BIOQUMICA DE LOSMICROORGANISMOS

RAMON PARS I FARRSCatedrtico de Microbiologa de la Universitat de Barcelona

ANTONIO JUREZ GIMNEZCatedrtico de Microbiologa de la Universitat de Barcelona

EDITORIAL REVERT, S. A.Barcelona - Bogot - Buenos Aires - Caracas - Mxico

INTRODUCCIN

UNA TEORA DE LOS MICROBIOS EN CULTIVO PURO

Este libro de Bioqumica de los microorganismos se enmarca delibe-radamente dentro de una abstraccin, la cual comprende la conside-racin exclusiva del cultivo puro, un crecimiento balanceado de labiomasa microbiana como un tipo de catalizador particular y unoscambios denidos de composicin del medio de cultivo, incluyendotanto el medio propiamente dicho como la atmsfera circundante. Enel contexto de esta abstraccin puede desarrollarse un discurso razo-nablemente coherente de una gran parte de lo que sabemos de losmicroorganismos en cuanto a su diversidad y actividad qumica. Eldesarrollo de esta abstraccin es el resultado de una estrategia quepersigue una comprensin del sistema microbio-medio que puedaservir de base para abordar cualquier otro aspecto del desarrollomicrobiano, partiendo de unos conocimientos directamente compro-bables que estructuran una teora de los microbios en cultivo puro.

Como puede verse al examinar el ndice de este libro, esta teoracomprendera la cintica del crecimiento de la biomasa microbiana(parte B, captulo 3), la generacin de productos en el medio (C y H) yla intervencin de oxidantes y reductores presentes en el mismo (D, Ey F), incluyendo la utilizacin de los compuestos C1 (E, captulo 19) yla utilizacin y produccin de energa radiante (G). La parte A y lorelativo a la composicin qumica de la parte B (captulo 2) puedenconsiderarse introductorias.

Una vez redactado el texto se ha considerado til aadir los Apn-dices A y B, que constituyen un complemento para facilitar la com-prensin de la obra. Por una parte, el Apndice A es un corolario de lateora del cultivo puro de microorganismos. Quizs con l puedaentenderse mejor que los grandes y complejos mapas metablicos noson esenciales para el microbilogo realmente interesado por la acti-vidad qumica que tiene lugar en los diferentes cultivos que obtiene y

VI

INTRODUCCIN

maneja. Por otra parte, las lminas a color del Apndice B pretendenser una ayuda tanto para relacionar diferentes vas metablicas o gru-pos siolgicos de microorganismos, como para mostrar estas relacio-nes a un auditorio en un momento dado. Con esta ltima nalidadtambin se han editado las mismas lminas en forma de transparen-cias que pueden ser adquiridas adicionalmente al libro.

Dado el planteamiento sealado, se excluyen muchos otros aspec-tos, como los relativos a la ecologa microbiana, la biosntesis y lagentica de poblaciones. El mismo metabolismo de las reservas y laformacin de metabolitos secundarios se tratan slo marginalmente,as como los sistemas de regulacin metablica. Este estudio se basafundamentalmente en aquellas propiedades fenotpicas de los micro-bios que determinan los cambios qumicos del medio cuando crecenen cultivo puro, dejando otros muchos aspectos en segundo plano.Por lo tanto, recoge como un todo lo que solamente constituye unaspecto parcial de la biologa microbiana. Un tratamiento anlogo enun marco ms amplio tomara una envergadura excesiva, tanto parael objetivo establecido por los autores como para su propia capacidad.

El prerrequisito para la comprensin de esta Bioqumica de losmicroorganismos es efectivamente el conocimiento de una microbio-loga general y el de una bioqumica bsica. Consecuentemente, estsituado a nivel de los segundos y terceros ciclos de la actual enseanzauniversitaria en varias de sus ramas, como pueden ser los estudios deBiologa, Qumica, Medicina, Farmacia y Veterinaria. Especcamente,est pensado para que sea de inters para los alumnos que cursan laLicenciatura de Bioqumica u otras carreras ms o menos anes.

Este libro no ha nacido in vacuo. En realidad slo se ha escrito comoconsecuencia de una historia determinada que posiblemente es su ver-dadera justicacin. Todo comenz en la dcada de los cincuenta,cuando la enseanza de la microbiologa estaba vinculada al mundo delas enfermedades infecciosas o bien a la siologa vegetal, quizs con laimportante excepcin de la escuela de Delf. De hecho, es en esa pocacuando, junto a grandes avances experimentales, se llega a un conven-cimiento general de la importancia del microbio para los problemasfundamentales de la biologa, as como para toda la economa del hom-bre. Es el periodo en el que, gracias a los trabajos de J. Buder, seempieza a comprender la siologa de las bacterias rojas del azufre,dentro de la duda de si eran verdaderas fotosintticas como habasugerido Engelmann, o si se trataba de un tipo particular pigmentadode bacterias quimiosintticas oxidadoras del azufre, como las descu-biertas por Winogradsky. En realidad en los aos cincuenta todavasabamos relativamente poco, tanto de la fotosntesis bacteriana comode la misma jacin autotrca de CO2, pero ya se haba llegado alconvencimiento de que el rasgo general de las reacciones metablicasera la transhidrogenacin, lo cual haca suponer que el sulfuro dehidrgeno actuara en las bacterias rojas del azufre como un reductor,de forma anloga a la funcin del agua en la fotosntesis vegetal.

En los aos cincuenta se saba bastante de las fermentaciones y dela oxidacin de los hidratos de carbono. Sin embargo, es justamente

VII

UNA TEORA DE LOS MICROBIOS ENCULTIVO PURO

cuando F. Lynen da las pruebas concluyentes de la condensacin delacetato activo para la formacin de los cidos grasos, cerrando unaserie de estudios, entre los que destacaban los trabajo llevados a cabopor Lipmann y Barker, donde los resultados obtenidos en el msculoy con los microorganismos llegaron a una feliz conjuncin, constitu-yendo un brillante captulo de lo que dentro del estilo del pensa-miento de la poca se llam bioqumica unitaria.

En el contexto referido, fue durante este tiempo cuando el autorde estas lneas empez a trabajar en varios aspectos de la bioqumicade la levadura, especialmente en el transporte de glucosa a travs de lamembrana, y en la formacin y utilizacin del glucgeno. Trabajarcon la levadura para iniciarse en la Bioqumica de los microorganis-mos era obligado, por cuanto todo haba empezado con este micro-organismo y, a travs de casi un siglo, la mitad de lo que se haballegado a saber lo habamos aprendido trabajando con levaduras.

Fue hacia nales de la dcada de los cincuenta cuando casual-mente se encomend al que suscribe la traduccin al castellano delcaptulo Bacterial metabolism de la McGraw-Hill Encyclopedia ofScience and Technology, escrito por C. B. van Niel. Casi al mismotiempo, por sugerencia de uno de sus profesores en la Facultad deCiencias de la Universidad de Barcelona, ley The Microbes Contri-bution to Biology, la edicin de un clebre curso dado por A. J. Klu-yver y C. B. van Niel. Estas dos lecturas son la raz profunda delpresente libro, cuyo efecto es patente todava en sus pginas, a pesarde los treinta y cinco aos transcurridos. De hecho, como despus seha podido comprobar, la obra referida en segundo lugar ha marcado amuchos microbilogos de toda una generacin en el mundo entero.

Desde 1960 a 1964 la Academic Press public los cinco volme-nes sobre The Bacteria. A Treatise on Structure and Function, bajola direccin de I. C. Gunsalus y Roger Y. Stanier, los cuales constitu-yen un hito en la historia de la literatura microbiolgica. Esta obra esindudablemente otra fuente bsica que podra citarse en casi todos loscaptulos del presente libro.

La referencias bibliogrcas que se acaban de referir constituyeron elfundamento sobre el que se desarroll el curso de Metabolismo bacte-riano (Ampliacin de Microbiologa) de la Licenciatura de Biologa en laUniversidad de Barcelona durante toda la dcada de los sesenta. No obs-tante, los trabajos de investigacin que se iban llevando a cabo paralela-mente, principalmente sobre las bacterias del cido actico y lasbacterias del cido frmico, dejaron una huella indiscutible en la ense-anza, como posteriormente ocurrira como consecuencia de los traba-jos sobre bacterias del gas detonante, sobre la utilizacin de materiaorgnica por Chlorella y sobre Bidobacterium. Las grandes revisiones, laslecturas de artculos especializados y la misma discusin personal tuvie-ron tambin su repercusin sobre las sucesivas reestructuraciones delcurso de Metabolismo bacteriano que sigui en la dcada de lossetenta. Precisamente fue en este tiempo cuando el Bacterial Metabo-lism de H. W. Doelle (1975) contribuy especialmente a una nueva yprofunda reestructuracin y ampliacin del programa del curso referido.

VIII

INTRODUCCIN

Tambin la obra de Gottschalk sobre el mismo ttulo, menosextensa pero ms didctica, fue especialmente tenida en cuenta paraque, nalmente, se llegara a redactar un extenso curso de metabo-lismo bacteriano, que con el ttulo de Ampliacin de microbiologaI: Actividad qumica, se public en 1982 por Edicions de la Univer-sitat de Barcelona.

FUENTES BIBLIOGRFICAS BSICAS

KLUYVER, A. J. y VAN NIEL, C. B. The Microbes contributions to Biology. Cam-bridge (Mass.), 1956.

VAN NIEL, C. B. Metabolismo bacteriano. Enciclopedia Salvat de la Ciencia y laTecnologa. Vol. 8. Salvat, S. A. Barcelona, 1964.

GUNSALUS, I. C. y STANIER, R. Y. The Bacteria. A Treatise on Structure andFunction. (5 vol.) Academic Press. New York, 1960-1964.

DOELLE, H. W. Bacterial Metabolism. Academic Press. London and New York(2nd edition), 1975.

GOTTSCHALK, G. Bacterial metabolism. Springer-Verlag. New York, 1985.PARES, R. Ampliacin de microbiologa I: Actividad Qumica. Edicions de la Uni-

versitat de Barcelona, 1982.

GNESIS DEL PRESENTE TEXTO

La reforma de los planes de estudios universitarios de los aosnoventa y la creacin de la Licenciatura de Bioqumica han hechorepensar la materia impartida durante tantos aos para dar forma aeste texto, centrado en un campo ms restringido, y con una estructu-racin diferente. Como es obvio, se han incorporado los conocimien-tos obtenidos en los ltimos diez aos a partir de las fuentes que seindican especcamente en cada captulo. Para el resto, puede servirlo que acabo de sealar ms arriba.

El Prof. A. Jurez, primero brillante alumno y colaborador, y despusexcelente profesor de microbiologa ha sido determinante para tomarla decisin de llevar a cabo el replanteamiento aludido y la elaboracinconjunta del presente texto. Este hecho podra considerarse naturaldadas las circunstancias de nuestra cooperacin en la enseanza delmetabolismo microbiano y la naturaleza misma de su currculuminvestigador, especialmente en su primera etapa de Barcelona, antes desus interesantes trabajos sobre regulacin de la expresin gnica. Des-graciadamente, estos ltimos se hallan en el contexto de una historiadiferente a la que ha servido para disear esta Bioqumica de losmicroorganismos. No obstante, se est en el convencimiento de que laparticipacin de dos autores de diferente generacin es extraordinaria-mente positiva para dibujar, aunque sea parcialmente, una etapa de laevolucin de nuestro conocimiento de los microbios tan activa comola correspondiente a los ltimos cincuenta aos.

Los autores quieren manifestar su agradecimiento a la Dra. Merce-des Mourio por su ayuda en la revisin del texto original as como ala Editorial Revert por su inters en la publicacin de este libro y laecaz labor realizada por su competente equipo tcnico.

