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2013
Facultad de Filosofía Humanidades y Artes Prueba de Suficiencia en Informática Yanel Correa
[MICROSCOPIO ELECTRÓNICO]
Microscopio electrónico 2013
Yanel Correa Página 1
Indice
Microscopio Electrónico ....................................................................................... 2
Historia ................................................................................................................................................................ 2
Funcionamiento ................................................................................................................................................... 2
La resolución teórica del microscopio electrónico es: ........................................................................................ 2
Limitaciones del microscopio electrónico ........................................................................................................... 3
Aplicaciones… ...................................................................................................................................................... 4
Unidades de medida en microscopia .................................................................................................................. 4
Clasificación de microscopio electrónico ............................................................................................................ 4
Microscopio electrónico de transmisión (MET ) ................................................... 5
Partes del Instrumento ........................................................................................................................................ 5
Preparación de las muestras ............................................................................................................................... 6
¿Que podemos estudiar con MET? ..................................................................................................................... 8
Ventajas y desventajas ........................................................................................................................................ 8
GALERIA DE FOTOS DEL MET ............................................................................................................................... 9
Microscopio electrónico de barrido (MEB) ........................................................... 9
Partes del MEB .................................................................................................................................................. 11
Preparación de las muestras ............................................................................................................................. 12
Mediante el MEB se estudian: ........................................................................................................................... 14
Ventajas y Desventajas ...................................................................................................................................... 14
Galeria de Fotos SEM ......................................................................................................................................... 15
BIBLIOGRAFIA ...................................................................................................... 16
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Microscopio Electrónico
Historia
ste instrumento fue inventado en Alemania por el físico Ruska en 1931. La óptica electrónica
había sido construida por el físico alemán Busch en 1924. El microscopio se patentó en 1932,
un año más tarde Ruska y Knoll obtenían aumentos de 12.000 con una resolución de 40
nanómetros. Estos modelos experimentales eran aún muy imperfectos, y sólo después de la II
Guerra Mundial se superaron los problemas técnicos del microscopio y de los cortes de tejido. El
microscopio electrónico de fines del siglo XX tiene una resolución del orden de 1.000 veces la del
microscopio de luz (0,2 y 200 nanómetros, respectivamente).
Funcionamiento
Un microscopio electrónico es aquél que utiliza electrones en lugar de fotones o luz visible para
formar imágenes de objetos diminutos. Los microscopios electrónicos permiten alcanzar una
capacidad de aumento muy superior a los microscopios convencionales (hasta 500.000 aumentos
comparados con los 1000 de los mejores microscopios ópticos) debido a que la longitud de onda de
los electrones es mucho menor que la de los fotones. Un microscopio electrónico funciona con un
haz de electrones generados por un cañón electrónico, acelerados por un alto voltaje y focalizados
por medio de lentes magnéticas (todo ello al alto vacío ya que los electrones son absorbidos por el
aire). Los electrones atraviesan la muestra (debidamente deshidratada) y la amplificación se produce
por un conjunto de lentes magnéticas que forman una imagen sobre una placa fotográfica o sobre
una pantalla sensible al impacto de los electrones que transfiere la imagen formada a la pantalla de
un ordenador. Los microscópios electrónicos sólo se pueden ver en blanco y negro, puesto que no
utilizan la luz, pero se le pueden dar colores en el ordenador. Como se puede apreciar, su
funcionamiento es semejante a un monitor monocromático.
La resolución teórica del microscopio electrónico es:
E
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Limitaciones del microscopio electrónico
*El limitado diámetro de la apertura no permite que la información detallada alcance la imagen,
limitando de este modo la resolución.
*El contraste de amplitud (que radica en la naturaleza corpuscular de los electrones) se debe al
constraste de difracción, provocado por la pérdida de electrones del rayo. Es un contraste dominante
en especímenes gruesos.
*El contraste de fase (que radica en la naturaleza ondulatoria de los electrones) se debe al contraste
de interferencia provocado por los desplazamientos en las fases relativas de las porciones del rayo. Es
un contraste dominante en especímenes finos.
