Uso de probiticos en sustitucin de antibiticos y papel emergente en obesidad

Un estudio demuestra por primera vez que los probiticos son ms eficaces y selectivos que los antibiticos en mastitis.Son algunas de las principales novedades presentadas en el 'VI Workshop Probiticos, Prebiticos y Saluds: Evidencia cientfica', que rene en Oviedo a 300 expertos.Entre los avances ms inminentes y prometedores de la aplicacin de los probiticos a la salud humana destaca el papel de estos microorganismos frente a determinados patgenos, tratados actualmente con antibiticos, as como su capacidad para mejorar la microbiota intestinal, lo que permite hablar ya de un arma ms contra la epidemia de la obesidad.As se ha puesto de manifiesto durante la primera jornada del 'VI Workshop Probiticos, Prebiticos y Salud: Evidencia cientfica', organizado por la Sociedad Espaola de Probiticos y Prebiticos (SEPYyP), que rene en Oviedo a 300 expertos de campos muy diversos relacionados con el estudio y empleo de probiticos y prebiticos.Una de las mximas autoridades en este campo, el doctor Francisco Guarner, gastroenterlogo del Hospital Valle de Hebrn (Barcelona) y presidente de SEPyP, ha destacado la presentacin del primer estudio que demuestra que el tratamiento con probiticos es ms eficaz que los antibiticos en una indicacin muy concreta como la mastitis. Se trata de un trabajo, liderado por doctor Juan Miguel Rodrguez, del Departamento de Nutricin, Bromatologa y Tecnologa de los Alimentos de la Universidad Complutense de Madrid, segn el cual cepas probiticas especficas han demostrado ser ms eficaces y selectivas que los antibiticos. En este sentido, Guarner ha explicado que no slo han conseguido mejores resultados de curacin, sino que han evitado la accin sobre bacterias no patgenas que s son destruidas con el empleo de antibiticos por su accin antibacteriana masiva.Estos resultados, segn Guarner, abren un nuevo campo muy importante para intentar controlar de forma mucho ms selectiva que hasta ahora el patgeno concreto causante de la infeccin.ObesidadComo otro gran avance, durante la reunin ha quedado de manifiesto que la obesidad es una de las reas de salud donde los probiticos y prebiticos estn sumando ms evidencias, basadas en la mejora de microbiota intestinal. Cada vez son ms los estudios centrados en la accin de estos microorganismos sobre la microbiota intestinal, permitiendo hablar ya de un arma ms contra la epidemia de la obesidad, un arma poco explotada hasta ahora, segn Guarner.Entre los datos que avalan esta accin beneficiosa, los expertos han destacado la mejora de los niveles de glicemia, evitando complicaciones de la obesidad como la diabetes tipo 2, la mejora de los niveles de HDL, la disminucin de los de LDL y el equilibrio del colesterol favorable y desfavorable. Otra accin demostrada tiene que ver con la mejora sobre la acumulacin de grasa visceral, la que se acumula en el abdomen, alrededor de las vsceras abdominales, que es la que ms preocupa por su relacin con complicaciones cardiovasculares. Esta grasa de tipo inflamatorio depende en gran medida de la microbiota, por lo que una posible alternativa para ella es la utilizacin de probiticos antiinflamatorios.Presencia internacionalEl Workshop ha contacto con la participacin de destacados expertos internacionales como el presidente de la Sociedad Internacional de Probiticos y Prebiticos, el profesor Colin Hill, del Instituto de Biociencias de la Universidad de Cork de Irlanda. Durante su intervencin Hill ha presentado el proyecto que dirigido recientemente para revisar el concepto de probiticos, un consenso que se public en Nature el pasado mes de junio de 2014.Otra de las intervenciones destacadas ha sido la de la doctora Erika Isolauri, del Departamento de Pediatra del Hospital Universitario Turku (Finlandia), autora del primer ensayo clnico con probiticos publicado en The Lancet en el ao 2000. Isolauri ha presentado los resultados del seguimiento de los 15 aos de este estudio, que consisti en administrar probiticos a las madres con antecedentes de alergia para prevenir la alergia en sus hijos, que tambin fueron tratados con estos microorganismos desde su nacimiento. Entre los resultados, destaca la identificacin de mayor riesgo de obesidad en los nios con menos bifidobacterias.Categorias:Digestivo y Metabolismo

Rev.MVZ Cordobavol.14no.2CrdobaMay/Aug.2009ORIGINALCARACTERIZACIN DE BACTERIAS PROBITICAS AISLADAS DEL INTESTINO GRUESO DE CERDOS COMO ALTERNATIVA AL USO DE ANTIBITICOSCHARACTERIZATION OF ISOLATED PROBIOTIC BACTERIA OF THE LARGE INTESTINE OF PIGS AS ALTERNATIVE TO USING ANTIBIOTICSHenry Jurado G1*, M.Sc, Diana Aguirre F2, Biol, Cristina Ramrez T3, Ph.D.1Universidad de Nario, Facultad de Ciencias Pecuarias, Departamento de Produccin y Procesamiento Animal, Programa de Zootecnia. Pasto, Colombia.2Universidad del Valle.3Universidad del Valle, Escuela de Ingeniera de Alimentos. Cali, Colombia.*Correspondencia:henryjugam@hotmail.comRecibido: Junio 23 de 2009; Aceptado: Agosto 25 de 2009