Ramon Pars

NDICE ANALTICO

INTRODUCCIN V

UNA TEORA DE LOS MICROBIOS EN CULTIVO PURO VFUENTES BIBLIOGRFICAS BSICAS VIIIGNESIS DEL PRESENTE TEXTO VIII

PARTE A: EL METABOLISMO MICROBIANO 1

CAPTULO 1: INTEGRACIN DE LA TOTALIDAD DE LAS TRANSFORMACIONES QUMICAS DE LA BIOFASE 3

1.1 LA QUMICA DEL CULTIVO PURO 41.2 ACTIVIDAD QUMICA Y GRUPOS TAXONMICOS 51.3 LA ACTIVIDAD DE LA BIOFASE 61.4 EL SUMINISTRO ENERGTICO 71.5 LA REGULACIN METABLICA 91.6 EL PRINCIPIO DE LA BIOQUMICA UNITARIA 10

PARTE B: COMPOSICIN QUMICA Y CRECIMIENTO DE LA BIOMASA MICROBIANA 13

CAPTULO 2: COMPOSICIN QUMICA 15

2.1 LA PRODUCCIN DE BIOMASA 162.2 CONTENIDO DE AGUA DE LA BIOFASE 172.3 COMPOSICIN ELEMENTAL 182.4 FRACCIN CIDO-SOLUBLE 182.5 PROTENAS 192.6 CIDOS NUCLEICOS 19

XNDICE ANALTICO

2.7 LPIDOS 202.8 HIDRATOS DE CARBONO 202.9 MOLCULAS EXCLUSIVAS DE LAS BACTERIAS 21

2.10 OTROS COMPONENTES MOLECULARES DE LA BIOMASA MICROBIANA 25

2.11 CONCLUSIONES GENERALES SOBRE LA COMPOSICIN QUMICA DE LA BIOFASE 27BIBLIOGRAFA 27

CAPTULO 3: CINTICA DEL CRECIMIENTO 29

3.1 CULTIVO DISCONTINUO (BATCH CULTURE) 303.2 CULTIVO CONTINUO 34

BIBLIOGRAFA 36

PARTE C: PRODUCTOS FINALES DEL CATABOLISMO 37

CAPTULO 4: ETANOL 39

4.1 LAS LEVADURAS 404.2 ALGUNAS REFERENCIAS HISTRICAS SOBRE LA CONTRIBUCIN DE

LAS LEVADURAS A LA BIOQUMICA 424.3 EFECTO PASTEUR 434.4 CULTIVO, SISTEMAS CELULARES Y EXTRACTOS 444.5 FERMENTACIONES DE LA GLUCOSA 45

4.5.1 Fermentacin alcohlica 454.5.2 Fermentacin glicrica con sulfito 474.5.3 Fermentacin aceto-glicrica 474.5.4 Fermentacin pirvico-glicrica 48

4.6 ACEITE DE FUSEL Y CIDO SUCCNICO 484.7 DESARROLLO AEROBIO 504.8 ASIMILACIN OXIDATIVA Y FERMENTATIVA DE LA GLUCOSA 504.9 FERMENTACIN ENDGENA 52

BIBLIOGRAFA 52

CAPTULO 5: CIDO ACTICO 53

5.1 EL VINAGRE 545.2 CARACTERSTICAS GENERALES DE LAS BACTERIAS DEL CIDO

ACTICO 555.3 CINTICA DE LA PRODUCCIN DE ACETATO 565.4 OXIDACIN DEL ETANOL 605.5 OXIDACIN DE ALCOHOLES PRIMARIOS 615.6 CETOGNESIS 625.7 OXIDACIN DE POLIALCOHOLES 625.8 OXIDACIN DE LOS CIDOS LCTICO Y PIRVICO 635.9 OXIDACIN DE AZCARES 63

5.9.1 El sistema de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa 635.9.2 Va de Entner-Doudoroff 645.9.3 Ciclo de la hexosa monofosfato o va de Warburg-Dickens 66

XI

NDICE ANALTICO

5.9.4 Formacin de gluconato 665.9.5 Utilizacin del gluconato 695.9.6 El sistema de las fosfocetolasas 69

5.10 MODELOS DEL METABOLISMO OXIDATIVO DE LAS BACTERIAS DEL CIDO ACTICO 71

5.11 FORMACIN DE CELULOSA 71BIBLIOGRAFA 72

CAPTULO 6: CIDO LCTICO 73

6.1 EL CIDO LCTICO COMO PRODUCTO DE FERMENTACIN 746.2 CARACTERSTICAS GENERALES DEL GRUPO LCTICO 746.3 FERMENTACIONES LCTICAS DE HEXOSAS Y PENTOSAS 776.4 BALANCES DE FERMENTACIN 796.5 FERMENTACIONES LCTICAS DE LA FRUCTOSA 826.6 FERMENTACIN LCTICA DE LA DESOXIRRIBOSA 836.7 COFERMENTACIN DE LA LACTOSA Y LA TREONINA 836.8 FERMENTACIN DEL MALATO 856.9 FERMENTACIN LCTICA DEL TARTRATO 86

BIBLIOGRAFA 87

CAPTULO 7: CIDO PROPINICO 89

7.1 EL CIDO PROPINICO COMO PRODUCTO DE FERMENTACIN 90

7.2 REACCIN DE SWICK Y WOOD 917.3 FERMENTACIN PROPINICA DEL LACTATO 91

7.3.1 Va metablica de Propionibacterium y Veillonella 917.3.2 Formacin de propionato en C. propionicum y Megasphaera

elsdenii 917.4 FERMENTACIN PROPINICA DE LA GLUCOSA 92

BIBLIOGRAFA 94

CAPTULO 8: CIDO BUTRICO 95

8.1 PRODUCCIN DE CIDO BUTRICO Y DE DISOLVENTES NEUTROS POR FERMENTACIN: PERSPECTIVA HISTRICA 96

8.2 VAS METABLICAS UTILIZADAS POR LAS BACTERIAS DEL CIDO BUTRICO 97

8.3 FORMACIN DE ACETATO POR FERMENTACIN DE SUSTRATOS ORGNICOS 99

8.4 FORMACIN DE ACETATO POR REDUCCIN DIRECTA DE CO2 101

8.5 BACTERIAS ACETGENAS 1038.6 LA VA DE WOOD PARA LA FIJACIN AUTOTRFICA DE CO2 1038.7 LA GENERACIN DE ENERGA EN LAS BACTERIAS

ACETGENAS 1068.8 OTRAS VAS METABLICAS UTILIZADAS POR LAS BACTERIAS

ACETGENAS 1078.8.1 Sistemas dependientes del tetrahidrofolato 1078.8.2 Reduccin indirecta del CO2 107

8.9 FERMENTACIN DEL ETANOL POR Clostridium kluyveri 1088.10 FORMACIN DE BUTIRATO A PARTIR DE GLUCOSA 1098.11 FORMACIN DE ACETONA Y BUTANOL 110

XII

NDICE ANALTICO

8.12 OTROS PRODUCTOS FINALES DE FERMENTACIN PRODUCIDOS POR LAS BACTERIAS DEL CIDO BUTRICO 110

8.13 PRODUCCIN DE SUCCINATO POR MICROORGANISMOS 112BIBLIOGRAFA 114

CAPTULO 9: CIDO FRMICO 115

9.1 EL GRUPO ENTRICO 1169.2 EL DESARROLLO DE LA BIOLOGA DE Escherichia coli 1199.3 LA FERMENTACIN CIDO MIXTA 121

9.3.1 Formacin de etanol 1229.3.2 Formacin de acetato 1249.3.3 Formacin de CO2 y H2 a partir del formiato 1249.3.4 Formacin de succinato 1259.3.5 Formacin del lactato 125

9.4 LA FERMENTACIN 2,3-BUTILENGLICLICA 1279.4.1 Formacin de acetona 1279.4.2 Formacin de 2,3-butanodiol (2,3-butilenglicol) 129

9.5 FORMACIN DE TRIMETILENGLICOL 130BIBLIOGRAFA 131

CAPTULO 10: AMONACO 133

10.1 CLOSTRIDIOS PUTREFACTIVOS 13410.2 FERMENTACIONES DE UN SOLO AMINOCIDO 134

10.2.1 Arginina 13510.2.2 Histidina y cido glutmico 13610.2.3 Glicina 13710.2.4 Serina 13810.2.5 Treonina 13810.2.6 Triptfano 13910.2.7 Lisina 13910.2.8 Ornitina 14110.2.9 Cistena y metionina 141

10.3 DESCARBOXILACIN DE AMINOCIDOS 14210.4 FERMENTACIN ACOPLADA DE DOS AMINOCIDOS 14210.5 FERMENTACIN DE UN AMINOCIDO JUNTO A UN

CETOCIDO 14510.6 FERMENTACIN DE LA PURINA 14710.7 FERMENTACIN DE LA PIRIMIDINA 14710.8 FERMENTACIN DE LA ALANTONA 14910.9 FERMENTACIN DEL CIDO NICOTNICO 149

BIBLIOGRAFA 149

CAPTULO 11: METANO 151

11.1 BACTERIAS METANGENAS 15211.2 REDUCCIN DEL DIXIDO DE CARBONO 15511.3 EL SISTEMA DE LA METILREDUCTASA 15711.4 LA PRODUCCIN DE ENERGA 159

BIBLIOGRAFA 159

XIII

NDICE ANALTICO

CAPTULO 12: DIXIDO DE CARBONO 161

12.1 EL GAS SILVESTRE 16212.2 EL CO2 COMO CATABOLITO 16312.3 EL CICLO DE LOS CIDOS TRICARBOXLICOS (CAT) 16312.4 SISTEMAS ENZIMTICOS DEL CAT 16412.5 ESTEQUIOMETRA DEL CICLO 16712.6 REACCIONES ANAPLERTICAS 16812.7 CICLO DEL CIDO GLIOXLICO 170

BIBLIOGRAFA 171

PARTE D: OXIDANTES INORGNICOS 173

CAPTULO 13: OXGENO MOLECULAR 175

13.1 RESPIRACIN AEROBIA 17613.2 ASIMILACIN DE O2 17713.3 OXIDASAS Y PEROXIDASAS 17813.4 SUPERXIDO DISMUTASA Y CITOCROMO c PEROXIDASA 17913.5 LAS FLAVOPROTENAS AUTOOXIDABLES 17913.6 BALANCE ENERGTICO DE LAS REACCIONES OXIDATIVAS 18013.7 LA CADENA RESPIRATORIA 18113.8 FOSFORILACIN OXIDATIVA 188

BIBLIOGRAFA 189

CAPTULO 14: NITRATO 191

14.1 DESNITRIFICACIN Y RESPIRACIN DEL NITRATO 19214.2 BACTERIAS DESNITRIFICANTES 19314.3 FISIOLOGA Y BIOQUMICA DE LA DESNITRIFICACIN 19414.4 LA RESPIRACIN DEL NITRATO EN LAS BACTERIAS

FACULTATIVAS 19514.4.1 Catabolismo de la glucosa 19614.4.2 Respiracin del nitrato y fermentacin 19714.4.3 Ciclo de los cidos tricarboxlicos (CAT) 19714.4.4 Respiracin anaerobia 19814.4.5 Mutantes clorato resistentes 19814.4.6 Metabolismo del nitrito 198BIBLIOGRAFA 199

CAPTULO 15: SULFATO 201

15.1 REDUCTORES DE SULFATO Y BACTERIAS SULFURGENAS 20215.2 REDUCCIN DEL SULFATO CON LACTATO 20415.3 HIDROGENASAS Y TRANSPORTADORES DE ELECTRONES 20515.4 REDUCCIN DEL SO4

2 CON H2 20515.5 METABOLISMO DEL CARBONO EN LOS SULFATO

REDUCTORES 20815.6 BISULFITO REDUCTASAS 210

BIBLIOGRAFA 211

XIV

NDICE ANALTICO

PARTE E: REDUCTORES ORGNICOS Y COMPUESTOS C1 213

CAPTULO 16: COMPUESTOS ALIFTICOS 215

16.1 ATAQUE PRIMARIO DE LAS FUENTES ORGNICAS DE PODER REDUCTOR 216

16.2 OXIDACIN DE ALCANOS Y ALQUENOS 21616.3 SISTEMA DE LA -HIDROXILASA 21816.4 OXIDACIN DE LOS CIDOS GRASOS 21816.5 LA -OXIDACIN 21816.6 LA -OXIDACIN 21916.7 FORMACIN DE PROPIONIL-CoA 22016.8 OXIDACIN A -HIDROXICIDOS 221

BIBLIOGRAFA 222

CAPTULO 17: COMPUESTOS AROMTICOS 223

17.1 PROCESOS AEROBIOS Y ANAEROBIOS 22417.2 CARACTERSTICAS GENERALES DE LA DEGRADACIN

AEROBIA 22417.3 LA ORTO-RUPTURA DEL ANILLO BENCNICO 22417.4 LA META-RUPTURA DEL ANILLO BENCNICO 22617.5 OXIDACIN DEL GENTISATO 22817.6 OXIDACIN DEL D-MANDELATO Y OTROS PRECURSORES DEL