*Existen también distintas aberraciones producidas por las lentes: astigmática, esférica y cromática
*El problema de la función de transferencia de contraste (CTF): la CTF describe la respuesta de un
sistema óptico a una imagen descompuesta en ondas cuadráticas.
El material biológico presenta dos problemas fundamentales: el entorno de vacío y la transferencia
de energía. Para resolverlos, se utilizan distintas técnicas dependiendo del tamaño de la muestra:
* Para muestras grandes como órganos, tejidos o células, se utilizan tres técnicas:
1. La fijación química o la criofijación
2. La inclusión en resinas (criosustitución)
3. La réplica metálica
* Para muestras pequeñas como complejos macromoleculares se utilizan las siguientes técnicas:
1. La tinción negativa: los agentes de tinción más usados son el molibdato amónico, el fosfotungstato
sódico y sales de uranio como acetato y formiato. Todos ellos presentan las siguientes propiedades:
interactúan mínimamente con la muestra y son estables en la interacción con los electrones, son
altamente solubles en agua, presentan una alta densidad que favorece el contraste, tienen un punto
alto de fusión, tienen un tamaño de grano pequeño.
2. La réplica metálica: para construir la réplica metálica se evapora el metal (estaño), que se deposita
sobre la muestra a la vez que esta, por el vacío, se disuelve.
3. La criomicroscopía
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Aplicaciones…
En el estudio de los circuitos integrados se suele utilizar el microscopio electrónico debido a una
curiosa propiedad: Como el campo eléctrico modifica la trayectoria de los electrones, en un circuito
integrado en funcionamiento, visto bajo el microscopio electrónico, se puede apreciar el potencial al
que está cada elemento del circuito.
Unidades de medida en microscopia
La unidad que se usa en microscopía de luz es el micrón (µ) que es la milésima parte del milímetro.
En microscopía electrónica la unidad más conocida es el angstrom (Å), definido como la diez
millonésima parte del milímetro. También se emplea el nanometro (nm), que es la millonésima parte
del micrón.
Así, por ejemplo, la resolución de un microscopio de luz es 0.25 µ ó 2500 Å ; y la de un microscopio
electrónico de 2.5 Å.
Clasificación de microscopio electrónico
Hay dos tipos básicos de microscopios electrónicos: el microscopio electrónico de
transmisión (TransmissionElectronMicroscope, TEM) y el microscopio electrónico de
barrido (ScanningElectronMicroscope, SEM).
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Microscopio electrónico de transmisión (MET )
El microscopio electrónico de transmisión emite un haz de electrones dirigido hacia el objeto que se
desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo
atraviesan formando una imagen aumentada de la muestra. Para utilizar un microscopio electrónico
de transmisión debe cortarse la muestra en capas finas, no mayores de un par de miles de ángstroms.
Los microscopios electrónicos de transmisión pueden aumentar un objeto hasta un millón de veces.
Permite la observación de muestra en cortes ultrafinos. Un TEM dirige el haz de electrones hacia el
objeto que se desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y
otros lo atraviesan formando una imagen aumentada del espécimen. Para utilizar un TEM debe
cortarse la muestra en capas finas, no mayores de un par de miles de ángstroms. Se coloca una placa
fotográfica o una pantalla fluorescente detrás del objeto para registrar la imagen aumentada. Los
microscopios electrónicos de transmisión pueden aumentar un objeto hasta un millón de veces.
Reemplaza la luz visible por un haz de electrones que produce un muy alto poder de resolución.
En este sistema se reemplazan los lentes (cristales) por campos electromagnéticos, estos producen la
amplificación de la imagen. Este haz de electrones viaje en un tubo de alto vacío, la imagen formada
es registrada en la pantalla (monitor) o en una placa fotográfica. La formación de la imagen depende
de la dispersión de los electrones. La imagen se debe a la ausencia de esos electrones. Depende del
número atómico (de los átomos presentes en el objeto) y del grosor del objeto.
Los cortes son de 1/40 micras (250 Armstrong) de espesor. Se pueden obtener aumentos de hasta
160.000 veces.
