Genética Molecular1. El ADN como material hereditario. Experimento de Griffith (Pág. 245)2. Replicación del ADN (Pág. 126-129)3. Transcripción y maduración del ARN (Págs. 248-250)4. Traducción o síntesis de proteínas (Págs. 253-255)5. El código genético (Págs. 251-252)6. El concepto de gen (Págs. 246-247)7. La retrotranscripción. (Pág. 247)

1. El ADN como material hereditario. Experimento de Griffith

Experimento realizado en 1928 con la bacteria Streptococcus pneumoniae.

Cepa S: bacterias encapsuladas, virulentas.Cepa R: bacterias sin cápsula, inócuas.

1er experimento:

+ bacterias S → Se recuperan bacterias vivas

2º experimento:

+ bacterias R → No se recuperan bacterias vivas

3er experimento:

+ bacterias S → No se recuperan bacterias vivas muertas por calor

4º experimento:

+ bacterias R → Se recuperan bacterias S vivas. y bacterias S

muertas por calor

Conclusión: un “principio transformante” ha pasado de las bacterias S muertas por calor a las bacterias R y las ha transformado en virulentas.

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En 1944, Avery y sus colaboradores demostraron que el principio transformante de Griffith era ADN. El ADN es el material genético de las bacterias. Sólo un extracto de células S que contenga ADN es capaz de inducir la trasformación.

2. Replicación del ADN

-Modelos posibles-Proceso: iniciación y elongación-Diferencias de la replicación en procariotas y eucariotas-Mecanismo de corrección de errores.

Modelos posibles

Teóricamente, a partir de una molécula de ADN la duplicación puede seguir tres modelos:

-Modelo conservativo: se conserva la hebra primitiva y se sintetiza otra molécula completamente nueva.

-Modelo semiconservativo: se producen dos moléculas de ADN mixtas, cada una con una hebra primitiva y otra de nueva síntesis.

-Modelo dispersivo: las dos moléculas de ADN presentan fragmentos nuevos y primitivos en cada una de sus dos hebras.

La evidencia experimental apoya el modelo semiconservativo.

Proceso de replicación

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IniciaciónLa duplicación del ADN se inicia en un lugar de la doble hélice que se conoce como origen (Ori C: repetición de secuencias GATC). En este punto de forma una "burbuja de replicación" con todos los componentes implicados. A partir del origen la replicación avanza en sentidos opuestos, por lo que se dice que es bidireccional.

En la burbuja de replicación actúan varias enzimas:

-Topoisomerasas y girasas desenrollan la doble hélice.-Helicasa: rompe los puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas y abre el ADN a modo de cremallera.-Primasa: es una ARN polimerasa ADN dependiente; su función es fabricar un pequeño fragmento de ARN que actúa como cebador.-ADN polimerasa: duplica el ADN. En procariotas existen tres tipos de ADN polimerasas denominadas I, II y III.

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Las proteínas SSB o DBP se unen al ADN para impedir su enrollamiento.

La ADN polimerasa es incapaz de iniciar la síntesis de ADN. Es necesario que una ARN polimerasa fabrique un corto fragmento de ARN, llamado primer, que actúa como cebador. La ADN polimerasa une al extremo 3'OH libre del cebador los desoxirribonucleótidos correspondientes según la complementariedad de bases de la hebra patrón (A-T y G-C). La dirección de síntesis es, por tanto, 5'—› 3'. La polimerasa no puede actuar en sentido inverso.

Elongación

Hay una hebra conductora que se sintetiza de forma continua en sentido 5'—› 3', y una hebra retardada, que se fabrica de forma discontinua en pequeños fragmentos, en el mismo sentido 5'—› 3'. Se trata de segmentos de ADN de unos 1000 a 2000 nucleótidos llamados fragmentos de OKAZAKI, en honor a su descubridor.

En la hebra retardada, la ADN polimerasa I hidroliza los cebadores de ARN gracias a su actividad exonucleasa 5'—› 3', y rellena los huecos formados. Posteriormente, una ADN ligasa, suelda todos los fragmentos.

La energía que alimenta el proceso es suministrada por los enlaces ricos en energía de los nucleótidos trifosfato que intervienen: dATP, dGTP, dCTP y dTTP.

