 1984).
2.2.1. Preocupación por los metales pesados
Existe una gran preocupación a nivel mundial, debido al considerable
incremento en los índices de contaminación de efluentes industriales por parte
de metales pesados tales como el cromo, níquel, cadmio plomo y mercurio.
Estas sustancias tóxicas tienden a persistir indefinidamente en el medio
ambiente, comprometiendo el bienestar y equilibrio no solo de fauna y la flora,
sino también la salud de las personas residentes en las comunidades aledañas,
mediante su acumulación e ingreso a la cadena trófica (Cartaya et al., 2008 y
Akar et al., 2009 citados TEJADA et al., 2014).
En el Perú, como ejemplo de lugares críticos donde se produce una
contaminación permanente del ambiente por productos químicos, podemos
citar a la ciudad de La Oroya con plomo, cadmio y otros metales en el aire y
agua; Cerro de Pasco por metales como plomo, cadmio; río Rímac por
presencia de arsénico, plomo, cadmio; Puno por metales tóxicos en el agua y
9
desechos de toda índole en el lago Titicaca; Cajamarca y Ancash por plomo,
cadmio, arsénico en sus ríos, etc. En todos estos lugares, la actividad principal
contaminante es la minería (Villena, 2006; citado por CHUNG, 2008).
Muestras extraídas en las cuencas hídricas del San Juan (Pasco),
Pisco (Ica), Huancané, Coata, Crucero Azángaro y Ayaviri-Pucará (Puno),
Madre de Dios (Cusco, Puno y Madre de Dios), Tahuamanu y Acre (Madre de
Dios), Rímac y Chillón (Lima), Moche y Virú (La Libertad), Chili-Vítor (Arequipa)
arrojaron la presencia de cobre, plomo, zinc, aluminio, hierro, manganeso,
arsénico, níquel y cadmio (AUTORIDAD NACIONAL DEL AGUA citado por el
COMERCIO, 2016).
2.3. Compuestos xenobióticos y su degradación por hongos
ligninoliticos
La palabra xenobiótico deriva del griego (xeno-extraño, y biótico-
vida), y son los compuestos cuya estructura química es poco frecuente o
inexistente en la naturaleza. Por lo tanto, se denominan xenobióticos a los
compuestos sintetizados por el hombre en el laboratorio, a diferencia del
termino biogénico que se utiliza para designar a los compuestos que son de
origen natural. Debido a su estructura inusual, algunos xenobióticos persisten
mucho tiempo en la biosfera sin alterarse y por eso se dice que son
“recalcitrantes" a la biodegradación. Varios xenobióticos, como ciertos
insecticidas, herbicidas, colorantes, tintes y detergentes, se utilizan en grandes
cantidades y tienen una larga persistencia en el medio ambiente. Los procesos
más importantes por los que se degradan los compuestos xenobióticos son la
10
fotodegradacion por radiaciones solares, los procesos de oxidación y reducción
químicos, y la biodegradación por los seres vivos.
Los hongos de podredumbre blanca de la madera han demostrado presentar
una alta capacidad para degradar compuestos xenobióticos, propiedades que
están determinadas por las enzimas extracelulares que pueden transformar los
compuestos a CO2 y H2O (RIVERO et al., 2012).
2.4. Mecanismos copartícipes en el proceso de biorremoción de
metales
2.4.1. Mecanismos físico químicos
Para el caso de hongos, la pared celular realiza la retención del
metal mediante una interacción fisicoquímica con grupos amino e hidroxilo
propios de la quitina presentes en la pared, al igual que grupos fosfatos,
sulfihidrilo y carboxilo. Esta interacción se traduce en la formación de un enlace
covalente coordinado pues el ion metálico actúa como un átomo central que
dispone de orbitales vacíos capaces de aceptar pares de electrones. Estos
pares de electrones son precisamente donados. La formación de este enlace,
puede estar acompañada por la dislocación de protones y dependiente en parte
del grado de protonación de la pared que es determinado por el pH (Gupta et
al., 2000 y Navarro et al., 2006 citados por MORALES y RUIZ, 2008).
11
Adsorción
El material biológico puede adsorber una variedad de metales. La
respuesta de las células microbianas a altas concentraciones de metales puede
ser una o más de las siguientes (que en algunos casos pueden conferir un
grado de tolerancia al metal):
- Exclusión del metal de la célula.
- Excreción dependiente de energía de los metales absorbidos en la célula.
- Secuestro intracelular mediante proteínas específicas, algunas de las
cuales son conocidas como metalioninas.
- Secuestro extracelular, bien en la pared celular o en polisacáridos
extracelulares y modificación química del metal.
El secuestro o acomplejamiento interno o externo de los metales
significa que el material biológico puede unirse a altos niveles de metales, de
hasta el 30% del peso seco. El uso del material biológico para eliminar metales
de los residuos puede hacerse de dos maneras. La primera es la
destoxificacion de las aguas residuales y la segunda la recuperación de
metales valiosos como el oro (Vilchez et al., 1997 citado por SCRAGG, 2001).
La adsorción de metales de las aguas residuales por organismos
vivos puede ser activa, pasiva o ambas. La adsorción pasiva es independiente
del metabolismo celular e Implica la unión de los metales a la pared celular
polianionica o el intercambio de iones de la pared celular. Los polisacáridos
12
extracelulares microbianos también pueden unirse a metales (Richau et al.,
1997; citado por SCRAGG, 2001).
