Profesor PatrocinanteDr. Juan Carlos Slebe Tajmuch
Instituto de BioquımicaFacultad de Ciencias
CITRATO INTERACCIONA CON FRUCTOSA 1,6BISFOSFATASA EN LA INTERFAZ C1-C4 CON EFECTOS
CONTROVERTIDOS SOBRE LA ACTIVIDADCATALITICA.
STEPHAN NICOLAS SCHOTT VERDUGO
Tesis de Grado presentada como par-te de los requisitos para optar al TıtuloProfesional de Bioquımico
VALDIVIA-CHILE2014
Agradecimientos
Siempre es difıcil realizar los agradeciemientos; nunca se agradece a la gente suficiente, que-
dando alguien en la memoria. Desearıa agradecer primeramente al Dr. Juan Carlos Slebe, por per-
mitirme realizar mi proyecto en su laboratorio, apoyarme y siempre tener disponibilidad para la
discusion. Al Dr. Joel Asenjo, por ensenarme, entregarme su amistad y tener tiempo para todas mis
dudas; se que fueron muchas. A la Dra. Heide Ludwig, por siempre recibirme y realizar crıticas
constructivas. A mis companeros de laboratorio, companeros de carrera y a Mauricio Hernandez,
con quienes compartı jornadas de trabajo, discusion, camaraderıa y amistad. A mis amigos Israel
Giacaman y Cristian Parga, con quienes compartimos los buenos y a veces malos momentos a lo
largo de la carrera. Al Dr. Carlos Bustos, por recibirme al comienzo de mi carrera y permitirme tra-
bajar desde temprano en su laboratorio. A los funcionarios, trabajadores y profesores del Instituto
de Bioquımica, quienes en general tienen disposicion a ayudar a quien lo necesita.
Gracias a mis amigos de ”la patota”, algunos con quienes he compartido lo que llevo de vida:
Chancho, Chapa, Chascon, Fena, Fone, Nacho, Pancho, Patroni, Pelao, Schild, Yolo y Wichi. A
Francisca, por compartir conmigo estos anos y con su carino hacer mas feliz y llevadero el trans-
curso del tiempo. Finalmente, pero por nada menos importante, a mi familia: mi padre Eduardo, mi
madre Anny y mi hermano Edu, por apoyarme y nunca cuestionar mi desarrollo como estudiante.
Esta tesis fue realizada en el Instituto de Bioquımica y Microbiologıa con financiamiento otor-
gado por CONICYT en el marco del proyecto FONDECYT 1090740.
A quienes amo y definen lo que soy
Eso es el comienzo del conocimiento:
el descubrimiento de algo que no
comprendemos
Dios Emperador de Dune
FRANK HERBERT
Indice general
1.. Resumen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
2.. Introduccion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
3.. Materiales y metodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
3.1. Materiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
3.1.1. Reactivos e insumos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
3.1.2. Equipos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
3.2. Metodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
3.2.1. Analisis de union in silico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
3.2.2. Extraccion Miniprep de DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
3.2.3. Transformacion de bacterias competentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
3.2.4. Ensayos de digestion de DNA por endonucleasas de restriccion . . . . . . . 17
3.2.5. Mutagenesis sitio-dirigida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
3.2.6. Induccion de expresion proteica y proceso de purificacion de las proteınas
recombinantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
3.2.7. Cuantificacion de proteinas por ensayo Bradford . . . . . . . . . . . . . . . . 20
3.2.8. Medicion de actividad enzimatica fructosa 1,6-bisfosfato 1-fosfohidrolasa . 21
3.2.9. Determinacion de constantes cineticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
3.2.10. Ensayo de inactivacion enzimatica por temperatura . . . . . . . . . . . . . . 23
3.2.11. Ensayos de dialisis al equilibrio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
i
Indice general ii
3.2.12. Generacion de figuras y representaciones graficas de estructuras moleculares 24
4.. Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
4.1. Validacion del correcto funcionamiento del software de docking para el sistema
FBPasa y citrato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
4.2. Analisis in silico de la union de citrato a FBPasa de rinon de cerdo . . . . . . . . . . 32
4.3. Mutagenesis sitio-dirigida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
4.4. Expresion y purificacion de FBPasa recombinante tipo silvestre y mutantes K42A
y E192A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
4.5. Caracterizacion cinetica de las enzimas purificadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
4.5.1. Efectos de comenzar la reaccion con sustrato o con enzima y activacion por
la adicion de EDTA o citrato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
4.5.2. Inactivacion enzimatica por temperatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
4.5.3. Curvas de saturacion por sustrato de la enzimas silvestre y mutantes . . . . . 48
4.5.4. Curvas de activacion por Magnesio (II) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
4.5.5. Curvas de inhibicion por AMP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
4.5.6. Activacion de la actividad enzimatica de FBPasa por adicion de citrato. . . . 54
4.5.7. Ensayos de dialisis al equilibrio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
5.. Discusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
6.. Bibliografıa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
Indice de figuras
1. Tetramero de FBPasa tipo 1 de Sus scrofa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
2. Sitio de union de citrato en FBPasa de E. coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
3. Estimacion del tiempo necesario para alcanzar el equilibrio en ensayos de dialisis
al equilibrio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
4. Docking de citrato en cristal de FBPasa de E. coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
5. Sitio de union de citrato en FBPasa de rinon de cerdo determinado por docking . . . 35
6. Representacion ”LigPlot+” de las interacciones de citrato con FBPasa de rinon de
cerdo segun lo determinado por ensayo de docking . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
7. Alineamiento de secuencias obtenidas por mutagenesis sitio-dirigida . . . . . . . . . 41
8. Cromatogramas del proceso de purificacion de la enzima FBPasa K42A . . . . . . . 43
9. Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones denaturantes de las frac-
ciones del proceso de purificacion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
10. Efectos de comenzar la reaccion con enzima o con sustrato y activacion al agregar
EDTA o citrato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
11. Inactivacion enzimatica por incubacion a distintas temperaturas . . . . . . . . . . . . 49
12. Curvas de actividad enzimatica de las enzimas tipo silvestre y mutantes a distintas
concentraciones de sustrato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
13. Curvas de activacion por Magnesio (II) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
14. Curvas de inhibicion por AMP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
iii
Indice de figuras iv
15. Curvas de activacion de FBPasa tipo silvestre y mutantes K42A y E192A por citrato 56
16. Curva de activacion de la enzima tipo silvestre por EDTA . . . . . . . . . . . . . . . 57
17. Ensayos de union por dialisis al equilibrio de citrato para FBPasa tipo silvestre y
mutantes K42A y E192A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
18. Ensayos de dialisis al equilibrio de mutante E192A a distintas concentraciones de
citrato total . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
19. Superficie molecular y cavidad de la interfaz C1-C4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
20. Superficie molecular y cavidad de la interfaz C1-C4 mostrando ubicacion de citrato
determinado por cristalografıa y por docking . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
21. Efecto de la concentracion de citrato sobre la intensidad de fluorescencia de la
mutante de rinon de cerdo F16W . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
22. Activacion e inhibicion de enzimas por zinc (II) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
Indice de tablas
I. Partidores utilizados para realizar mutagenesis sitio-dirigida . . . . . . . . . . . . . . 14
II. Registro entregado por Vina al realizar calculo de docking en FBPasa de E. coli
PDB=2OWZ con citrato como ligando . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
III. Desviaciones cuadraticas medias de las distintas poses de citrato obtenidas por Vina
respecto a la ubicacion obtenida por cristalografıa en PDB=2OWZ . . . . . . . . . . 29
IV. Registro entregado por Vina al realizar calculo en FBPasa de rinon de cerdo tipo
silvestre PDB=1EYI con citrato como ligando . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
V. Tabla de purificacion de enzima tipo silvestre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
VI. Parametros cineticos para la enzima silvestre y mutantes . . . . . . . . . . . . . . . . 55
VII. Parametros cineticos reportados para las enzimas tipo silvestre y mutantes K42A y
E192A por Lu et al., 1996 y 1997 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
v
Lista de abreviaturas
CM FF Carboximetil sefarosa Fast Flow
EDTA acido etilendiaminotetraacetico
Fru-1,6-P2 D-fructosa 1,6-bisfosfato
Fru-2,6-P2 D-fructosa 2,6-bisfosfato
FBPasa fructosa 1,6-bisfosfatasa
FBPasa tipo 1 FBPasa hepatica
G6PD glucosa 6-fosfato deshidrogenasa
IPTG isopropil-β-D-1-tiogalactopiranosido
LB Lysogeny broth o medio de lisogenia
mRNA acido ribonucleico mensajero
PDB Protein Data Bank
PFK 6-fosfofructoquinasa
PGI glucosa 6-fosfato isomerasa
PMSF fluoruro de fenilmetilsulfonilo
RMSD ”Root Mean Square Deviation o raız de la desviacion cuadratica media
SOC Super Optimal Broth with Catabolite Repression o medio super optimo
con represion catabolica
Tris tris(hidroximetil)aminometano
U Unidad de actividad enzimatica
wt wild-type o tipo silvestre
vi
1 Resumen
Fructosa 1,6-bisfosfatasa (FBPasa) es una enzima esencial en la vıa gluconeogenica, siendo
una de las principales responsables de los distintos mecanismos de regulacion que presenta esta
vıa. Desde mediados de los 60’ y principalmente en los 70’ se planteo que en general los quelantes
(entre los que se encontrarıa citrato) son capaces de activar a FBPasa por un mecanismo en el cual
se disminuye la concentracion efectiva de Zn2� en el medio, un potente inhibidor de la enzima.
Estos estudios fueron por lo general realizados con EDTA, debido a la utilizacion de este quelan-
te en las preparaciones de enzima purificada, y no se ahondo en los estudios con otros quelantes.
Recientemente se demostro que FBPasa de E. coli es activada por aniones como citrato y fos-
foenolpiruvato, planteando que esta capacidad se perdio evolutivamente en mamıferos al cambiar
interacciones aminoacıdicas de la interfaz C1-C4, generando una conformacion constitutivamente
activa. En la presente tesis se evaluo computacionalmente la interaccion de citrato con la enzima de
rinon de cerdo, y se generaron mutantes de residuos presentes en la interfaz C1-C4. Se encontraron
diferencias al comenzar las mediciones de actividad enzimatica con enzima o con sustrato, con o
sin citrato o EDTA. A traves de ensayos de union por dialisis al equilibrio se evaluo la interaccion
de citrato con la enzima y las mutantes generadas. Se discute el posible rol de Zn2� en la activacion
de la enzima por adicion de quelantes, ademas del posible rol fisiologico en la regulacion de la
enzima.
1
Summary
Fructose 1,6-biphosphatase (FBPase) is an essential enzyme in the gluconeogenic pathway,
being one of the main responsible for the regulation present in it. Since mid-60’ and mostly in
the 70’ has been raised that, in general, chelating agents (being citrate one of them) are capable
of activating FBPase by a mechanism in which the effective concentration of Zn2�, a potent in-
hibitor of the enzyme, is diminished. This studies were generally performed using EDTA, since
this chelating agent is commonly used in the purification of the enzyme, leaving other chelating
agents aside. It has been shown recently that E. coli’s FBPase is activated by anions like citrate and
phosphoenolpyruvate, proposing that this capability was lost in mammals due to changes in the
C1-C4 interface aminoacidic composition. In this Thesis the interaction of citrate with pig kidney
FBPase was evaluated computationally, and protein mutants of C1-C4 aminoacids were generated.
Differences in starting the enzymatic assays with substrate or enzyme, with or without citrate or
EDTA, were found. The interaction of citrate with the wild-type and mutant enzymes was asses-
sed by using equilibrium dialysis. The possible role of Zn2� in the observed activation and in the
physiological regulation is discussed.
2
2 Introduccion
Generalidades de la enzima fructosa 1,6-bisfosfatasa
Fructosa-1,6-bisfosfatasa (D-fructosa-1,6-bisfosfato 1-fosfohidrolasa, EC 3.1.3.11; FBPasa) es
una enzima regulatoria esencial en la vıa gluconeogenica, cuya funcion es catalizar la hidrolisis de
fructosa-1,6-bisfosfato en fructosa 6-fosfato y fosfato inorganico. La enzima, que fue descrita en
1942 por Gomori [16], es una enzima altamente distribuida entre distintos organismos y en practi-
camente todos los tejidos [59], y se caracteriza por tener una estructura funcional homotetramerica,
dando lugar a distintas estructuras cuaternarias segun el grado de activacion [23]. La subunidad de
la enzima de rinon de cerdo consta de 337 aminoacidos y tiene una masa aproximada de 37000
Da, presentando una forma tridimensional hexaedrica. En general es una enzima muy conservada
evolutivamente; la enzima de rinon de cerdo tiene una identidad del 90 % respecto a su homologa
en humanos. Aunque con la enzima de Escherichia coli solo presenta un 40 % de identidad y 60 %
de similaridad, la estructura terciaria es altamente homologa (RMSD aproximado de 1,64A entre
estructura de Sus scrofa en conformacion R [1EYI] y su simil de Escherichia coli [2OWZ]).