CATECOL 22917.7 OXIDACIN DEL p-HIDROXIBENZOATO Y OTROS PRECURSORES DEL

CIDO PROTOCATQUICO 23117.8 RELACIN ENTRE LAS DISTINTAS VAS DE OXIDACIN AEROBIAS DE

LOS COMPUESTOS AROMTICOS 23217.9 INDUCCIN DE LOS ENZIMAS IMPLICADOS EN LA DEGRADACIN DE

COMPUESTOS AROMTICOS 23317.10 DEGRADACIN ANAEROBIA DE COMPUESTOS

AROMTICOS 23417.10.1 Obtencin de metabolitos centrales a partir de intermediarios

activados 23617.10.2 Fotometabolismo anaerobio 23717.10.3 Catabolismo por desnitrificantes 23817.10.4 Fermentacin 23917.10.5 Degradacin por reductores de sulfatos 23917.10.6 Metabolismo en condiciones metanognicas 239BIBLIOGRAFA 240

CAPTULO 18: COMPUESTOS NITROGENADOS 241

18.1 DIGESTIN DE PROTENAS Y PPTIDOS 24218.2 DEGRADACIN OXIDATIVA DE LOS AMINOCIDOS 242

18.2.1 Aminocido oxidasas 24218.2.2 Deshidrogenasas 24318.2.3 Aspartasa 243

18.3 OXIDACIN DE LA HISTIDINA 24318.4 OXIDACIN DE LA HIDROXIPROLINA 244

XV

NDICE ANALTICO

18.5 OXIDACIN DEL TRIPTFANO 24518.6 OXIDACIN DE LA TREONINA 24818.7 OXIDACIN DE PURINAS Y PIRIMIDINAS 24918.8 OXIDACIN DE LA VITAMINA B6 251

CAPTULO 19: COMPUESTOS C1 COMO SUSTRATOS 253

19.1 CRECIMIENTO SOBRE COMPUESTOS DE UN SOLO TOMO DE CARBONO 254

19.2 CICLO REDUCTOR DE LAS PENTOSAS 25419.3 UTILIZACIN DEL FORMIATO POR EL CICLO DE CALVIN 25719.4 CICLO REDUCTOR DEL CIDO TRICARBOXLICO 25819.5 FIJACIN DE CO2 EN CHROMATIUM 25919.6 BACTERIAS METILOTROFAS 26019.7 OXIDACIN DEL METANO 26319.8 VAS DE LA RIBULOSA-5-P Y DE LA SERINA 26519.9 CRECIMIENTO SOBRE METILAMINA 267

BIBLIOGRAFA 268

PARTE F: REDUCTORES INORGNICOS 269

CAPTULO 20: COMPUESTOS REDUCIDOS DE NITRGENO 271

20.1 QUIMIOLITOTROFISMO 27220.2 LAS BACTERIAS NITRIFICANTES 27320.3 EL GRUPO NITROSO 27420.4 EL GRUPO NITRO 27620.5 OBTENCIN DEL PODER REDUCTOR POR LAS BACTERIAS

QUIMIOLITOTROFAS 27820.6 EFECTO DE LA MATERIA ORGNICA SOBRE LAS BACTERIAS

NITRIFICANTES 278BIBLIOGRAFA 280

CAPTULO 21: COMPUESTOS DE HIERRO Y DE AZUFRE 281

21.1 OXIDACIN DEL HIERRO 28221.2 OXIDACIN DE COMPUESTOS REDUCIDOS DE AZUFRE 28521.3 CRECIMIENTO AUTOTRFICO, MIXOTRFICO Y

HETEROTRFICO 28521.4 VAS DE OXIDACIN DE LOS COMPUESTOS REDUCIDOS DE

AZUFRE 28621.5 CADENAS RESPIRATORIAS EN LOS TIOBACILOS. GENERACIN DE ATP

Y DE PODER REDUCTOR 288

CAPTULO 22: HIDRGENO MOLECULAR 291

22.1 LAS BACTERIAS DEL HIDRGENO Y OTROS AUTOTROFOS FACULTATIVOS 292

22.2 TAXONOMA DE LAS BACTERIAS DEL HIDRGENO 292

XVI

NDICE ANALTICO

22.3 CRECIMIENTO AUTOTRFICO 29322.3.1 Caractersticas generales del crecimiento autotrfico de las

bacterias del H2 29322.3.2 El sistema de la hidrogenasa 29422.3.3 Asimilacin del CO2 295

22.4 ASIMILACIN DEL NITRGENO 29622.5 CRECIMIENTO MIXOTRFICO 29622.6 OXIDACIN DEL MONXIDO DE CARBONO 29722.7 OXIDACIN DEL H2 EN PARACOCCUS DENITRIFICANS 29722.8 OXIDACIN DEL HIDRGENO EN DESULFOVIBRIO 298

BIBLIOGRAFA 299

PARTE G: ENERGA RADIANTE 301

CAPTULO 23: FOTOFOSFORILACIN Y FOTOMETABOLISMO 303

23.1 FOTOSNTESIS VEGETAL Y FOTOSNTESIS BACTERIANA. PERSPECTIVA HISTRICA 304

23.2 FOTOSNTESIS OXIGNICA Y ANOXIGNICA EN EL MUNDO MICROBIANO 307

23.3 GRUPOS DE BACTERIAS FOTOTROFAS 30723.4 BACTERIAS PRPURA 30823.5 BACTERIAS VERDES 31123.6 FISIOLOGA DEL CRECIMIENTO FOTOTRFICO EN LAS BACTERIAS

PRPURA Y VERDES 31123.7 LA FOTOSNTESIS DE LAS CIANOBACTERIAS 31323.8 EL FOTOMETABOLISMO DE LAS HALOBACTERIAS 31723.9 BIOLUMINISCENCIA EN LAS BACTERIAS 318

BIBLIOGRAFA 320

PARTE H: METABOLISMO SECUNDARIO 321

CAPTULO 24: METABOLITOS SECUNDARIOS: COMPOSICIN, PRODUCCIN Y ACTIVIDAD 323

24.1 DEFINICIN Y CARACTERSTICAS DEL METABOLISMO SECUNDARIO 324

24.2 TIPOS DE METABOLITOS SECUNDARIOS 32624.2.1 Composicin qumica 32624.2.2 Actividad 329

24.3 FUNCIONES DE LOS METABOLITOS SECUNDARIOS 33124.4 REGULACIN DEL METABOLISMO SECUNDARIO 333

24.4.1 Cintica de formacin de los metabolitos secundarios 33324.4.2 Induccin y represin de la sntesis de metabolitos

secundarios 33524.4.3 Gentica del metabolismo secundario. Superproduccin de

metabolitos secundarios 33724.5 MACROMOLCULAS ESPECFICAS COMO METABOLITOS

SECUNDARIOS 338BIBLIOGRAFA 338

XVII

NDICE ANALTICO

APNDICE 339

APNDICE: GRUPOS FISIOLGICOS Y DIVERSIDAD BACTERIANA 341

A.1 EL TIPO CULTURAL COMO PIEZA BSICA DEL TRABAJO BIOQUMICO 342

A.2 LA IDEALIZACIN DE LAS VAS METABLICAS Y LA UNIDAD DE LA ACTIVIDAD QUMICA DEL CULTIVO PURO 343

A.3 GRUPOS FISIOLGICOS Y TAXONOMA 344

NDICE ALFABTICO DE MATERIAS Y AUTORES 347

NDICE ALFABTICO DE MICROORGANISMOS CITADOS 363

ASPECTOS COMPARATIVOS DE DIFERENTES VAS METABLICAS Y DE DIFERENTES GRUPOS FISIOLGICOS

MICROBIANOS 367

PARTE A

EL METABOLISMO MICROBIANO

INTEGRACIN DE LA TOTALIDAD DE LAS

TRANSFORMACIONESQUMICAS DE LA BIOFASE

1.1 LA QUMICA DEL CULTIVO PURO 41.2 ACTIVIDAD QUMICA Y GRUPOS TAXONMICOS 51.3 LA ACTIVIDAD DE LA BIOFASE 61.4 EL SUMINISTRO ENERGTICO 71.5 LA REGULACIN METABLICA 91.6 EL PRINCIPIO DE LA BIOQUMICA UNITARIA 10

1

4Parte A: EL METABOLISMO MICROBIANOCaptulo 1: INTEGRACIN DE LA TOTALIDAD DE LAS TRANSFORMACIONES QUMICAS DE LA BIOFASE

1.1 LA QUMICA DEL CULTIVO PURO

En condiciones naturales, los microorganismos se desarrollan en dife-rentes hbitats y frecuentemente en poblaciones mezcladas o junto aotros seres vivos. Sin embargo, la mayor parte de la informacin queposeemos de los microorganismos se deriva del estudio de cultivospuros de los mismos. Sin duda, este hecho constituye una limitacin,pero es dudoso que sin la prctica del aislamiento y mantenimiento delneas clonales la microbiologa hubiera llegado a constituirse como tal.

La bioqumica de los microorganismos se centra fundamental-mente en el estudio de sistemas constituidos por una biofase reducidaa un conjunto de individuos idnticos, el medio propiamente dicho yuna fase gaseosa. En un medio constante, cualquiera de los innitoscultivos puros que pueden obtenerse a partir del mismo aislamientoinicial son idnticos. Este conjunto de cultivos constituyen la cepa:

cepa = C1 + C2 + C3 + ... + Cn

y, en todo caso, Cm

Cn (m, sera cualquier cultivo entre C1 y Cn). Enrealidad, esto slo se cumple aproximadamente, porque en ciertos casospueden aparecer variaciones en la descendencia clonal, y en el cultivodiscontinuo han de considerarse los efectos que las variaciones delmedio pueden tener sobre la poblacin microbiana durante su creci-miento. Sin embargo, estos fenmenos pueden ser minimizados en laprctica de tal modo que no se altere la validez del principio establecido.

El cultivo puro es un sistema dinmico que puede caracterizarse enfuncin del aumento de la biomasa, de la formacin de nuevos pro-ductos que se acumulan en el medio y de la desaparicin o consumode componentes originales del mismo. En estos dos ltimos casos seincluye tambin la atmsfera circundante. Todo esto se puede ponerclaramente de maniesto separando las clulas y analizando el medioy la atmsfera a lo largo del tiempo.

Existen muchas formas de medir la biomasa. Las clulas puedensepararse por centrifugacin y lavarse para obtener luego su peso seco,el correspondiente a una muestra del cultivo. Muchos otros mtodos,como el del recuento celular, de la densidad ptica o del carbono totalde la fraccin celular, pueden ser utilizados de acuerdo al plantea-miento de un determinado experimento. Tambin existe toda unaamplia metodologa analtica aplicable tanto al medio de cultivo pro-piamente dicho como a la atmsfera que forma parte del sistema. Eneste libro no se hace una descripcin sistemtica de las tcnicas deanlisis aludidas, pero se habla de ellas con mayor o menor detallesegn los diferentes casos, y, si es necesario un conocimiento ms pre-ciso, se remite al lector a libros o manuales especcos. En relacin conla evolucin de la biomasa en el cultivo puro, en este libro se conside-ran separadamente los siguientes aspectos que pueden tener lugardurante el desarrollo microbiano: evolucin de la biomasa micro-biana; formacin de nuevos productos; desaparicin de sustratosorgnicos; y transformaciones de compuestos inorgnicos. Se tratantambin de un modo relativamente independiente la utilizacin decompuestos de un solo tomo de carbono y la formacin de produc-

51.2 ACTIVIDAD QUMICA Y GRUPOSTAXONMICOS

tos especiales denominados metabolitos secundarios, los cuales notienen relacin aparente con el desarrollo de la biofase.

El metabolismo microbiano tiene un alcance mayor que el com-prendido en los temas sealados, abarcando la integracin de la totali-dad de las transformaciones qumicas que se realizan en el microbio.Aparte de la biosntesis y la regulacin metablica, dentro del metabo-lismo se incluyen los fenmenos de permeabilidad, la diferenciacincelular y molecular, el trabajo osmtico, la motilidad, los tactismos, laluminiscencia y el mantenimiento de la forma y estructura en ausen-cia de crecimiento. Estos aspectos, junto a la reproduccin, el creci-miento celular y la adaptacin, son parte del metabolismo por cuantopresuponen de algn modo determinados cambios qumicos. En todocaso, son materias que exceden al programa desarrollado en este libro,el cual, en lneas generales, se centra particularmente en las transfor-maciones qumicas mayoritarias y, especialmente, en las relacionadascon el suministro energtico.