El proceso de adsorción se ve influenciado por diferentes factores
como el pH, la temperatura, la naturaleza del adsorbente, el tipo y
concentración de adsorbato, entre otros (Hidalgo et al., 2004; citado por
MORALES y RUIZ, 2008).
a) pH
La pared fúngica a pH menores de 3.5, sufre una protonación de
los grupos fosfatos y carboxilos cargándolos positivamente o menos negativo,
lo cual permite que se promueva una repulsión electrostática entre los iones
metálicos y la pared, al mismo tiempo se origina una competencia entre
protones como el H+ y los metales. Por el contrario, a pH por encima de 4 y
menores de 6 la carga negativa de la pared favorece un acercamiento aniónico
con los iones del metal (Loukidou, 2004; citado por MORALES y RUIZ, 2008).
b) Temperatura
La temperatura apropiada para una alta remoción de metales con
hongos está entre 25 – 30 °C, además sugiere que la temperatura puede
afectar a la adsorción física entre el metal y el hongo (Quingbiao, 2004; citado
por MORALES y RUIZ, 2008).
13
2.4.2. Mecanismos de resistencia
a) Mecanismos fisiológicos y genéticos
La supervivencia de los hongos depende de sus adaptaciones
intrínsecas y desde luego a las propiedades fisicoquímicas del medio ambiente.
Posiblemente esta adaptación sea a través de mecanismos fisiológicos y
genéticos, activados o inducidos por metales, que controlan determinados
eventos bioquímicos. En diversos grupos taxonómicos de hongos, los metales
pesados son quelados por componentes extracelulares e intracelulares, de bajo
peso molecular. La interacción de los hongos con los metales pesados ha
desencadenado respuestas adaptativas, ya que presentan tolerancia a altas
concentraciones y una adaptación fisiológica muy rápida; como parte de sus
mecanismos se encuentran involucrados fisiológicos, genéticos y enzimáticos
(Gutiérrez et al., 2008 y Baldrian, 2002; citados por MORALES y RUIZ, 2008).
La producción de ácido oxálico por parte de cepas de hongos de la
pudrición café, lograron precipitar el cobre en la forma insoluble de oxalato de
cobre. Los oxalatos de metal se pueden también formar con el Cd. Entre los
hongos de la pudrición blanca, las cantidades más altas de oxalato se
producen por P. ostreatus, P. chrysosporium y T. versicolor (Baldrian, 2003;
citados por MORALES y RUIZ, 2008). Uno de los sistemas de quelación de los
metales, desarrollado por los basidiomicetos es el oxalato. El ácido oxálico liga
o inmoviliza iones metálicos solubles a compuestos de oxalato insolubles, lo
cual disminuye la biodisponibilidad de estos metales y aumenta la tolerancia
(Reyes, 2007 citado; por MORALES y RUIZ, 2008).
14
Los hongos producen una envoltura hifal extracelular compuesta
principalmente por polisacáridos (ß1-3 y ß1-6 glucanos); que atrapan los iones
metálicos, ofreciendo así una primera barrera contra el metal. Otro mecanismo
es la síntesis intracelular de metalotioninas, proteínas que tienen una función
en la desintoxicación, almacenamiento y regulación de la concentración interna
del metal (Baldrian, 2003 citado por MORALES y RUIZ, 2008).
A nivel genético se reportan mecanismos para evitar lesiones
premutagenicas en el ADN, especialmente bajo la acción del cromo; entre ellas
están la reparación por escisión de nucleótidos (NER) que se encarga de la
remoción de lesiones a nivel estructural y el gen encargado de su expresión
(rad1). (BER) escisión de bases de nucleótidos, por metilación u oxidación a
nivel genético y los genes implicados en su expresión (apn1, ntg1, ntg2)
(O'Brien et al., 2002; citado por MORALES y RUIZ, 2008).
b) Mecanismos enzimáticos
Los hongos de la podredumbre blanca tienen un sistema
enzimático el cual está comprendido por las enzimas Lignina peroxidasa (LiP),
que por síntesis endógena de H2O2, oxida veratril alcohol, a la vez oxida
compuestos aromáticos no fenólicos, Manganeso peroxidasa (MnP) que oxida
componentes fenólicos de la lignina, mediante la reacción de oxidación del
Mn2+ a Mn3+ , la cual es dependiente del H2O2 y Lacasa (LAC ),una fenol
oxidasa con cobre, que oxida anillos de la lignina (Pointing, 2001; citado por
MORALES y RUIZ, 2008).
15
2.5. Aplicaciones de hongos ligninolíticos en la remoción de metales
pesados
El hongo Phanerochaete chrysosporium presenta alta tolerancia a
cadmio, níquel y plomo. Creciendo en concentraciones de 1500 mg/L, 300mg
/L y 10000 mg/L, con tiempos mínimos de dos, cinco y tres días
respectivamente con respecto a Trametes versicolor y Pleurotus ostreatus
(MORALES y RUIZ, 2008). Tal es así que, en investigaciones realizadas
removió cadmio a razón de 300 ppm, alcanzando porcentajes máximos de 74%
en células libres e inmovilizadas en 16%.