Dependencia de la actividad catalıtica de cationes divalentes
La actividad catalıtica de la enzima es completamente dependiente de la interaccion de la en-
zima con cationes divalentes, como Mg2�, Zn2�, Mn2� o Co2�, cuyas afinidades siguen la serie de
Irving-Williams [47]. La enzima tiene 3 sitios de union para metales proximos al sitio de union de
sustrato, rodeando el grupo fosfato 1 de este. Los metales estabilizarıan la interaccion del sustrato,
estableciendo un puente entre este y los residuos Asp68, Asp118, Asp121, Glu97 y Glu280. El
3
2. Introduccion 4
residuo 68 de la enzima ademas se encuentra en un lazo denominado lazo 52-72, y serian en parte
los metales divalentes los encargados de estabilizar la interaccion de este lazo con el sitio activo
(denominada conformacion ”enganchada”), permitiendo por tanto la estabilizacion del sustrato y
la actividad catalıtica [7]. De los metales mencionados se cree que principalmente magnesio seria
el involucrado de forma fisiologica, al describirse concentraciones libres alrededor de 1 mM [47].
Adicionalmente al Zn2� se le describe un rol doble, donde en bajas concentraciones (@1 µM) en
presencia de otro cation divalente serıa un potente inhibidor de la enzima al generarse complejos
metal-enzima mixtos, mientras que a concentraciones mas elevadas (A10 µM, en conjunto con 0.1
mM Mg2�) actuaria como el cation catalıtico [3, 4, 41, 47, 48] . La enzima presenta sitios de alta
afinidad por Zn2�, con constantes de disociacion @10 nM y de 30 nM para las enzima de higado de
rata y de conejo ,respectivamente, siendo teoricamente estos los sitios responsables de la presencia
de especies mixtas y por tanto de la inhibicion de la enzima en presencia de otros cationes diva-
lentes [38, 41]. La interaccion de Zn2� no puede ser revertida por concentraciones de Mg2� usadas
comunmente en ensayos cineticos, requiriendose 100 mM de este ultimo para revertir la union de
Zn2� a la enzima [41]. Adicionalmente la enzima une sustrato en ausencia de quelantes, pero es
incapaz de unir sustrato en presencia de 50 mM EDTA [13]. Esto da cabida a que aun en ausencia
de metal agregado la enzima se encuentra con metales unidos en los sitios de alta afinidad, siendo
estos los que permitirıan la union de sustrato; esto sugerirıa que estos sitios de union no solo son
importantes para la catalisis, si no tambien para estabilizar la estructura de la enzima. Es interesante
mencionar que se ha establecido el vinculo entre la inhibicion de enzimas del metabolismo de la
fructosa en cultivos de hepatocitos de rata al ser incubados a distintas concentraciones de Zn2� [11].
2. Introduccion 5
Regulacion de la actividad enzimatica de FBPasa
La enzima cataliza la reaccion contraria a aquella realizada por fosfofructoquinasa (PFK), dan-
do por tanto paso a un ciclo inutil que consume ATP. Esto ultimo se evita por medio de una regula-
cion fina y complementaria de ambas enzimas. El ejemplo mas claro de este sistema es el basado
en adenosın monofosfato (AMP), el cual se mantiene practicamente constante a nivel celular, y
fructosa 2,6-bisfosfato, cuya sıntesis esta regulada de forma hormonal [19]. Ambos compuestos
son capaces tanto de activar a PFK como de inhibir a FBPasa, actuando de forma sinergica para
lograr esta inhibicion. La capacidad inhibitoria de AMP esta dada por la union a un sitio alosterico
ubicado a 28A del sitio activo de la misma subunidad, inhibiendo de forma no competitiva respecto
al sustrato, pero competitiva respecto a cationes divalentes, al adicionalmente provocar el movi-
miento del lazo 52-72 y ”desengancharlo”, impidiendo la estabilizacion de la union de los metales
en el sitio catalıtico [19]. Por el contrario, Fru-2,6-P2 ejerce su accion inhibidora uniendose en el
sitio activo, impidiendo por tanto la catalisis de la reaccion del sustrato [19].
Cada subunidad del homotetramero es denominada desde C1 a C4 segun las manecillas del reloj,
formando un dimero superior C1-C2 y uno inferior C3-C4 (Figura 1). La enzima tiene la particu-
laridad de, al unir AMP, ademas de ”desenganchar” el lazo 52-72, sufrir una rotacion de aproxi-
madamente 15° del homodımero C1-C2 respecto al homodımero C3-C4, desplazando el equilibrio
de un estado R activo a uno T inactivo, siendo por tanto esta modificacion estructural la responsa-
ble de los efectos cineticos (Figura 1) [23]. Es interesante que hasta el momento no se ha descrito
fehacientemente un activador para FBPasa.
El acido cıtrico y su relacion con fructosa 1,6-bisfosfatasa
Adicionalmente al efecto de AMP y Fru-2,6-P2 sobre PFK, se ha demostrado que esta enzima
es inhibida por citrato [37, 39]. El acido citrico es un acido tricarboxılico, cuyos pKa son 2,9, 4,3
2. Introduccion 6
Figura 1: Tetramero de FBPasa tipo 1 de Sus scrofa. Se muestra en gris sustrato unido a su sitio de union,y en verde AMP unido a su correspondiente sitio. Por convencion se denomina a cada monomerodesde C1 hasta C4 siguiendo el orden de las manecillas del reloj. Por cristalografıa se ha observadoque la union de AMP provoca un giro de 15º del dımero superior respecto al inferior, siendo estemovimiento el responsable de la inhibicion de la enzima.(PDB=1EYI)
2. Introduccion 7
y 5,6; esto implica que de forma fisiologica se encuentra principalmente como anion citrato. Una
de las funciones mas conocidas de este compuesto esta relacionada con la generacion de energıa
en el ciclo de Krebs (razon por la cual es tambien llamado ciclo del acido cıtrico o de los acidos
tricarboxılicos); adicionalmente el citrato participa en la sıntesis de acidos grasos, tanto por la
activacion de la ruta de sıntesis, como por actuar como intermediario en el transporte de acetil-CoA
desde la mitocondria al citoplasma [35]. Las concentraciones de citrato en cultivos de hepatocitos
de rata son aproximadamente 10 veces mayores en el interior de la mitocondria respecto al citosol;
la concentracion citosolica varia entre aproximadamente 0,2 y 1,2 mM segun el medio de cultivo
utilizado [45]. Esto ultimo se acompana de reportes de oscilaciones en celulas β-pancreaticas de las
concentraciones de citrato, lo que permitirıa actuar como ”marcapasos” de la glicolisis, que de por
si tiene caracterısticas oscilatorias, al inhibir a PFK [30, 50]. Respecto a citrato, en la decada de los
70 hubieron variadas publicaciones que trataban de dar cuenta de su posible efecto sobre FBPasa,
en conjunto con el fenomeno observado al utilizar otros quelantes como EDTA e histidina, entre
otros.
En 1965, Underwood y Newsholme informaban que para FBPasa de hıgado de rata, una serie de
intermediarios metabolicos, entre los que se encontraba citrato, no ejercıan accion sobre la enzima
[52]. Fu y Kemp, en cambio, muestran en 1973 que la isoforma muscular de conejo es activada por
citrato, ademas de EDTA, creatina y fosfato inorganico [15]. Tanto Rosenberg et al. como Van Tol et
al. postularon en 1972 y 1973 respectivamente que la enzima es activada alostericamente por EDTA
[43, 53]. Nimmo y Tipton mostraron en 1975 que EDTA no interacciona con la enzima utilizando el
metodo de filtracion en gel de Hummel y Dreyer, ademas de demostrar que los efectos activadores
observados al utilizar EDTA pueden ser replicados al incubar una solucion de la enzima con una
resina quelante como lo es Chelex-100 [36]. En 1976 Tejwani et al. informaron que en la enzima
de hıgado de rata los efectos activadores de EDTA y los quelantes en general son probablemente
2. Introduccion 8
causados por eliminacion de trazas de metales inhibidores como Zn2�, habiendose adicionalmente
demostrado por el mismo grupo que EDTA e histidina no interaccionan directamente con la enzima,
utilizando tambien el metodo de filtracion en gel de Hummel-Dreyer [48, 49]. En 1978 Benkovic et
al. demostraron por espectroscopıa de absorcion atomica que efectivamente la enzima se inhibe con
concentraciones micromolares de Zn2�, apoyando la idea de eliminacion de metales pesados por
EDTA [3]. A pesar de esto, no se menciona directamente lo que ocurrirıa con citrato y si su forma
de activar serıa solamente a traves de este mecanismo. En 1990, Adams et al. muestran que para
la enzima muscular humana se observa una mayor activacion por una mezcla de citrato y histidina,
respecto a EDTA solo, lo que se contrapone con la mejor capacidad quelante de este ultimo y por
tanto con la teorıa de la inhibicion por metales pesados de la enzima [1].
En 2007 Hines et al. publicaron como citrato es capaz de activar la enzima de E. coli, postu-
lando un sitio de activacion por aniones, el cual adicionalmente interactua con metabolitos como
fosfoenolpiruvato, malato, fosfoglicerato, entre otros [21]. La activacion de la enzima llega a ser
de un 80 % utilizando concentraciones milimolares tanto de fosfoenolpiruvato, como de citrato,
ademas de antagonizar el efecto inhibitorio de AMP. El sitio descrito por cristalografıa se ubica
en la interfaz entre los dımeros C1-C2 y C3-C4 (Figura 2) planteandose por alineamientos que este
sitio es comun en procariontes, pero no ası en eucariontes. Se sugirio que la enzima eucariotica se
encuentra constitutivamente activa debido a que en teorıa la interaccion entre Glu192 y Lys42 su-
plirıa la interaccion generada en la enzima procarionte con aniones en la interfaz C1-C4 (comparar
izquierda y derecha en Figura 2B) [20].
Herramientas bioinformaticas para evaluar union molecular
En la actualidad existen formas de evaluar la posible union de un ligando a una proteına a traves
de ensayos de dinamica molecular, o de docking (acoplamiento molecular). El primero implica una
2. Introduccion 9
A
B
Figura 2: Sitio de union de citrato en FBPasa de E. coli. A Ubicacion de citrato, ademas de fructosa 2,6-bisfosfato, en el cristal de la enzima de E. coli (PDB: 2QVR). B Residuos aminoacıdicos presentesen el sitio de union de aniones con sulfato unido en la enzima de E. coli (derecha) y el sitioequivalente en la enzima de rinon de cerdo (izquierda). En lıneas punteadas se representan lospuentes de hidrogeno generados entre aminoacidos, sulfato o agua segun corresponda. El esquemadel tetramero indica desde donde se observa la interfaz. Imagenes obtenidas de Hines et al [20, 21].
2. Introduccion 10
alta capacidad de calculo computacional, tiempo de calculo, ademas de conocimiento en los soft-
ware desarrollados para este fin. El docking, por otra parte, es una herramienta que por lo general
es considerablemente mas rapida y sencilla que los calculos basados en dinamica molecular, lo que
ha permitido que sea una de las herramientas mas utilizadas en el ambito del descubrimiento de
interacciones farmacologicas. El objetivo del docking es predecir la estructura del complejo for-
mado por un ligando y su receptor, estimando la fuerza de los enlaces no covalentes formados por
este complejo a traves de calculos computacionales. Este proceso generalmente se puede subdividir
en dos pasos, los cuales implican establecer la interaccion estructural del ligando con el receptor
(generalmente denominado pose), para posteriormente establecer la intensidad de esta interaccion
a traves de una funcion de ”puntuacion” o scoring function. Esta funcion permite generar un ran-
king de las distintas poses, y por tanto predecir la forma de union mas probable. El metodo tiene
desventajas, como generalmente mantener la estructura del receptor rıgida y mantener los estados
de protonacion y distribucion de cargas constante durante el calculo.
En 2009 Trott y Olson publicaron un nuevo software capaz de realizar docking en tiempos muy
reducidos, con resultados reproducibles y con buena capacidad de prediccion [6, 12, 51, 54]. El
software se basa en un sistema de busqueda local iterativa (ILS), realizando una optimizacion local
basada en el metodo cuasi-Newtoniano Broyden-Fletcher-Goldfarb-Shanno (BFGS). De forma bre-
ve, el software, comenzando con una conformacion aleatoria del ligando, genera una perturbacion
estocastica seguida de la optimizacion local.
Problematica e hipotesis de trabajo
En conjunto los datos bibliograficos indican que citrato tiene un efecto activador sobre la enzi-
ma, aunque no queda claro si este efecto es consecuencia de un proceso de activacion directo por
interaccion con la proteına, o indirecto por quelacion de metales inhibidores como Zn2�. Adicional-
2. Introduccion 11
mente resultados preliminares cristalograficos y de variaciones en patrones fluorescentes de nuestro
laboratorio permiten plantear la idea que citrato se une a FBPasa en la interfaz C1-C4, tal como en
E. coli. En base a estos datos preliminares, a la falta de claridad respecto al efecto de citrato en la
literatura y al efecto observado sobre la enzima de E. coli, se postulo la siguiente hipotesis:
” Citrato interacciona con FBPasa de rinon de cerdo en la interfaz C1-C4, con potenciales
efectos en su actividad catalıtica.”
Teniendo en cuenta lo anterior, se planteo como objetivo general establecer si existe interaccion
entre citrato y la enzima de rinon de cerdo. Para esto se planteo como objetivos especıficos:
Establecer por medio de analisis de acoplamiento molecular o docking si esta interaccion es
teoricamente factible, utilizando para esto Autodock Vina en conjunto con otras herramientas
bioinformaticas.