1.2 ACTIVIDAD QUMICA Y GRUPOS TAXONMICOS

Las condiciones del cultivo y la actividad de los microorganismos die-ren de un caso a otro. De este modo puede reconocerse una diversidadimportante de microorganismos, cada uno con caractersticas peculia-res. Estos aspectos son relevantes en relacin con la distribucin taxo-nmica de los diferentes microorganismos, si bien la caracterizacincompleta requiere del conocimiento de otros aspectos relativos a suforma y estructura, propiedades antignicas y genticas, caractersticasde los cidos nucleicos y de otras molculas estructurales.

El grupo taxonmico bsico es la especie. En microbiologa la espe-cie queda generalmente denida por una cepa tipo. Todas las cepas losucientemente semejantes a una cepa tipo se incluyen en una mismaespecie, mientras que las cepas los sucientemente distintas de estacepa tipo se comprenden en otras especies. Esto siempre puede impli-car criterios subjetivos que exigen un cierto compromiso provisional.Las especies parecidas se incluyen en el mismo gnero, y as se formansucesivamente categoras superiores. Por lo que respecta a la relacinentre actividad qumica y grupos taxonmicos, hay que considerar queuna misma actividad qumica puede hallarse en microorganismos muydiferentes. No obstante, existe una relacin signicativa entre los gru-pos de microorganismos que presentan actividades qumicas globalesequivalentes y la proximidad taxonmica de los mismos.

La bioqumica de los microorganismos, como disciplina indepen-diente, presenta una obvia interseccin entre microbiologa ybioqumica. Esto se reeja en el gran nmero de publicaciones al res-pecto que aparecen tanto en revistas de microbiologa como en revis-tas de bioqumica. En los tratados y manuales de microbiologa y debioqumica tambin se desarrollan algunos temas comunes. La carac-terstica de la bioqumica de los microorganismos que este libro pre-tende asumir es la de sistematizar una parte del conocimiento de laqumica biolgica desde la perspectiva de los distintos grupos demicroorganismos particulares.

6Parte A: EL METABOLISMO MICROBIANOCaptulo 1: INTEGRACIN DE LA TOTALIDAD DE LAS TRANSFORMACIONES QUMICAS DE LA BIOFASE

El concepto de microorganismos que se utiliza aqu est deacuerdo con todo lo que se ha referido ms arriba. Evidentemente setrata de organismos generalmente de tamao microscpico, pero fun-damentalmente interesan aquellos que permiten obtener una infor-macin importante a travs del estudio de cultivos puros. No hay queolvidar que un cultivo puro est constituido por una poblacinenorme de individuos iguales que viven sobre un medio uniforme yque se multiplican con un tiempo de generacin relativamente muycorto. En este sentido se incluyen igualmente bacterias, levaduras yalgas unicelulares. Tambin podra comprender a los protozoos, eincluso a cultivos de clulas de organismos superiores, aunque aquno se hace referencia a ellos.

1.3 LA ACTIVIDAD DE LA BIOFASE

El metabolismo microbiano comprende miles de transformacionesdistintas, incluso considerando exclusivamente las que se llevan acabo en una sola cepa bacteriana. De hecho, aunque pudieran hacersetodas a la vez, no constituiran por s mismas el metabolismo, porquepara ello se requiere una integracin. El rasgo ms distintivo de laintegracin del metabolismo es que dichas transformaciones se llevana cabo en una estructura altamente organizada y que gracias a suactividad esta estructura organizada se perpeta e incrementa, mante-nindose fundamentalmente idntica a s misma. Sin estructura nohay metabolismo, y sin metabolismo no hay estructura. Este aparentecrculo vicioso en el que parecen estar la estructura y la actividad qu-mica del protoplasma se considera que es el resultado de un largo pro-ceso de evolucin a partir de una actividad muy simple relacionadacon una estructura tambin muy simple. Actualmente esta actividades muy compleja y tiene lugar en una estructura tambin muy com-pleja, y ambas estn diversicadas de forma irreversible.

Otra caracterstica fundamental de la integracin de la actividadqumica es que todas las reacciones aparecen ordenadas en secuenciasmuy bien denidas en las que el producto nal de una es el sustratode la siguiente. Estas secuencias de reacciones se llaman vas metab-licas y algunas se inician en algn material del medio exterior, quedebe pasar al protoplasma a travs de las envueltas celulares. Otrasterminan en productos que se liberan al medio exterior.

Cada cambio qumico aislado de una va metablica est catali-zado por un enzima. Muchos tipos de cambios requieren adems uncoenzima y, ocasionalmente, otros factores menos especcos, comopor ejemplo la presencia de determinados iones. El cambio qumicorealizado en una sola etapa es muy simple y generalmente reversi-ble. Existe un nmero relativamente reducido de cambios de este tipo,que pueden limitarse prcticamente a transferencias inter o intramole-culares de 2H, PO3H2, NH2, SH, CH3CO, CH3, aminoci-dos y a carboxilaciones o descarboxilaciones. Concomitantementepueden romperse o formarse nuevos enlaces CC.

71.4 EL SUMINISTRO ENERGTICO

Muchas vas metablicas tienen carcter cclico, esto es: cualquierproducto de la misma puede considerarse el nal y el punto de partida.

Casi todas las vas metablicas estn relacionadas unas con otras yun mismo intermediario puede obtenerse por distintos caminos. Nose puede actuar sobre una secuencia de reacciones sin afectar al resto.

Clsicamente, las vas metablicas pueden tener una funcincatablica o anablica. Estrictamente, las primeras seran aquellasque partiendo de ciertos materiales exteriores terminan en otros pro-ductos ms simples que se devuelven totalmente al medio exterior. Lanica nalidad de estas vas sera la produccin de energa. Los pro-ductos nales son de menor peso molecular y globalmente la reac-cin tiene carcter oxidante.

La secuencia bioqumica de carcter anablico conduce al incre-mento de protoplasma y por lo tanto supone siempre un balance demateria positivo para la fraccin celular. Tiene carcter reductor yforma molculas de mayor peso molecular que las de partida.

Alternativamente, tambin puede hacerse una separacin en tresclases de vas metablicas. Las de clase I comprenden reaccionespuramente degradativas que conducen a productos nales que seliberan al exterior o a subunidades que son utilizadas ulteriormentepara la biosntesis; son sistemas fundamentalmente exoergnicos. Lasvas metablicas de la clase II tienen carcter biosinttico y sus pro-ductos nales son subunidades y coenzimas. Las de clase III condu-cen a la formacin de macromolculas especcas a partir desubunidades. Estas macromolculas son protenas, cidos nucleicos ypolmeros de envueltas.

En los microorganismos encontramos una gran diversidad de otrasvas metablicas que conducen a la formacin de materiales que noforman ninguna estructura esencial para la clula bacteriana. Estosmateriales se encuentran en proporcin variable y generalmente pue-den ser reutilizados para la formacin de subunidades destinadas a labiosntesis o para la obtencin de energa, sin participacin de nin-gn sustrato exterior. Se trata de los metabolitos de reserva.

En determinadas condiciones de crecimiento muchos microorganis-mos pueden tambin dar lugar a la formacin de grandes cantidades dealgunos productos que no tienen funcin estructural ni de reserva.Generalmente se liberan al medio exterior, pero no son productos na-les de reacciones degradativas sino de vas biosintticas especcas.Entre ellos se encuentran antibiticos y otras sustancias que pueden serde utilidad para el hombre. En algunos casos pueden ser artefactosmetablicos, pero en otros pueden tener sentido adaptativo. De formageneral, estos productos se denominan metabolitos secundarios.

1.4 EL SUMINISTRO ENERGTICO

Las reacciones biosintticas requieren suministro energtico. Estesuministro suele llevarse a cabo generando un sustrato activado conel cual la reaccin puede tener lugar espontneamente. Para la forma-cin de sustratos activados es esencial la produccin de dadores deenerga libre cuyo tipo ms general es el ATP.

8Parte A: EL METABOLISMO MICROBIANOCaptulo 1: INTEGRACIN DE LA TOTALIDAD DE LAS TRANSFORMACIONES QUMICAS DE LA BIOFASE

Las reacciones biosnteticas son muy parecidas no slo entre distin-tos microorganismos sino incluso a las de los organismos pluricelulares.Mucha mayor diversidad encontramos en los sistemas suministrado-res de energa, los cuales pueden ser divididos en tres grandes tipos: lafotosntesis, la oxidacin de compuestos inorgnicos y el catabo-lismo o metabolismo degradativo de sustratos orgnicos.

En general, la actividad qumica que conduce a la produccin deenerga es cuantitativamente mayoritaria. Adems, si se comparan lasbacterias o las levaduras con las clulas de los organismos superiores,en las primeras existe de modo caracterstico una proporcin anmayor respecto de la actividad qumica total.

La biosntesis es totalmente dependiente de la integridad metab-lica, esto es, de la estructura y del sistema qumico suministrador deenerga. En cambio, la actividad de este ltimo puede tener lugar enausencia de biosntesis y se mantiene en gran parte en los sistemaslibres de clulas.

De acuerdo con el segundo principio de la termodinmica, cuandouna reaccin qumica libera energa, slo una parte de la misma, lla-mada energa libre (G), puede ser utilizada para desarrollar trabajo.El resto se pierde en forma de calor.

Las reacciones qumicas reversibles ocurren espontneamente enel sentido en el cual el cambio de energa libre sea negativo. Si todos

O

OH OH

O CH2PO

O

O

PO

O

O

PO

O

O

N

N N

N

NH2

RIBOSA

ADENOSINA

MONOFOSFATO DE ADENOSINA (AMP)

DIFOSFATO DE ADENOSINA (ADP)

ADENINA

Trifosfato de adenosina (ATP)

91.5 LA REGULACIN METABLICA

los productos estn presentes en concentracin molar,

G se llamaenerga libre especca (

G), que est relacionada con la constante deequilibrio

G = RT ln K

donde R es la constante de los gases, T es la temperatura absoluta y Kla constante de equilibrio. Si K es mayor que 1,

G ser negativo yesto indica que la formacin de los productos en el sentido conside-rado est favorecida. Si K es menor que 1,

G ser positivo y entoncesla reaccin no puede producirse. Esto es, si se aumenta la cantidad dealguno de los productos, se lleva a cabo en sentido opuesto hasta res-tablecer el equilibrio. Para una estequiometra determinada, el valorde

G puede ser calculado de la diferencia entre

G de los produc-tos nales y

G de los productos reaccionantes.Cuando el ATP da lugar a la formacin de un compuesto activado,

el nivel de energa libre de este ltimo aumenta, lo cual determinauna situacin termodinmicamente favorable en comparacin con elsustrato sin activar. El valor de

G pasa de un valor positivo a unvalor negativo relativamente grande. Estos compuestos activados sonintermediarios fosforilados.

En la biosntesis intervienen otros intermediarios que tienen unefecto activador parecido al ATP. En su formacin participa general-mente el ATP, pero algunas veces se forman directamente como resul-tado de reacciones catablicas. A este grupo pertenecen el GTP, UTP,CTP, dTTP (desoxitimidina trifosfato) y acetil-CoA.

1.5 LA REGULACIN METABLICA

Otra caracterstica de la integracin de la actividad qumica del proto-plasma es su capacidad de modicarse ordenadamente segn sean lascondiciones del medio exterior. Estos cambios tienen sentido adapta-tivo y se llevan a cabo mediante mecanismos de regulacin diversos.

Los mecanismos ms sencillos de regulacin metablica son:

a) El bypass metablico. En este mecanismo dos enzimas compi-ten por un mismo sustrato.

b) La represin de la sntesis de un enzima o la inhibicin de suactividad. La inhibicin de la actividad suele afectar al enzimaque cataliza la primera etapa de una va metablica, y est con-trolada por el producto nal de la misma (regulacin feedback).Cuando crecen en un medio sinttico, los microorganismossintetizan en cantidades adecuadas todas las subunidades nece-sarias para la biosntesis de macromolculas, pero, por la exis-

A

B

C

e1

e2

10

Parte A: EL METABOLISMO MICROBIANOCaptulo 1: INTEGRACIN DE LA TOTALIDAD DE LAS TRANSFORMACIONES QUMICAS DE LA BIOFASE

tencia de este tipo de mecanismo, dejan de sintetizar unasubunidad si sta se aade al medio de cultivo. Por lo que res-pecta a la sntesis de enzimas implicados en procesos catabli-cos, stos slo suelen sintetizarse cuando el sustrato catablicoest presente. Cuando hay dos sustratos, la bacteria utiliza pri-mero uno y despus el otro. El enzima que se sintetiza primeroes siempre el que acta sobre el sustrato que produce un creci-miento ms rpido.

c) Otro sistema de regulacin metablica es el de reacciones aco-pladas por un coenzima comn. En este sistema, la forma delcoenzima que requiere una reaccin es la que se produce des-pus de actuar en la otra.

d) Todo el metabolismo se desarrolla en un sistema altamenteheterogneo y muchas actividades estn localizadas en determi-nados orgnulos. Por lo tanto, la sntesis de los mismos regularla intensidad de aqullas. Tal es el caso de la sntesis proteica yla sntesis de RNA ribosmico.