Partes del Instrumento
El sistema óptico-electrónico del microscopio electrónico de transmisión está constituído por las
siguientes partes:
1. Cañón de electrones
2. Sistema de lentes
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3. Pantalla fluorescente
Estos componentes están ensamblados en una columna vertical la cual se encuentra en alto vacío.
El cañón de electrones, es la fuente emisora del haz de electrones. Se encuentra ubicado en la parte
superior de la columna. Está constituído por un filamento (cátodo), un cilindro con una apertura
central, llamado cilindro de Wehnelt que rodea al filamento y tiene un potencial ligeramente más
negativo que éste. El ánodo se encuentra por debajo del cilindro de Wehnelt.
El filamento es calentado por el pasaje de corriente (alrededor de 2800 K). Los electrones emitidos
termoiónicamente por el cátodo son acelerados hacia el ánodo, pasan por la apertura circular central
de éste y un haz de alta energía es emitido hacia la columna del microscopio.
El sistema de lentes está formado por lentes condensadores objetivo, intermedia y proyectora. Las
lentes condensadoras, en los microscopios, más modernos son dos. La primera, proyecta la imagen
punto de entrecruzamiento demagnificada (spot size), mientras que la segunda controla su diámetro
y el ángulo de convergencia en que incide sobre la muestra. limita al haz que incide sobre la muestra.
La lente objetivo forma la primera imagen, localizada debajo del especímen. Es considerada el
componente más importante del microscopio electrónico. Cualquier defecto en ésta, será
magnificado y transmitido al resto del sistema óptico. Por lo tanto, de ella dependen, en gran
medida, la resolución final y la corrección de las aberraciones.
Las lentes intermedia y proyectora son las encargadas de amplificar la imagen dada por la lente
objetivo y proyectarla sobre la pantalla fluorescente.
La pantalla del microscopio electrónico de transmisión está recubierta por una pintura de fluoruros
de Zn y Cd, que fluoresce cuando es bombardeada por electrones, generando una imagen en el rango
de las longitudes de onda del visible.
Preparación de las muestras
El proceso comienza con el tejido altamente hidratado y termina con el tejido virtualmente libre
de agua y preservado en una matriz de resina.
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Existen muchos caminos para la preparación de tejidos para Microcopia electrónica de transmisión,
pero los métodos siguen básicamente ocho pasos:
1. Fijación primaria: Busca preservar la estructura del tejido vivo, evitando los procesos autoliticos. Se
realiza con glutaraldehido CHO- CH2-CH2-CH2-CHO. Su acción se centra en las proteínas así:
(COOH-proteína-NH2)2 + CHO- CH2-CH2-CH2-CHO
Entonces:
COOH-proteína-NH=CH-CH2-CH2-CH2-CH=N-proteina-COOH +H2O
La penetración del glutaraldehido es lenta, esto quiere decir que 1 mm de tejido es atravesado en
una hora por el glutaraldehido.
2. Lavado: Normalmente se hace con un buffer.
Buffer: es necesario su uso debido a que el pH de los tejidos se baja drásticamente durante el
proceso de fijación. El uso de buffer mantiene el pH fisiológico (7,2 a 7,4) los sistemas de buffer más
comunes son: fosfato, s-collidine, tris-maleato y cacodylate.
3. Fijación secundaria: es llevada a cabo por la acción del tetróxido de osmio, el cual reacciona
principalmente con los lípidos. El tetróxido de osmio generalmente no penetra mas de 0,5 mm en
una hora.
4. Deshidratación: La filosofía de la deshidratación es el reemplazo del agua usando etanol en series
70% 85% 95% y etanol absoluto.
5. Infiltración con solventes transicionales: procedimiento por el cual hay transmisión de fluidos
gradualmente reemplazado por soluciones intermediarias altamente miscibles con los agentes
deshidratantes, la mayoría de los protocolos emplean un solvente transicional entre el deshidratante
y la resina.