Investigaciones sobre la presencia de metales pesados en 238
muestras de carpóforos pertenecientes a 28 especies de hongos silvestres
comestibles mostraron las máximas concentraciones metálicas.
Individualmente la especie más relevantes fue Agaricus macrosporus para el
cadmio. El himenóforo es la parte anatómica que muestra mayores niveles de
metales (ALONSO et al., 2003).
El fungi Penicillium sp. es un potencial biosorbente de metales
pesados ya que presenta alta capacidad de eliminar plomo, cadmio y
mercurio en solución acuosa. A 51.5 mg/L se pudo encontrar los mayores
porcentajes de remoción de los contaminantes tóxicos. A medida que
aumentan las concentraciones (hasta 103 mg/L) de los metales en la solución,
la capacidad de adsorción se va manteniendo constante, esto es debido a la
saturación de los sitios disponibles en la superficie de biosorbente. A mayor
16
temperatura hasta 60°C mayor es la eficiencia de remoción de estos metales
(SÁNCHEZ et al., 2014).
El elevado valor de la relación superficie/volumen celular de los
fungi filamentosos les convierte en eficaces degradadores en determinados
nichos como los suelos contaminados. Por otra parte, los hongos tienen una
capacidad muy notable para acumular metales pesados como cadmio, cobre,
mercurio, plomo y zinc, lo que está demostrado por los aislamientos
realizados en minas de cobre, zinc o plomo (MARTIN et al., 2004).
En hongos, la bioadsorcion es debida esencialmente a la presencia
de polisacáridos en la pared fúngica, tales como quitina y quitosan o por otros
compuestos que poseen sitios de unión de metales como la melanina o
polímeros fenólicos. Esta capacidad de absorber metales pesados les confiere
un potencial uso biotecnológico, ya que pueden ser utilizados como material
empaquetado para columnas (Galli et al., 2003; citado por OMARINI, 2007).
La mayoría de los tratamientos de biorremediación se han
realizado con bacterias, debido a que son fácilmente cultivables, crecen
rápidamente y son capaces de usar los contaminantes orgánicos como fuentes
de carbono y energía. Sin embargo, en los últimos años, el empleo de los
hongos de la pudrición blanca, ha demostrado el gran potencial que poseen
para la biodegradación de un amplio espectro de xenobióticos como los
insecticidas químicos.
17
Figura 1. Acción de degradación de los hongos de pudrición blanca de lignina,
celulosa y hemicelulosa en la pared celular de la madera.
2.6. Principio de los hongos de pudrición banca para usar en
biorremediación
Los hongos de podredumbre blanca de la madera tienen la
capacidad de producir un complejo enzimático con actividad oxidativa contra
una amplia variedad de sustancias tóxicas recalcitrantes. La lignina en la
madera, es un biopolímero aromático complejo; es el segundo polímero en
abundancia después de la celulosa, constituye cerca del 15% de la biomasa
terrestre y su fuente natural es la madera, donde se encuentra en una
proporción del 20 al 35%. Solamente un pequeño número de microorganismos
son responsables de la biodegradación de la lignina, de los cuales los hongos
de la podredumbre blanca constituyen el grupo más importante, gracias a que
producen unas enzimas ligninolíticas extracelulares, lignino peroxidasa (LiP) y
manganeso peroxidasa (MnP), que tienen una potente capacidad oxidante
(HAMMEL, 1996). Si los hongos tienen capacidad para degradar polímeros
complejos a través de la producción de enzimas, esto conduce a que también
lo realicen con otros compuestos tales como cono metales pesados y
xenobióticos.
18
2.7. Medios de cultivo
2.7.1. Generalidades respecto a la composición de los medios de
cultivo
Los medios de cultivo pueden definirse como un conjunto de
elementos o sustancias que garantizan a un microorganismo, célula, o a un
grupo de ellos, los nutrientes necesarios para su conservación, crecimiento y
desarrollo (DÁVILA y VÁSQUEZ, 2001).
En general, los medios de cultivo son una mezcla equilibrada de
nutrientes que, en concentraciones adecuadas y con condiciones físicas
óptimas, permiten un buen crecimiento de los microorganismos. Contienen una
base mineral, fuente de carbono, de nitrógeno y azufre; atmósfera adecuada y
los factores de crecimiento necesarios. Pueden ser de origen natural o artificial
y posibilitan, además, la identificación o diferenciación de una célula o
microorganismo dentro de un conjunto de ellos, e incluso inhiben el desarrollo
de otros (DÁVILA y VÁSQUEZ, 2001).
El elevado ritmo de desarrollo de la industria biofarmacéutica y de
la biotecnología abrió nuevas perspectivas en el diseño de los medios de
cultivo y sus componentes, pero también ha impuesto conceptos referentes a
los requisitos de calidad de estos productos.
Por su naturaleza y función, los componentes fundamentales de
estos medios pueden agruparse como agua, bases nutritivas, extractos,
infusiones y otros, carbohidratos (azúcares, agar y sus derivados, almidones y
19
varios más), sales minerales (orgánicas e inorgánicas) y colorantes e
indicadores (DÁVILA y VÁSQUEZ, 2001).