Al considerar los aspectos estructurales hay que mencionar que lasenvueltas celulares tienen una capacidad importante de regular laentrada de productos al citoplasma y la salida de productos desde l.En algunos casos las bacterias son capaces de modicar la estructurade los compuestos que constituyen el medio exterior, generalmentedegradndolos para obtener un conjunto de compuestos ms hetero-gneo y de estructura ms sencilla, pero tambin formando cpsulas ylimos. Esto les permite estar en contacto directo con un medio msfavorable para conseguir un desarrollo mayor y ms ecaz que el quecorrespondera a un medio de la misma composicin pero de concen-tracin homognea.

Considerada en s misma, la actividad qumica de las bacteriasparece tener como objetivo nico el uso de los nutrientes disponiblespara conseguir formar cuanto antes dos clulas idnticas a la de par-tida. La coordinacin de la actividad qumica y la existencia de losdiversos mecanismos de regulacin dan la impresin de que las bacte-rias estn programadas para tal n.

1.6 EL PRINCIPIO DE LA BIOQUMICA UNITARIA

La bioqumica empez con el estudio de la fermentacin alcohlicacon extractos de levadura. El estudio de la glucolisis in vitro e in vivo sebas en dos materiales de trabajo: la levadura y el msculo. Esto segu-ramente fue el principio de la bioqumica comparada. Principalmente

A B

C D

Coenzimareducido

Coenzimaoxidado

11

1.6 EL PRINCIPIO DE LA BIOQUMICAUNITARIA

gracias a la visin de Kluyver y Van Niel, hacia los aos 30 se lleg alconvencimiento de que las vas metablicas de los distintos organis-mos tenan muchos aspectos comunes, independientemente de sunaturaleza vegetal, animal o microbiana. Es por ello que de una formageneral el metabolismo microbiano ha constituido un modelo cuyosresultados no slo han servido para comprender mejor la actividadqumica de las bacterias sino la de toda la materia viva. En gran parteha sido as porque el uso de las bacterias como material de experi-mentacin es mucho ms favorable que el de otros organismos y por-que una parte de la historia de la biologa, que va desde nales delpasado siglo hasta los aos 40, est profundamente marcada por lahuella de una fructfera interaccin entre bioqumica y microbiologa.

La semejanza entre las distintas vas metablicas aboga en favor deuna unidad de esquema de organizacin de todos los seres vivos ytambin en favor de su parentesco. Se considera que las secuenciasbioqumicas son el resultado de una historia evolutiva paso a paso, enla cual ha sido la seleccin natural la que ha potenciado los modelosde organizacin ms ecaces que pueden surgir de pequeas variacio-nes dentro de una poblacin homognea. La evolucin bioqumicatiene el mismo carcter neodarwiniano que la evolucin morfolgica.

Las grandes lneas de la evolucin bioqumica ya se manifestaronen la organizacin de los procariotas. Dentro de ella encontramos lamayor simplicidad, la mayor diversidad y, en cierto sentido, la mayorcomplejidad. La inventiva bioqumica en la evolucin biolgica delos eucariotas ha sido importante pero relativamente menor. De aquel gran inters del metabolismo bacteriano para la bioqumica compa-rada. Tambin en ella encontramos una mejor comprensin de ladiversidad de las bacterias, dada su relativa simplicidad morfolgica yla prctica ausencia de testimonios fsiles.

PARTE B

COMPOSICIN QUMICA Y CRECIMIENTO DE LA

BIOMASA MICROBIANA

COMPOSICIN QUMICA

2.1 LA PRODUCCIN DE BIOMASA 162.2 CONTENIDO DE AGUA DE LA BIOFASE 172.3 COMPOSICIN ELEMENTAL 182.4 FRACCIN CIDO-SOLUBLE 182.5 PROTENAS 192.6 CIDOS NUCLEICOS 192.7 LPIDOS 202.8 HIDRATOS DE CARBONO 202.9 MOLCULAS EXCLUSIVAS DE LAS BACTERIAS 21

2.10 OTROS COMPONENTES MOLECULARES DE LA BIOMASA MICROBIANA 25

2.11 CONCLUSIONES GENERALES SOBRE LA COMPOSICIN QUMICA DE LA BIOFASE 27BIBLIOGRAFA 27

2

16

Parte B: COMPOSICIN QUMICA Y CRECIMIENTO DE LA BIOMASA MICROBIANA.Captulo 2: COMPOSICIN QUMICA

2.1 LA PRODUCCIN DE BIOMASA

La cantidad de clulas disponible para el anlisis depende de la con-centracin celular nal obtenida y del volumen de los cultivos. El cre-cimiento microbiano cesa por agotamiento del sustrato, o porque stedeja de ser utilizable, y tambin a causa de que la acumulacin deproductos metablicos alcanza niveles inhibidores. Para obtener elcrecimiento mximo debe explotarse al mximo la capacidad meta-blica del microorganismo, principalmente en relacin con la fuentede energa, y, adems, hay que eliminar o neutralizar los productosque se acumulan en el medio. La consecucin de estos objetivosrequiere un planteamiento diferente segn sea el microorganismo.

Cuando la fuente de energa es un sustrato orgnico que puede seroxidado completamente, lo primero es encontrar la cantidad ade-cuada del mismo y el suministro de oxgeno necesario. As, por ejem-plo, con E. coli creciendo en caldo ordinario (5 g de peptona y 3 g deextracto de carne por litro) se obtienen alrededor de 2

108 clulas/ml en la fase estacionaria del crecimiento o 5

109 cuando el medioesta dotado de agitacin o aireacin,. Esto signica que se obtienepoco ms de 1 g de peso seco por litro o una produccin del 15%,referida a la cantidad de nutrientes convertida en biomasa. En unmedio constituido por un 2% de hidrolizado de casena y un 1% deglucosa, con Brucella suis, que es bastante ms pequea que E. coli, seobtienen 8

1010 clulas/ml, lo que signica de 5 a 10 g/l de pesoseco. En estos casos, son importantes la buena circulacin del oxgenocon difusores apropiados, la agitacin y la prevencin de la forma-cin de espuma con antiespumantes no txicos.

A menudo resultan apropiados para grandes producciones losmedios de composicin qumica denida en los que se pueda conse-guir una utilizacin completa del sustrato energtico y el manteni-miento del pH con un tampn apropiado. Evidentemente, el mediosinttico debe contener las fuentes de N, S y P adecuadas, as como losfactores de crecimiento necesarios para conseguir el mximo rendi-miento. De este modo, con la misma Brucella suis, se puede alcanzaruna concentracin nal de 1011 clulas/ml.

En los medios sintticos puede aumentarse la produccin utili-zando una mezcla de sustratos. As, con Serratia marcescens, queoxida tanto la glucosa como el citrato, se llegan a obtener 29 g/l depeso seco celular (2

1011 clulas/ml) con 57 g/l de glucosa y 20 g/lde cido ctrico. El 40% del C asimilado se incorpora a la biomasa, entanto que el resto es oxidado hasta CO2. Con E. coli se pueden obte-ner resultados semejantes utilizando, en lugar de citrato, malato uotro intermediario del ciclo de Krebs. Con levaduras se consiguen enmedio sinttico producciones de hasta 10 g/l de peso seco celular conla completa utilizacin de 100 g/l de glucosa.

Los sustratos oxidables pueden ser aadidos gradualmente para pre-venir la inhibicin del crecimiento debido a la alta presin osmtica.En sistemas de ujo continuo, bien regulados y con un reemplaza-miento del medio no demasiado rpido, pueden obtenerse produccio-

17

2.1 LA PRODUCCIN DE BIOMASA

nes de 13 g de peso seco l1 h1 de levadura con completa utilizacindel azcar. De todas formas, cuando se pretenden obtener produccio-nes absolutas muy grandes, la construccin de fermentadores apropia-dos puede presentar problemas complejos de ingeniera en aspectostales como la optimizacin del suministro de oxgeno, la mezcla delcultivo y la separacin de las clulas.

Las altas producciones de bacterias aerobias y de levaduras condu-cen a una biofase que representa del 10 al 40% del volumen del cul-tivo. En estas circunstancias, los problemas de alimentacin,aireacin y separacin celular pueden ser muy delicados, si bien en smismos no constituyen una limitacin del crecimiento. Se ha detener en cuenta que en el crecimiento de un cultivo sobre mediosslidos la produccin alcanzada por gramo de nutriente utilizado nodiere de la que puede conseguirse con el mismo cultivo en mediolquido.

Con los microorganismos que crecen anaerobiamente o que slorealizan una oxidacin parcial del sustrato energtico se planteangeneralmente problemas ms complicados. Cuando se producen ci-dos, el control del pH es esencial y la naturaleza y concentracin deltampn utilizado pueden ser crticos. As, con las bacterias del cidolctico se obtienen resultados mucho mejores con tampones decitrato o acetato que con fosfato o aminocidos. El principio deldoble sustrato es igualmente aplicable. Por ejemplo, el crecimiento deLactobacillus arabinosus puede aumentar utilizando mezclas de glu-cosa y malato en lugar de glucosa sola. Streptococcus faecalis y Saccha-romyces cerevisiae crecen anaerobiamente con glucosa, produciendorespectivamente 22 y 21 microgramos de peso seco celular por micro-mol de glucosa. Aadiendo arginina, en S. faecalis tenemos una pro-duccin adicional de 10 microgramos de peso seco por micromol dearginina. Estos crecimientos corresponden a producciones de alrede-dor del 12% en gramos de peso seco por gramo de glucosa y del 6%para la arginina. Ambos resultados muestran un crecimiento quedepende de la capacidad de generar ATP a partir del sustrato. S. faeca-lis y S. cerevisiae obtienen 2 moles de ATP a partir de cada mol de glu-cosa fermentada, y S. faecalis obtiene 1 mol de ATP por mol dearginina fermentada a ornitina. En el desarrollo fermentativo siemprehay un crecimiento total jo para cada microorganismo correspon-diente a la utilizacin de una determinada cantidad de sustrato.

En conjunto es razonable asumir que no existe lmite para la canti-dad de clulas que se puede obtener por cultivo de microorganismossi se llegan a controlar sucientemente las condiciones ptimas decrecimiento. Sin embargo, las caractersticas metablicas de algunosmicroorganismos hacen que su cultivo presente dicultades prctica-mente infranqueables. As, las bacterias del hierro requieren a la vezoxgeno y hierro en estado reducido, lo cual es muy difcil de conse-guir en el laboratorio. En realidad, representan una adaptacin margi-nal en el seno de medios biticos naturales complejos.

18

Parte B: COMPOSICIN QUMICA Y CRECIMIENTO DE LA BIOMASA MICROBIANA.Captulo 2: COMPOSICIN QUMICA

2.2 CONTENIDO DE AGUA DE LA BIOFASE

Tal y como ha sido comentado anteriormente, las clulas pueden serseparadas del medio por centrifugacin o ltracin y posteriorlavado. La biomasa hmeda obtenida pierde por secado a 105 C deun 70 a un 90% de agua, segn el microorganismo y las condicionesde crecimiento, una cantidad inferior a la que se encuentra en orga-nismos superiores (90%).

Hay un agua intercelular y otra intracelular. La primera puedevariar segn el mtodo de obtencin de la masa hmeda y de los pro-ductos hidroflicos (polisacridos) o hidrofbicos (lpidos) que seencuentren sobre las paredes celulares. El agua intercelular puede serdeterminada por medio de protenas marcadas isotpicamente, lascuales no penetran en la clula. Puede representar un 10-20% delvolumen total de la masa hmeda.