RESUMENObjetivo.Caracterizar bacterias cido lcticas probiticas aisladas del intestino grueso de cerdos adultos como posible alternativa al uso de antibiticos.Materiales y mtodos. Se incluyeron muestras de intestino grueso de 20 cerdos adultos, para el aislamiento de bacterias lcticas (BAL). La caracterizacin de los parmetros bioqumicos-fisiolgicos de las BAL contemplo la evaluacin del pH del fermento, determinacin de cidos orgnicos por HPLC y deteccin de ismeros de cido lctico. Los procedimientos microbiolgicos evaluaron la capacidad de inhibicin del crecimiento de patgenos y la actividad antagnica del probitico vs antibitico con su interaccin competitiva. Se utilizaron pruebas API CHL 50 para la identificacin de las BAL que se complementaron con la produccin de gas, actividad de catalasa y viabilidad a diferentes concentraciones de sales biliares y temperaturas.Resultados. El plan de anlisis permiti seleccionar dos aislados que se identificaron como:Lactobacillus plantarum1 H1 yLb. plantarum1 H2. Las pruebas microbiolgicas evidenciaron que las BAL seleccionadas inhibieron principalmente los enteropatgenos:Escherichia coli,Salmonella typhimuriumyClostridium perfringens. Las pruebas bioqumicas fueron compatibles con el gneroLactobacillus, mostrando el siguiente perfil: Catalasa negativas; no productoras de gas; productoras de ismeros DL; resistentes a sales biliares y pH ptimo de crecimiento 3.5 a 38C.Conclusiones. Los dos aislados deLactobacillus plantarum1 reunieron las caractersticas para el uso potencial como probiticos. Se recomienda su uso como complemento de terapias con antibiticos y en la elaboracin de inculos para aplicacin en raciones alimenticias de lechones destetos, sin embargo, estudios complementarios se requieren para evaluar el efecto directo del probitico como sustituto del uso de antibiticos in vivo.Palabras clave:Lactobacillus plantarum, probiticos, antibiticos.

ABSTRACTObjective.To characterize probiotic lactic acid bacteria isolated from adult pig intestine as an alternative to antibiotics. Materials and methods. For isolation of lactic acid bacteria, samples of large intestine of 20 adult pigs were included. The characterization of biochemical and physiological parameters of the lactic acid bacteria (LAB) required an evaluation of the pH of the ferment, determination of organic acids by HPLC and detection of lactic acid isomers. Microbiological processes assessed the capacity of inhibiting the growth of pathogenic and antagonistic activity of probiotic antibiotic vs competitive interaction. We used API CH 50 test to identify the LAB supplemented with gas production, catalase activity and viability at different concentrations of bile salts and temperatures. Results. The analysis plan allowed selection of two isolates that were identified as:Lactobacillus plantarum1 H1 yL. plantarum1 H2. Microbiological testing showed that the lactic bacteria selected inhibited the enteropathogensEscherichia coli,Salmonella typhimuriumandClostridium perfringens. The biochemical tests were consistent with the genus Lactobacillus, showed the following profile: catalase negative, non- gas producing, producing isomers DL; resistant to bile salts and pH optimum for growth of 3.5 to 38C. Conclusions. The two isolates ofL. plantarum1 were considered eligible for potential use as probiotics. Its use is recommended in addition to antibiotic therapy and the development of inoculum for use in food rations for weaned piglets, however, additional studies are needed to assess the direct effect of probiotics as a substitute for antibiotics in vivo.Key words:Lactobacillus plantarum, probiotics, antibiotics.