2.7.2. Condiciones físico-químicas de los medios de cultivo
Aparte de las condiciones nutritivas que debe cumplir un medio de
cultivo, existen las condiciones físico-químicas apropiadas que permiten el
crecimiento adecuado del microorganismo en estudio. De acuerdo a esto se
deben considerar las siguientes condiciones:
a) Temperatura
Todo microorganismo necesita una temperatura óptima para su
adecuado desarrollo, ya sea para su crecimiento o sobrevivencia. Según Eaton
and Hale (1993), citados por MORALES, 2006), la mayoría de los hongos son
organismos mesófilos, es decir, crecen en un rango de temperatura de 10 y 40º
C, con una temperatura óptima de entre 20 y 30º C.
b) Humedad
Corresponde a la cantidad de agua que va a necesitar el
microorganismo para su crecimiento. En general, cualquier medio sólido o
líquido requiere una cierta proporción de agua. En el caso de los hongos, la
humedad adecuada para su desarrollo según (MORALES, 2006), se encuentra
entre 30% y 80%.
c) pH
La presencia de iones hidrógeno libres que se encuentran en el
medio es relevante para el desarrollo de los microorganismos en cultivo. En el
20
caso de los hongos, la mayoría de ellos crece en un rango de pH de 4 y 7, con
un óptimo de 5 y 6. Es importante mencionar que en un medio de cultivo
pueden existir variaciones del pH, como consecuencia de las reacciones que
se producen durante la degradación de los nutrientes por parte de los hongos.
d) Oxígeno
En el caso de los microorganismos aeróbicos, es fundamental la presencia de
oxígeno en el medio de cultivo. Como los hongos son organismos aerobios, su
respiración se produce cuando existe presencia de oxígeno.
2.7.3. Principales tipos de medios de cultivo
Existen muchos tipos distintos de medios de cultivo, así como
diferentes clasificaciones de éstos. A continuación, se describen los principales
medios de cultivo clasificados según el sustrato, utilización, composición y
presentación (MORALES, 2006). En este caso, nos centraremos en ver según
el sustrato:
a) Medios sólidos
Corresponden a aquellos medios donde la proporción en agar está
siempre por encima del 1,5%. Este tipo de medios es muy importante en la
actualidad ya que permite el aislamiento, purificación, y visualización del
crecimiento en colonias, así como identificarlos a través de medios específicos.
21
b) Medios semisólidos
Son medios intermedios entre los líquidos y sólidos, donde su
proporción en agar suele ser inferior al 0,5% pero suelen presentar una cierta
cantidad de sustrato sólido que les proporciona una consistencia semisólida.
c) Medios líquidos
Corresponden a los también denominados caldos. No contienen
agar y su composición además suele tener una fuente de carbono, sales
minerales y, en algunas ocasiones, según las características del medio,
factores de crecimiento, vitaminas, peptonas, etc. Son muy importantes para la
realización de múltiples pruebas bioquímicas, como también para la realización
de inóculos.
2.7.4. Utilización de medios de cultivo sólidos para caracterización
de cepas de hongos comestibles
Para el cultivo y crecimiento de los hongos en el laboratorio, es
decir el desarrollo de micelio en tubos de ensaye o cajas de Petri, se deben
utilizar determinados medios de cultivo los cuales deben proporcionar al hongo
los nutrimentos requeridos para su crecimiento y desarrollo. Comúnmente se
emplean medios de cultivo sólidos con agar, los cuales actúan a manera de
substrato al solidificar como una gelatina. El medio de cultivo que se utilizará
dependerá de la especie de hongo que se quiere cultivar, ya que cada especie
tiene sus propios requerimientos nutricionales (GUZMAN. 2000).
22
RODRÍGUEZ (1996) estudió el comportamiento de 5 cepas de
Pleurotos ostreatus sobre 4 medios de cultivo sólido de laboratorio: agar con
extracto de malta, agar con dextrosa y papa, agar con dextrosa sabouraud y
agar con extracto de trigo, paja y malta; bajo condiciones de obscuridad total y
a temperaturas de 28-30 °C. El medio de cultivo que resultó el más adecuado
fue el de agar con extracto de trigo, paja y malta.
Cultivando el micelio de una cepa comercial de Pleurotus ostreatus
en cinco medios sólidos, estos fueron: agar saboraud dextrosa (ASD), agar
papa dextrosa (PDA), agar extracto de malta (AEM), bactoagar (BA) y
bactoagar ejote (BAE). El crecimiento más rápido de la cepa en estudio se
observó en BAE, donde el micelio se expandió a una velocidad de 2.5-5.0
mm/día, y se caracterizó por ser un micelio denso, arraigado, sumamente
ramificado, vigoroso y con numerosas fíbulas (RODRÍGUEZ, 1996).
HERNÁNDEZ y LÓPEZ (2009), al utilizar 5 cepas de Pleurotos
nativas de la región del Sonocusco Chiapas, evaluó el crecimiento micelial en
tres medios de cultivo: extracto de malta (EMA). Papa dextrosa agar (PDA) y
Sabouraud (SA). Los resultados obtenidos mostraron que la mayor velocidad
de crecimiento fue sobre EMA, con valores entre 18.14 mm/día (cepa 0105) y
17.9 mm/día (cepa 0103).