2.3 COMPOSICIN ELEMENTAL

El anlisis elemental se practica por los mtodos de la qumica org-nica sobre una alcuota de la materia seca obtenida del crecimientototal de un cultivo. Para nuestro objetivo, el detalle de la composicinelemental no tiene demasiado inters. Podemos sealar que propor-ciona un resultado global tpico de la materia viva y que diere pocode un microorganismo a otro. Como valores medios se obtiene un50% de carbono, 20% de oxgeno, 14% de nitrgeno, 8% de hidr-geno, 3% de fsforo, 2% de potasio, 1% de azufre, 0,05% de calcio,magnesio y cloro, 0,2% de hierro y un total de elementos traza del0,3% que comprenden manganeso, cobalto, cobre, zinc y molibdeno.A partir de estos datos se puede anticipar que la biomasa microbianaest formada de materia orgnica.

2.4 FRACCIN CIDO-SOLUBLE

Es la que se obtiene por extraccin con cido tricloractico al 5% ocido perclrico al 10% en fro, para minimizar la hidrlisis. Contienemolculas orgnicas de bajo peso molecular y iones inorgnicos.

TABLA 2.1 Tipos y nmero aproximado de molculas distintas de la fraccincido-soluble.

Tipos de molculas Nmero de tipos

Aminocidos, precursores y derivadosNucletidos, precursores y derivadoscidos grasos y sus derivadosAzcares y sus precursoresQuinonas, poliisoprenoides, porfirinas,

vitaminas, otros coenzimas, grupos prostticos y sus precursores

12010050

250

300

19

2.5 PROTENAS

Las molculas orgnicas representan en E. coli unos 8 fg (femtogra-mos, 1015 g) por clula. Hay centenares de tipos diferentes de mol-culas que incluyen precursores de macromolculas, intermediariosmetablicos y cofactores de enzimas (tabla 2.1).

La fraccin cido-soluble comprende un 8% del C total y un 20%del fsforo. Constituye una especie de medio interno en el que muchoscompuestos estn enormemente ms concentrados que en el medioexterno. Esto determina una alta presin osmtica, variable de un casoa otro (Staphylococcus aureus: 20-25 atmsferas, E. coli: 5-6 atmsferas).Hay que resaltar que esta fraccin no presenta fragmentos de las gran-des molculas estructurales (protenas y cidos nucleicos). Su eventualliberacin puede ir seguida de hidrlisis hasta pequeos fragmentos.

Los aniones ms abundantes dependen de la composicin delmedio, pero siempre incluyen sulfato, fosfato y cloruro. El catin msabundante es el K+, que es el factor inorgnico ms importante en laregulacin de la presin osmtica. El Na+ est ausente o se halla enpequea proporcin. Tambin se encuentran concentraciones reduci-das de NH4+, Mg2+, Ca2+ y Fe2+-Fe3+, y, a concentraciones an msbajas, Mn2+, Mo2+, Co2+, Cu2+ y Zn2+. El conjunto de molculasinorgnicas slo alcanza alrededor del 1% del peso seco, pero sus fun-ciones son esenciales para el crecimiento.

2.5 PROTENAS

Las protenas pueden separarse de la fraccin cido-insoluble encaliente. Representan alrededor del 50% del peso seco de las clulas.Contienen el 60% del carbono celular y el 70% del azufre. Se cree quede un 15 a un 20% de las protenas son, probablemente, lipoprotenas.

Se ha estimado que el nmero total de polipptidos diferentes quese encuentran en E. coli es del orden de 1800, con un peso molecularmedio de 40 kDa. El total de molculas proteicas puede llegar a 2,5millones por clula.

2.6 CIDOS NUCLEICOS

Se pueden separar de la fraccin alcohol-ter insoluble con cido tri-cloroactico al 5% (30 min a 90 C). Los dos componentes, RNA yDNA, pueden ser estimados colorimtricamente despus de unahidrlisis sin ulterior separacin. Las fracciones de RNA y DNA pue-den separarse por su solubilidad selectiva en soluciones salinas, porhidrlisis alcalina del RNA, o por digestin con RNAsa o DNAsaseguida de una precipitacin alcohlica de la fraccin no digerida.

Las clulas de muchos microorganismos son muy ricas en RNA. Enlas bacterias y levaduras constituye el 20-25% del peso seco. El RNApreponderante es el ribosmico (rRNA) que se presenta en varias espe-cies moleculares (23S, 16S y 5S) y constituye el 80% del RNA total. ElRNA de transferencia (tRNA) constituye el 15% del total y tiene unpeso molecular del orden de 25 kDa. Existen diferentes tipos de tRNA;as, por ejemplo, se estima que en E. coli hay unas 60 molculas dife-rentes. Pero la abundancia de molculas diferentes de tRNA vara

20

Parte B: COMPOSICIN QUMICA Y CRECIMIENTO DE LA BIOMASA MICROBIANA.Captulo 2: COMPOSICIN QUMICA

mucho de un microorganismo a otro. El conjunto de las poblacionesde RNA ribosomal y de transferencia recibe el nombre de RNA estable.Ello es as en contraposicin al RNA mensajero (mRNA), que presentageneralmente una vida media corta (entre 0,5 y 10 min). Este ltimoes el menos abundante (4% del RNA total).

La elevada proporcin de RNA total y la baja estabilidad del mRNAson dos caractersticas asociadas al relativamente rpido crecimientode muchos microorganismos.

El material gentico de las bacterias est ordenado en una solamolcula de DNA llamada cromosoma. Adems, las bacterias tambinpueden tener otras molculas de DNA independientes, llamadas pls-midos, relativamente ms pequeas. Estas ltimas constituyen unafraccin variable y no esencial del genoma de la clula bacteriana. Enlos organismos eucariotas el DNA se encuentra en estructuras muchoms complejas que comprenden varios cromosomas propiamentedichos, puesto que el nombre de cromosoma se aplica en las bacteriassolamente en sentido anlogo.

El cromosoma de E. coli se conoce con notable precisin. Repre-senta 9 femtogramos por clula y est formado por una doble cadenade DNA cerrada covalentemente que contiene unos 4720000 pares debases. Totalmente extendida alcanzara 1 mm de longitud. Sinembargo, dentro de la clula se encuentra convenientemente plegadade modo que su longitud es unas 500 veces menor.

2.7 LPIDOS

La fraccin cido-insoluble puede ser tratada con alcohol o alcohol-ter a 40-50 C para extraer algunos lpidos. Sin embargo, otras mol-culas de este tipo slo se separan con disolventes despus de unaenrgica hidrlisis con HCl concentrado (6 N a 100 C durante variashoras). Claramente, la mayor parte de estos lpidos deben formarparte de estructuras mole-culares ms complejas de la pared celular ode la membrana protoplasmtica.

En E. coli los lpidos totales contienen del 10 al 15% del carbonototal de la clula y una proporcin semejante del peso seco. Se encuen-tran repartidos entre la pared celular y la membrana protoplasmtica.Algunas bacterias acumulan poli-

-hidroxibutirato, que es una ecazreserva energtica. En las micobacterias se encuentran lpidos estructu-rales especiales que pueden llegar a constituir el 10% del peso seco.

Excluyendo el lipopolisacrido, los lpidos de E. coli son fosfolpi-dos (g. 2.1). Los cidos grasos ms frecuentes que se encuentran enestas molculas son el palmtico (43%), el palmitoleico (33%) y el cis-vaccnico (25%).

2.8 HIDRATOS DE CARBONO

Se encuentran formando parte de los cidos nucleicos, en oligosacri-dos de la fraccin cido-soluble, como polisacridos extracelulares(cpsulas y limos) y formando parte de molculas complejas en lapared celular.

21

2.9 MOLCULAS EXCLUSIVAS DE LASBACTERIAS

Tambin se encuentran polisacridos como reserva energtica enforma de grnulos. En Clostridium se acumula almidn o granulosa, yen las enterobactericeas y las levaduras se acumula una sustanciaanloga al glucgeno. Son reservas energticas que pueden almace-narse en gran cantidad cuando se dispone de sustrato en el medioexterior y el crecimiento est impedido por falta de algn nutrienteimprescindible. Un caso particular es el de Acetobacter xylinum, queforma celulosa que es extruida al medio en forma de bras. Esto cons-tituye un fenmeno nico en el mundo procariota.

2.9 MOLCULAS EXCLUSIVAS DE LAS BACTERIAS

Todos los componentes de la biomasa microbiana referidos antes seencuentran tambin , en lneas generales, en cualquier tipo de mate-ria viva. Las bacterias presentan adems cuatro molculas importan-tes en exclusividad: la murena, el lipopolisacrido, los cidosteicoicos y los cidos lipoteicoicos.

La murena es un peptidoglicano que se encuentra en todas lasbacterias, con excepcin de las arqueobacterias y los mollicutes(micoplasmas). Constituye la mayor parte de la pared celular y es res-ponsable de la forma de la clula y de su integridad estructural, pro-porcionando rigidez a la misma.

La murena est compuesta de restos de N-acetilglucosamina (NAG)y de cido N-acetil murmico (NAM), unidos alternativamente por enla-ces

-1,4-glucosdicos. Hay un tetrapptido unido al NAM que puedeunirse a su vez con el tetrapptido de una cadena adyacente (g. 2.2).

Figura 2.1 Fosfolpidos de Escherichia coli.

R1 O CH2CHOR2

H2C O P

O

OH

CH2 CH2 NH2

R1 y R2: cidos grasos

Fosfatidiletanolamina(75%)

CHOH CH2OHFosfatidilglicerol

(18%)

CH CH2Cardiolipina

(5%)OH

O P O

O

OH

CH2

HC O R2

H2C O R1

22

La estructura del lipopolisacrido (LPS) vara de una bacteria aotra, e incluso entre diferentes cepas, pero se presenta en todas lasbacterias gramnegativas. Una subunidad del lipopolisacrido de Sal-monella podra representarse como se indica en la gura 2.3.

El lpido A es un disacrido de glucosamina fosforilado y esteri-cado con distintos cidos grasos (R12: dodecanoico, R14: tetradeca-noico, R16: hexadecanoico y OH-R14: 3-hidroxitetradecanoico). Elncleo es un oligosacrido que comnmente incluye L-glicero-d-manoheptosa y cido ceto-desoxi-octanoico (3-desoxi-D-manooctulo-smico). El lpido A y el ncleo correspondientes al LPS de las distin-tas enterobactericeas parecen ser semejantes. La cadena O, que es

Figura 2.2 Diagrama de la murena de E. coli. (a) Esquema de la unidad bsica repetida del peptidoglicano. (b) Enlace pep-tdico que posibilita la unin de cadenas lineales. (c) Estructura de la red formada por cadenas de peptidoglicano unidas porenlaces peptdicos. Algunas cadenas peptdicas quedan libres.

O

NH

OH

CH2OH

C O

CH3

NAG

O

NH

O

CH2OH

C O

CH3

NAM

OO

O

NH

OH

CH2OH

C O

CH3

NAG

O

O

NH

O

CH2OH

C O

CH3

NAM

HC

C

CH3

L-Alanina

O

O

D-Glutmico

Meso-diaminopimlico

D-Alanina

HC

C

CH3

L-Ala nina

O

D-Glutmico

Meso-diaminopimlico

D-Alanina

UNIDAD BSICA

(a)

NAM

L-Ala

D-Glu

DAP

D-Ala CO NH DAP

D-Ala

D-Glu

L-Ala

NAM

(b)

NAM

NAM

NAM

NAM

NAG

NAG

NAG

NAG

NAM

NAM

NAM

NAM

NAG

NAG

NAG

NAG

NAM

NAM

NAM

NAM

NAG

NAG

NAG

NAG

(c)

NAM: cido N-acetil murmicoNAG: N-acetilglucosamina

23

2.9 MOLCULAS EXCLUSIVAS DE LASBACTERIAS

especca de cada cepa, tiene mayor longitud que el ncleo y est for-mada por la repeticin de varias subunidades de tri-, tetra- o pentasa-cridos, constituidos por azcares poco comunes.

Las bacterias grampositivas no tienen LPS, pero pueden presentarcidos teicoicos asociados a la murena. Se trata de polmeros del gli-cerol o del ribitol unidos por enlaces fosfodister y con uno o msaminocidos como sustituyentes (g. 2.4).

Figura 2.3 Subunidad del lipopolisacrido (LPS) de Salmonella (vasetexto).