6. Infiltración con resina: mezclas de propilen oxidado con Epoxy son introducidas reemplazando
dentro de los tejidos después de la deshidratación. La concentración del solvente es minimizada
gradualmente incrementando las concentraciones de resina hasta llegar a la resina pura.
7. Inclusión: sumergir el tejido en la resina pura.
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8. Polimerización de la resina: se logra acelerar el proceso de polimerización aumentando la
temperatura.
¿Que podemos estudiar con MET?
Mediante el microscopio electrónico de transmisión podemos estudiar la ultraestruacura de un
material orgánico oinorgánico. Para esto, existen diferentes formas de operación que posibilitan el
estudio de una característica en particular. Entre las aplicaciones del TEM para el estudio de
materiales no- biológicos y biológicos podemos nombrar :
1. Determinación de estructura cristalina en minerales, metales, etc.
2. Estudio de catalizadores.
3. Determinación de impurezas, precipitados,etc.
4. Identificación de bordes de grano e interfaces en metales.
5. Estudio de fases y zonas cristalinas en polímeros.
6. Determinación de tamaño de partícula en catalizadores, minerales,etc.
7. Identificación de planos cristalinos.
8. Cambios estructurales de materiales sometidos a diferentes tratamientos térmicos.
9. Realización de estudios de histoquímica para identificxar compuestos específicos.
10. Estudios de ultraestructura de tejidos vegetales y animales.
11. Reconocimiento de virus.
12. Estudios de citoquímica.
13. Estudios de estructuras moleculares.
Ventajas y desventajas
•Los elevados costos de los equipos y la debida adecuación de una infraestructura para el buen
funcionamiento hacen que esta técnica , se convierten en acceso de investigadores privilegiados . Si
embargo, es común contratar estos servicios por horas o por fotografías requeridas.
•Los costos de reactivos también dan un factor decisivo para la elección de esta técnica. Aun cuando
este proceso de investigación sea costoso , proporciona resultados muy precisos de amplia
resolución y magnificación.
•La técnica de preparación de las muestras cumple con protocolos establecidos, pero son
vulnerables y variados al tipo de investigación que se realice ,contandomas con la experiencia del
investigador.
•La complejidad de los equipos , lo hacen susceptibles a la des calibración. Nuevamente encontrar
las condiciones óptimas requiere de un proceso tedioso y prolongado.
•La manipulación de reactivos se torna peligroso por la elevada condición toxica de los mismos.
•Las imágenes obtenidas son moncromáticas y planas siendo necesario, en algunos casos, un
tratamiento posterior mediante análisis de imágenes con un software especializado.
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GALERIA DE FOTOS DEL MET
Bacilos en división 60.000X MET, Mitocondria
Microscopio electrónico de barrido (MEB)
La imagen de cabecera muestra el primer microscopio electrónico de uso en España, que data de
1946. En la siguiente imagen aparece un microscopio actual.
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En el microscopio electrónico de barrido la muestra es recubierta con una capa de metal delgado, y
es barrida con electrones enviados desde un cañón. Un detector mide la cantidad de electrones
enviados que arroja la intensidad de la zona de muestra, siendo capaz de mostrar figuras en tres
dimensiones, proyectados en una imagen de TV. Su resolución está entre 3 y 20 nm, dependiendo del
microscopio. Permite obtener imágenes de gran resolución en materiales pétreos, metálicos y
orgánicos. La luz se sustituye por un haz de electrones, las lentes por electroimanes y las muestras se
hacen conductoras metalizando su superficie.