Generar mutantes para los aminoacidos de la interfaz C1-C4, que son potencialmente re-
levantes para la putativa interaccion de la proteına con el ligando, utilizando para esto un
plasmido pET-22 con la secuencia codificante para FBPasa de rinon de cerdo wt generado en
el laboratorio.
Expresar las proteınas mutantes recombinantes en un sistema de expresion basado en E. coli
BL21(DE3).
Realizar ensayos de union del ligando marcado radiactivamente con las proteınas a traves de
dialisis al equilibrio.
3 Materiales y metodos
3.1. Materiales
3.1.1. Reactivos e insumos
Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranosido (IPTG) de alta pureza y libre de dioxanos, sal disodica
dihidrato de acido etilendiaminotetraacetico (EDTA), sulfato de magnesio (MgSO4) heptahi-
drato, tris(hidroximetil)aminometano (Tris), citrato de sodio dihidrato, sulfato de amonio,
cloruro de sodio, acido clorhıdrico 37 %, N, N, N’, N’-trimetiletilendiamina (TEMED), acri-
lamida, bis-acrilamida, Triton X-100, etanol absoluto y metanol fueron obtenidos de Merck
Millipore/Calbiochem.
Isopropanol, glicerol y agarosa fueron obtenidos de Winkler Ltda.
Acido acetico, etanol y metanol grado tecnico fueron obtenidos de TCL.
Pre-mezcla de medio de cultivo LB pH 7 en polvo fue obtenido de MO BIO.
La resina Carboximetil Sefarosa Fast flow y la columna pre-empacada de 5 ml HiTrap Desal-
ting Column fueron obtenidas de GE Healthcare.
El kit de extraccion y purificacion de DNA E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II se obtuvo de
Omega Bio-Tek.
Las filtros para centrifuga Amicon Ultra-4 con un corte de peso molecular de 10 kDa fueron
obtenidos de Merck Millipore.
12
3. Materiales y metodos 13
El reactivo de Bradford Bio-Rad Protein Assay fue obtenido de Bio-Rad.
El kit de mutagenesis sitio-dirigida Quikchange II se obtuvo de Agilent Technologies
Acido cıtrico-[1,15-14C] fue obtenido de Perkin Elmer, Inc.
Las camaras de dialisis al equilibrio Micro-Equilibrium DIALYZER fueron obtenidas de Har-
vard Apparatus
Las membranas de dialisis de celulosa regenerada Spectra/Por-1 fueron obtenidas de Spec-
trum Labs
Las enzimas fosfoglucosa isomerasa y glucosa 6-P deshidrogenasa, adenosina monofosfa-
to, D-fructosa 1,6-bisfosfato sal trisodica octahidrato, β-nicotinamida adenina dinucleotido
hidrato, asi como la resina Cibacron Blue 3GA Agarosa, inmobilizada en agarosa 6 % entre-
cruzada fast-flow fueron obtenidas de Sigma-Alrdich, Inc.
Los partidores utilizados para realizar mutagenesis sitio-dirigida fueron sintetizados por In-
tegrated DNA Technologies (Tabla I)
3.1.2. Equipos
Espectrofotometros Agilent 8453 UV-visible Spectroscopy System, Thermo Scientific Evo-
lution 60 y Nanodrop 2000
Sistema de cromatografıa liquida AKTA Prime Plus FPLC
Balanza analıtica Shimadzu AUW220D y balanza Sartorius TE4101.
Centrifugas HITACHI CR-22GII, Sigma 1-14 y 2-16K.
Contador de Centelleo Perkin Elmer Tri-Carb 2910.
Sistema cromatografico GE Healthcare AKTAprime plus.
3. Materiales y metodos 14
Tabla I: Partidores utilizados para realizar mutagenesis sitio-dirigida
K42A 5’-TGTGCACCGCGGTCGCAGCCATCTCCACCG-3’
K42A antisense 5’-CGGTGGAGATGGCTGCGACCGCGGTGCACA-3’
E192A 5’-CCCGGCCATCGGAGCGTTCATTTTGGTGG-3’
E192A antisense 5’-CCACCAAAATGAACGCTCCGATGGCCGGG-3’
3. Materiales y metodos 15
Termociclador Eppendorf MasterCycler personal.
Agitador termorregulado Aosheng Thermo-Shaker MS-100
Incubador con Agitador Termoregulado IKA KS 4000 ic control.
pH-Metro WTW inoLab pH 720.
Multilector de microplacas BioTek Synergy 2.
Sistemas de documentacion Syngene InGenious y Ultra-Lum Omega.
Sistema de electroforesis 1-D Protean-Mini Bio-Rad.
3.2. Metodos
3.2.1. Analisis de union in silico
Para realizar los analisis de union se utilizo el programa Autodock Vina (en adelante Vina),
desarrollado por Trott y Olson (2009) en The Scripps Research Institute. Para realizar los calculos
se utilizo la estructura previamente cristalizada de la enzima en su conformacion activa (R), obte-
nida de la base de datos Protein Data Bank (codigo PDB=1EYI). En el cristal escogido la enzima
fue cocristalizada con fructosa 6-fosfato, fosfato inorganico y magnesio, condiciones similares a
las presentes en los medios utilizados en ensayos de actividad. Se reconstituyo la estructura ho-
motetramerica de la enzima utilizando el software Chimera en su version 1.7, desarrollado por la
Universidad de California, San Francisco (UCSF). Se utilizo una caja de busqueda de aproxima-
damente 167 nanometros cubicos (56Ax 48Ax 62A), con un parametro exhaustiveness de 500 y
con un numero de posiciones de 20. El resto de los parametros se dejaron por defecto. El tamano
de la caja es lo suficientemente amplia como para abarcar una subunidad completa, ademas de las
interfaces C1-C4 como C1-C2. Considerando la naturaleza simetrica de la proteına, este analisis
3. Materiales y metodos 16
abarca todos los posibles sitios de union a la enzima. Para generar los archivos PDBQT requeri-
dos por Vina, se utilizo el programa Autodock Tools 1.5.6, tambien desarrollado en The Scripps
Research Institute. La preparacion de la proteına y del ligando fue segun lo recomendado por los
autores. Abreviadamente, a la proteına se le extrajo el agua y los ligandos co-cristalizados, se le
adicionaron hidrogenos, y aquellos no polares fueron tratados de forma implıcita.
3.2.2. Extraccion Miniprep de DNA
Para realizar la extraccion y purificacion de DNA se utilizo E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II
de Omega, segun lo indicado en el manual del fabricante. La pureza y cantidad del DNA obtenido
fue cuantificado utilizando el espectrofotometro NanoDrop 2000 de Thermo Scientific.
3.2.3. Transformacion de bacterias competentes
Se retiraron 100 µL de celulas competentes (E. coli BL21 o JM109) de refrigeracion a -80ºC
y se dejaron reposar en hielo por 5 minutos. Transcurrido el tiempo se le agrego de 1 a 2 µL
(aproximadamente entre 100 ng y 1 µg) de una solucion de DNA de interes, y se agito suavemente,
con cuidado de no aumentar la temperatura de la suspension bacteriana. Se dejo incubar la mezcla
en hielo por 20 minutos. Finalizado el tiempo, la mezcla fue calentada en agitacion a 42ºC por 1
minuto 45 segundos en un agitador termorregulado y se retiro rapidamente, dejando nuevamente
en hielo. Se agrego 1 ml de una solucion esteril de LB y la mezcla se dejo incubar por 1 hora a
37ºC en agitacion. 200 µL de esta solucion fueron sembrados en una placa de LB-Agar 100 µg/ml
Ampicilina, dejando la placa sembrada a 37ºC overnight (12-16 horas).
3. Materiales y metodos 17
3.2.4. Ensayos de digestion de DNA por endonucleasas de restriccion
Para realizar los ensayos de digestion se siguieron las instrucciones indicadas por el fabricante,
agregando cantidades suficientes para preparar 10 µL de reaccion, con al menos 800 ng del plasmi-
do a digerir y 10 U de enzima de restriccion, dejando digerir por 1 hora a 37°C. Los resultados
fueron evaluados por electroforesis en geles de agarosa al 1 % con 0.2 µg/ml de bromuro de etidio,
visualizando los fragmentos resultantes en un transiluminador UV.
3.2.5. Mutagenesis sitio-dirigida
Para realizar la mutagenesis sitio-dirigida se utilizo el kit Quikchange II de Agilent Technolo-
gies, segun lo establecido por el fabricante, realizando pequenas modificaciones. Abreviadamente,
se generaron 50 µL de reaccion con 25 ng de plasmido pET-22b FBPasa RC-wt, 125 ng de cada par-
tidor, 2.5 U de DNA-polimerasa PfuUltra HF y 1 µL de mix dNTP y 5 µL de tampon 10X incluidos
en el kit. A las reacciones se les aplico 30 segundos a 95°C, 16 ciclos de 30 segundos a 95°, un mi-
nuto a 55°C y 7 minutos a 68°C, agregando 7 minutos extra a 68°C en el ultimo ciclo para finalizar
la reaccion completamente. A cada reaccion se le agregan 10 U de DpnI, extendiendo la digestion
por una hora a 37°C. Los partidores fueron disenados utilizando la aplicacion web Quikchange Pri-
mer Design de Agilent Technologies (http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp),
y utilizando la secuencia del mRNA para FBPasa de rinon de cerdo (NCBI Reference Sequence:
NM 213979.1).
Se transformaron bacterias E. coli JM109 segun el protocolo indicado anteriormente, utilizan-
do medio SOC para crecer las bacterias antes de sembrar en LB-Agar 100 µg/ml Ampicilina. Se
seleccionan colonias individuales para la posterior purificacion del plasmido segun lo indicado an-
teriormente. Se seleccionaron aquellos plasmidios que tuvieran dos sitios de restriccion para la
3. Materiales y metodos 18
enzima XhoI, y las mutaciones fueron corroboradas por secuenciamiento, realizado por Macrogen
Inc., utilizando como partidores secuencias universales T7, tanto del promotor como de la secuen-
cia de termino. Los cromatogramas de secuenciamiento fueron evaluados utilizando el software
DNADynamo.
3.2.6. Induccion de expresion proteica y proceso de purificacion de las
proteınas recombinantes
Se seleccionaron 3 colonias de E. coli BL21(DE3) de una placa LB-Agar de bacterias previa-
mente transformadas con el plasmido de interes, y se dejo crecer en overnight (12-16 horas) a 37ºC
en 50 ml de medio LB Tris-HCl 100 mM pH 7.5, 100 µg/ml Ampicilina y 1 % Glucosa. Las bac-
terias fueron recolectadas por centrifugacion a 5000xg por 10 minutos y fueron resuspendidas en
50 ml del mismo medio LB fresco. Se usaron 7 ml del resuspendido bacteriano para inocular cada
uno de 6 matraces con 500 ml de medio LB Tris-HCl 20 mM pH 7,5 ampicilina 100 ug/ml Glucosa
1 % cada uno. Se incubaron los 6 matraces en agitacion (agitacion orbital a 220 rpm) a 25ºC hasta
que se alcanzo una D.O. a 600 nm entre 0.6 y 0.8 (aproximadamente 5 horas). Se le agrego a cada
matraz cantidad suficiente de una solucion stock de IPTG 1M para alcanzar una concentracion de
0,4 mM, y se dejo inducir la expresion bajo agitacion a 16ºC overnight (12-16 horas).
Las bacterias inducidas fueron recolectadas por centrifugacion a 5000xg por 10 minutos, y fue-
ron posteriormente resuspendidas y lisadas en 300 mL de tampon lisis (Tris-HCl 20 mM pH 8,
EDTA 0,1 mM, Triton X-100 1 % y PMSF 1mM; este ultimo es agregado inmediatamente antes
de realizar la lisis a partir de un stock 200 mM en metanol). La solucion se dejo agitando a 4ºC
por al menos 4 horas. Posteriormente se dividio en 2 fracciones de 150 mL, y cada una fue soni-
cada utilizando un sonicador Qsonica Q500 y el tip Nº4220 (12,7 mm de diametro, amplitud de
120 µm, punta reemplazable), aplicando ciclos de 3 segundos “ON” y 5 segundos “OFF” durante
3. Materiales y metodos 19
16 minutos (120 ciclos) y un 40 % de amplitud. Una vez sonicada la solucion, se separo el debris
celular por centrifugacion a 15000xg durante 30 minutos. Realizada la centrifugacion se obtuvo
un sobrenadante transparante con aspecto amarillento denominado extracto proteico crudo. A este
extracto se le agrego sulfato de amonio a un 50 % de saturacion a 4ºC y se dejo equilibrar al me-
nos durante una hora. Las proteınas precipitadas son separadas y descartadas por centrifugacion
a 18000xg durante 15 minutos. Al sobrenadante recuperado se le agrego sulfato de amonio hasta
alcanzar una saturacion del 80 % a 4ºC. El precipitado proteico fue recuperado por centrifugacion
a 18000xg por 15 minutos, descartando el sobrenadante. El precipitado fue resuspendido en 20 ml
de tampon fosfato 20 mM (19,25 mM KH2PO4, 0,75 mM Na2HPO4) pH 5,8, EDTA 0,1 mM. La
muestra se dejo dializar durante al menos 3 dıas contra el mismo tampon fosfato a 4°C, cambiando
esta solucion al menos 3 veces. Es importante considerar que el tampon fue preparado a tempera-
tura ambiente, por lo que el pH bajo las condiciones utilizadas es menor. Realizada la dialisis, se
incubo la muestra a 20ºC por 2 horas antes de ser extraıda de la bolsa de dialisis, para que ası el
pH de la muestra fuera 5,8. Se centrifugo a 20000xg por 30 minutos para remover la presencia de
proteınas precipitadas.