ROSALES (2010), al estudiar el comportamiento de una cepa
silvestre de Pleurotos ostreatus macro y microscópico en agar con extracto de
malta bajo incubación a 29-30°C en obscuridad. Obtuvo que la cepa sembrada
23
en agar con extracto de malta a 29-30°C con obscuridad, las colonias se
observaron densas con micelio aéreo, textura algodonosa, con anillos
concéntricos, la velocidad de crecimiento fue de 8.5 mm/día, requiriendo 11
días para cubrir la caja de Petri, el micelio fue blanquecino con tonos
amarillentos.
2.7.5. Incubación
En la fase de incubación se busca que el micelio invada totalmente el
sustrato por medio de la optimización de las condiciones ambientales. En este
caso los cultivos son sometidos a incubadora y en oscuridad. Las condiciones
ambientales pueden variar en las características de crecimiento de cada hongo
(FERNÁNDEZ, 2004).
24
III. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. Lugar de ejecución
La presente práctica se realizó en el Laboratorio de Micología y
Tecnología de la Propagación, perteneciente a la Facultad de Recursos
Naturales Renovables en la Universidad Nacional Agraria de la Selva (UNAS)
Tingo María, con los siguientes detalles:
3.1.1. Condiciones climáticas
Tingo María, presenta una temperatura media mensual de 23.9 ºC,
temperatura máxima de 29.7 ºC y mínimas de 19.6 ºC. La precipitación media
anual es de 3 429.0 mm, con una media mensual acumulada de 285.8 mm. De
acuerdo con la Clasificación Climática de Thornthwaite y de Zonas de Vida de
Holdrige, la localidad de Tingo María está ubicado a 660 m.s.n.m. presenta un
clima de tipo cálido muy lluvioso de bosques muy húmedo premontano, con
humedad relativa de 85% a 100% (SENAMHI, 2014).
3.1.2. Zona de vida
Ecológicamente de acuerdo a la clasificación de zonas de vida o
formaciones vegetales del mundo y el diagrama bioclimático de HOLDRIDGE
(1982), Tingo María se encuentra en la formación vegetal bosque muy húmedo
Pre-montano Sub Tropical bmh-PST, y de acuerdo a las regiones naturales del
25
Perú corresponde a Rupa Rupa o Selva Alta. De acuerdo a las regiones
naturales del Perú, PULGAR (1938) se encuentra en la selva alta o Rupa Rupa.
3.2. Materiales, equipos y herramientas
3.2.1. Material biológico
Los hongos de pudrición blanca, utilizados y proporcionados por el
Laboratorio de Micología y Tecnología de la Propagación fueron:
Pleurotus ostreatus (FTM-220.1) Cepa 1; Pleurotus ostreatus (FTM-
220.2) Cepa 2; Pleurotus ostreatus (FTM-220.3) Cepa 3; Pleurotus djamor (FTM-
221) y Polyporus craterellus (FTM-226).
3.2.2. Materiales de laboratorio
Los materiales de laboratorio que se usaron fueron: placas Petri, bisturí,
espátula de metal, agitador, vaso pecipitado, balanza, matraz (150 mL), agua
destilada, mechero y paraflim.
3.2.3. Equipos
Los equipos de laboratorio que se usaron fueron: Autoclave,
cámara de flujo laminar, incubadora, estufa, cámara fotográfica, laptop y cocina
eléctrica.
3.2.4. Insumos
Los insumos utilizados fueron: Agar Extracto de Malta, Agar Dextrosa de
Papa, alcohol 96° e Hipoclorito de sodio al 4%.
26
3.3. Metodología
3.3.1. Fase pre campo
Ha consistido en el reconocimiento de las instalaciones del
laboratorio, instrucciones de uso de los equipos, y capacitación por el jefe del
laboratorio sobre el reino Fungi, y técnicas de colección de muestras a través
de una ficha.
3.3.2. Fase de laboratorio
a) Acondicionamiento del área física del laboratorio
Se realizó una limpieza general del laboratorio, donde incluía la
limpieza y desinfección de paredes, vidrios y equipos (Anexo 1, Figura 11).
b) Esterilización de materiales de vidrio y accesorios
Los materiales de vidrio y accesorios fueron esterilizados en
estufa a 160°C por el tiempo de 2 horas (Anexo 1, Figura 12).
c) Preparación del medio de cultivo
Agar Papa Dextrosa
En un vaso de precipitación agregar 1000 ml de agua destilada,
añadir luego 29 gramos de medio comercial y calentar hasta hervir en una
estufa por unos 10 minutos aproximadamente, de manera práctica hasta que el
medio cambie de color a un tono más transparente. Esto será agitado
27
constantemente con una varilla de vidrio para homogenizar y diluir el medio,
luego separar el medio en cantidades de 200 ml en matraces de 500 ml.
Agar Extracto de Malta
En un vaso de precipitación se agregaron 1000 mL de agua destilada, a
esto se le ha añadido 50 gramos de medio comercial y luego se ha calentado
hasta hervir en una estufa por unos 10 minutos aproximadamente, de manera
práctica hasta que el medio cambie de color a un tono más transparente. Esto
será agitado constantemente con una varilla de vidrio para homogenizar y diluir
el medio, luego separar el medio en cantidades de 200 mL en matraces de 500
mL.
d) Plaqueado
Llevamos los instrumentos a utilizar: Los medios de cultivos
(PDA Y EMA), las placas, el mechero, el fósforo y el antibiótico Ceftriazona, el
A B
Figura 2. (A) Medio de cultivo industriales (B) Preparación de medio de cultivo.