INTRODUCCINUna de las etapas de la vida del cerdo que ms retos presenta a nivel sanitario es la de precebo, en la cual es comn la presentacin de diarreas ocasionadas porEscherichia coli,Clostridium perfringens,Salmonella typhimurium, produciendo deficientes ganancias de peso, pobre conversin alimenticia, trastornos en su sistema inmunolgico y en casos severos la muerte del animal, llegando alrededor del 41% (1).Uno de los procedimientos tradicionalmente utilizados consiste en el suministro de antibiticos, sin embargo, han sido empleados de modo y en dosis inadecuadas, generando la aparicin de cepas resistentes, cada vez ms patgenas y con implicaciones negativas en la salud humana y animal (2). Por este motivo, la Unin Europea ha prohibido su utilizacin, impulsando la investigacin en aplicacin de probiticos (3).Una alternativa al uso de antibiticos son las bacterias lcticas probiticas suministradas a travs de inculos, con el propsito de equilibrar la microbiota intestinal (4). Los probiticos usados en cerdos reducen o eliminan los patgenos en el tracto gastrointestinal, as como residuos de antibiticos y otras sustancias anlogas en productos finales, mejorando el ndice de conversin y reduciendo la incidencia de diarreas (5).La utilizacin de probiticos en la dieta depende en parte de la cepa utilizada; pues, no todas las cepas tienen la misma capacidad de modulacin de la microflora intestinal o de unirse a las clulas intestinales (6). Los mejores probiticos son aislados de los intestinos de los cerdos, motivo por el cual este estudio pretendi buscar una alternativa para reducir o eliminar el uso de antibiticos en cerdos mediante la caracterizacin de bacterias lcticas aisladas del intestino grueso de porcinos adultos y verificar su desempeo in vitro para el tratamiento de infecciones bacterianas durante el destete.MATERIALES Y MTODOSSitio de estudio. El presente estudio se realiz en el laboratorio de Microbiologa y Biotecnologa Aplicada de la seccin de Biologa Marina de la Facultad de Ciencias Naturales y Exactas y en el laboratorio de Biocatlisis y Fermentacin de la Escuela de Ingeniera de Alimentos de la Universidad del Valle, sede de Melndez, Cali, Colombia.Recoleccin de muestras. Procedentes del intestino grueso (parte inicial, media y parte final) de 20 cerdos adultos tomados aleatoriamente para un total de 60 submuestras, en un nmero representativo y recolectadas en el matadero del municipio de Yumbo, de la finca Flores Amarillas, y del matadero de CAVASA ubicado en la va Cali Candelaria (Valle del Cauca).Se incluyeron cerdos adultos para aumentar la viabilidad de los aislamientos de BAL en comparacin de lechones destetos donde su edad y alimentacin dificulta el xito del cultivo in vitro.Obtencin y almacenamiento de microorganismos. Las muestras fueron sembradas por dilucin en agar MRS (7), y azul de anilina para ayudar al reconocimiento de los microorganismos lcticos segn Giraud (8) y Ramirz, (9), incubndose por 48 horas a 32C para seleccionar los microorganismos facultativos. Despus del crecimiento de colonias, se realiz la coloracin de Gram para verificar la pureza y seleccionar aquellas colonias con caractersticas similares. Finalmente se sembraron en caldo MRS, y criopreservaron en glicerol al (25%) a -20C.Seleccin de cepasAnlisis de produccin de cidos orgnicos por cromatografa lquida de alta eficiencia (HPLC) como mtodo de diferenciacin de cepas. Permitiendo caracterizar las bacterias en cuanto a la produccin de cido lctico determinando si son homo o hetero-fermentativas, estableciendo un perfil caracterstico para cada especie (6), descartando fcilmente cepas con perfiles idnticos. As, el caldo de crecimiento se centrifug a 8500 r.p.m., filtrando el sobrenadante por membrana de 0.45 m.La cidos orgnicos fueron determinados por HPLC as: Solvente de fase mvil, cido sulfrico a pH 1.5; presin 800-900 PSI; volumen inyectado: 20 L; temperatura del horno: 65C; columna BIORAD aminex HPX 87 H con soporte de resina transplantada H+ (copolmero de estireno y bisulfato de divinilbenzeno).Poder de inhibicin frente a patgenos y comparacin frente a antibiticos.Ensayos de inhibicin in vitro. La seleccin de cepas inhibidoras de patgenos, se hizo siguiendo la mtodologa de Tagg y Mc Given (10) y Ramrez (9), utilizando bacterias de referencia como:Salmonella typhimuriumATCC 14028, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Staphylococcus aureus ATCC 25923,Escherichia coliATCC 25922,Clostridium perfringensATCC 13124, Serratia marcensces ATCC 13280, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Proteus hauseri ATCC 13315, Yersinia enterocolitica ATCC 23715, Shigella flexneri ATCC 12022 y Vibrio spp. La determinacin de la accin inhibitoria por sobrenadantes del cultivo, neutralizados y concentrados hasta el 10%, 25%, 50% frente a bacterias patgenas, se realiz por el mtodo de difusin en pozos. El volumen de inoculo del sobrenadante fue de 200 mL a una densidad celular de acuerdo con la evaporacin del mismo. El dimetro del pozo fue de 4 mm. El ensayo se hizo en agar CASO (Peptona de casena, peptona de harina de soya, USP para microbiologa).En el caso deC. perfringensse probaron los sobrenadantes hasta el 75% y 100% de concentracin. De igual manera, se aplicaron los ensayos de inhibicin frente a los antibiticos: ampicilina (AMP) 10 g, penicilina G (P) 10 g, carbecinicilina (CAR) 100 g,vancomicina (VA) 30 g, amoxicilina (AML) 10 g, aztreonam (ATM) 30 g, tetraciclina (TE) 30 g, eritromicina (E) 15 g, oxitetraciclina (OT) 30 g, y cloranfenicol (C) 30 g, mediante la metodologa de Dopazo et al (11) y Jorgensen et al (12), con el propsito de comparar la accin de las bacterias.Finalmente se efectuaron ciclos de siembra de las bacterias lcticas seleccionadas frente a patgenos con una frecuencia determinada hasta cuando se presentara resistencia por parte de las patgenas frente a las bacterias lcticas.As, despus de cada siembra, se observ la resistencia o sensibilidad de la bacteria patgena por la accin de la bacteria lctica. Si se presentaba sensibilidad, de ese mismo agar donde se haba hecho la prueba se tomaba la bacteria patgena y se volva a repetir la prueba en una frecuencia hasta cuando presentara resistencia.Ensayos de interaccin competitiva in vitro con aplicacin de los probiticos seleccionados. Se probaron dosis de 1.0, 0.5 y 0.25 ml de los patgenos con cada una de las bacterias lcticas seleccionadas (dosis de 1.5, 1.0 y 0.5 ml) y concentracin de 107 UFC/ml correspondiente a un Estndar Mc Farland 2, disponible en elkitAPI 50 CHL para bacterias lcticas. El inoculo se ajust por espectrofotometra a una longitud de onda de 650 nanmetros, comparando la densidad ptica del inculo hasta llegar a 0.243 equivalente a la densidad ptica del estndar 2.0 en la escala de Mc Farland.Los inculos de las bacterias patgenas fueron desarrollados en caldo TSA (Caldo Triptona Soja) a 30C por 24 horas y ajustada la concentracin a 107 UFC/ml. Los resultados de interaccin competitiva fueron cuantificados por el mtodo de conteo en placa, sembrando cada bacteria lctica con cada patgena en caldo TSA (Triptona soya), por un periodo de incubacin por 24 horas. Posteriormente fueron sembrabas en agar Mac Conkey, agar Baird Parker y en agar MRS respectivamente, para determinar la presencia de crecimiento o de inhibicin. Se evalu por tincin de Gram morfologa de la bacteria lctica.Estudio de viabilidad frente a concentracin de sales biliares. Utilizando el mtodo de Yimin et al (13), probando concentraciones de 5 y 10% de sales biliares p/v, y efectuando la prueba de viabilidad.Produccin de gas. Siguiendo la metodologa de Yimin et al (13).Actividad de catalasa. Mediante la utilizacin de perxido de hidrgeno sobre las colonias de las bacterias lcticas seleccionadas (14).Viabilidad a diferentes concentraciones de pH. Segn metodologa de Yimin et al (13), con pH de 2, 3, 4 y 6.5.Deteccin de los ismeros del cido lctico. Segn metodologa de Jehanno et al (15).Resistencia a diferentes niveles de temperatura. Segn metodologa de Yimin et al (13) y a temperaturas de 35, 40 y 45C.Anlisis estadstico. Basado en la exploracin de datos y una estadstica descriptiva con mtodos grficos y estimativos.Identificacin bioqumica de las bacterias lcticas. Utilizando galeras API 50 (Biomereux) De Roissart y Luquet (16).RESULTADOSEn la seleccin de las cepas, se aislaron 30 microorganismos con caractersticas de bacterias lcticas, utilizando el medio MRS con azul de anilina, presentando caractersticas diferentes en tamao, borde, elevacin y topografa entre otras. Los resultados de la caracterizacin de los microorganismos, muestran que las cepas (Pro 1b y Pro 2b), cumplieron con las caractersticas deseadas para microorganismos probiticos (Tabla 1).Tabla 1. Seleccin preliminar de cepas aisladas del intestino grueso de cerdos adultos.