Corrección de errores

La ADN polimerasa es capaz de "leer" el ADN y detectar errores: nucleótidos incorrectos según las leyes del apareamiento. Entonces, su actividad exonucleásica en sentido 3'—>5' elimina los nucleótidos incorrectos y restituye los que corresponden, en sentido 5'—>3'.

Para detectar los errores es necesario diferenciar la cadena nueva y la antigua. Esto se consigue mediante la metilación de las adeninas, proceso que tiene lugar pasado un cierto tiempo. Así, las adeninas de la hebra recién sintetizada no están aun metiladas, al contrario de lo que sucede con las de la hebra antigua, lo cual permite distinguirlas.

La replicación del ADN produce un error cada 107-108 bases incorporadas. El mecanismo de corrección reduce esa cifra a un error por cada 1010. Este hecho de que la corrección no sea del 100%, da lugar a errores de lectura no corregidos o "mutaciones espontáneas" que tienen relevancia en la evolución, porque constituyen un mecanismo adicional de variabilidad.

Diferencias del proceso de duplicación del ADN entre procariotas y eucariotas

Procariotas Eucariotas

Localización Citoplasma Núcleo

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Origen de replicación Único Muchos orígenes

ADN polimerasa Tres tipos Cinco tipos

Proteínas ADN "desnudo", sin proteínas Se incorporan proteínas al ADN (histonas)

Tipo de ADN Circular, sin extremos ADN lineal con extremos (telómeros) que se acortan

En las células eucariontes, cuando se elimina el último ARN cebador, la hebra retardada quedará incompleta, ya que la ADN polimerasa no podrá rellenar el hueco, al ser incapaz de sintetizar en dirección 5'—› 3'.

Este hecho hace que el telómero se vaya acortando un poco cada vez que la célula se divide, proceso que es uno de los responsables del envejecimiento y de la muerte de las células.

En los extremos de los cromosomas existen múltiples repeticiones de una secuencia que no posee información genética. Se repite entre 250 y 1500 veces la secuencia TTAGGG, de modo que el acortamiento no supone un problema de pérdida de información hasta que, tras sucesivas duplicaciones del cromosoma, se pierde el telómero completo, momento en el cual, la pérdida de genes hace a la célula inviable y llega al final de su ciclo de divisiones.

Algunas células, como las generadoras de gametos, las células embrionarias o las cancerosas, propias de tejidos que se dividen continuamente, poseen una enzima llamada telomerasa, que impide el acortamiento de los telómeros. Es una proteína unida a un ARN que actúa como molde para permitir a la ADN polimerasa completar la hebra de ADN.

3. Transcripción y maduración del ARN

-Componentes necesarios-Iniciación-Elongación-Terminación-Maduración del ARN-Diferencias del proceso en procariotas y eucariotas

Componentes necesarios

Se necesitan los siguientes elementos:

-Cadena de ADN que actúe como molde. -La enzima ARN polimerasa -Ribonucleótidos trifosfato: ATP, UTP, GTP y CTP.

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Iniciación

Se produce el desenrollamiento de la doble hélice de ADN y la separación de sus dos cadenas en la zona que se transcribirá a ARN. La ARN polimerasa se une a un centro promotor que consiste en una secuencia corta de nucleótidos que marca el inicio de la transcripción (TATA box, CAAT, etc.).

Elongación

La ARN polimerasa une ribonucleótidos según la complementariedad de la hebra molde del ADN, en sentido 5'—>3', es decir, uniendo cada nucleótido nuevo al extremo 3'OH de la cadena preexistente.

La energía necesaria para el proceso es suministrada por la rotura de los enlaces fosfato de los ribonucleótidos trifosfato que intervienen: ATP, GTP, CTP y UTP se hidrolizan a AMP, GMP, CMP y UMP respectivamente, nucleótidos monofosfato, que es como se incorporan al ARN. En cada una de esas hidrólisis se libera un grupo pirofosfato (PPi) y se libera energía.

Terminación

La ARN polimerasa reconoce una secuencia de terminación que señala el fin de la transcripción. Se separan las moléculas de ARN y ADN y se vuelve a cerrar este.

Maduración del ARN (empalme o "splicing")

Se añade una "caperuza" (CAP) de 7-metil-GTP al extremo 5' del ARN transcrito. Será necesaria para la unión del ARN mensajero formado al ribosoma, en la síntesis de proteínas.