28
cual va a ayudar a reducir la contaminación por bacterias. A la cámara de flujo
laminar.
Procedemos a encender la cámara de flujo para la desinfección
por rayos ultra violeta, por 15 minutos, abrimos la cámara de flujo, para realizar
el plaqueado.
Encendemos el mechero, acercamos el medio, y cogemos
cuidadosamente la placa, mientras vertimos 15 ml de medio, cerramos,
separamos, continuamos con las demás placas, y dejamos secar, por
aproximadamente 3 horas.
e) Siembra de la cepa en los medios de cultivo
De las placas Petri donde se mantienen las cepas, se cogieron
fragmentos de aproximadamente 0,4 x 0,4 mm y fueron propagados en placas
Petri conteniendo medio agar papa dextrosa y agar extracto de malta, 5 placas
Figura 3. Plaqueado de medios de cultivo.
29
del mismo hongo para cada medio, de las 5 especies de hongos, 3 de ellas la
misma especie de distintas cepas. Esta operación se hizo cuidadosamente en
la cámara de flujo para evitar el riesgo de contaminación. Posteriormente, las
placas sembradas fueron codificadas y selladas con parafilm, y llevadas a la
incubadora con una temperatura constante de 28° C y en oscuridad para el
crecimiento micelial, para ser observadas y evaluadas diariamente en el lapso
de un periodo de tiempo aproximado de entre 8 a 15 días, el micelio ha cubierto
el área total de las placas Petri de 90 mm de diámetro.
3.4. Datos registrados
3.4.1. Crecimiento radial del micelio
El crecimiento radial del micelio del hongo se ha obtenido midiendo
en centímetros (cm), iniciados a partir del inóculo (centro de la placa) hasta el
borde de ésta (diámetro de a placa de 90 mm), la medición fue realizada a
cada 24 horas, hasta que el micelio cubra totalmente el medio de cultivo.
Diámetro de la placa Petri (90 mm)
Radio de la placa
(45 mm)
Figura 4.Medición radial de crecimiento de micelio del hongo en placas Petri con medio de cultivo.
30
3.4.2. Caracterización morfológica macroscópica de las colonias.
Para la evaluación de las características macroscópicas de las
colonias que se muestran en el Anexo 1, Figura 13, para el cual se usaron la
siguiente tabla sugerido por ANGEL (2006).
Cuadro 1. Evaluación de las características morfológicas de colonias de los
hongos.
Fuente: ANGEL (2006).
Características morfológicas Código
Tipo de crecimiento
Homogéneo 1
Irregular 2
Ralo 3
Con anillos de crecimiento 4
Textura
Algodonosas 1
Aborlada 2
Venosa 3
Aterciopelada 4
Cerosa 5
Color
Blanco 1
Blanquecino 2
Rojo a rojizo 3
Amarillento 4
Micelio aéreo
Regular 1
Escaso 2
Ausente
3
31
3.5. Procesamiento de resultados
Los datos registrados de velocidad de crecimiento del micelio,
fueron procesados en hoja electrónica Excel; con el cual sean obtenido los
promedios y confeccionado de las figuras respectivas de velocidad de
crecimiento, considerando cada procedencia y el tipo de medio de cultivo del
hongo de los hongos estudiados.
32
IV. RESULTADOS
4.1. Determinar la velocidad de crecimiento de micelio de los hongos de
pudrición utilizando dos medios de cultivo.
En el Cuadro 2, se presenta los datos de crecimiento radial diario del
micelio de los hongos en los medios de cultivos PDA y EMA hasta cubrir el total
de la placa Petri de 90 milímetros de diámetro, aquí se muestra cierta
diferencia en la velocidad de crecimiento entre los medios de cultivo utilizados.
El promedio de crecimiento radial del micelio ha sido obtenido del
registro de crecimiento diario a través de una regla milimetrada, de cinco
repeticiones (placas) por cada medio de cultivo. La medición radial, ha sido
tomada desde el inóculo sembrado en el centro de la placa hacia el borde de la
misma.
Asimismo, de acuerdo a este cuadro, la cepa 1 de Pleurotus
ostreatus ha logrado el crecimiento de micelio en las placas de 90 mm de
diámetro en menor tiempo entre las cepas del mismo género y especie,
existiendo poca diferencia entre ambos medios. En el caso del hongo
Polyporus craterellus se aprecia un rápido crecimiento de micelio, en este caso
entre 7 y 8 días alcanza cubrir el total de la placa Petri de 90 mm. Cuadro 2.
Velocidad de crecimiento radial de micelio y promedio cm/día de los hongos de
pudrición blanca en distintos medios.