(Pro4b y Pro9b cepas seleccionadas como Pro1b y Pro2b respectivamente). + = Prueba positiva; - = Prueba negativaEl analsis por HPLC, indica que la cepa Pro 1b fue homofermentativa, presentando una produccin de cido lctico del 80% y Pro 2b es heterofermentativa con presencia de cido ctrico y actico (Tabla 2yFigura 1).Tabla 2. Perfil caracterstico de la produccin de cidos orgnicos, concentracin gramos/litro (g/l) para Pro 1b y Pro 2b.

Figura 1. Cromatograma de la produccin de cidos orgnicos para Pro 1b (a) y Pro 2b (b)En la prueba de accin inhibitoria, Pro 1b y Pro 2b, presentaron inhibicin frente aE. coli,S. aureusy P. aeruginosa, Shigella flexneri hasta el cuarto ciclo (Tabla 3yFigura 2).Tabla 3. Accin inhibitoria de Pro 1b y Pro 2b, frente a bacterias patgenas.

Figura 2. Accin inhibitoria de Pro 2b frente a Shigella flexneri(a) y Pseudomonas aeruginosa (b).Los resultados de la prueba de susceptibilidad antimicrobiana de antibiticos frente a bacterias patgenas aparecen en latabla 4.Tabla 4. Prueba de susceptibilidad antimicrobiana de antibiticos contra patgenos.

(+) y (-) Resistencia y Susceptibilidad de las bacterias patgenas frente a los antibiticos.Lafigura 3explica la relacin del tamao del halo promedio asociado a cada antibitico (puntos negros) y la desviacin promedio de los tamaos con respecto al tamao promedio (puntos rojos).

Figura 3. Promedio tamao del halo vs. desviacin estndar entre antibiticos.Se observa que los tamaos de halo de los antibiticos aztreonam con un promedio de halo ms alto y una varianza considerablemente pequea corroboran lo presentado en latabla 4donde se muestra una mayor susceptibilidad por parte de las bacterias patgenas a este antibitico; el antibitico vancomicina su promedio fue menor que la varianza y el coeficiente de variacin es mayor que la unidad, donde las bacterias patgenas fueron resistentes; indicando que existe mucha variabilidad entre de los antibiticos.La prueba de susceptibilidad antimicrobiana frente a bacterias lcticas probiticas, indica Pro 1b mostr resistencia a la ampicilina, carbenicilina, vancomicina, ampicilina y amoxicilina; y fue sensible a la tetraciclina, eritromicina. En cambio, Pro 2b mostr ser resistente a la ampicilina, vancomicina y amoxicilina; y fue sensible a la tetraciclina, eritromicina, oxitetraciclina, carbecinicilina, penicilina, cloranfenicol y ampicilina (Tabla 5).Tabla 5. Prueba de susceptibilidad antimicrobiana frente a bacterias lcticas.

(+) y (-) Resistencia y Susceptibilidad de las bacterias probiticas frente a antibiticos respectivamente.Lafigura 4explica como Pro 1b y Pro 2b presentaron la mayor susceptibilidad para el antibitico eritromicina y cloranfenicol; mientras que la mayor resistencia se present para los antibiticos vancomicina y aztreonam. Para el antibitico penicilina, Pro 1b mostr resistencia, en cambio para Pro 2b present susceptibilidad a este antibitico.