Se produce una poliadenilación o adición de un polinucleótido de adenina (poli A, de unos 200 nucleótidos) al extremo 3'. Su función es proteger al ARN de su degradación, aumentando su vida media en el citosol, para que pueda fabricar mayor cantidad de proteína.

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En las células eucariotas los genes están fragmentados en secuencias codificadoras, llamadas exones, y en secuencias no codificantes o intrones. La maduración consiste en la eliminación de éstas últimas.

Diferencias del proceso de transcripción entre procariotas y eucariotas

Procariotas Eucariotas

Localización Citoplasma Núcleo

ARN mensajero Policistrónico(codifica varios genes)

Monocistrónico(codifica un solo gen)

Maduración No hay Se añaden CAP, poli A y se eliminan los intrones

4. Traducción o síntesis de proteínas

-Componentes necesarios -Elongación-Activación de los aminoácidos -Terminación-Iniciación

Componentes necesarios

Ribosomas ARN mensajero (ARNm) EnzimasAminoácidos ARN de transferencia (ARNt) Energía (GTP)

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Activación de los aminoácidos

Cada aminoácido se une a su ARNt específico gracias a la energía aportada por el ATP y a la actividad de la enzima aminoacil-ARNt sintetasa:

Aminoácido + ARNt + ATP −> aminoacil-ARNt + AMP + PPi

Iniciación

El ARNm se une a la subunidad menor del ribosoma. A continuación se una al mensajero el primer aminoacil-ARNt. Esta unión se realiza gracias a la complementariedad de las bases nitrogenadas del primer triplete del ARNm y el anticodón del ARNt. El primer aminoácido es siempre la metionina (formil-metionina en las células procariotas). Estos procesos están catalizados por unas enzimas llamadas factores de iniciación (Fi). Todos estos elementos forman el complejo de iniciación.

Elongación

Se une la subunidad mayor del ribosoma a la menor.

El ribosoma posee dos centros: el sitio P o peptidil y sitio A o aminoacil. El segundo es el centro aceptor de nuevos aminoacil-ARNt.

El primer aminoácido se une con el segundo mediante enlace peptídico catalizado por una peptidil transferasa. El ARNt sin aminoácido abandona el ribosoma y se produce la translocación ribosomal. El dipeptidil-ARNt se sitúa en el sitio y al sitio A llega otro triplete o codón.

Las enzimas llamadas factores de elongación (Fe) catalizan estos procesos.

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Terminación

La elongación continúa hasta que el triplete de terminación (UUA, UAG o UGA) se instala en el centro A. Este codón es reconocido por los factores de liberación (Fr). Como ninguno de esos codones codifica aminoácido, la peptidil-transferasa hace reaccionar al último grupo carboxilo con agua, lo que hace que la proteína se libere. A continuación se separan el ARNm y las subunidades ribosomales.

Una misma molécula de ARNm puede ser traducida por Varios ribosomas simultáneamente. El conjunto de ellos constituye un polisoma o polirribosoma.

A medida que la cadena peptídica se va construyendo va adoptando sus estructuras secundaria y terciaria. Al finalizar la traducción, algunas proteínas necesitan eliminar ciertos aminoácidos (la metionina inicial, por ejemplo).

5. El código genético

El desciframiento del código genético partía del problema de pasar de un lenguaje de 4 elementos, las cuatro bases nitrogenadas del ADN, a otro que empleaba veinte, el número total de aminoácidos que forman las proteínas.Asignar un aminoácido a una base nitrogenada era claramente insuficiente, porque cuatro bases solo podrían codificar otros cuatro aminoácidos. Un código de dos bases permite hacer 16 parejas diferentes, cifra también inferior al total de veinte aminoácidos. Sin embargo, uniendo las bases nitrogenadas en tripletes, existen 64 combinaciones, número que supera el total de aminoácidos.

Efectivamente es la agrupación en codones de tres nucleótidos el modo en que está codificado el leguaje de la vida. Cada triplete de nucleótidos se traduce en un aminoácido en cada proteína.