33
Hongo M.C DÍAS
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Pleurotus ostreatus FTM-220.1
PDA 0.40 0.70 0.94 1.29 2.14 2.54 3.40 4.18 4.41 4.50
EMA 0.40 0.70 1.29 2.04 3.01 3.61 4.34 4.50
Pleurotus ostreatus FTM-220.2
PDA 0.40 0.63 0.86 1.19 1.76 2.12 2.63 3.12 3.67 4.08 4.25 4.43 4.47 4.50
EMA 0.40 0.63 1.08 1.50 2.02 2.31 2.71 3.06 3.30 3.60 3.86 4.08 4.26 4.42 4.50
Pleurotus ostreatus FTM-220.3
PDA 0.40 1.05 1.56 2.06 2.49 2.81 3.35 3.71 3.93 4.20 4.29 4.38 4.48 4.50
EMA 0.40 1.06 1.43 1.72 2.11 2.32 2.67 2.89 3.10 3.38 3.60 3.80 4.14 4.29 4.43 4.46 4.50
Pleurotus djamor
PDA 0.40 0.72 0.89 1.49 2.25 2.75 3.67 4.33 4.47 4.50
EMA 0.40 0.76 1.20 1.71 2.32 2.75 3.38 3.97 4.44 4.48 4.50
Polyporus craterellus
PDA 0.40 1.45 2.26 3.08 4.02 4.30 4.48 4.50
EMA 0.40 1.35 2.20 3.02 4.04 4.27 4.50
33
34
y = 0.52x - 0.4092R² = 0.9727
y = 0.6527x - 0.4511R² = 0.9831
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Cre
cim
ien
to d
e m
icel
io (
cm)
Dias de evaluación
PDA EMA Lineal (PDA) Lineal (EMA)
y = 0.3645x - 0.0113R² = 0.9671
y = 0.3084x + 0.3149R² = 0.9742
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Cre
cim
ien
to d
e m
icel
io (
cm)
Días de evaluación
PDA EMA Lineal (PDA) Lineal (EMA)
Figura 5.Crecimiento diario de micelio (cm) de Pleurotus ostreatus FTM-220.1
Figura 6.Crecimiento diario de micelio (cm) de Pleurotus ostreatus FTM-220.2.
35
y = 0.3168x + 0.71R² = 0.9278
y = 0.2509x + 0.7009R² = 0.9684
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Cre
cim
ien
to d
e m
icel
io (
cm)
Días de evaluación
PDA EMA Lineal (PDA) Lineal (EMA)
y = 0.5296x - 0.366R² = 0.9686
y = 0.4607x - 0.0453R² = 0.9754
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Cre
cim
ien
to d
e m
icel
io (
cm)
Días de evaluación
PDA EMA Lineal (PDA) Lineal (EMA)
Figura 7.Crecimiento diario de micelio (cm) de Pleurotus ostreatus FTM-220.3
Figura 8.Crecimiento diario de micelio (cm) de Pleurotus djamor.
36
y = 0.6061x + 0.3339R² = 0.9152
y = 0.7136x - 0.0286R² = 0.9598
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
1 2 3 4 5 6 7 8
Cre
cim
ien
to d
e m
ice
lio (
cm)
Días de evaluaciónPDA EMA Lineal (PDA) Lineal (EMA)
Figura 9.Crecimiento diario de micelio (cm) de Polyporus craterellus.
37
Figura 10.. A: Pleurotus ostreatus FTM-220.3 (C3); B: Pleurrotus ostreatus FTM-220.2 (C2); C: Pleurotus ostreatus FTM-220.1 (C1); D: Pleurotuss djamor, E: Polyporus craterellus. Fotos cortesía del Dr. Ladislao Ruiz. En la figura 7 se muestran los basidiocarpos de los hongos de pudrición
blanca, tales como: A Pleurotus ostreatus cepa 1, B Pleurotus ostreatus cepa 2,
38
C Pleurotus ostreatus cepa 3, D Pleurotus djamor y E Polyporus craterellus.
Cada una de estas cepas y especies de hongos presentan sus propias
características, además que todas son comestibles en la amazonia peruana
(RUIZ et al, 2017).
4.2. Caracterizar las colonias de hongos de pudrición blanca
propagadas en dos tipos de medios de cultivo sólido
En el Cuadro 3, se aprecian las diferencias en cuanto a las
características morfológicas del micelio de cada uno de los hongos sembrados.
En su mayoría presentan un tipo de crecimiento homogéneo, solo Pleurotus
ostreatus cepa1 presenta anillos de crecimiento; en su mayoría el micelio es de
e tipo algodonoso y aterciopelado; todos los micelios de los hongos tuvieron un
color blanco a excepción de P. djamor que inicialmente tiene un color blanco y
después con los días se torna a un color rosado claro (próximos a la formación
de primordios); de igual manera, presentan micelio aéreo abundante y regular.
39
Cuadro 3. Características morfológicas del micelio de los hongos aislados en medios nutritivos.