Figura 4. Susceptibilidad antimicrobiana de Pro 1b y Pro 2b.La aplicacin de los sobrenadantes de Pro 1b al 90% de evaporacin inhibieron aE. coli,S. typhimurium, S. flexneri,S. aureusy P. hauseri. A una evaporacin del 50%, inhibieron el crecimiento deS. aureus, S. flexneri y P. hauseri. Adems, a una evaporacin del 25% inhibieron aS. aureus. Finalmente a un 25% y a 0% de evaporacin inhibieron aC. perfringens. Las diferentes concentraciones de los sobrenadantes no inhibieron el crecimiento de P. aeruginosa, S. marcescens y K. pneumoniae. La aplicacin de los sobrenadantes al 90% de evaporacin para Pro 2b, inhibieron a P. aeruginosa yS. aureus; a una evaporacin del 25% inhibieron aE. coli,S. typhimurium, P. hauseri,S. aureusy K. pneumoniae, y a una evaporacin del 50% paraS. aureus, S. flexneri y P. hauseri inhibieron su crecimiento. Para S. marcescens los diferentes niveles de evaporacin no ejercieron efecto inhibitorio. A niveles de evaporacin de 25% y 0% Pro 2b inhibieron aC. perfringens. Los ensayos de interaccin competitiva in vitro entre Pro 1b y Pro 2b presentaron efecto de inhibicin de su crecimiento entre s, indicando que no se pueden usar las dos cepas conjuntamente.En la interaccin competitiva de Pro 2b (1ml) contraE. coli,S. typhimurium,C. perfringensyS. aureus(0.25, 0.50 y 1 ml), esta dosis inhibieron el crecimiento de estos patgenos. A una dosis de 0.5 ml Pro 2b inhibi el crecimiento deE. coli,S. typhimurium,C perfringensyS. aureus(0.25, 0.50 y 1 ml), excepto para un valor de 1 ml usado en C. perfringuens,S. typhimuriumy para 0.5 ml usado enE. coli. Los resultados de la interaccin competitiva de Pro 2b (1.5 ml) inhibi el crecimiento deE. coli,S. typhimurium,C. perfringensyS. aureus(0.25, 0.50 y 1 ml), excepto para 0.5 ml usado enS. typhimurium.La interaccin competitiva de Pro 1b (1ml) inhibi el crecimiento deE. coli,S. typhimurium,C. perfringensyS. aureus(0.25, 0.50 y 1 ml), excepto para 1 ml usado enS. typhimurium. Los resultados de Pro 1b (0.5 ml) inhibieron aE. coli,S. typhimurium,C perfringensyS. aureus(0.25, 0.50 y 1 ml). Finalmente, Pro 1b a una dosis de 1.5 ml inhibi el crecimiento deE. coli,C. perfringens,S. typhimuriumyS. aureus(0.25, 0.50 y 1 ml).La viabilidad a diferentes tiempos en pH= 3.5 aparece en laTabla 6. La prueba de catalasa para Pro 1b y Pro 2b fue negativa.Tabla 6. Prueba de viabilidad (UFC/mL) a concentraciones de pH = 3.5

Los resultados de la prueba de crecimiento a 50C por 24 horas, no presentaron crecimiento, para Pro 1b y Pro 2b. A 45C por 24 horas, Pro 1b y Pro 2b presentaron un crecimiento de 1.0 x107 UFC/ml y 3.0 x 1011 UFC/ml respectivamente. Finalmente a 38C por 24 horas, Pro 1b y Pro 2b mostraron un crecimiento de 4.0 x 108, 5.0 x 109 UFC/ml, y de 1.0 x 108, 6.0 x 108 y 1.0 x 109 UFC/ml respectivamente.La prueba de produccin de gas para Pro 1b y Pro 2b fue negativa (ausencia de crecimiento).A una concentracin del 10% de sales biliares Pro 1b y Pro 2b mostraron un crecimiento de 9.0 x 107, 2.0 x 108 y 2.0 x 1010 UFC/ml, y de 1.0 x 108, 1.0 x 107 y 1.0 x 108 UFC/ml respectivamente.Pro 1b y Pro 2b a una concentracin del 5% de sales biliares indicaron un crecimiento de 2.0 x 106 UFC/ml, y de 4.0 x 107, 2.0 x 108 y 3.0 x 1010 UFC/ml respectivamente. Las bacterias Pro 1b y Pro 2b fueron productoras del ismero DL (Tabla 7yFigura 5), que segn la FAO/WHO (10) no produce efectos txicos en la salud humana o animal.Tabla 7. Cepas Pro 1b y Pro 2b productoras de ismeros DL del acido lctico.