La muestra ya dializada fue aplicada en una columna de intercambio cationico carboximetil-
sefarosa Fast Flow (CM FF, 10 cm x 1,6 cm ø). La cromatografıa fue eluıda a 2 ml/min, usando
como fase movil tampon fosfato 20 mM pH 5,8 como tampon de corrida y este mismo tampon con
500 mM NaCl como tampon de elucion. La columna fue lavada utilizando 6 volumenes de columna
de tampon de corrida, aplicando posteriormente una elucion isocratica con 6 volumenes de columna
de 25 % tampon de elucion, para despues generar un gradiente de 6 volumenes de columna desde
un 40 % hasta 100 % de tampon de elucion, terminando con una elucion final de 6 volumenes de
columna de tampon de elucion.
Las fracciones que presentan actividad FBPasa fueron recolectadas y aplicadas en conjunto en
3. Materiales y metodos 20
una columna de afinidad Cibacron Blue 3GA Agarosa Fast flow 6 % entrecruzada (22 cm x 1 cm ø).
La cromatografıa fue eluıda, al igual que en el caso de la resina CM FF, a 2 mL/min, usando como
fase movil tampon fosfato 20 mM pH 5,8 como tampon de corrida, mientras que el tampon de
elucion es el tampon de corrida con NaCl 2 M. Primeramente se eluyeron 6 volumenes de columna
de tampon de corrida, para posteriormente aplicar tampon de elucion al 20 % por 6 volumenes de
columna y terminar aplicando 6 volumenes de columna de tampon de elucion. Se fracciona cada
10 ml, y cada 4 ml al cambiar el tampon para eluır a la proteına. Las fracciones con actividad son
recolectadas, obteniendo ası la proteına purificada. La preparacion enzimatica fue almacenada a
4°C en el tampon de elucion, el cual, dado el procedimiento utilizado, presenta concentraciones
cercanas a NaCl 2 M.
El proceso de purificacion fue evaluado en geles de poliacrilamida en condiciones denaturan-
tes, segun lo descrito por Laemmli, utilizando un gel apilador al 5 % y uno separador al 12 % de
acrilamida [26].
3.2.7. Cuantificacion de proteinas por ensayo Bradford
Para la cuantificacion de proteınas se utilizo un sistema de cuantificacion en placas de 96 po-
cillos, similar a lo indicado por el proveedor del reactivo. En breve, se diluyeron muestras en 160
µl, agregando posteriormente 40 µl de reactivo de Bradford, homogeneizando la mezcla y dejando
incubar por al menos 2 minutos. En caso de generarse burbujas, se agregaron 5 µl de etanol en la
superficie de la mezcla. Para generar una curva estandar se utilizaron entre 0,5 y 5 µg totales de
albumina de suero bovino en los 200 µl de mezcla. Las absorbancias fueron evaluadas en un lector
de microplacas BioTek Synergy 2.
3. Materiales y metodos 21
3.2.8. Medicion de actividad enzimatica fructosa 1,6-bisfosfato
1-fosfohidrolasa
La medicion de actividad enzimatica FBPasa fue realizada con un ensayo de enzimas acopladas,
el cual consta de fosfoglucosa isomerasa (PGI, Saccharomyces cerevisiae) y glucosa 6-fosfato
deshidrogenasa (G6PD, Leuconostoc mesenteroides) como enzimas auxiliares. Esta ultima reduce
un mol de NAD por cada mol de Fru-1,6-P2 hidrolizado por FBPasa, permitiendo medir la actividad
FBPasa segun la variacion de absorbancia a 340 nm. Esto se esquematiza a continuacion:
D-fructosa 1,6-bisfosfatoFBPasaÐÐÐÐ� D-fructosa 6-fosfato � fosfato inorganico
D-fructosa 6-fosfatoPGIÐÐ� D-glucosa 6-fosfato
D-glucosa 6-fosfato � NADG6PDÐÐÐ� D-6-fosfogluconolactona � NADH
La Unidad de actividad enzimatica se definio como la cantidad de enzima que genera un micromol
de producto por minuto. El mezcla de reaccion base consto de Tris/HCl 20mM pH 7,5, 5 mM
MgSO4, 0.1 mM EDTA, 30 µM Fru-1,6-P2 y 1,2 U de cada enzima auxiliar. La concentracion
de EDTA, sustrato y magnesio variaron en distintos ensayos, segun se especifica mas adelante. El
mezcla, tanto si la reaccion fue comenzada con enzima o con sustrato, se dejo incubar a lo menos
5 minutos a 30ºC previo a iniciar la reaccion. Para realizar los ensayos, el EDTA fue removido de
la enzima purificada por exclusion molecular, utilizando una columna Hi-Trap Desalting Column
como indica el fabricante, o por al menos 4 filtraciones en unidades de filtracion centrifuga Amicon
Ultra-4 realizadas en serie, tambien como indica el proveedor.
Para realizar las caracterizaciones cineticas con proteınas purificadas se agregaron 0,4 µg de
proteına en 500 µl de mezcla de reaccion, cuantificando la concentracion de proteına espectro-
3. Materiales y metodos 22
fotometricamente segun su absorbancia a 280 nm, utilizando el coeficiente de extincion 0,755
ml/(mg�cm), segun Marcus y Hubert [31].
3.2.9. Determinacion de constantes cineticas
Los ensayos de activacion por magnesio fueron ajustados a la ecuacion de Hill:
v �Vmax � �Mg2��nKna � �Mg2��n
,donde Vmax corresponde a la velocidad maxima alcanzada al agregar magnesio, Ka corresponde a
la concentracion de Mg2� necesaria para obtener la mitad de la Vmax y n corresponde al coeficiente
de cooperatividad de Hill.
Las curvas de sustrato fueron ajustadas a una ecuacion que da cuenta de la inhibicion por exceso
de sustrato de forma parcialmente no competitiva descrita por Webb [5, 55]:
v �Vmax � �S� � �1 �
�S�Kss
�Km � �S� � �S�2
Kss
,donde Vmax corresponde a la velocidad maxima, Km corresponde a la concentracion de sustrato
necesaria para obtener la mitad de la Vmax, Kss corresponde a la constante de disociacion del
sustrato del complejo EYS2 y β equivale al factor de inhibicion sobre la kcat.
Las curvas de inhibicion por AMP fueron ajustadas a una ecuacion de Hill modificada por
Taketa y Pogell [46]:
v �Vmax �Kn
i
Kni � �AMP �n
, donde Vmax corresponde a la velocidad maxima (sin AMP), Ki corresponde a la concentracion
3. Materiales y metodos 23
de AMP necesaria para inhibir la enzima en un 50 % y n es el coeficiente de Hill. Se dio el caso de
inhibiciones bifasicas, para lo que se utilizo una suma de esta ecuacion:
v �Vmax1 �Kn
i1
Kni1 � �AMP �n �
Vmax2 �Kni2
Kni2 � �AMP �n
, donde el subındice 1 y 2 se aplica a cada fase.
Las regresiones no lineales y las respresentaciones graficas fueron realizadas utilizando el soft-
ware GraphPad Prism 6.
3.2.10. Ensayo de inactivacion enzimatica por temperatura
Para evaluar la estabilidad de las enzimas se realizo un ensayo de inactivacion por temperatura.
Para esto se incubaron alicuotas de proteina a distintas temperaturas por 10 minutos en un ter-
mociclador, para posteriormente evaluar la actividad enzimatica como se describe anteriormente,
comenzando la reaccion con sustrato.
3.2.11. Ensayos de dialisis al equilibrio
Los ensayos de dialisis al equilibrio fueron realizados en camaras Micro-Equilibrium DIALY-
ZER de 250 µl, utilizando membranas de dialisis Spectrapor-1 (corte de peso molecular entre 6 y 8
kDa) cortadas de un tamano acorde a la camara. Las membranas fueron tratadas con EDTA, segun
lo recomendado por el fabricante, y se dejaron equilibrar con tampon Tris-HCl 20 mM pH 7,5 NaCl
100 mM. En cada ensayo se agrego 1 µM de citrato-[1,15-14C] 116,4 mCi/mmol considerando el
volumen total en ambas camaras, utilizando como solucion tampon Tris-HCl 20 mM pH 7,5 NaCl
100 mM, empleando 200 µl de solucion en ambas camaras. Se determino la tasa de dialisis y el
tiempo requerido por el citrato para alcanzar el equilibrio realizando un ensayo control con cantidad
3. Materiales y metodos 24
suficiente para 1 mM de citrato total considerando el volumen total en ambas camaras y midiendo
a 0, 1, 3, 5, 7 y 9 horas (Figura 3). Los ensayos de dialisis propiamente tal fueron dejado bajo agita-
cion a 150 rpm a 25ºC durante 14 horas. Se agregaron 200 µl de una solucion de proteına 1 mg/ml
en una de las camaras, previo cambio de tampon a Tris-HCl 20 mM pH 7.5 NaCl 100 mM. En la
otra camara se agrego 200 µl de la solucion tampon con 100 mM NaCl con citrato radiactivo y,
cuando corresponda, citrato no radiactivo y/o otro ligando de interes. Las mediciones de radiactivi-
dad presente tanto en la porcion retenida como la filtrada de la camara de dialisis fueron realizadas
por triplicado utilizando un contador de centelleo Perkin Elmer Tri-Carb 2910TR, utilizando 1 ml
de liquido de centelleo y 50 µl de la camara; en todos los casos ambas camaras fueron evaluadas.
3.2.12. Generacion de figuras y representaciones graficas de estructuras
moleculares
Las representaciones de proteinas tridimensionales fueron generadas utilizando el software
UCSF Chimera 1.7 [40]. Para generar representaciones bidimensionales de interacciones intermo-
leculares se utilizo el paquete LigPlot+ [27]. El alineamiento de secuencias fue generado utilizando
el software AlignX, correspondiente al paquete Vector NTI Advance 11.
3. Materiales y metodos 25
Horas
CPM/50ml
0 2 4 6 8 10
0
10000
20000
30000
Figura 3: Estimacion del tiempo necesario para alcanzar el equilibrio en ensayos de dialisis al equili-brio. Las cuentas por minuto fueron evaluadas tal como se describe en el texto. Se muestran lasmediciones de radiactividad en la camara que fue cargada con cıtrato-[1,15-14C] (azul), como deaquella que solamente tiene el dializado (rojo).
4 Resultados
4.1. Validacion del correcto funcionamiento del software de
docking para el sistema FBPasa y citrato
Antes de comenzar a trabajar directamente en la enzima de rinon de cerdo fue importante com-
probar que el software utilizado para hacer los analisis in silico es capaz de realizar el analisis en
una proteına como FBPasa y de replicar la union del ligando en este sistema. Para esto se utilizo el
software computacional Autodock Vina, tal como se describe en Materiales y Metodos. El ensayo
de union se realizo en una reconstruccion del tetramero de FBPasa de E. coli cristalizado por Hi-
nes et al. junto a citrato (PDB=2OWZ) [21]. El registro del calculo, tal como es entregado por el
software, se puede observar en la Tabla II. El software ordena las poses segun la afinidad estimada
por el algoritmo, calculando la raız de las desviaciones cuadraticas medias (RMSD) a partir de la
primera pose entregada. Todas a excepcion de la tercera pose, que resulto en el sitio activo, fueron
ubicadas en la interfaz C1-C4, lo que explica el alto valor de RMSD reportado para la tercera pose.
En la Tabla III se observan los valores de RMSD (RMSD) de las poses obtenidas por Vina
respecto a la posicion establecida cristalograficamente. En la Figura 4 se observa la pose de mayor
afinidad entregada por Vina (pose 1, Tabla II), ademas de la pose con menor RMSD respecto al
cristal 2OWZ (pose 6, Tablas II y III). Se observa que el software predice como sitio de union la
interfaz descrita por Hines, donde la pose 6 tiene un RMSD considerablemente menor a 2 A[21].
El orden de las poses entregado no concuerda con aquella con menor RMSD respecto al resultado
empırico, pero este hecho es frecuente en este tipo de software y analisis, donde el proceso de
26
4. Resultados 27
Tabla II: Registro entregado por Vina al realizar calculo de docking en FBPasa de E. coli PDB=2OWZcon citrato como ligando
Nº Pose Afinidad (kcal/mol) RMSD L.B.1 (A) RMSD U.B.2 (A)
1 -6,2 0,000 0,000
2 -6,2 5,243 7,076
3 -6,1 30,023 32,095
4 -6,1 1,390 4,429
5 -6,1 5,463 6,479
6 -6,0 5,550 7,263
7 -6,0 1,443 2,095
8 -6,0 5,061 6,239
9 -6,0 5,217 6,761
10 -6,0 1,414 2,210
Continua en la pagina siguiente
1 RMSD L.B.: Root Mean Square Deviation Lower Bound; parametro de medicion de diferen-cias en alineamiento estructural respecto a la primera pose entregada, considerando factores desimetrıa.2 RMSD U.B.: Root Mean Square Deviation Upper Bound; parametro de medicion de diferen-cias en alineamiento estructural respecto a la primera pose entregada, sin considerar factores desimetrıa.