Azcar Azcar

Azcar

Azcar n

Cadena O

Azcar Azcar

Azcar

Azcar Azcar

Heptosa Heptosa

P HeptosaPEtanolamina

KDO

KDOEtanolamina P KDO

P P

Etanolamina

Glucosamina

R14 R16 R12

Glucosamina

R14 R14

P

Ncleo

Lpido AOH

24

Parte B: COMPOSICIN QUMICA Y CRECIMIENTO DE LA BIOMASA MICROBIANA.Captulo 2: COMPOSICIN QUMICA

Ms recientemente (1987-1993), se ha descrito otro tipo de molcu-las complejas que se encuentran en muchas bacterias grampositivas. Setrata de los llamados cidos lipoteicoicos (LTA) y los lipoglucanos, loscuales tienen carcter macroanflico y estn anclados en la membrana

Figura 2.4 Ejemplos de cidos teicoicos.

Lactobacillus casei O CH2CHO

H2C

R

O P

O

OHR = D-alanina

Actinomyces antibioticus O CH2CHO

H2C O P

O

OHR = D-alanina

R

Streptococcus lactis D-ala

gluAcN P O CH2CHHO

H2C O P

O

OH

Bacillus subtilis CH2CH

O

O

CH

R

HO

CHHO

H2C O P

O

OH

D-ala

Actinomyces streptomicini CH2OH

CHOH

CHO

CH

H2C O P

O

OH

HO

2(gal)1-3 (glu)1-3 (ram)1

25

2.10 OTROS COMPONENTESMOLECULARES DE LA BIOMASA

MICROBIANA

protoplasmtica por interaccin hidrofbica con los restos acil-grasos.La cadena hidroflica, que alcanza hasta 13-30 nm de longitud, puedepenetrar en la cubierta de peptidoglicano y llegar hasta la supercie obien puede quedar enrollada sobre la membrana protoplasmtica.Unos y otros son parcialmente perdidos durante el crecimiento,pasando al medio. En la gura 2.5 se representa una estructura caracte-rstica de un lipoglucano. Los LTA son parecidos, pero tienen D-Ala,azcares aminados y enlaces -glucosdicos en lugar de -glucosdicos.

Las molculas macroanflicas referidas varan de una especie aotra y, en menor grado, de una cepa a otra. Como ejemplo de la inte-raccin de la murena con los cidos teicoicos y lipoteicoicos, en lagura 2.6 se representa un modelo del complejo membrana proto-plasmtica-pared celular en las bacterias grampositivas.

Adems de la complejidad de estas molculas singulares de las bac-terias que se acaban de referir brevemente, es interesante destacar elhecho de que algunas de ellas contienen D-aminocidos, los cualesno se encuentran en ninguna protena.

2.10 OTROS COMPONENTES MOLECULARES DE LA BIOMASA MICROBIANA

Otro importante grupo de componentes orgnicos del protoplasmabacteriano est constituido por los pigmentos. Algunos de ellos,como la prodigiosina, la piocianina y la violacena, slo se forman endeterminadas condiciones de crecimiento. Los pigmentos puedenpermanecer dentro de la clula o excretarse al medio. Algunos pig-mentos tienen un papel semejante a un metabolito secundario, perootros desempean un papel funcional crtico, como las clorolas y loscarotenoides.

Figura 2.5 Estructura caracterstica de un lipoglucano.

O CH2

X

CH

OH

CH2 O P

O

O

OH CH2

CHOH

HOOH

OH

O O

O

OH

OH

OH

CH2

O

OH O

OH

OH

CH2

O CH2HC

H2Cf-gal

m

p-glu

n

p-galX = L-alam = 11-18n = 8-12

R1R2

resto acil-graso

OR1

f, forma furansicap, forma piransica

26

Parte B: COMPOSICIN QUMICA Y CRECIMIENTO DE LA BIOMASA MICROBIANA.Captulo 2: COMPOSICIN QUMICA

Tambin en muchas bacterias podemos encontrar cido fosfricoaltamente polimerizado. Los grnulos de polimetafosfato son unareserva energtica. Son conocidos como volutina o grnulos metacro-mticos por su caracterstica de cambiar el color de los colorantes queincorporan en las preparaciones microscpicas.

Otra molcula que slo se halla en las bacterias es el cido dipicol-nico (cido piridn-2-6-dicarboxlico), encontrado en las esporas deClostridium y Bacillus (10-15% del peso seco de las esporas). Durantela germinacin se libera al medio.

Figura 2.6 Modelo del complejo membrana protoplasmtica-pared celularen las bacterias grampositivas. Los LTA estn anclados hidrofbicamente, entanto que los cidos teicoicos (TA) se unen covalentemente al peptidogli-cano.

P

P

........... . . ........

........... . . ........

...............

..

............. ....

.

.

..

...

.

.. ...

.. .. .

.....

... . . ....

.... ...

..... . . .

.

. ................

......

...... . .....

Peptidoglicano

cido teicoico

cido lipoteicoico

Glicolpido

Fosfolpido

Protena

27

2.11 CONCLUSIONES GENERALESSOBRE LA COMPOSICIN QUMICA

DE LA BIOFASE

2.11 CONCLUSIONES GENERALES SOBRE LA COMPOSICIN QUMICA DE LA BIOFASE

La biomasa microbiana que se obtiene a partir de cultivos puros esqumicamente compleja. No obstante, actualmente existen recursosanalticos sucientes para denir cuantitativa y cualitativamentecualquier tipo de molcula presente en la misma. Ello no impide reco-nocer que la denicin precisa de una molcula de LPS o de LTA seaun problema de gran complejidad.

Es sumamente importante tener presente que para una cepa deter-minada, un medio de cultivo denido y unas condiciones de desarro-llo constantes, se encuentra siempre la misma composicin. Encambio, sta puede variar de un microorganismo a otro. Los cambiosrelativos al medio y a las condiciones de cultivo son reversibles y pue-den ser prede-cibles.

Una gran parte de la composicin qumica de los microorganismoses semejante a la de otros organismos. Sin embargo, aqullos presen-tan algunas caractersticas peculiares que merecen ser tenidas encuenta: el alto contenido de ARN y la presencia de molculas espec-cas de alto signicado siolgico como la murena, el LPS, los AT y losLTA. Aparte de esto, pueden encontrarse singularidades menores quecaracterizan a algunos microorganismos particulares.

BIBLIOGRAFA

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REAVELEY, D. A. y BURGE, R. F. Walls and Membranes in Bacteria. Advancesin Microbial Physiol. (Ed. by a. H. Rose and D. W. Tempest). v. 7. AcademicPress. New York and London, 1972.

NEIDHARDT, F. C., INGRAHAM, J., SCHACHTER, M. Physiology of the Bacte-rial cell. A Molecular Approach. Sinauer Associates, Inc. Massachusetts. 1990.

FISCHER, W. Bacterial phosphoglycolipids and lipoteichoic acids. HandbookLipid Resch. 1990; 6:123.

FISCHER, W. Lipoteichoic acids and lipoglycans. En Bacterial Cell Wall (J.-M.Gluysen y R. Hakenbeck, eds.). Elsevier Science B. V. Amsterdam 1994.

CINTICA DEL CRECIMIENTO

3.1 CULTIVO DISCONTINUO (BATCH CULTURE) 303.2 CULTIVO CONTINUO 34

BIBLIOGRAFA 36

3

30

Parte B: COMPOSICIN QUMICA Y CRECIMIENTO DE LA BIOMASA MICROBIANACaptulo 3: CINTICA DEL CRECIMIENTO

3.1 CULTIVO DISCONTINUO (BATCH CULTURE )

Cuando una fraccin de clulas de un cultivo puro es inoculada en undeterminado volumen de medio fresco, despus de una incubacin,se produce un incremento de la biomasa hasta un valor mximodenominado crecimiento total. Este proceso comporta crecimientocelular propiamente dicho y aumento del nmero de clulas porautoduplicacin. La biomasa es un catalizador de una reaccin queproduce ms biomasa idntica a la de partida.

Para poder cuanticar el aumento del nmero de clulas de lapoblacin, es importante limitarnos aqu a microorganismos que semultiplican por divisin binaria, tal y como sucede con la mayora delas bacterias. Si consideramos el crecimiento de una nica clula encondiciones ambientales que no imponen ninguna restriccin a sumultiplicacin, el crecimiento de dicha clula, que se divide de formabinaria, sigue una progresin geomtrica de base 2, es decir:

20

21

22

23 2n

Si la poblacin inicial, en vez de estar formada por una clula, estformada por N0 clulas, el nmero nal de clulas que habr en unmomento dado (N1) depender, obviamente, del nmero de genera-ciones que hayan tenido lugar (n), y ser:

N1 = N0 2n (1)

o, tomando logaritmos:

log N1 = log N0 + n log 2 (2)

Conociendo experimentalmente N0 y N1, el nmero de generacionesn puede determinarse por la ecuacin:

(3)

Como el log 2 es igual a 0,301, puede escribirse tambin:

n = 3,32 (log N1 log N0) (4)

Estos clculos permiten determinar con facilidad el nmero degeneraciones que ha tenido lugar en una poblacin que ha incremen-tado su nmero de clulas de N0 a N1. Es importante resaltar aqu queestas frmulas son vlidas para cualquier organismo vivo que proli-fere por divisin binaria.

El factor que puede introducirse ahora hace referencia al tiemponecesario para que N0 clulas se conviertan en N1. Este factor s que escaracterstico de cada microorganismo y puede variar enormementede uno a otro. La introduccin del factor tiempo (t) implica necesaria-

nlog N1 log N0

log 2------------------------------------------=

31

3.1 CULTIVO DISCONTINUO(BATCH CULTURE)

mente la aparicin del concepto de velocidad de multiplicacin (R), onmero de generaciones por unidad de tiempo:

(5)

Si el valor de n se obtiene de la ecuacin (4), tenemos:

(6)

Un concepto que suele utilizarse para caracterizar el crecimientomicrobiano es el llamado tiempo de generacin g que el tiempo nece-sario para que se duplique la poblacin:

g = 1/R = t/n (7)

El planteamiento matemtico realizado hasta ahora es un modeloterico, que si bien nos posibilita una aproximacin interesante parala determinacin de una serie de parmetros que caracterizan el creci-miento microbiano, presenta algunas limitaciones. Por ejemplo, hayque tener en cuenta que no todas las clulas de un cultivo se dividen,por lo que, en conjunto, el cultivo presentar un valor de g algomayor que el calculado a partir de la ecuacin (7).

Una aproximacin matemtica ms precisa se basa en considerarel mismo sistema referido anteriormente, es decir, clulas creciendoen condiciones no restrictivas, como un sistema autocataltico y ana-lizar los cambios que se producen en la biomasa en intervalos inni-tesimales de tiempo en lugar de estudiar el promedio de cambios en elnmero de clulas que tienen lugar a lo largo de un periodo detiempo. En estas condiciones, el aumento de biomasa a lo largo deltiempo es proporcional a la biomasa existente, por lo que sigue lacintica de una reaccin de primer orden.

En trminos matemticos, esto puede expresarse como:

dN/dt =

N (8)

Aqu y en adelante, N puede ser cualquier parmetro que reeje labiomasa, como el nmero de clulas, pero tambin podra ser la canti-dad de protena, de cidos nucleicos, etc. Por otro lado, t es el tiempo y

una constante de proporcionalidad que se denomina constante de lafase de crecimiento o velocidad especca de multiplicacin. Es impor-tante mencionar aqu que

no es la velocidad de crecimiento (dN/dt),sino un valor que reeja la capacidad del microorganismo de incre-mentar su biomasa en un medio determinado.

Si integramos la ecuacin (8) entre N0 y N1, tenemos:

ln (N1/N0) =

t (9)

R nt---=

R3,32 log N1 log N0

t-----------------------------------------------------------=

32

Parte B: COMPOSICIN QUMICA Y CRECIMIENTO DE LA BIOMASA MICROBIANACaptulo 3: CINTICA DEL CRECIMIENTO

Tambin con este planteamiento matemtico puede calcularse eltiempo de generacin, g, a partir de la ecuacin (9). Si g es el tiemponecesario para la duplicacin de la poblacin, tendremos que N1 = 2N0 y t = g. Sustituyendo:

ln 2 =

g, o (10)

Si comparamos las ecuaciones (7) y (10):

g = 1/R g = 0,693/

entonces:

= 0,693 R

Esto signica que R es mayor que

. Este hecho hay que interpretarlopensando que

reeja la tasa de crecimiento instantnea, y que estase toma como si se mantuviese constante desde el momento en queuna clula resultante de una divisin empezase a crecer. En la prc-tica, al nal del ciclo celular, la tasa de sntesis de biomasa es prctica-mente el doble que al principio. Por ello R, que representa elpromedio de lo que ocurre durante el periodo de duplicacin, esmayor que

.Otra pregunta interesante es si

vara con la concentracin del sus-trato de crecimiento ([S]). Si los valores de obtenidos con diferentesconcentraciones de sustrato se representan grcamente, se obtiene:

La curva obtenida es muy parecida a la descrita para la catlisisenzimtica. Monod demostr que la ecuacin de esta curva es:

(11)

donde m es la velocidad especca mxima de crecimiento para valo-res de [S] no muy alejados de aquellos para los que deja de ser limi-tante para el crecimiento. Ks es la constante de saturacin, igual a la

g ln 2---------- 0,693/= =

[S]KS

12

m

m

mS; =

Ks S; =+--------------------r=

33

3.1 CULTIVO DISCONTINUO(BATCH CULTURE)

concentracin de sustrato que reduce la velocidad especca de creci-miento a m.