Figura 5. Ismeros DL de acido lctico producidos por Pro 1b y Pro 2b.Por medio de la galera API 50 CHL, fueron identificadas bioqumicamente las cepas Pro 1b y Pro 2b comoLactobacillus plantarum1, las cuales presentaron como caracterstica especial un comportamiento bioqumico igual al fermentar el azcar 2-cetogluconato potsico y se diferenciaron en la fermentacin del azcar D-sorbitol, ya que Pro 1b present una fermentacin positiva y Pro 2b fue negativa. Para diferenciarlas se nombraron comoL. plantarum1 H1 (Pro 1b) yL. plantarum1 H2 (Pro 2b).DISCUSINLa importancia de aislar bacterias lcticas probiticas del cerdo, para utilizarlas en la misma especie es fundamental por la especificidad del hospedero, fortaleciendo su sistema inmunolgico, facilitando la colonizacin de las bacterias lcticas y su accin probitica. Esto constituye una alternativa basada en la limitacin del crecimiento de patgenos en el intestino, fomentando el crecimiento de otras bacterias que compitan contra estas en la colonizacin de los nichos intestinales, es decir la exclusin competitiva (17).Los probiticos puede sustituir las terapias con antibiticos como un mtodo menos agresivo, siendo una nueva visin en la industria farmacutica, desde el aislamiento de probiticos de ecosistemas especficos tales como un hato o regin geogrfica, caracterizar las bacterias responsables de la accin probitica, producirlas a escala industrial, procesarlas y reintroducirlas a la dieta del animal. En muchos casos el uso no selectivo de probiticos distribuidos por casas comerciales ha resultado baja o nula eficiencia en el aumento de la produccin, debido a que los probiticos adquiridos proceden de otras regiones geogrficas o incluso de otras especies animales (18).Los resultados de cromatografa lquida (HPLC), demostraron queL. plantarum1 H1 presenta un comportamiento homofermentativo con produccin del 80% de cido lctico, existiendo una diferencia entre las dos cepas. La presencia de cido lctico podra actuar como inhibidor de microorganismos patgenos debido a su mayor prevalencia. Adems, las bacterias con una alta produccin de cido lctico, disminuyen el pH del medio (9).La prueba de susceptibilidad antimicrobiana entre antibiticos y bacterias patgenas, indic que los antibiticos con mejores resultados fueron oxitetraciclina, aztreonam y cloranfenicol, este ltimo por su toxicidad en animales y humanos, ha sido prohibido. Estos resultados son importantes porque uno de los problemas ms significativos en la produccin porcina es la alta mortalidad (41%), especialmente en la lactancia y destete ocasionada por diarrea bacteriana (1,2).

En la prueba de susceptibilidad antimicrobiana entre antibiticos y bacterias lcticas probiticas,L. plantarum1 H1 presenta resistencia a la mayora de antibiticos utilizados, mostrando sensibilidad a tetraciclina, eritromicina, oxitetraciclina y cloranfenicol. Lo anterior permite predecir que de las dos BAL seleccionadas en esta investigacin (L. plantarum1 H1 yL. plantarum1 H2), se recomienda el uso deL. plantarum1 H1 como coadyuvante en la terapia antibitica ya que segn los resultados de la prueba in vitro el microorganismo presenta resistencia a la mayora de antibiticos utilizados, en contraste con la sensibilidad observada deL. plantarum1 H2. Mientras queL. plantarum1 H2 fue resistente a ampicilina, vancomicina y aztreonam, por lo cualL. plantarum1 H1 sera recomendable estudios previos fase III (modelo animal in vivo), para evidenciar su uso como alternativa a antibiticos en cerdos. La sensibilidad de las cepas podra depender de la resistencia a ciertas concentraciones de antibiticos, debido a la presencia de algunos plsmidos, o a propiedades particulares de la pared y membrana de estos microorganismos hacindolos impermeables a antibiticos. Adems, el gnero Lactobacillus es sensible a penicilina y coincidieron con la susceptibilidad deL. plantarum1 H2 (19).Segn este comportamiento y los resultados estadsticos, estas bacterias lcticas generan mucha variabilidad frente a la aplicacin de los 10 antibiticos, es decir, no existe un comportamiento constante que determine con certeza el grado de susceptibilidad o resistencia de una bacteria, aunque el promedio deL. plantarum1 H1 indic ms resistencia a los 10 antibiticos queL. plantarum1 H2.En las pruebas de accin inhibitoria deL. plantarum1 H1 yL. plantarum1 H2 frente a las bacterias patgenas presentaron actividad antimicrobiana hasta un cuarto ciclo de siembra. Esta accin pudo ser por la produccin de substancias inhibitorias como: cido lctico, perxido de hidrgeno y los sobrenadantes, posiblemente bacteriocinas, caracterstico del metabolismo de las bacterias lcticas (20).En el caso de los sobrenadantes producidos porL. plantarum1 H1 se present su mayor accin inhibitoria a un nivel de concentracin del 10%, en contraste paraL. plantarum1 H2 fue al 25% de concentracin del sobrenadante, lo que indica que si bien son muy eficaces estas 2 bacterias probiticas contra la mayora de patgenos, estos niveles de concentracin tan altos resultan ser muy costosas y de difcil obtencin. Sin embargo, no debe olvidarse cul puede ser el tipo de compuesto inhibitorio que producen estos dos microorganismos y se recomendara efectuar estudios referentes a la identificacin de ellos.Un resultado importante se obtuvo cuando los dos microorganismos seleccionados a niveles de evaporacin del 0 y 25% de los sobrenadantes inhibieron el crecimiento deC. perfringens. Esto puede ser debido a la accin de las biocinas (20).En la interaccin competitiva deL. plantarum1 H2 (1ml) contraE. coli,S. typhimurium, C. perfringnes yS. aureus, fue capaz de inhibir su crecimiento; y paraL. plantarum1 H1 (0.5 y 1.5 ml) contraE. coli,S. typhimuriumyS. aureustambin fue capaz de inhibir su crecimiento. Segn lo anterior,L. plantarum1 H2 resulta ser el ms indicado para su uso debido que se requiere una dosis menor de aplicacin para su accin inhibitoria obteniendo como resultado un menor costo en su produccin (21).En la prueba de interaccin competitiva entreL. plantarum1 H1 yL. plantarum1 H2, se observ que se inhiben entre s, por lo tanto, para este estudio no sera viable una mezcla de estos microorganismos para la elaboracin de inculos.Los resultados de la prueba de viabilidad a diferentes concentraciones de pH, son de gran importancia para saber si las bacterias probiticas a utilizar presentan una viabilidad alta a pH bajo, como es el caso del que se presenta en el estmago del lechn, donde puede alcanzar valores hasta de pH 2.0, indicndo que los probiticos seleccionados son los apropiados para favorecer los procesos de fermentacin, en la produccin de inculos. La tolerancia a cidos es una de las primeras propiedades evaluadas al seleccionar cepas probiticas (22).Los resultados obtenidos demostraron la capacidad de las cepas para sobrevivir en condiciones drsticas de acidez. De otro modo, esta resistencia a pH bajos, favorece la inhibicin de patgenos a lo largo del tracto intestinal, favoreciendo los sitios de adhesin de los microorganismos lcticos (23). Adems, se pudo observar que en la prueba de pH a 3.5 las viabilidades en el tiempo T0, T1 y T2 deL. plantarum1 H2 yL. plantarum1 H1, los resultados fueron similares excepto con una pequea variacin en el tiempo T2, indicando, que si el lechn consume el alimento, hasta las tres horas las bacterias lcticas del inculo mantienen una viabilidad alta (mayor a 3.0 x 108 UFC/ml), por lo tanto su accin probitica ser eficaz contra los microorganismos patgenos presentes en el intestino del animal.La prueba de catalasa de las dos cepas fueron negativas, caracterstica general del generoLactobacillus, y concuerda con Roissart y Luquet (16), quienes describen que las cepas lcticas carecen de la enzima.