4. Resultados 28
Nº Pose Afinidad (kcal/mol) RMSD L.B.1 (A) RMSD U.B.2 (A)
11 -6,0 1,483 2,908
12 -6,0 1,601 3,774
13 -5,9 5,481 6,551
14 -5,9 5,272 7,122
15 -5,9 5,534 6,475
16 -5,8 5,251 6,643
17 -5,8 2,088 3,539
18 -5,8 5,319 6,602
19 -5,8 5,293 6,869
20 -5,8 5,460 6,580
1 RMSD L.B.: Root Mean Square Deviation Lower Bound; parametro de medicion de diferen-cias en alineamiento estructural respecto a la primera pose entregada, considerando factores desimetrıa.2 RMSD U.B.: Root Mean Square Deviation Upper Bound; parametro de medicion de diferen-cias en alineamiento estructural respecto a la primera pose entregada, sin considerar factores desimetrıa.
4. Resultados 29
Tabla III: Desviaciones cuadraticas medias de las distintas poses de citrato obtenidas por Vina respectoa la ubicacion obtenida por cristalografıa en PDB=2OWZ
Nº Pose RMSD1 (A)
1 2,1
2 2,2
3 Q52
4 3,1
5 2,9
6 0,7
7 0,8
8 3,6
9 2,0
10 3,3
Continua en la pagina siguiente
1 Corresponde a:
RMSD �
¾d21 � d
22 � d
23 � ...d
2n
n
donde d es la distancia medida entre los atomos equivalentes n de la estructura del cristal yaquella obtenida por docking.2 Corresponde a la pose ubicada en el sitio activo.
4. Resultados 30
Nº Pose RMSD1 (A)
11 1,7
12 1,6
13 1,3
14 3,5
15 1,6
16 3,5
17 2,9
18 2,9
19 2,9
20 2,0
1 Corresponde a:
RMSD �
¾d21 � d
22 � d
23 � ...d
2n
n
donde d es la distancia medida entre los atomos equivalentes n de la estructura del cristal yaquella obtenida por docking.2 Corresponde a la pose ubicada en el sitio activo.
4. Resultados 31
Figura 4: Docking de citrato en cristal de FBPasa de E. coli. Se muestra el sitio de union para citratoen la interfaz C1-C4. En el sitio se representa una superposicion de tres estructuras: en naranja laubicacion de citrato obtenida por cristalografıa, en celeste se muestra la pose con mayor afinidad(pose 1, Tabla II) y en verde aquella con RMSD mas bajo (pose 6, Tablas II y III), estas dos ultimasobtenidas por docking, como se describe en el texto y en las tablas II y III (PDB=2OWZ).
4. Resultados 32
ranking suele presentar falencias [12]. A pesar de esto, la Tabla III muestra que ningun valor, con
excepcion de la pose 3, tiene un RMSD excesivamente alto comparado con el resultado empırico,
dado que todas las poses se ubican aproximadamente en la misma posicion de la interfaz C1-C4
(Figura no mostrada).
4.2. Analisis in silico de la union de citrato a FBPasa de rinon
de cerdo
El ensayo se realizo en una reconstruccion del tetramero de la enzima en su conformacion activa
(codigo PDB=1EYI), a la cual se le eliminaron todos los ligandos unidos, tal como se describe en
materiales y metodos. De las veinte poses obtenidas, tal como se obtuvo en el caso de E. coli,
una pose se encontro en el sitio activo (pose 1, Tabla IV), mientras que las otras diecinueve se
ubicaron en la interfaz C1-C4. En la Tabla IV se muestra el registro generado por Vina para el
analisis, incluyendo constantes de afinidad estimadas por el software. Que la primera pose se
encontrara en el sitio activo explica que todos los valores de RMSD estimados por el programa
fueran cercanos a 30 A, tal como la tercera pose del calculo realizado con la enzima de E. coli.
Considerando que en condiciones catalıticas el sitio activo se encontrara ocupado por el sustrato,
y que este presenta una alta afinidad por este sitio, es razonable considerar que el putativo sitio de
union para citrato se encuentra en la interfaz C1-C4. En la Figura 5 se muestra la pose de mayor
afinidad obtenida en la interfaz C1-C4 por el proceso de docking en el cristal PDB=1EYI (pose 2,
Tabla IV). Adicionalmente se destacan todos los residuos aminoacıdicos que se encuentran a una
distancia menor a 5A de la pose obtenida. En la Figura 6 se muestra un diagrama bidimensional
generado con LigPlot+ de las posibles interacciones no covalentes entre la enzima y el ligando de
la estructura mostrada en la Figura 5.
4. Resultados 33
Tabla IV: Registro entregado por Vina al realizar calculo en FBPasa wt de rinon de cerdo PDB=1EYIcon citrato como ligando
N° Pose Afinidad (kcal/mol) RMSD L.B1 (A) RMSD U.B.2 (A)
1 -6,3 0,000 0,000
2 -6,2 33,238 34,563
3 -6,2 30,354 31,818
4 -6,1 29,336 31,361
5 -6,1 29,158 31,078
6 -6,1 30,958 33,464
7 -6,1 32,094 33,962
8 -6,1 29,316 30,867
9 -6,1 29,422 31,160
10 -6,0 30,609 31,947
Continua en la pagina siguiente
1 RMSD L.B.: Root Mean Square Deviation Lower Bound; parametro de medicion de diferen-cias en alineamiento estructural considerando factores de simetrıa.2 RMSD U.B.: Root Mean Square Deviation Upper Bound; parametro de medicion de diferen-cias en alineamiento estructural, sin considerar factores de simetrıa.
4. Resultados 34
N° Pose Afinidad (kcal/mol) RMSD L.B1 (A) RMSD U.B.2 (A)
11 -6,0 31,151 33,449
12 -6,0 34,439 36,600
13 -6,0 31,930 33,093
14 -5,9 29,825 32,278
15 -5,9 31,447 33,623
16 -5,9 29,916 32,195
17 -5,8 31,301 33,682
18 -5,8 30,361 32,345
19 -5,8 31,919 33,206
20 -5,8 31,976 33,880
1 RMSD L.B.: Root Mean Square Deviation Lower Bound; parametro de medicion de diferen-cias en alineamiento estructural considerando factores de simetrıa.2 RMSD U.B.: Root Mean Square Deviation Upper Bound; parametro de medicion de diferen-cias en alineamiento estructural, sin considerar factores de simetrıa.
4. Resultados 35
Figura 5: Sitio de union de citrato en FBPasa de rinon de cerdo determinado por docking.Se muestrael sitio de union de citrato segun lo determinado por docking. Corresponde a la segunda poseobtenida, dado que la primera se ubica en el sitio activo como se discute en el texto (Tabla IV). Semuestra el citrato (naranja) y todos los aminoacidos que presentan atomos a una distancia igual omenor a 5 A alrededor del sitio de union determinado (celeste).
4. Resultados 36
3.01
3.12
2.93
2.84
3.08
3.11
CB
CA
CACOA1
OA2
CBC
OB1
OB2
CG
CGC
OG1
OG2
OHB
N
CA
CO
CB
OG1
CG2
Thr14(D)
N
CA
C
O
CB
CG
CD
OE1
OE2
Glu192(D)
N
CA
C
O
CB
CGCD1
CD2CE1
CE2CZ
Phe193(D)
N
CA
C
O
CB
CG
CD
CE
NZ
Lys42(D)
Leu13(D)
Asn35(D)
N
CAC
O
CBOG1
CG2
Thr39(D)
Cys38(D)
Thr12(D)
Gly191(D)
Figura 6: Representacion ”LigPlot+” de las interacciones de citrato con FBPasa de rinon de cerdosegun lo determinado por ensayo de docking. Se muestran las putativas interacciones no co-valentes generadas entre la pose de citrato y la enzima a partir del calculo de docking. El ligandoubicado en posicion central se representa con enlaces purpura. En lineas discontinuas verdes serepresentan los puentes de hidrogeno y las distancias a las que se encuentran los atomos involu-crados; rodeados por una corona roja se encuentran aquellos atomos involucrados en interaccioneshidrofobicas o no-enlazantes. Cada aminoacido muestra a un costado el nombre de la cadena co-rrespondiente del tetramero, mostrando que en este caso el citrato interacciona preferentementecon una subunidad de la interfaz.
4. Resultados 37
4.3. Mutagenesis sitio-dirigida
Para la realizacion de la mutagenesis se utilizaron partidores apuntados a modificar aminoacidos
putativamente relevantes para la interaccion de citrato considerando el bolsillo identificado en el
analisis in-silico. Basados en la suposicion hecha por Hines et al. y en la composicion de la cavidad
se consideraron de interes los residuos K42 y E192 (Figura 6). Las mutaciones fueron realizadas
al aminoacido alanina, considerando que de existir union en el sitio, esta modificacion apuntarıa
a interrumpir interacciones electroestaticas con el ligando. Por secuenciacion se determino que
ambas mutaciones fueron realizadas correctamente, ademas que la secuencia tipo silvestre usada en
el laboratorio presenta una mutacion silente en el residuo T63 respecto a la secuencia NM 213979.1
publicada en GenBank (posicion 192, Figura 7). Los cromatogramas de secuenciamiento realizados
con el partidor T7 de termino resultaron en cromatogramas mezclados (o mixed chromatogram,
como es descrito por Kommedal et al. [24]); debido probablemente a la amplificacion inespecifica
generada por el partidor al presentar un alineamiento parcial del partidor entre la posicion 487 y
506 del marco de lectura abierto (datos no mostrados). Esto ultimo no impidio pero si dificulto el
analisis de las secuencia anti-sense a partir de los cromatogramas resultantes.
4.4. Expresion y purificacion de FBPasa recombinante tipo
silvestre y mutantes K42A y E192A
Todas las enzimas utilizadas fueron purificadas por un proceso de precipitacion con sulfato de
amonio y por cromatografıas de intercambio cationico Carboximetil sefarosa y una de afinidad a
Cibacron Blue, tal como se describe en Materiales y Metodos. Aunque todas las enzimas fueron
expresadas bajo las mismas condiciones se observo que la mutante E192A se expreso en cantidades
4. Resultados 38
Section 11 4410 20 30(1) ATGACGGACCAGGCGGCCTTCGACACCAATATCGTCACCCTAACORF mRNA FBPasa (NM_213979) (1) ATGACGGACCAGGCGGCCTTCGACACCAATATCGTCACCCTAACFBPasa wt (1) ATGACGGACCAGGCGGCCTTCGACACCAATATCGTCACCCTAACFBPasa K42A (1) ATGACGGACCAGGCGGCCTTCGACACCAATATCGTCACCCTAACFBPasa E192A (1)
Section 245 8850 60 70(45) CCGCTTCGTCATGGAGGAGGGCAGGAAGGCCCGCGGCACCGGCGORF mRNA FBPasa (NM_213979) (45) CCGCTTCGTCATGGAGGAGGGCAGGAAGGCCCGCGGCACCGGCGFBPasa wt (45) CCGCTTCGTCATGGAGGAGGGCAGGAAGGCCCGCGGCACCGGCGFBPasa K42A (45) CCGCTTCGTCATGGAGGAGGGCAGGAAGGCCCGCGGCACCGGCGFBPasa E192A (45)
Section 389 132100 110 120(89) AGATGACCCAGCTGCTCAACTCGCTGTGCACCGCGGTCAAAGCCORF mRNA FBPasa (NM_213979) (89) AGATGACCCAGCTGCTCAACTCGCTGTGCACCGCGGTCAAAGCCFBPasa wt (89) AGATGACCCAGCTGCTCAACTCGCTGTGCACCGCGGTCGCAGCCFBPasa K42A (89) AGATGACCCAGCTGCTCAACTCGCTGTGCACCGCGGTCAAAGCCFBPasa E192A (89)
Section 4133 176140 150 160(133) ATCTCCACCGCAGTCCGCAAGGCGGGCATCGCGCACCTCTATGGORF mRNA FBPasa (NM_213979) (133) ATCTCCACCGCAGTCCGCAAGGCGGGCATCGCGCACCTCTATGGFBPasa wt (133) ATCTCCACCGCAGTCCGCAAGGCGGGCATCGCGCACCTCTATGGFBPasa K42A (133) ATCTCCACCGCAGTCCGCAAGGCGGGCATCGCGCACCTCTATGGFBPasa E192A (133)
Section 5177 220190 200 210(177) AATTGCTGGCTCCACGAACGTGACAGGTGATCAAGTGAAGAAGTORF mRNA FBPasa (NM_213979) (177) AATTGCTGGCTCCACAAACGTGACAGGTGATCAAGTGAAGAAGTFBPasa wt (177) AATTGCTGGCTCCACAAACGTGACAGGTGATCAAGTGAAGAAGTFBPasa K42A (177) AATTGCTGGCTCCACAAACGTGACAGGTGATCAAGTGAAGAAGTFBPasa E192A (177)
Section 6221 264230 240 250(221) TGGATGTCCTCTCCAATGACCTGGTTATTAACGTGTTAAAGTCAORF mRNA FBPasa (NM_213979) (221) TGGATGTCCTCTCCAATGACCTGGTTATTAACGTGTTAAAGTCAFBPasa wt (221) TGGATGTCCTCTCCAATGACCTGGTTATTAACGTGTTAAAGTCAFBPasa K42A (221) TGGATGTCCTCTCCAATGACCTGGTTATTAACGTGTTAAAGTCAFBPasa E192A (221)
Figura 7: Descripcion en pagina 41.
