APLICACIONES DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR II
“Identificación de la(s) hexocinasa(s) sensor(es) de carbohidratos en maíz”
Giovanna Paulina Aguilera Alvarado
Tutor: Dra. Sobeida Sánchez Nieto
Departamento de Bioquímica
Facultad de Química
2018-1
CLONACIÓN MOLECULAR. La clonación molecular se refiere a los procesos mediante los cuales moléculas de DNA recombinante son producidos y transferido a un organismo hospedero en el cual serán replicadas.
https://www.neb.com/~/media/NebUs/Files/Brochures/Cloning_Tech_Guide.pdf http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi
Embrión de maíz
Se necesitaba un molde…
24h
RNA
Transcripción reversa
cDNA
TRIzol
5’UTR ORF 3’UTR
Mucha similitud
Diseño de primers
¡PCR!
Adenilación y ligación
Miles copias del cDNA de las
HXKs de maíz
Transformación y secuenciación HXKs
aisladas
TECNOLOGÍA GATEWAY®. Esta tecnología usa el sistema de recombinación del fago lamba para facilitar la transferencia de secuencias de DNA heterólogo (flanqueado por los sitios att) entre diferentes vectores. Se basa en dos reacciones de recombinación.
Reacción BP
BP clonasa®
KanR
KanR
Reacción LR
gen
gen
Vector donador
Clona de entrada
gen
Clona de entrada
KanR
AmpR
Vector destino
Clona de expresión
gen
AmpR
KanR
Subproducto
LR clonasa®
https://www.thermofisher.com/mx/es/home/life-science/cloning/gateway-cloning/gateway-technology.html
INDUCCIÓN: Liberación de la represión de los genes.
PRODUCCIÓN DE PROTEÍNA RECOMBINANTE.
BL21 (DE3) Codon Plus RIL (pET-DEST42 Gateway: V5, 6X His).
Inducción con IPTG
RNA pol E. coli
lacI
lacI
RNA pol T7 RNA pol T7
lacI
lacI
RNA pol T7
Gen de interés
Inducción con IPTG
pEXP42
Genoma de E. coli BL21 (DE3)
ptRNAR
ptRNAI
ptRNAL
Probar diferentes condiciones: o Temperatura o Tiempo de inducción o [IPTG] o Cepa o Tag
PRODUCCIÓN DE PROTEÍNA RECOMBINANTE.
Resina
Proteína-6His
ZmHXK
75 kDa
50 kDa
4 5 6 7 8
X No se produjo ZmHXK9. X ZmHXK4, ZmHXK5 y ZmHXK6 insolubles, sin actividad de HXK.
AtHXK1 AtHXK2 OsHXK5 OsHXK6 OsHXK7 OsHXK8 ZmHXK4 ZmHXK5 ZmHXK6 ZmHXK7 ZmHXK8 ZmHXK9
MEM*
Citosol
¿Qué tienen en común?
*Membrana Externa Mitocondrial Balasubramanian et al., Plant Physiol (2007); Cheng et al., Biol Plantarum (2011); Cho et al., Plant Physiol (2009)
Templado en pGEM®-T Easy
ZmHXK5
ZmHXK5Δ30
Se produjo ZmHXK9Δ1-30 ZmHXK4Δ1-30, ZmHXK5Δ1-30, ZmHXK6Δ1-30 y ZmHXK9Δ1-30 solubles, con actividad de HXK.
75 kDa
50 kDa
4Δ30 5Δ30 6Δ30 7 8 9Δ30
ZmHXK
VARIANTES SIN N-TERMINAL.
Diseño de primer 5’
Eliminemos la región hidrofóbica, la PCR es nuestra amiga…
ZmHXK5 ZmHXK5 sin la región hidrofóbica
MEDICIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA. Existen diversas maneras de medir la actividad de una enzima: cuantificando la desaparición del sustrato, la aparición del producto o mediante un ensayo acoplado.
y = 0.1435x + 0.2075
R² = 0.9998
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
Abs
34
0n
m
Tiempo (min)
Curva temporal de actividad de HXK
X Hexosas o ATP marcados. Medición de NADH.