Crea una imagen ampliada de la superficie de un objeto. No es necesario cortar el objeto en capas
para observarlo con un SEM, sino que puede colocarse en el microscopio con muy pocos
preparativos. El SEM explora la superficie de la imagen punto por punto, al contrario que el TEM, que
examina una gran parte de la muestra cada vez. Su funcionamiento se basa en recorrer la muestra
con un haz muy concentrado de electrones, de forma parecida al barrido de un haz de electrones por
la pantalla de una televisión. Los electrones del haz pueden dispersarse de la muestra o provocar la
aparición de electrones secundarios. Los electrones perdidos y los secundarios son recogidos y
contados por un dispositivo electrónico situado a los lados del espécimen. Cada punto leído de la
muestra corresponde a un píxel en un monitor de televisión. Cuanto mayor sea el número de
electrones contados por el dispositivo, mayor será el brillo del píxel en la pantalla. A medida que el
haz de electrones barre la muestra, se presenta toda la imagen de la misma en el monitor. Los
microscopios electrónicos de barrido pueden ampliar los objetos 200.000 veces o más. Este tipo de
microscopio es muy útil porque, al contrario que los TEM o los microscopios ópticos, produce
imágenes tridimensionales realistas de la superficie del objeto.
A diferencia de los microscopios ópticos, el MEB utiliza un haz de electrones que se trasladan en una
trayectoria libre de colisiones (columna de alto vacío) e interactúan con el espécimen, recorriendo la
topografía de la muestra. El bombardeo de la muestra con el haz produce un elevado número de
señales, las que son captadas por un detector y transformadas en una imagen.
El microscopio electrónico de barrido (SEM) es similar al microscopio electrónico de transmisión.
Ambos tienen ciertas características comunes tales como un cañón de electrones donde se genera el
haz de electrones, lentes condensadoras y objetivo, sistema de vacío. La diferencia principal entre
ellos es la manera en que forman y magnifican la imagen. Esto hace que la información que se
obtenga de cada uno sea distinta. Mientras el TEM permite el estudio de la ultraestructura de
muestras delgadas, el SEM posibilita conocer la morfología superficial.
En el microscopio electrónico de barrido, el haz electrónico, atraviesa la columna y llega a la muestra.
Un generador de barrido es el responsable de producir el movimiento del haz , de manera que barra
la muestra punto a punto. De la interacción entre los electrones incidentes con los átomos que
componen la muestra se generan señales, las cuales pueden ser captadas con detectores adecuados
para cada una de ellas. El detector capta una señal y las convierte en una señal electrónica que es
proyectada en un tubo de rayos catódicos (CRT).
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El barrido del haz está sincronizado con el barrido del CRT y produce una relación uno a uno entre
puntos de la muestra y puntos en el CRT.
Partes del MEB
El MEB consta de las siguientes partes:
1. Cañón de electrones (e-).
2. Filamento de tungsteno o de hexaboruro de lantano-LaB6.
3. Anodo.
4. Columna en vacío.
5. Lentes condensadores (centran y dirigen el rayo de electrones).
6. Lentes Objetivas (controlan la cantidad de electrones del haz).
7. Detectores para colectar y medir electrones (producción de imagen).
8. Bobinas de barrido (obligan al haz a barrer la muestra).
9. Control de aumento.
10. Generador de barrido.
11. Colector de electrones (electrones se atraen y se aceleran).
12. Escintilador (convierte la energía cinetica de los e- en luz visible).
13. Amplificador.
14. Pantalla (imagen).
15. Bombas de vacío.
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Preparación de las muestras
Se debe tener en cuenta el material a observar y guiarse por parámetros específicos para cada
muestra. Los siguientes pasos son utilizados en general y guían acerca de lo necesario en cada uno.
*Limpieza
Reactivo: solución salina
Objetivo: Remoción de contaminantes de la muestra
Comentarios: En muestras como dientes y huesos es necesario limpiar la muestra con una bomba de
aire. Para epitielio intestinal se utilizan enzimas (quimiotripsina) que degradan el moco intestinal. En
esperma de mamíferos es necesario lavar con solución salina y posteriormente centrifugar
suavemente.
*Relajación
Reactivo: Cloruro de magnesio, cloretano, hidrato de cloral y anestésicos locales como lidocaína.
Objetivo: Permitir que organismos marinos o de agua fresca, que utilizan el encogimiento y extensión
para movilizarse, no se contraigan y pueda observarse toda la superficie de éste.
Comentarios: Se aplica gradualmente hasta que cese el movimiento del organismo.
*Fijación
Reactivo: Glutaraldehído, formaldehído, permanganato y acroleína.