4. Resultados 39
Section 7265 308270 280 290(265) TCTTTTGCCACCTGCGTTCTCGTGTCAGAAGAAGATAAAAACGCORF mRNA FBPasa (NM_213979) (265) TCTTTTGCCACCTGCGTTCTCGTGTCAGAAGAAGATAAAAACGCFBPasa wt (265) TCTTTTGCCACCTGCGTTCTCGTGTCAGAAGAAGATAAAAACGCFBPasa K42A (265) TCTTTTGCCACCTGCGTTCTCGTGTCAGAAGAAGATAAAAACGCFBPasa E192A (265)
Section 8309 352320 330 340(309) CATAATAGTAGAACCTGAGAAAAGGGGTAAATACGTGGTCTGTTORF mRNA FBPasa (NM_213979) (309) CATAATAGTAGAACCTGAGAAAAGGGGTAAATACGTGGTCTGTTFBPasa wt (309) CATAATAGTAGAACCTGAGAAAAGGGGTAAATACGTGGTCTGTTFBPasa K42A (309) CATAATAGTAGAACCTGAGAAAAGGGGTAAATACGTGGTCTGTTFBPasa E192A (309)
Section 9353 396360 370 380(353) TTGATCCCCTCGATGGATCGTCGAACATCGACTGCCTTGTGTCCORF mRNA FBPasa (NM_213979) (353) TTGATCCCCTCGATGGATCGTCGAACATCGACTGCCTTGTGTCCFBPasa wt (353) TTGATCCCCTCGATGGATCGTCGAACATCGACTGCCTTGTGTCCFBPasa K42A (353) TTGATCCCCTCGATGGATCGTCGAACATCGACTGCCTTGTGTCCFBPasa E192A (353)
Section 10397 440410 420 430(397) ATTGGAACCATCTTTGGCATCTACAGAAAGAATTCAACTGATGAORF mRNA FBPasa (NM_213979) (397) ATTGGAACCATCTTTGGCATCTACAGAAAGAATTCAACTGATGAFBPasa wt (397) ATTGGAACCATCTTTGGCATCTACAGAAAGAATTCAACTGATGAFBPasa K42A (397) ATTGGAACCATCTTTGGCATCTACAGAAAGAATTCAACTGATGAFBPasa E192A (397)
Section 11441 484450 460 470(441) ACCTTCTGAGAAGGACGCACTGCAGCCAGGCCGGAACCTGGTGGORF mRNA FBPasa (NM_213979) (441) ACCTTCTGAGAAGGACGCACTGCAGCCAGGCCGGAACCTGGTGGFBPasa wt (441) ACCTTCTGAGAAGGACGCACTGCAGCCAGGCCGGAACCTGGTGGFBPasa K42A (441) ACCTTCTGAGAAGGACGCACTGCAGCCAGGCCGGAACCTGGTGGFBPasa E192A (441)
Section 12485 528490 500 510(485) CAGCTGGCTATGCGCTCTATGGCAGTGCCACCATGTTGGTCCTGORF mRNA FBPasa (NM_213979) (485) CAGCTGGCTATGCGCTCTATGGCAGTGCCACCATGTTGGTCCTGFBPasa wt (485) CAGCTGGCTATGCGCTCTATGGCAGTGCCACCATGTTGGTCCTGFBPasa K42A (485) CAGCTGGCTATGCGCTCTATGGCAGTGCCACCATGTTGGTCCTGFBPasa E192A (485)
Figura 7: Descripcion en pagina 41.
4. Resultados 40
Section 13529 572540 550 560(529) GCCATGGTGAATGGAGTCAATTGCTTCATGCTGGACCCGGCCATORF mRNA FBPasa (NM_213979) (529) GCCATGGTGAATGGAGTCAATTGCTTCATGCTGGACCCGGCCATFBPasa wt (529) GCCATGGTGAATGGAGTCAATTGCTTCATGCTGGACCCGGCCATFBPasa K42A (529) GCCATGGTGAATGGAGTCAATTGCTTCATGCTGGACCCGGCCATFBPasa E192A (529)
Section 14573 616580 590 600(573) CGGAGAGTTCATTTTGGTGGACAGGGATGTGAAGATCAAAAAAAORF mRNA FBPasa (NM_213979) (573) CGGAGAGTTCATTTTGGTGGACAGGGATGTGAAGATCAAAAAAAFBPasa wt (573) CGGAGAGTTCATTTTGGTGGACAGGGATGTGAAGATCAAAAAAAFBPasa K42A (573) CGGAGCGTTCATTTTGGTGGACAGGGATGTGAAGATCAAAAAAAFBPasa E192A (573)
Section 15617 660630 640 650(617) AGGGGAGCATTTACAGCATCAATGAAGGCTATGCCAAGGAGTTCORF mRNA FBPasa (NM_213979) (617) AGGGGAGCATTTACAGCATCAATGAAGGCTATGCCAAGGAGTTCFBPasa wt (617) AGGGGAGCATTTACAGCATCAATGAAGGCTATGCCAAGGAGTTCFBPasa K42A (617) AGGGGAGCATTTACAGCATCAATGAAGGCTATGCCAAGGAGTTCFBPasa E192A (617)
Section 16661 704670 680 690(661) GACCCTGCCATCACTGAGTATATCCAGAGGAAGAAGTTTCCCCCORF mRNA FBPasa (NM_213979) (661) GACCCTGCCATCACTGAGTATATCCAGAGGAAGAAGTTTCCCCCFBPasa wt (661) GACCCTGCCATCACTGAGTATATCCAGAGGAAGAAGTTTCCCCCFBPasa K42A (661) GACCCTGCCATCACTGAGTATATCCAGAGGAAGAAGTTTCCCCCFBPasa E192A (661)
Section 17705 748710 720 730(705) AGACAACTCAGCCCCCTACGGGGCCAGGTACGTGGGCTCCATGGORF mRNA FBPasa (NM_213979) (705) AGACAACTCAGCCCCCTACGGGGCCAGGTACGTGGGCTCCATGGFBPasa wt (705) AGACAACTCAGCCCCCTACGGGGCCAGGTACGTGGGCTCCATGGFBPasa K42A (705) AGACAACTCAGCCCCCTACGGGGCCAGGTACGTGGGCTCCATGGFBPasa E192A (705)
Section 18749 792760 770 780(749) TGGCCGATGTCCACCGCACGCTGGTCTATGGAGGGATCTTTATGORF mRNA FBPasa (NM_213979) (749) TGGCCGATGTCCACCGCACGCTGGTCTATGGAGGGATCTTTATGFBPasa wt (749) TGGCCGATGTCCACCGCACGCTGGTCTATGGAGGGATCTTTATGFBPasa K42A (749) TGGCCGATGTCCACCGCACGCTGGTCTATGGAGGGATCTTTATGFBPasa E192A (749)
Figura 7: Descripcion en pagina 41.
4. Resultados 41
Section 19793 836800 810 820(793) TACCCAGCAAACAAGAAAAGCCCCAAAGGAAAGTTAAGACTGCTORF mRNA FBPasa (NM_213979) (793) TACCCAGCAAACAAGAAAAGCCCCAAAGGAAAGTTAAGACTGCTFBPasa wt (793) TACCCAGCAAACAAGAAAAGCCCCAAAGGAAAGTTAAGACTGCTFBPasa K42A (793) TACCCAGCAAACAAGAAAAGCCCCAAAGGAAAGTTAAGACTGCTFBPasa E192A (793)
Section 20837 880850 860 870(837) ATACGAATGTAACCCGATGGCCTATGTCATGGAGAAGGCAGGAGORF mRNA FBPasa (NM_213979) (837) ATACGAATGTAACCCGATGGCCTATGTCATGGAGAAGGCAGGAGFBPasa wt (837) ATACGAATGTAACCCGATGGCCTATGTCATGGAGAAGGCAGGAGFBPasa K42A (837) ATACGAATGTAACCCGATGGCCTATGTCATGGAGAAGGCAGGAGFBPasa E192A (837)
Section 21881 924890 900 910(881) GACTGGCCACCACTGGGAAGGAAGCTGTGCTGGACATCGTTCCCORF mRNA FBPasa (NM_213979) (881) GACTGGCCACCACTGGGAAGGAAGCTGTGCTGGACATCGTTCCCFBPasa wt (881) GACTGGCCACCACTGGGAAGGAAGCTGTGCTGGACATCGTTCCCFBPasa K42A (881) GACTGGCCACCACTGGGAAGGAAGCTGTGCTGGACATCGTTCCCFBPasa E192A (881)
Section 22925 968930 940 950(925) ACTGACATCCACCAGAGGGCGCCAATCATCTTGGGGTCTCCTGAORF mRNA FBPasa (NM_213979) (925) ACTGACATCCACCAGAGGGCGCCAATCATCTTGGGGTCTCCTGAFBPasa wt (925) ACTGACATCCACCAGAGGGCGCCAATCATCTTGGGGTCTCCTGAFBPasa K42A (925) ACTGACATCCACCAGAGGGCGCCAATCATCTTGGGGTCTCCTGAFBPasa E192A (925)
Section 23969 1012980 990 1000(969) AGACGTGACTGAGCTCTTGGAAATATATCAGAAGCACGCAGCCAORF mRNA FBPasa (NM_213979) (969) AGACGTGACTGAGCTCTTGGAAATATATCAGAAGCACGCAGCCAFBPasa wt (969) AGACGTGACTGAGCTCTTGGAAATATATCAGAAGCACGCAGCCAFBPasa K42A (969) AGACGTGACTGAGCTCTTGGAAATATATCAGAAGCACGCAGCCAFBPasa E192A (969)
Section 2410131017(1013) AGTGAORF mRNA FBPasa (NM_213979) (1013) AGTGAFBPasa wt (1013) AGTGAFBPasa K42A (1013) AGTGAFBPasa E192A (1013)
Figura 7: Alineamiento de secuencias obtenidas por mutagenesis sitio-dirigida. La figura muestra el ali-neamiento de la secuencia del mRNA para FBPasa de Sus scrofa obtenida desde el GenBank(NM 213979), ademas de las secuencias de consenso obtenidas por secuenciamiento a partir delos plasmidios para la enzima tipo silvestre, K42A y E192A. En amarillo se destaca la identidadentre todas las secuencias, en azul se indica la identidad parcial entre un grupo de secuencias,mientras que en blanco las secuencias diferentes.
4. Resultados 42
considerablemente menores (datos no mostrados). Grosso modo se obtuvieron en el sobrenadante
de lisis y sonicacion 1000 unidades para la enzima tipo silvestre, 700 unidades para la mutante
K42A y solo 200 unidades para la enzima E192A, por 3 litros de cultivo.
La Figura 8 muestra los cromatogramas de la purificacion de la mutante K42A representativos
para todas las purificaciones. Una gran cantidad de proteinas y contaminantes no son retenidos en
las columnas utilizadas, principalmente en la columna CM FF, lo que se aprecia como un incremen-
to de la absorbancia a 280 nm en los primeros minutos de la cromatografıa (Figura 8A). Ademas
el lavado con 25 % de tampon de elucion remueve proteinas que interaccionan debilmente bajo las
condiciones utilizadas. La cromatografıa de afinidad utilizando Cibacron Blue 3GA no muestra una
cantidad importante de proteınas contaminantes en el lavado de la columna, pero se observo una
disminucion de proteinas contaminantes por SDS-PAGE (observado al cargar 10 µg de proteina en
geles SDS-PAGE al 12 %, no mostrado), ademas de un incremento en la actividad especıfica (ver
mas abajo). Se puede apreciar en ambos cromatogramas como la elucion de la actividad enzimatica
fructosa 1,6-bisfosfato 1-fosfohidrolasa, y por lo tanto de la enzima, se corresponde con el incre-
mento en la absorbancia del eluıdo. En ambas cromatografıas solo las fracciones que presentaron
actividad enzimatica fueron recolectadas para su uso.
En la Figura 9A se observa un gel de poliacrilamida en condiciones denaturantes SDS-PAGE
del proceso de purificacion de la enzima tipo silvestre representativo para todas las enzimas. Se
observa claramente como al avanzar en el proceso de purificacion, las bandas correspondientes a
proteınas contaminantes van disminuyendo, mientras que la banda que putativamente corresponde
a FBPasa (�37 kDa) va aumentando en intensidad.