Entre los años 1950 y 1960, el premio nobel español Severo Ochoa contribuyó al desciframiento del código genético por su descubrimiento de la enzima polinucleótido fosforilasa en la bacteria Escherichia coli. Esta enzima es capaz de unir nucleótidos para formar ARN. Gracias a ello, se pudo sintetizar ARN de forma artificial en un tubo de ensayo y eso hizo posible vincular cada triplete de bases del

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ARN con el aminoácido codificado por él. El primer paso fue la síntesis de un ARNm formado exclusivamente por UMP, un poli U, que se utilizó para construir un péptido que resultó ser repetición del aminoácido fenilalanina. Consecuentemente los investigadores asociaron el triplete UUU a ese aminoácido.

El código genético muestra las siguientes características:

-Es universal, lo que significa que es utilizado por todos los seres vivos, con la excepción de algunos protozoos, algunas bacterias y el ADN mitocondrial.-Es degenerado: existen codones sinónimos que codifican el mismo aminoácido.-Posee tres codones sin sentido o señales de terminación.-Carece de solapamiento: los tripletes son leídos de manera lineal y continua sin que se compartan bases entre ellos.-Se lee en sentido 5'—>3'.

6. Concepto de gen. El dogma de la Biología Molecular.

Un gen es una secuencia de ADN que se transcribe a ARNm y se traduce a una cadena polipeptídica. Esta serie de pasos se conoce como el dogma de la Biología Molecular:

Las primeras investigaciones relacionaron gen y enzima, estableciendo que un gen era una secuencia de ADN capaz de codificar una enzima. Se expresó así:

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"Un gen, una enzima"

Posteriormente, el concepto se amplió ante la evidencia de que el ADN codificaba cualquier proteína y no todas ellas eran enzimas:

"un gen equivale a una proteína"

Sin embargo, una proteína puede estar formada por varias cadenas polipeptídicas, por lo que el concepto tuvo que ajustarse aun:

"un gen equivale a una cadena polipeptídica"

7. Retrotranscripción

Algunos virus poseen ARN monocatenario como material genético. Un grupo de ellos, al que pertenece el VIH responsable del SIDA, se denominan retrovirus, por ser portadores de una enzima capaz de transcribir el ARN a ADN. Recibe el nombre de transcriptasa inversa o retrotranscriptasa.

El proceso de replicación de estos virus incluye los siguientes pasos:

1º) El virus se une a receptores de membrana específicos de ciertas células (receptores CD4 de ciertos linfocitos T y macrófagos, en el caso del VIH) y penetra en ellas.

2º) El ARN vírico se libera en el citoplasma y la transcriptasa en reverso copia en ADN su secuencia de bases. Se obtiene así un ácido nucleico mixto formado por ARN y ADN.

3º) Se degrada el ARN de la molécula híbrida, quedando ADN simple.

4º) Se sintetiza una cadena complementaria de ADN, con lo que se obtiene un ADN doble o bicatenario.

5º) En el núcleo, este ADN se intercala en alguno de los cromosomas del genoma celular.

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Como consecuencia del descubrimiento de los virus ARN, así como de los retrovirus y de su proceso de retrotranscripción, el dogma de la Biología Molecular tuvo que modificarse, incluyendo los procesos de la replicación del ARN, en los virus que tienen este ácido nucleico como material genético, y de la transcripción inversa:

ACTIVIDADES SOBRE GENÉTICA MOLECULAR

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259 28-29-30-31-33-35-39

1. Deducir la mutación puntual responsable de la anemia falciforme: el aminoácido ácido glutámico (Glu) es sustituido por la valina (Val).

2. Formular el pentapéptido resultante de la transcripción y traducción de la cadena inferior del siguiente fragmento de ADN, en el que la secuencia subrayada es un intrón:

5’ G G G G G A T T A A G G C G T G C C C 3’3’ C C C C C T A A T T C C G C A C G G G 5’

3. La toxina de Corynebacterium diphteriae, causante de la difteria, impide la acción de la translocasa, la enzima responsable de la translocación ribosomal. Razonar por qué el efecto de esa toxina puede matar a la célula.

4. ¿Una célula de la piel de un individuo contendrá la misma información genética que una célula hepática? ¿Sintetizan esas dos células similares las mismas proteínas? Razonar las respuestas.

5. Imaginemos que queremos imitar el proceso de la replicación del ADN en un tubo de ensayo. Para ello disponemos de todas las moléculas necesarias excepto alguna de ellas. Explicar qué ocurriría si faltara:

a) ADN polimerasa I c) Topoisomerasasb) Uracilo d) ADN ligasa

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