Los resultados de la produccin de gas paraL. plantarum1 H1 yL. plantarum1 H2 fueron negativos, constituyendo una importante caracterstica probitica de las bacterias lcticas utilizadas en la alimentacin animal y que pueden evitar que el animal presente enfermedades como el meteorismo, que en casos severos llevan a la muerte del mismo.Al analizar el efecto de diferentes temperaturas en el crecimiento de las cepas de bacterias lcticas se observ que adems de la temperatura ptima de crecimiento (32C), las 2 bacterias seleccionadas presentaron una termotolerancia con un gran crecimiento a una temperatura de 38C (24).L. plantarum1 H1 yL. plantarum1 H2 demostraron que son capaces de crecer a altas concentraciones de sales biliares (5 y 10%). Segn Brizuela (6) esta capacidad de crecer en presencia de altas concentraciones de bilis a las que pueden encontrarse en el intestino (0.15%) es un parmetro importante (25-26), para los microorganismos que componen los preparados probiticos para ser administrados por va oral a animales. Esto les permite pasar a travs del tracto gastrointestinal sin sufrir alteraciones en su comportamiento fisiolgico. As, para que una cepa probitica ejerza una ptima actividad es imprescindible que sea capaz de manifestar una actividad metablica que le permita colonizar el intestino delgado; por lo que la tolerancia a bilis, es un criterio esencial de seleccin de bacterias lcticas (27).Las dos bacterias seleccionadas presentaron produccin de ismeros DL de acido lctico, lo cual constituye una importante caracterstica probitica, ya que segn la FAO (3) y Jehanno et al (15), recomiendan para uso humano o animal y para la elaboracin de los inculos los ismeros DL o L+ de cido lctico, rechazando el uso del cido lctico D (-) por sus efectos secundarios.En concluscin,Lactobacillus plantarum1 H1 yLactobacillus plantarum1 H2 mostraron un gran perfil de bacterias lcticas con caractersticas probiticas, siendo una alternativa para sustituir las terapias con antibiticos como un mtodo menos agresivo y una nueva visin en la industria farmacutica. Adems, estos microorganismos seran utilizados en la fabricacin de inculos y posterior aplicacin mediante el procesamiento e introduccin en la racin para los lechones destetos.AgradecimientosA la empresa CERDOS DEL VALLE S.A. (CERVALLE), de la ciudad de Cali, por la financiacin de esta investigacin que constituyen los resultados preliminares del trabajo de tesis doctoral desarrollado en la Universidad del Valle. A la Escuela de Ingeniera de Alimentos y al personal del laboratorio de Microbiologa y Biotecnologa Aplicada de la seccin de Biologa Marina de la Facultad de Ciencias Naturales y Exactas. A todas personas que de una u otra manera colaboraron para el desarrollo de esta investigacin.REFERENCIAS1. Meja-Silva W, Rubio-Guilln J, Calatayud-Mrquez D, Rodrguez-Caldera A, Quintero-Moreno A. Evaluacin de dos probiticos sobre parmetros productivos en lechones lactantes. Zoot Trop 2007; 25:301-306.[Links]2. Prez N, Fajardo P, Mendez J, Cachaldora P, Pastrana CL. Production of four potentially probiotic lactic acid bacteria and their evaluation as feed additives for weaned piglets. Anim Feed Sci Technol 2006; 134: 89-107. [Links]3. FAO/WHO Working Group. Guidelines for the evaluation of probiotics in food, 2002 (Fecha de acceso 5 de enero de 2005) URL disponible en:ftp://ftp.fao.org/es/esn/food/wgreport2.pdf. [Links]4. Oyetayo VO, Oyetayo FL. Potential of probiotics as biotherapeutic agents targeting the innate immune system. Afr J Biotechnol 2005; 4: 123-127.[Links]5. Figueroa J, Chi E, Cervantes M, Dominguez A. Alimentos funcionales para cerdos al destete. Vet Mx 2006; 37: 117-136. [Links]