El cambio es visualmente importante despues del primer paso cromatografico en Carboxime-
til sefarosa Fast flow (Carril 6, Post-CM FF). A su vez en la Tabla V se muestra un cuadro de
purificacion de la enzima tipo silvestre representativa del proceso de purificacion para todas las
4. Resultados 43
A
Tiempo (minutos)
Ab
so
rban
cia
(mA
u)
Un
idad
es
En
zim
atic
as
(U/m
l)
0 50 100 150 200 2500
500
1000
1500
2000
0
50
100
150
200
250
%B
uffe
rE
lució
n
0
50
100
Co
nd
ucti
vid
ad
(mS
/cm
)
0
20
40
B
Tiempo (minutos)
Ab
so
rban
cia
(mA
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Un
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es
En
zim
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as
(U/m
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0 50 100 150 2000
50
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200
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0
10
20
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0
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100
150
Figura 8: Cromatogramas del proceso de purificacion de la enzima FBPasa K42A. A Perfil de elucion dela cromatografıa de intercambio cationico en Carboximetil sefarosa Fast Flow. B Perfil de elucionde la cromatografıa de afinidad en Cibacron Blue 3GA Fast Flow. Se obtuvieron cromatogramassimilares tanto para la enzima tipo silvestre como para la mutante E192A. En azul se destaca laabsorbancia a 280 nm, en negro las unidades enzimaticas por ml, en verde el porcentaje del bufferde elucion y en rojo la conductividad. Ambos procedimientos fueron realizados con un flujo de 2ml/min, y recolectando fracciones de la proteına de interes de 4 ml, como se indica en Materialesy Metodos.
4. Resultados 44
A B
Figura 9: Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones denaturantes de las fracciones delproceso de purificacion. A SDS-PAGE 12 % del proceso de purificacion de la enzima tipo silves-tre, como descrito en Materiales y Metodos. Carriles: S-Estandar de peso molecular, 1-Post-Lisis,2-Post-sonicacion, 3-Post-50 % (NH4)2SO4, 4-Post-80 % (NH4)2SO4, 5-Post-dialisis, 6-Post-CMFF y 7-Post-Cibacron Blue 3GA. En todos los carriles se cargo 10 µg, con excepcion de los carriles6 y 7 donde se cargo 1 µg. Se observa un ensanchamiento del carril 3, posiblemente debido a la altafuerza ionica. B SDS-PAGE 12 % de las proteınas tipo silvestre (1) y mutantes K42A (2) y E192A(3) purificadas. En los tres carriles se cargo 1 µg de proteına.
4. Resultados 45
Tabla V: Tabla de purificacion de enzima tipo silvestre
Actividad
Enzimatica
(U/ml)
Concentracion
de proteinas
(mg/ml)
Actividad
Especıfica
(U/mg)
Volumen
aproximado
(ml)
Rendimiento
( %)
Sobrenadante
de la lisis y
sonicacion
3,55 4,37 0,8 300 100
Corte con
(NH4)2SO4 y
dialisis
17,52 5,59 3,1 35 57,6
Cromatografıa
de intercam-
bio cationico
9,45 0,44 21,3 32 28,4
Cromatografıa
de afinidad
10,92 0,36 30,2 28 28,7
Actividad enzimatica evaluada con 30 µM FBP, 5 mM Mg2SO4, 0,1 mM EDTA ycomenzando la reaccion por adicion de la enzima.
4. Resultados 46
enzimas en cuanto al rendimiento (20 %-30 %). El incremento en la actividad especıfica se condice
con lo observado en los geles de poliacrilamida, siendo el cambio mas notorio en las fracciones
recolectadas despues de la cromatografıa de intercambio cationico. Es interesante hacer notar que
se logro obtener una actividad especıfica de 30 U/mg al utilizar este metodo de purificacion. En la
Figura 9B se muestra las bandas correspondientes a FBPasa tipo silvestre y mutantes despues del
proceso de purificacion.
4.5. Caracterizacion cinetica de las enzimas purificadas
4.5.1. Efectos de comenzar la reaccion con sustrato o con enzima y
activacion por la adicion de EDTA o citrato
Una primera aproximacion fue evaluar los efectos de comenzar la reaccion con enzima o con
sustrato y de los quelantes EDTA y citrato. Si bien es usual comenzar los ensayos de actividad en-
zimatica por la adicion de la enzima, datos preliminares del laboratorio han mostrado diferencias,
especialmente al comenzar la reaccion con sustrato. Por esto es de interes evaluar las diferencias en
la actividad enzimatica observada al comenzar la reaccion de una u otra forma, ademas del efecto
que los quelantes puedan tener sobre este fenomeno. Para esto se realizaron ensayos donde se co-
menzo con enzima o con sustrato, ambos casos sin quelante, con EDTA 0.1 mM o Citrato 1 mM.
En la Figura 10 se observa claramente como la adicion de quelantes provoca una activacion tanto
si se comienza con enzima como con sustrato. Las enzimas mutantes siempre presentan una mayor
actividad al comenzar con enzima; para la enzima tipo silvestre, aunque bajo las distintas condi-
ciones la diferencia entre comenzar con enzima y sustrato es bastante discreta, esto solo ocurre en
ausencia de quelantes, ya que al agregar tanto EDTA como citrato se observa una mayor activi-
4. Resultados 47
A
ActividadEspecífica( mmol*min-1*mg-1)
-
EDTA0.1mM
Citrato1mM
0
10
20
30
Comienzo con sustrato
Comienzo con enzima
61±10%
81±8%
35±6%
24±6%
B
ActividadEspecífica( mmol*min-1*mg-1)
-
EDTA0.1mM
Citrato1mM
0
5
10
15
20
102±23%
151±36%
48±8%
25±8%
Comienzo con enzima
Comienzo con sustrato
CActividadEspecífica( mmol*min-1*mg-1)
-
EDTA0.1mM
Citrato1mM
0
2
4
6
8
10Comienzo con enzima
Comienzo con sustrato
99±14%
182±23%
90±14%
45±14%
Figura 10: Efectos de comenzar la reaccion con enzima o con sustrato y activacion al agregar EDTA ocitrato. En los graficos de barra se muestran las actividades de la enzima tipo silvestre (A) y lasmutantes K42A (B) o E192A (C) al comenzar la reaccion con enzima o sustrato, tanto sin quelantecomo con EDTA 0,1 mM o citrato 1 mM. Los valores mostrados son promedios � σ de cuatromediciones. Ademas se muestran los porcentajes de activacion al agregar quelantes respecto avalor sin quelante tanto al comenzar con enzima (rojo) como al comenzar con sustrato (negro).
4. Resultados 48
dad al comenzar con sustrato. El porcentaje de activacion observado al comenzar las reacciones
con sustrato es mayor en las tres enzimas, comparado a la activacion observada al comenzar los
ensayos con la adicion de la enzima. Ademas, en general, se observo un porcentaje de activacion
menor en la enzima tipo silvestre al comparar los ensayos con EDTA o citrato, respecto a aquellos
sin quelante, comparado con las enzimas mutantes. Aunque las actividades son notoriamente dife-
rentes para ambas mutantes, es interesante hacer notar la similitud de la respuesta de ambas a las
distintas condiciones.
4.5.2. Inactivacion enzimatica por temperatura
Tomando como evidencia la bibliografıa (Lu et al. 1996 [29]) y lo observado en el ensayo
anterior, se evaluo la actividad enzimatica depues de incubar la proteina a distintas temperaturas,
como se describe en Materiales y Metodos. En la Figura 11 se observa como las enzimas mutantes
son mas sensibles al incremento en la temperatura comparado con la enzima tipo silvestre. Se
determino que la temperatura necesaria para obtener la mitad de la actividad es de 60ºC para la
enzima tipo silvestre, 49ºC para la mutante E192A y 46ºC para la mutante K42A.
4.5.3. Curvas de saturacion por sustrato de la enzimas silvestre y mutantes
Se realizaron curvas de medicion de actividad utilizando concentraciones de sustrato hasta 1
mM. Los resultados obtenidos se grafican en la Figura 12.
Se comenzo la reaccion para la enzima silvestre con sustrato y para las mutantes con enzima. Se
obtuvieron velocidades maximas aparentes en todos los casos entre 20 y 40 µM de sustrato, eviden-
ciando una clara inhibicion por exceso de sustrato a concentraciones superiores en todos los casos.
A pesar de obtener curvas con aspectos muy similares considerando las diferencias en Vmax de las
distintas enzimas, las regresiones dan cuenta de variaciones en los valores de Km, considerando
4. Resultados 49
Temperatura (°C)
Acti
vid
ad
Rela
tiva
(%)
30 40 50 60 700
50
100
Figura 11: Inactivacion enzimatica por incubacion a distintas temperaturas. El grafico muestra la activi-dad relativa de la enzima tipo silvestre (negro), y mutantes K42A (azul) y E192A (rojo). Alıcuotasde las enzimas (0.2 mg/ml) fueron incubadas por 10 minutos a las temperaturas indicadas; pos-teriormente 0,4 µg de proteına fueron incubadas por 5 minutos a 30 ºC antes de comenzar lareaccion por adicion de sustrato. Se muestran las actividades de forma relativa a aquella obtenidapor cada enzima a 30ºC. El valor graficado es el promedio �σ de tres mediciones.
4. Resultados 50
[F-1,6-P2] mMActividadEspecífica( mmol*min-1*mg-1)
1 10 100 10000
10
20
30
Figura 12: Curvas de actividad enzimatica de las enzimas tipo silvestre y mutantes a distintas concen-traciones de sustrato. Se muestra en un grafico semi-logarıtmico los cambios en las actividad delas enzimas tipo silvestre (negro), y mutantes K42A (azul) y E192A (rojo). Las reacciones de laenzima silvestre fueron comenzadas con sustrato, mientras que aquellas de las enzimas mutantesfueron comenzadas por adicion de la enzima correspondiente; en todos los casos la mezcla con-tenıa 0.1 mM EDTA, 5 mM MgSO4 y Tris-HCl 20 mM pH 7,5, midiendose a 30 ºC. Se muestranlos valores promedio � σ de tres mediciones. Las curvas fueron obtenidas por ajuste a la ecuaciondescrita en Materiales y Metodos utilizando regresion no lineal.
4. Resultados 51
que comunmente se obtienen valores entre 5 y 10 µM para la enzima tipo silvestre; se obtuvieron
valores de 5,7 µM para la mutante E192A, de 16 µM para la mutante K42A y de 18,6 µM para la
enzima tipo silvestre. Se habıa reportado previamente valores para kcat significativamente menores
para ambas mutantes [28, 29]; el valor de kcat para la enzima tipo silvestre fue de 32 s�1, para la
mutante K42A fue de 27 s�1, mientras que para la mutante E192A fue de 9,8 s�1, obteniendose por
tanto solo una diferencia importante para esta ultima mutante respecto a la enzima tipo silvestre.
4.5.4. Curvas de activacion por Magnesio (II)
Como se describio en la Introduccion, la actividad catalıtica de la enzima es dependiente de
la concentracion de cationes divalentes como Magnesio (II). Se realizaron curvas de activacion de
las enzimas a concentraciones crecientes de Mg2�, lo que se puede observar en la Figura 13. No
se observaron cambios importantes en la Ka, obteniendose valores cercanos a 1 mM en todos los
casos. La cooperatividad mostro ligeros cambios, aunque para las tres enzimas el coeficiente de
Hill (nMg2�) fue cercano a 2.
4.5.5. Curvas de inhibicion por AMP
Se ha descrito que para las enzimas utilizadas en esta tesis el unico parametro que se ve afec-
tado, con excepcion de la kcat, son las constantes de inhibicion por AMP [28, 29]. Se realizaron
ensayos sin quelante comenzando la reaccion con sustrato para la enzima silvestre y con enzima
para las enzimas mutantes. La Figura 14 muestra los resultados obtenidos. Se obtuvo un valor
de Ki de 8,2 µM para la enzima tipo silvestre, con un coeficiente de Hill de 1,1. Se observo un
comportamiento bifasico de la mutante K42A, por lo que se ajusto a la ecuacion adecuada como se
indica en Materiales y Metodos. La regresion indica un aumento considerable en los valores de Ki
comparado con la enzima tipo silvestre (23,6 y 1700 µM); la mutante E192A no se inhibio comple-
4. Resultados 52
[MgSO4] mMActividadEspecífica( mmol*min-1*mg-1)
0 1 2 3 4 50
10
20
30
Figura 13: Curvas de activacion por Magnesio (II). Se muestran los cambios en la actividad enzimaticaa distintas concentraciones de magnesio para la enzima recombinante tipo silvestre (negro), ymutantes K42A (azul) y E192A (rojo). Las reacciones fueron comenzadas con sustrato suficientepara alcanzar una concentracion de 30 µM, en presencia de 0,1 mM EDTA y en tampon Tris-HCl20 mM pH 7,5. Las mediciones son el promedio �σ de 2 mediciones para la enzima silvestre ymutante K42A y 3 mediciones para la mutante E192A.
4. Resultados 53
[AMP] mM
ActividadRelativa(%)
0.1 1 10 100 1000 100000
50
100
150
Figura 14: Curvas de inhibicion por AMP. Se muestran los cambios en la actividad enzimatica a distintasconcentraciones de AMP para la enzima recombinante tipo silvestre (negro), y mutantes K42A(azul) y E192A (rojo). Las reacciones fueron comenzadas con sustrato en el caso de la enzimatipo silvestre, y con enzima para ambas mutantes; no se agrego EDTA en ningun caso. La mezclaconsto de 30 µM sustrato, 5 mM MgSO4, en Tris-HCl 20 mM pH 7,5 a 30ºC. Las mediciones sonel promedio �σ de 3 mediciones.