Características morfológicas Código
Pleurotus
ostreatus c1
Pleurotus ostreatus
c2
Pleurotus
ostreatus c3 Pleurotus djamor
Polyporus
craterellus
PDA AEM PDA AEM PDA AEM PDA AEM PDA AEM
Tipo de
crecimiento
Homogéneo 1 x x x x x x x x x x
Irregular 2
Ralo 3
C/anillos de crecimiento 4 x
Textura
Algodonoso 1
x x x x x x x x
Aborlada 2
Venosa 3
x
Aterciopelada 4 x x
Cerosa 5
Color
Blanco 1 x x x x x x
x x
Blanquecino 2
Amarillento 3
Rosado a rojizo 4
x x
Marrón a oscuro 5
Micelio aéreo
Abundante 1 x x x
x x x x
Regular 2 x
x
x
Escaso 3
Ausente 4
39
40
V. DISCUSIÓN
El crecimiento del micelio en los medios de cultivo agar papa
dextrosa y agar extracto de malta, muestran un crecimiento promedio diario y
una velocidad de crecimiento en algunos casos variable. Esta variación se
debe a la diferencia en la composición de cada medio de cultivo utilizado, al
respecto GUZMAN et al. 1993, indican que el medio de cultivo a utilizar
dependerá de la especie de hongo que se quiere cultivar, ya que cada especie
tiene sus propios requerimientos nutricionales, definidos como un conjunto de
elementos o sustancias que garantizan a un microorganismo, célula, o a un
grupo de ellos, los nutrientes necesarios para su conservación, crecimiento y
desarrollo, contienen una base mineral, fuente de carbono, de nitrógeno y
azufre (DAVILA y VÁSQUEZ, 2001). Los hongos de la pudrición blanca (PB),
además de ser los principales causantes de la degradación de la madera, son
más numerosos que los hongos de pudrición café; están representados en
basidiomicetos y ascomicetos (DÁVILA Y VÁSQUEZ, 2001).
Los cultivos fueron sometidos a temperatura ambiente,
característica en cuanto a requerimiento de temperatura de la mayoría de
hongos, el cual coincide con lo que establece Eaton (1993), citados por
MORALES (2006), que indica que la mayoría de los hongos son organismos
41
mesófilos, es decir, crecen en un rango de temperatura de 10 y 40º C, con una
temperatura óptima de entre 20 y 30º C.
En cuanto a los medios de cultivo utilizados (agar papa dextrosa y
agar extracto de malta) en el crecimiento de micelio de los hongos, los dos
medios demuestran buenas condiciones para ser usadas con algunas variantes
en cuanto al ritmo de crecimiento y características morfológicas. Esto corrobora
con los reportado por RODRIGUEZ (1996) donde al estudiar el comportamiento
de 5 cepas de Pleurotos ostreatus sobre 4 medios de cultivo sólido de
laboratorio: el agar con extracto de malta, agar con dextrosa y papa, agar con
dextrosa sabouraud y agar con extracto de trigo, paja y malta; bajo condiciones
de obscuridad total y a temperaturas de 28-30 °C, reporta una velocidad de 2.5-
5.0 mm/día con un micelio arraigado, sumamente ramificado y vigoroso con el
medio agar con extracto de trigo, paja y malta; ROSALES (2010), obtiene
cepas de Pleurotus ostreatus en agar con extracto de malta a 29-30°C con
obscuridad, donde reporta colonias densas con micelio aéreo, textura
algodonosa, con anillos concéntricos, y la velocidad de crecimiento fue de 8.5
mm/día, requiriendo 11 días para cubrir la caja de Petri, el micelio fue
blanquecino con tonos amarillentos. Asimismo, RIOS & RUIZ, 1993, al estudiar
el crecimiento de micelio de Pleuotus ostreatus demuestran que crece con
mayor rapidez en condiciones de oscuridad, pero requieren cierto estímulo de
luz posteriormente para generar primordios y frutos.
Finalmente, los micelios de los hongos de pudrición blanca por la
presencia de enzimas ligninoliticas (lignino peroxidasas, manganeso
42
peroxidasas y lacasas principalmente) son los responsables de la degradación
de polímeros complejos como la celulosa, hemiclulosa y la lignina presente en
la pared celular de los vegetales, el cual demuestra el papel biodegradador de
muchos metales pesados y xenobióticos. Los hongos presentan una envoltura
hifal extracelular compuesta principalmente por polisacáridos en la pared
fúngica (ß1-3 y ß1-6 glucanos); y tienen la capacidad de atrapar a los iones
metálicos, ofreciendo así una primera barrera contra el metal (Baldrian, 2003
citado por MORALES y RUIZ, 2008).
.
43
VI. CONCLUSIONES
1.- El micelio de Polyporus craterellus, crece con mayor rapidez en ambos
medios de cultivo (agar extracto de malta y agar papa dextrosa) con respeto
a las tres cepas de Pleurotus ostreatus y Pleurotus djamor evaluados.
2.- La característica morfología del micelio de los hongos evaluados,
presentan un crecimiento homogéneo, de textura algodonosa y
aterciopelada, y micelio aéreo de regular a abundante. Las características
morfológicas complementan conjuntamente con la velocidad de crecimiento
micelial aspectos importantes para definir la evaluación.
44
VII. RECOMENDACIONES
1. Realizar trabajos similares usando otras especies de hongos, a fin de
conocer a detalle las características de las colonias para fines
biotecnológicos.
2. Realizar investigaciones de hongos de pudrición blanca con fines de
biorremediación.
45
XIII. REFERENCIA BIBLIOGRÁFICAS
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50
ANEXO
51
ANEXO 1
Figura 11.Vista parcial del laboratorio de Micología y Tecnología de la propagación.
Figura 12.Estufa esterilizando en seco materiales de vidrio y utensilios.
52
A - B C - D
E – F G – H
I - J
M
Figura 13. Micelio en crecimiento de los hongos evaluados.
A-B Pleurrotus ostreatus C1; C-D Pleurotus ostreatus C2; E-F Pleurotus ostreatus C3; G-H
Popyporus craterellus; I-J Pleurotus djamor.