Objetivos: Permitir que cese la actividad biológica de la célula y preservar la estructura celular.
Mantener la integridad de la superficie. Evitar cambios autolíticos, debido a que al haber remoción
del organismo se presnetan cambios en temperatura, pH y concentración de oxígeno y nutrientes.
Comentarios: Se puede utilizar vapor de osmio, específicamente cuando se observan esporas de
hongos. Es importante tener en cuenta la concentración del fijador y de la muestra, debido a que
diversos estudios muestran que a una mayor concentración de éste, se dificulta la observación de
lamuestra.
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*Deshidratación
Reactivo: Etanol o acetona.
Objetivo: Remover agua de los tejidos
Comentarios: Se utiliza más comúnmente etanol, debido a que la acetona, puede danar el secador en
el SPC.
*Secado de punto crítico
Reactivo: CO2 líquido y gaseoso.
Objetivo: Remoción total del agua de la muestra
Comentarios: Este paso se basa en lo siguiente: el CO2 a temperatura baja es líquido y a temperatura
alta es gaseoso. Cuando la muestra sale deshidratada por el etanol, se coloca en el secador de punto
crítico (SPC), allí, la muestra se purga con CO2 líquido hasta que el etanol haya sido reemplazado,
posteriormente se sella la cámara y se calienta hasta que la temperatura llegue a 31ºC, de esta forma
el CO2 líquido se evapora y la muestra queda totalmente seca. Este procedimiento reduce de tamano
la muestra.
*Montaje de la muestra
Objetivo Utilizado: Porta muestra o stub
Objetivo: Colocar la muestra asegurada para permitir la colocación en el rociador de oro.
Comentarios: Para asegurar la muestra en el stub, se utiliza una cinta doble faz (tejidos) o carbono
cemento conductivo CCC (dientes).
*Recubrimiento con oro (sputter)
Elementos: Oro, paladio o carbono
Objetivo: Permitir que el haz de electrones primarios choquen contra la muestra recubierta con un
material conductor para que estas sean eléctricamente conductivas.
*Comentarios: Este pocedimiento se realiza con un rociador o Sputtercoater. Se coloca la muestra en
la cámara, se sella y se programa el tiempo de recubrimientoen el cual el oro cae uniformemente, se
hace vacío y automáticamente el timer se enciende y la muestra se recubre totalmente según el
tiempo programado, aproximadamente son 2 minutos. Cuando el tiempo ha finalizado, lentamente
empieza a ingresar aire a la cámara y de esta forma, la muestra está lista para colocarla en el MEB. El
stub con la muestra recubierta no se debe tocar con los dedos, por lo tanto es necesario utilizar
pinzas.
*Almacenamiento
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Objeto utilizado: Cámara libre de humedad
Objetivo: Mantener la muestra totalmente seca para posterior observación.
Mediante el MEB se estudian:
1. Morfología superficial de minerales, catalizadores, etc.
2. Electrodepósitos
3. Adherencia fibra-matríz en polímeros.
4. Cambios morfológicos de materiales sometidos a tratamientos químicos.
5. Formas de cristalización de minerales.
6. Control de calidad de catalizadores industriales.
7. Morfología superficial interna de partículas poliméricas.
8. Morfología de tejidos u órgano animales y vegetales.
9. Estudio de moléculas
10. Reconocimiento de fósiles.
Ventajas y Desventajas
Mayor resolución.
Mayor numero de señales, mayor información.
Imágen de detalles profundos de la superficie de la muestra: 3D
No da información acerca de viabilidad cell.
Costos
Destrucción de la muestra: fijación y secado.
Personal especializado.
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Galeria de Fotos SEM
Detalle de epidermis de semilla de justicia.
Fotografia tomada con el microscopio electrónico de barrido. (1cm=10 micras)
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BIBLIOGRAFIA
http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/microelectrans.htm
http://www.biologia.edu.ar/microscopia/meb.htm
http://morfoudec.blogspot.com.ar/2008/07/microscopio-electrnico.html
http://www.micomania.rizoazul.com/microscopia%20el%20microscopio.html
