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DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD TRANSCRIPCIONAL DE GENES CANDIDATOS A SER RESPONSABLES DEL FENOTIPO
Athena EN Arabidopsis thaliana.
Proyecto Pregrado 2011
p
Laboratorio de Biotecnología Vegetal Facultad de Ciencias Agronómicas
Universidad de Tarapacá.
ALUMNO: VÍCTOR EDUARDO ROJAS PÉREZA. PATROCINANTE: DR. WILSON HUANCA‐MAMANI
Arica‐Chile.2012
El ciclo de vida de las plantas consta de dos fases.
MICROSPORA (N) MEGASPORA (N)
MEIOSIS
( ) ( )
MITOSIS Y DIFERENCIACIÓN
ESPOROFITO (2N)
FECUNDACIÓN
Con la fecundación se inicia el desarrollo de la semilla.
Núcleos Espermáticos
LA DOBLE FECUNDACIÓNES LA SEÑAL DE INICIO
Endospermo
Embrión
Tubo Polínico
ES LA SEÑAL DE INICIO
PARA LOS PROGRAMAS DE DESARROLLO
Cubierta de la semilla
El desarrollo embrionario sigue un patrón ordenado de divisiones celulares.
Estado globular Estado de corazón
Estado de torpedo
Estado de cotiledónCigoto 1era División celular
Identificación de Athena
Identificada por el Dr. Wilson Huanca en un escrutinio genético
Desarrolla un embrión secundario
Tiene una mutación en una región Intergénica del cromosoma 5
Sitio de la mutación en el genoma de Athena
Cromosoma 5
Athena
895 pbGen‐1 Gen‐2Gen‐2
6105 pb
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Objetivo
Determinar el nivel de expresión de cinco genes
candidatos de ser responsables del fenotipo Athena
en Arabidopsis thaliana
• Analizar fenotipos de líneas mutantes Athena e insercionales
• Realizar análisis histológico de la embriogénesis en Athena
• Determinar el nivel de expresión de los cinco genes candidatos en plantas silvestres y en Athena, en tejido reproductivo
• Analizar cruzas con marcadores moleculares del desarrollo
Resultados
AthenaSilvestre
Semillas abortadas en plantas mutantes Athena
Desarrollo embrionario normal en semillas de Arabidopsis tipo silvestre
Semillas fueron clareadas con solución de clareo y analizadas con óptica de Nomarski
Estado globular Estado de corazón Estado de torpedo
Proembrión 2 Células
Embriones de Athena muestran proliferación celular anormal en el suspensor y un patrón de desarrollo aberrante
AB
DC
Estado globular Estado de corazón
FE
Embriones de Athena muestran proliferación celular anormal en el suspensor y un patrón de desarrollo aberrante
Estado de corazón Estado de torpedo
En la mutante Athena existe proliferación celular anormal en el suspensor
◄
AB
*◄
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En Athena la mutación se inserta en una región intergénica
Cromosoma 5
Athena
¿ La región intergénica es la responsable ?
¿Algún elemento regulatorio está siendo afectado ?
895 pbGen‐1 Gen‐2Gen‐2
6105 pb
Líneas mutantes que poseen una inserción en una región
intergénica cercana a Athena
Cromosoma 5
Gen‐1 Gen‐2
Salk_073901 Salk_130478
895 pb
598 pbGen 2
718 pb
Athena
6105 pb
Líneas insercionales muestran proliferación celular en el suspensor y desarrollo de embriones aberrantes
Semillas fueron clareadas con solución de clareo y vistas con optica de Nomarski
Salk_130478 Salk_073901
P.F.D. ATPProteasa i L
P.F.D.
Cromosoma 5
Athena
¿ Cuál es el gen responsable ?