6. Briizuela MA. Seleccin de cepas de bacterias cido lcticas para la obtencin de un preparado con propiedades probiticas y su evaluacin en cerdos. [Tesis doctoral] La Habana: Instituto Cubano de los Derivados de la Caa de Azcar, ICIDCA, Facultad de Ciencias Veterinarias; 2003.[Links]7. De man JC, Rogosa M. and Sharpe, M.E. A medium for the Cultivation of Lactobacilli. J Appl Bact 1960 ; (23) : 130-135. [Links]8. Giraud E. Contribution a l'etude physiologique et ezimologique d'une nouvelle souche deLactobacillus plantarumamylolytique isolee du mandioc fermente. [Thse] Marseille: Universit demProvence aix; 1992.[Links]9. Ramrez C. Uso de bactrias lcticas probiticas na alimentao de camares Litopenaeus vannamei como inibidoras de microrganismos patognicos e estimulantes do sistema imune. [Tese de doutorado]. Curitiba: Universidade Federal do Paran, Setor de Tecnologa; 2005.[Links]10. Tagg JR, Mc. Given AR. Assay sistem for bacteriocins. J Appl Microbiol 1971; 21:943.[Links]11. Dopazo CP, Lemos ML, Lodeiros C, Bolinches J, Barja L, Toranzo AL. Inhibitory activity of antibiotic-producing marine bacteria against fish pathogens. J Appl Bacteriol 1998; 65: 97-101.[Links]12. Jorgensen JH, Turnidge JD, Washington JA. Antibacterial susceptibility tests: dilution and disk diffusion methods. In: Myrray, PR, Pfaller MA, Tenover FC, Baron EJ, Yolken RH. Manual of clinical microbiology. 7th ed. Washington, DC: ASM Press; 1999.[Links]13. Yimin C, Yoshimi B, Takashi N, Tae-Kwang O. Specific probiotic characterization of Weissella hellenica DS-12 isolated from flounder intestine. In: Ramrez C. Uso de bactrias lcticas probiticas na alimentao de camares Litopenaeus vannamei como inibidoras de microrganismos patognicos e estimulantes do sistema imune. [Tese de doutorado]. Curitiba: Universidade Federal do Paran, Setor de Tecnologa; 2005.[Links]14. Dahl TA, Midden WE, Hartman DE. Comparation of killing of Gram-negative and Gram-positive Bacteria by Pure Singlet Oxygen. In: Ramrez C. Uso de bactrias lcticas probiticas na alimentao de camares Litopenaeus vannamei como inibidoras de microrganismos patognicos e estimulantes do sistema imune. [Tese de doutorado]. Curitiba: Universidade Federal do Paran, Setor de Tecnologa; 2005.[Links]15. Jehanno D, Thuault D, Bourgeois C. M. Development of a Method for Detection of Lactic Acid Bacteria Producing Exclusively the L (+) Isomer of Lactic Acid. J Appl Environ Microbiol 1992; 58:4061-4067.[Links]16. De Roissart H, Luquet FM. Bacteries lactiques Aspects Fondamentaux et Technologiques. 2 Ed. France: Lorica; 1994.[Links]17. Pluske J, Pethick D. El impacto de la nutricin sobre desrdenes y enfermedades de tipo entrico en porcino. Australia: Murdoch University; 2005.[Links]18. Schrezenmeir J, De Vrese, M. Probiotics, prebiotics and symbiotics: approaching a definition. Am J Clinical Nutr 2001; 73 (2):361-364. [Links]19. Ramayoni S, Chivas M. Estudio de la actividad antimicrobiana de extractos naturales y cidos orgnicos. Posible alternativa a los antibiticos promotores de crecimiento. [Tesis de maestra]. Barcelona: Universitat Autnoma de Barcelona, Departament de sanitat i anatomia animals; 2007.[Links]20. Savadogo A, Ouattara CA, Bassole IH, Traore AS. Bacteriocins and lactic acid bacteria: a mini review. Afr J Biotechnol 2006; 5 (9):678-683.[Links]21. Finegold SM and Baron EJ. Bailey and Scott's Diagnostic Microbiology. 7 th ed. St Louis: C.V. Mosby; 1986.[Links]22. Tuomola EM, Crittenden R, Playne M, Isolauri E, Salminen SJ. Quality assurance criteria for probiotic bacteria. Am J Clin Nutr 2001; 73: 393-398.[Links]23. Iiguez C, Perez R, Acedo E. Evaluation of probiotics properties in Lactobacillus isolated from small intestine of piglts. Latinoam Microbiol 2007; 49:3-4.[Links]24. Taras D, Vahjen W, Simon O. Probiotics in pigs - modulation of their intestinal distribution and of their impact on health and performance. Liv Sc 2007; 108:229-231.[Links]25. Carr FJ, Chill D, Maida N. The lactic Acid Bacteria: A Literature. Crit Rev Microbiol 2001; 28:281-370.[Links]26. Pieper R, Janczyk P, Urubschurov V, Korn U, Pieper B, Souffrant WB. Effect of a single oral administration ofLactobacillus plantarumDSMZ 8862/8866 before and at the time point of weaning on intestinal microbial communities in piglets. Int J Food Microbiol 2009; 130 (3):227-232.[Links]27. Mar L, Wolfaardt GM, Dicks LM. Adhesion ofLactobacillus plantarum423 and Lactobacillus salivarius 241 to the intestinal tract of piglets, as recorded with fluorescent in situ hybridization (FISH), and production of plantaricin 423 by cells colonized to the ileum. J Applied Microbiol 2006; 100(4):838-845.[Links]