La ecuacin (11) se parece mucho a la ecuacin de Michaelis-Mentenpara la cintica de los sistemas enzimticos. De este modo tambinpuede aplicarse el mtodo de Lineweaver-Burk para la determinacinms precisa de Ks y m. La ecuacin (11) puede expresarse tambin como:

(12)

Llevando a una grca los valores de 1/ como ordenadas y los de 1/[S] como abscisas, puede calcularse la Ks (g. 3.1).

A la hora de establecer una relacin entre la concentracin de sus-trato y la tasa de crecimiento bacteriana, es muy importante tener encuenta que las bacterias incorporan la mayora de los nutrientes pormecanismos de transporte activo o de translocacin de grupo. Elloimplica que incluso cuando un nutriente est notablemente diluidoen el medio, su concentracin citoplasmtica es mxima. Por ello,bajas concentraciones de sustrato proporcionan ya una m. As, Esche-richia coli ya crece con una tasa mxima de crecimiento en medioscon una concentracin de glucosa de 0,004 mM (0,72 mg l1).

Monod tambin demostr experimentalmente que existe una rela-cin constante entre el crecimiento de un cultivo y la cantidad de sus-trato utilizado:

dN/dt = Y dS/dt (13)

Donde Y es el llamado factor de produccin. Durante la fase exponencial:

Y = peso de biomasa formada/peso de sustrato consumido

Cuando se conocen los valores de m, Ks e Y se tiene una descripcincuantitativa completa del desarrollo de un ciclo del cultivo discontinuo.

Figura 3.1 Determinacin de la Ks para un sustrato determinado.

1

1

1KS

1

[S]

m

12---

1---

Ks S; =+m S; =r--------------------

1S; =

-------

Ksm-------

1m-------+= =

34

Parte B: COMPOSICIN QUMICA Y CRECIMIENTO DE LA BIOMASA MICROBIANACaptulo 3: CINTICA DEL CRECIMIENTO

3.2 CULTIVO CONTINUO

En la prctica, las condiciones de crecimiento no restrictivas indica-das en el apartado anterior solamente perduran durante un tiempolimitado. Tanto el agotamiento de los nutrientes como la produccinde metabolitos inhibidores del crecimiento por parte de la biomasa endesarrollo producen condiciones en las que el crecimiento micro-biano cesa. Una alternativa para mantener la poblacin indenida-mente en crecimiento en condiciones no restrictivas lo constituye elcultivo continuo. El cultivo continuo se inicia del mismo modo queel discontinuo. Si cuando se alcanza la fase logartmica se aademedio fresco a una velocidad adecuada para mantener la densidad depoblacin en un valor constante e inferior al valor mximo de la faseestacionaria, el crecimiento puede continuar indenidamente. Sinembargo, la velocidad de entrada y el volumen de cultivo crecernexponencialmente con la biomasa, a no ser que se vaya eliminandoun volumen de cultivo igual al del medio fresco que va entrando. Elsistema de volumen constante tiene un intercambio energtico jo yla biofase produce un mnimo de entropa.

En un quimiostato los microorganismos crecen a una velocidadespecca constante inferior a m. En el recipiente de cultivo, quetiene un volumen V, entra un ujo constante F de medio de cultivofresco. Este medio tiene todos los nutrientes a una concentracin nolimitante, a excepcin de uno que se halla a una concentracin limi-tante para una velocidad de crecimiento determinada. El volumen Vse mantiene constante porque simultneamente se elimina un ujo Fde medio modicado por la actividad metablica que adems llevaclulas producto del crecimiento. El caudal de entrada F, determina lavelocidad de dilucin:

D = F/V

La velocidad especca de multiplicacin depende de la dilucin,esto es, del nmero de volmenes de cultivo que pasan por el reci-piente de cultivo en la unidad de tiempo. Si la dilucin es constante,la concentracin de sustrato tambin ser constante y habr una velo-cidad especca de crecimiento = D que determina un estado esta-cionario que puede mantenerse indenidamente.

La concentracin efectiva de sustrato puede expresarse por:

[S]x = [S]0 [S]

donde [S]0 es la concentracin de sustrato en el depsito de mediofresco y [S] la concentracin en el recipiente de cultivo. Si [S]x = 0, elsustrato no es utilizado y no hay crecimiento. Para que haya creci-miento, [S]x debe ser mayor que 0. Aumentando [S]0, puede conse-guirse un valor de [S] que d una prxima a m.

La velocidad especca de crecimiento ser prxima a m si pue-den satisfacerse las siguientes condiciones: (a) medio de cultivo per-fectamente agitado, (b) cultivo homogneo, (c) que las propiedadesdel cultivo sean prcticamente constantes a altas concentraciones de

35

3.2 CULTIVO CONTINUO

sustrato (S >> Ks) y (d) que todos los dems componentes del medioestn en exceso. Recordando la ecuacin (8):

dN/dt = N

Si N es ahora compensado por la salida de biomasa del volumende cultivo DN, el cambio neto de concentracin de biomasa con eltiempo ser:

(14)

Si > D, dN/dt ser positivo y la concentracin de microorganismosen el cultivo aumentar con el tiempo. Si < D, dX/dt ser negativo y laconcentracin celular disminuir, esto es, el cultivo se ir lavando fueradel recipiente de cultivo. nicamente cuando = D ser dN/dt = 0 y laconcentracin de microorganismos en el recipiente de cultivo perma-necer constante. Esta es la situacin de estado estacionario, en la que:

(15)

El estado estacionario no es difcil de conseguir, porque, al estarlimitada por el suministro del sustrato, la velocidad especca de cre-cimiento cambiar con la dilucin. Si esta ltima es constante, el sis-tema tiende a equilibrarse.

Cuando la velocidad de dilucin aumenta, D > y, entonces, dX/dtse hace negativo y la biomasa decrece. Esto conduce a una menor uti-liacin sustrato, lo cual, para < m, conduce a un aumento de lavelocidad de crecimiento por incremento de [S]. La velocidad de cre-cimiento no puede sobrepasar m y, por lo tanto, hay una dilucincrtica Dc por encima de la cual el cultivo ser denitivamente lavado.

Puesto que depende de [S], es necesario considerar no slo elefecto de la dilucin sobre la velocidad especca de crecimiento, sinotambin el efecto de la dilucin sobre la concentracin de sustrato [S]y la biomasa (N) en el cultivo.

El sustrato entra en el recipiente de cultivo a la concentracin [S]0, esconsumido por el microorganismo y emerge en el euente a la concentra-cin [S]. De este modo, el cambio neto en la concentracin de sustrato es:

Reordenando la ecuacin y sustituyendo por la ecuacin (11):

(16)

Incremento Crecimiento Prdida=dN/dt N DN=dN/dt N D =

D mS; =

Ks S; =+-------------------- r ln 2g----------= = =

Incremento de sustrato Entrada Salida Consumo=d S; =/dt D S; =0 D S; = Crecimiento/Produccin =

d S; =/dt D S; =0 D S; = N/Y =

d S; =dt

----------- D S; =0 S; = m Nr

Y----------------

S; =Ks S; =+-------------------- =

36

Parte B: COMPOSICIN QUMICA Y CRECIMIENTO DE LA BIOMASA MICROBIANACaptulo 3: CINTICA DEL CRECIMIENTO

De modo semejante, puede ser sustituida en la ecuacin (14), conlo cual tendremos:

(17)

Las ecuaciones, (16) y (17) denen cuantitativamente el comporta-miento del cultivo en el quimiostato y la capacidad autorreguladoradel sistema.

En estado estacionario, las ecuaciones (16) y (17) son 0 y por lo tanto,los valores de N y [S] pueden ser calculados. En la ecuacin (16) tenemos:

y en (17):D = m ([S]/(Ks + [S]))

con lo que, operando:

(18)

y

(19)

Los valores de Ks, m e Y pueden determinarse en un cultivo dis-continuo y aplicarse a las ecuaciones (18) y (19). Entonces puedenvariarse [S]0 y D para obtener un gran nmero de estados estaciona-rios para distintas concentraciones celulares (N). La nica restriccines que [S]0 debe permanecer dentro del margen que permita que elsustrato sea el factor limitante del crecimiento.

El quimiostato controla la velocidad de crecimiento con ayuda dedilucin y una sustancia limitante del crecimiento. Para dilucionesgrandes la estabilidad de la poblacin es difcil. Cuando la velocidadde crecimiento no resulta estrechamente ligada a la densidad depoblacin, el estado estacionario tampoco resulta fcil. Entoncespuede utilizarse otro recurso que permite una regulacin directa de ladensidad de poblacin mediante una clula fotoelctrica que emiteseales al desviarse de una determinada turbidez, las cuales permitenaumentar o disminuir la entrada de medio fresco para volver al valordeseado. Esto constituye el fundamento del cultivo continuo en elturbidostato, que puede utilizarse en conjuncin con el quimiostatoincluso cuando el sustrato no es el factor limitante del crecimiento.

BIBLIOGRAFA

MONOD, J. Recherches sur la croissance des cultures bactriennes. Deuximedition. Hermann. Paris 1958.

TEMPEST, P. W. The continuous cultivation of microorganisms. I. Theory ofthe chemostat. En Methods in Microbiology (J. R. Norris y D. W. Ribbons,eds.), vol. 2, p. 259. Academic Press, New York. 1970.

dNdt-------- N m

S; =Ks S; =+-------------------- D=

D S; =0 S; = m N

Y--------------

S; =Ks S; =+-------------------- =

S; = KsD

m D------------------ =

N Y S; =0 KsD

m D------------------ =

PARTE C

PRODUCTOS FINALES DEL CATABOLISMO

ETANOL

4.1 LAS LEVADURAS 404.2 ALGUNAS REFERENCIAS HISTRICAS SOBRE LA

CONTRIBUCIN DE LAS LEVADURAS A LA BIOQUMICA 42

4.3 EFECTO PASTEUR 434.4 CULTIVO, SISTEMAS CELULARES Y EXTRACTOS 444.5 FERMENTACIONES DE LA GLUCOSA 45

4.5.1 Fermentacin alcohlica 454.5.2 Fermentacin glicrica con sulfito 474.5.3 Fermentacin aceto-glicrica 474.5.4 Fermentacin pirvico-glicrica 48

4.6 ACEITE DE FUSEL Y CIDO SUCCNICO 484.7 DESARROLLO AEROBIO 504.8 ASIMILACIN OXIDATIVA Y FERMENTATIVA DE LA

GLUCOSA 504.9 FERMENTACIN ENDGENA 52

BIBLIOGRAFA 52

4

40

Parte C: PRODUCTOS FINALES DEL CATABOLISMOCaptulo 4: ETANOL

4.1 LAS LEVADURAS

Desde hace tiempo existe un acuerdo general en denominar levadurasa los hongos que presentan predominantemente carcter unicelular. Lareproduccin vegetativa tiene lugar habitualmente por gemacin. Encomparacin con los otros grandes grupos de microorganismos, laslevaduras presentan escasa diversidad (39 gneros, 350 especies). Noconstituyen una unidad taxonmica propiamente dicha. Este grupoest formado por especies relacionadas con distintos grupos de hongoslamentosos. Muchos hongos pueden presentar dos fases: miceliar yunicelular. Las levaduras slo se presentan en forma de clulas aisladaso, como mucho, pseudomicelios. Se reproducen por ascosporas o sloasexualmente por gemacin o divisin binaria. Las caractersticas gene-rales de las levaduras por las que se las diferencia entre s son ms biensiolgi