Salk_073901Salk_130478
Proteína de unión a
ribonucleasa S
ATPsintetasa
tipo Lon
Se realizó análisis de expresión por RT‐PCR
Reacción en cadena de la polimerasa en retrotranscripción (RT‐PCR)
Extracción de RNA total Método TRIzol ( Invitrogen )
RNA total
Cuantificación del RNA total
Se colectaron muestras
1 ug RNA total + DNAsa I
RTAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAA
TTTTTTTTTTTTTRNAmOligo dT
RT‐PCR
TTTTTTTTTTTTT
AAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAA
TTTTTTTTTTTTT
TTTTTTTTTTTTT
TTTTTTTTTTTTT
Oligo dT
RNAmcDNA
Transcriptasa Inversa
dNTP’s
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TTTTTTTTTTTTT cDNA
PCR
Taq Polimerasa
dNTP’s
VisualizaciónVisualización Gel de agarosa
gen 1gen 1
Athena
gen 2gen 2 gen 1gen 1 gen 2gen 2
RT‐PCR
Productos de PCR
WT
GEL
Sobre expresión del gen para ATP Sintetasa en la mutante Athena
ACTINA 11 P.F.D 1ATP
Sintetasa Proteasatipo Lon
Proteína unión a Ribonucleasa S P.F.D 2100pb
400 pb
Tamaños esperados :
Actina‐11 : 180pbP.F.D 1 : 391pb ATP Sintetasa: 357pb
200 pb
p
Proteasa Lon: 364pbProteína unión a Ribonucleasa S: 342pbP.F.D 2 : 389pb
Sobre expresión del gen para ATP Sintetasa en la mutante
Athena
ACTINA 11 P.F.D 1ATP
Sintetasa Proteasatipo Lon
Proteína unión a Ribonucleasa S P.F.D 2100pb
400 pb
200 pb
p
Tamaños esperados :
Actina‐11 : 180pbP.F.D 1 : 391pb ATP Sintetasa: 357pb
Proteasa Lon: 364pbProteína unión a Ribonucleasa S: 342pbP.F.D 2: 389pb
En Athena la región intergénica produce una sobrexpresión del gen para ATP Sintetasa( Sub‐unidadδ)
Cromosoma 5 Salk_073901Salk_130478
Proteína de unión a
ribonucleasa S
P.F.D. ATPsintetasa
Proteasa tipo Lon
P.F.D.Athena
¿ Son células del suspensor?.
¿Que tipo de células son?.
¿ Se está desarrollando un nuevo embrión?.
Se analizaron cruzas de Athena con marcadores moleculares del desarrollo
¿ Hay cambios en los patrones de desarrollo?
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Athena cruzada con marcadores del desarrollo
Marcador Athena
F 1F 1
óResultados esperados
Wild‐typePIN 1:: GFP
A B
E F
Línea marcador
Expresión normal de marcadores
moleculares del desarrollo embrionario
WOX‐5:: GFP
WOX‐8 :: GFP
JI
Wild‐type Athena
A B
Línea marcador Athena
C D E F
Expresión de marcadores para desarrollo embrionario en la mutante Athena
PIN 1:: GFP
A
G
Línea marcador Athena
C
H I J
E
WOX‐5:: GFP
Línea marcador Athena
WOX‐8 :: GFP
L M NK
Conclusiones
• La mutante Athena y las líneas insercionales Salk_130478 ySalk_073901 presentan fenotipos asociados a la semilla endesarrollo.
• En Athena el desarrollo del suspensor es aberrante debido a• En Athena el desarrollo del suspensor es aberrante, debido aque sufre proliferación celular lo cual origina, en algunos casos,el desarrollo de una estructura tipo embrión o embriónsecundario.
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Conclusiones
• En Athena el gen que codifica para la subunidad δ de la ATPSintetasa se desregula, aumentando su expresióntranscripcional, posiblemente esta desregulación sería laresponsable de la proliferación celular en el suspensor. Paralos otros cuatro genes analizados, no se detecta actividadtranscripcionaltranscripcional.
• En Athena el análisis con marcadores moleculares deldesarrollo, muestra que las células que proliferan en elsuspensor, cambian su programa de desarrollo e identidadcelular, adquiriendo un destino embrionario.
Perspectivas
Para confirmar que el gen de la ATP Sintetasa subunidad δ esrealmente responsable de producir el fenotipo mutante Athena,se podrían realizar las siguientes actividades:
1.‐ Análisis de expresión por RT‐PCR para los cinco genes en estudio,en plantas de mutantes Salk. El patrón de expresión para loscinco genes, en estas mutantes debería ser similar al de lamutante Athena.
2.‐ Sobreexpresión del gen de la ATP Sintetasa en un fondo genéticosilvestre, a través de la generación de plantas transgénicas deArabidopsis, portando una construcción que consiste en el gende la ATP Sintetasa comandada por un promotor fuerte. Seespera que la expresión de este gen dentro de la planta produzcaun desarrollo anormal del suspensor.
Control embrionario del suspensor en sus y twn
Genes SUS son necesarios para la morfogénesis normal
Schwartz et al. (1994)
Agradecimientos
Dr. Wilson Huanca‐Mamani, Laboratorio de Biotecnología Vegetal (U.T.A.) por el apoyo académico y técnico brindado en la realización de este seminario.
Factores genéticos en el desarrollo temprano
YDAMPK3 TAA1
WOX 8MPK6 WOX 2SSP
PIN 1PIN 7
TAR 1 y 2MPWOX 8SSP PIN 7 MP
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Factores genéticos en estados avanzados
WOX 5
WUS
KNOX
STM
Mutantes en Arabidopsis
twn 1
Vernon et al. A.J.B.(2001)
sus
Schwartz et al.Development (1994)
twn2
Zhang, J. (1997 )