Substrate
Glucose Fructose Mannose ATP
ZmHXK4Δ30
Km (µM) 195.70 ± 31.96 19324.15 ± 3914.89 138.85 ± 22.42 134.90 ± 25.74
Vmax 5.65 ± 0.12
kcat
ZmHXK5Δ30
Km (µM) 136.65 ± 20.01 30216.8. ± 5708.76 119.55 ± 33.30 135.60 ± 11.46
Vmax 4.55 ± 0.34
kcat
ZmHXK6Δ30
Km (µM) 65.86 ± 15.19 4291.84 ± 1410.04 48.85 ± 1.06 198.85 ± 12.80
Vmax 3.60 ± 0.14
kcat
ZmHXK9Δ30
Km (µM) ND ND ND ND
Vmax ND
kcat ND
ZmHXK7
Km (µM) 108.10 ± 17.96 2701.85 ± 590.93 123.79 ± 11.61 28.74 ± 0.30
Vmax 27.19 ± 0.77
kcat
ZmHXK8
Km (µM) 4687 ± 299.53 ND 10396.50 ± 54.31 147.20 ± 62.08
Vmax 17.38 ± 0.24
kcat
OBTENCIÓN DE PARÁMETROS CINÉTICOS.
OBTENCIÓN DE PARÁMETROS CINÉTICOS.
Inhibitor
ADP NAG G6P
IC50 (mM)
ZmHXK4Δ30 0.71 ± 0.15 52.14 ± 16.42 47.49 ± 2.89
ZmHXK5Δ30 0.69 ± 0.15 46.80 ± 1.82 47.46 ± 1.44
ZmHXK6Δ30 0.72 ± 0.14 25.15 ± 2.25 53.54 ± 2.48
ZmHXK9Δ30 ND ND ND
ZmHXK7 6.47 ± 1.14 15.01 ± 3.24 NS
ZmHXK8 3.12 ± 1.14 37.54 ± 1.63 NS ND: Non detected NS: Non significance
Sin actividad. ¿Plegamiento incorrecto?
¿Sistema heterólogo inadecuado?
ENSAYO DE COMPLEMENTACIÓN EN S. cerevisiae. La genética inversa es una disciplina genética que, partiendo del conocimiento de un fragmento de ADN clonado o secuenciado, investiga sobre su función biológica alterando dicho ADN mediante mutación, generalmente a nivel masivo. Dicha mutación puede ser puntual, por sustitución de nucleótidos, o más drástica, por ejemplo mediante silenciamiento de genes completos.
Eason, PNAS (2004); https://es.wikipedia.org/wiki/Gen%C3%A9tica_inversa
¿Cómo se obtiene una mutante de S. cerevisiae? Deleción
Ronda 1 PCR
Homología con el gen de interés
Homología con el gen de interés Primer de homología
Primer de homología
Templado 2
Ronda 2 PCR
Cassette de deleción
La levadura perdió un gen pero adquirió otro, en este caso uno que le permite crecer en presencia de Kan
Confirmación por PCR
Primer UPTAG
Homología con el gen de interés
Templado
Resistencia o prototrofía
Primer DNTAG
Homología con el gen de interés
Inserción del cassete por recombinación homóloga
ENSAYO DE COMPLEMENTACIÓN EN S. cerevisiae. JT 20088: hxk1::HIS3 hxk2::LEU2 glk1::LEU2, fondo genético W303-1a: No es capaz de crecer en presencia de Glu ni en ausencia de uracilo. pDRf1-GW: Alto número de copias, prototrofía a uracilo, gen de interés bajo un promotor constitutivo.
Transformación de la mutante con las diferentes HXKs de maíz: Método LiAc/SS DNA/ PEG.
JT 20088 Crece en YPGal
Crecimiento hasta la fase
mid-log LiAC
SSDNA PEG
DNA de interés
Vórtex
42°C 40 min
Siembra en medio selectivo 29°C, 2-3 días
SGal-URA
Gietz, Yeast Protocols (2014); http://2011.igem.org/Team:WashU/Notebook/Transformation
Crecimiento en presencia de diferentes hexosas.
ENSAYO DE COMPLEMENTACIÓN EN S. cerevisiae.
¿El extremo N-terminal estará
afectando la actividad in vivo?
Todas las versiones truncas crecieron
mejor que las versiones completas,
incluso
ZmHXK9Δ30.
ENSAYO DE COMPLEMENTACIÓN EN S. cerevisiae.
CARACTERIZACIÓN CINÉTICA.
• ZmHXK4Δ30, ZmHXK5Δ30 and ZmHXK6Δ30: They have a smaller Km value for Man followed by the Glc Km value, but the lower Vmax found is displayed with Man.
• The enzyme with the smallest Km for Glc was ZmHXK6Δ30. In addition, ZmHXK7 showed the smallest Km for ATP and Fru, as opposed to ZmHXK8, whose Km for Fru was not possible to estimate.
• The 30 amino acids at N-terminal not only make the proteins insoluble in E. coli, but also modify their activity.
• ZmHXK9 has a minimal enzymatic activity sufficient to allow yeast growth in a medium supplemented with Glc or Fru as carbon source. Therefore, ZmHXK4-9 must be considered as true HXKs, even if ZmHXK9 shows a marginal enzymatic activity whose physiological relevance remains uncertain.