4. Resultados 54
tamente aun con 100 µM de AMP, lo que da cabida a un comportamiento bifasico. Esto ultimo no
se evaluo debido a las bajas actividades registradas bajo las condiciones experimentales utilizadas,
ajustando la curva a una inhibicion de una sola fase; se obtuvo un valor de 3,3 µM para Ki, con
un coeficiente de Hill de 1,2. Se observo una alta dispersion en los datos obtenidos, probablemente
debido a la ausencia de quelante en la mezcla de reaccion.
En la Tabla VI se muestra un cuadro resumen con los parametros cineticos determinados
en los ensayos con sustrato, magnesio (II) y AMP.
4.5.6. Activacion de la actividad enzimatica de FBPasa por adicion de
citrato.
Se ha descrito que distintos tipos de quelantes son capaces de activar a la enzima, como se
describio en la Introduccion y como se observo en resultados anteriores. Para determinar las con-
centraciones necesarias para observar esta activacion, se realizaron curvas de actividad a concentra-
ciones crecientes de citrato. En la Figura 15 se muestra el resultado al agregar citrato hasta 1 mM
comenzando tanto con sustrato como con enzima, en ausencia de EDTA, dado que al realizar el
ensayo en presencia de EDTA no se aprecia la activacion por citrato (datos no mostrados). Aunque
se observo una clara activacion a 1 mM citrato, respecto a la reaccion sin este, la alta dispersion
de datos no permitio establecer claramente una constante de activacion, que en todos los casos se
estimo B100 µM. Adicionalmente se observo que al comenzar la reaccion con enzima la activacion
fue menor, lo que concuerda con los resultados mostrado previamente.
Como ensayo control se realizo una curva de activacion por adicion de EDTA de la enzima tipo
silvestre, lo que se muestra en la Figura 16. Al igual que en el caso anterior se obtuvo una alta
dispersion de los valores obtenidos, pero se estimo una constante de activacion de 607�258 nM
4. Resultados 55Ta
bla
VI:
Para
met
rosc
inet
icos
para
laen
zim
asi
lves
tre
ym
utan
tes
FBPa
saVmax
(µm
ol/(
min
mg)
)
k cat
(s�1)
Km
(µM
)
Kss
(µM
)
βKiA
MP
(µM
)
n AM
PKa
Mg2
�
(mM
)
n Mg2
�
wt
52,6�
3,6
32,0�
2,2
18,6�
2,1
60,5�
11,0
0,21
8�0,
012
8,2�
0,7
1,1�
0,1
0,98
�0,
032,
5�0,
2
K42
A44
,4�
2,9
27,0�
1,8
16,0�
1,7
41,1�
7,0
0,27
6�0,
016
23,6�
7,1;
1700
�24
9�
1,8�
0,3
1,00
�0,
061,
8�0,
2
E19
2A16
,1�
0,7
9,8�
0,4
5,7�
0,5
59,6�
0,6
0,31
5�0,
013
3,3�
0,3
1,2�
0,1
1,24
�0,
111,
8�0,
2
�C
orre
spon
dea
lase
gund
aco
nsta
nte
inhi
bito
ria,
segu
nlo
desc
rito
enM
ater
iale
sy
Met
odos
.
4. Resultados 56
A
[Citrato] mMActividadEspecífica( mmol*min-1*mg-1)
0 200 400 600 800 10000
10
20
30
B
[Citrato] mMActividadEspecífica( mmol*min-1*mg-1)
0 200 400 600 800 10000
10
20
30
Figura 15: Curvas de activacion de FBPasa tipo silvestre y mutantes K42A y E192A por citrato. A Cur-va de activacion generada comenzando la reaccion con sustrato. B Curva de activacion generadacomenzando la reaccion con enzima. En el primer caso corresponde al promedio �σ de 2 medicio-nes, en cambio en el segundo caso fueron 4 mediciones. En ambos graficos se muestra lo obtenidotanto para la enzima tipo silvestre (negro), como para las mutantes K42A (azul) y E192A (rojo).No se obtuvieron valores confiables para las constantes de activacion, pero en todos los casos fueB100 µM.
4. Resultados 57
[EDTA] nMActi
vid
ad
Esp
ecíf
ica
( mm
ol*
min
-1*m
g-1
)
0.1 1 10 100 1000 10000 1000000
10
20
30
Figura 16: Curva de activacion de la enzima tipo silvestre por EDTA. Los ensayos se realizaron a con-centraciones crecientes de EDTA hasta 0,1 mM. El grafico se muestra utilizando una escala semi-logarıtmica con el fin de ver el proceso de activacion.
4. Resultados 58
4.5.7. Ensayos de dialisis al equilibrio
Se realizaron ensayos de dialisis al equilibrio utilizando 1 µM de citrato radiactivo considerando
el volumen total de ambas camaras, tal como se indica en Materiales y Metodos. Adicionalmente se
agregaron otros ligandos importantes en la catalisis y que podrıan afectar la union, como son mag-
nesio (II) (5 mM) y Fru-1,6-P2 (30 µM). Los resultados para cada una de las enzimas se muestra
en la Figura 17. La enzima tipo silvestre no mostro ningun tipo de union bajo ninguna de las condi-
ciones probadas. Las mutantes en cambio mostraron diferencias en la radiactividad recuperada de
las distintas camaras, al realizar el ensayo sin adicion de otro ligando, observandose una diferencia
de 4,9 % en el caso de la enzima K42A y de un 10,9 % para la enzima E192A, siendo significativa
esta diferencia segun la prueba t de Student para la mutante E192A (Figura 17C). Considerando lo
anterior se realizo con esta mutante el ensayo a distintas concentraciones de citrato entre 1 µM y
1 mM, manteniendo en 1 µM la concentracion de citrato radiactivo, siempre considerando el vo-
lumen total en ambas camaras (Figura 18A). A concentraciones sobre 10 µM deja de observarse
diferencia entre ambas camaras. Se intento determinar la constante de afinidad utilizando concen-
traciones de ligando entre 0,1 y 5 µM (Figura 18B), pero dada la pequena diferencia en cuentas por
minuto entre camaras, no se logro obtener valores significativos (datos no mostrados).
4. Resultados 59
A
CPMcámara/CPMtotal
MgSO45mM
Fru-1,6-P230mM
Mg2+ +Fru-1,6-P2 -
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
B
CPMcámara/CPMtotal
MgSO45mM
Fru-1,6-P230mM
Mg2+ +Fru-1,6-P2 -
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
C
CPMcámara/CPMtotal
MgSO45mM
Fru-1,6-P230mM
Mg2+ +Fru-1,6-P2 -
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
*
Figura 17: Ensayos de union por dialisis al equilibrio de citrato para FBPasa tipo silvestre y mutantesK42A y E192A. Ensayos de dialisis al equilibrio con las enzimas tipo silvestre (A), y mutantesK42A (B) y E192A (C) En los graficos de barra se representa la razon de las cuentas por minutorecuperadas de la camara con retenido de proteına (negro) y de aquella sin proteına (gris) respectoa la suma total de ambas camaras. Los ensayos se realizaron agregando solo el citrato radioactivoen buffer (-), o agregando ademas magnesio (II), Fru-1,6-P2 o ambos. * representa un t-Studentcon un [email protected] para la diferencia entre las camaras.
4. Resultados 60
A
[Citrato] mM
CPMcámara/CPMtotal
1 10 50 100
1000
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
B
[Citrato] mM
CPMcámara/CPMtotal
0.1
0.5 1
2.5 5
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Figura 18: Ensayos de dialisis al equilibrio de mutante E192A a distintas concentraciones de citratototal. En los graficos de barra se representa la razon de las cuentas por minuto recuperadas de lacamara con retenido de proteına (negro) y de aquella sin proteına (gris) respecto a la suma totalde ambas camaras.
5 Discusion
La enzima fructosa 1,6-bisfosfatasa ha sido ampliamente estudiada desde su descubrimiento por
Gomori [16]. Como se describio anteriormente, los reguladores mas estudiados han sido AMP y
fructosa 2,6-bisfosfato, dejando de lado otros posibles ligandos efectores con importancia fisiologi-
ca [47]. Desde los comienzos del estudio de la enzima se observo que los ensayos in vitro requieren
la presencia de un quelante, de preferencia EDTA, para obtener actividades enzimaticas mayores y
mas estables. De hecho una de las razones que explica la dificultad de detectar la isoforma muscular
fue la ausencia de un quelante en el medio de reaccion, como describieron Krebs y Woodford en
1965 [25], quienes observaron actividades bajas e inestables, atribuidas a la diferencia de concen-
tracion de metales contaminantes. El mecanismo descrito para este fenomeno implica la existencia
de especies mixtas de metales divalentes con la enzima. Al tener Zn2� en conjunto con magnesio,
la actividad catalıtica es menor a la obtenida solo con Mg2� como metal catalıtico. EDTA, aun-
que permite el estudio de los efectos de ligandos sobre la enzima, como AMP y Fru-2,6-P2, es
sintetico, por lo que no refleja las condiciones presentes a nivel celular. Teniendo en cuenta este
contexto se vuelve interesante intentar describir el efecto de activadores y quelantes fisiologicos
como aminoacidos e intermediarios del metabolismo de carbohidratos. De estos, los que tendrıan
mayor implicancia en la quelacion de metales a nivel celular son citrato e histidina; se demostro que
el segundo no interacciona con la enzima, asumiendo que su mecanismo de activacion es exclusi-
vamente por quelacion de metales inhibidores [49], mientras que no se ha reportado si el primero
interacciona o no con la enzima de mamıfero.
61
5. Discusion 62
Ensayos de union molecular in-silico o docking establecen el putativo sitio de union de citrato
en la interfaz C1-C4 tanto en la enzima de E. coli como en la enzima de rinon de cerdo
Con el fin de evaluar si citrato es capaz de interaccionar con la enzima se evaluo de forma
preliminar si a traves de un ensayo in silico se observa la union de citrato en el tetramero de
enzima, teniendo como antecedente que el grupo de Fromm, demostro que citrato activa a FBPasa
de E. coli por interaccion con la interfaz C1-C4 de dicha enzima [21]. Con esto se decidio evaluar
la posibilidad de reproducir este resultado computacionalmente, con el fin de validar el ensayo a
utilizar en la enzima de rinon de cerdo. El resultado mostro ser satisfactorio, obteniendose una
pose con solo 0.7 A de RMSD. Al realizar el mismo ensayo en la enzima de rinon de cerdo, se
observo una pose unida en el sitio activo, y un grupo de poses en la interfaz C1-C4. La union
en el sitio activo no se considero relevante, dada la alta afinidad del sustrato por el sitio. El sitio
de union postulado por el docking presente en la interfaz C1-C4 para la enzima de mamıfero es
estructuralmente equivalente al sitio presente en la enzima de E. coli (comparar Figuras 4 y 5).
Al observar la superficie molecular presente en la interfaz (Figura 19) se observa la presencia de
una cavidad rodeada por los residuos C38, T39, K42, G191, E192 y F193, correspondiente al sitio
de union resultante del docking. Es interesante que el resultado del ensayo de docking contempla
interacciones con los aminoacidos E192 y K42 (Figura 6), los cuales, segun la suposicion hecha
por el grupo de Fromm, permite mantener a la enzima en forma constitutivamente activa.
Adicionalmente a los ensayo de docking, el laboratorio cuenta con resultados cristalograficos
preliminares que indican la interfaz C1-C4 como el sitio de union (Figura 20). Aunque la union ocu-
rre en la interfaz, la molecula de citrato se encuentra interaccionando con los residuos Q32 y N35,
mas alejados del centro del tetramero. Por otra parte, en el putativo sitio determinado por docking
se encontraron moleculas de glicerol, lo que resulta controversial, al no haberse generado el cristal
en presencia de este compuesto, pero si habiendose tratado de forma posterior a la cristalizacion.
5. Discusion 63
Figura 19: Superficie molecular y cavidad de la interfaz C1-C4. A la izquierda de la Figura se muestra lasuperficie molecular de FBPasa (PDB=1EYI), coloreada segun potencial electroestatico; negativo(rojo) y positivo (azul). Adicionalmente, en el costado superior derecho, se muestra un cortevertical, en el cual se resalta la cavidad presente en la interfaz (trazos verde), y en el costadoinferior derecho se muestra la superficie de contacto entre subunidades (trazos naranja).
5. Discusion 64
Figura 20: Superficie molecular y cavidad de la interfaz C1-C4 mostrando ubicacion de citrato deter-minado por cristalografıa y por docking. En la Figura se muestra la superficie molecular deFBPasa (PDB=1EYI), coloreada segun potencial electroestatico; negativo (rojo) y positivo (azul).En la porcion superior derecha se muestra la ubicacion determinada por cristalografıa, mientrasque en la inferior derecha se muestra la estructura determinada por docking. La molecula de ci-trato se muestra de color naranja, glicerol de color celeste, y los nombres de los residuos que seencuentran a una distancia B a 5 A en verde. Los datos cristalograficos corresponden a datos nopublicados de Adelaida Dıaz, Joel Asenjo, Joan Guinovart y Juan Carlos Slebe.
5. Discusion 65
Existe la posibilidad que citrato haya sido desplazado de forma posterior a su cristalizacion, por
lo que este antecedente no es necesariamente contradictorio con el resultado obtenido por docking
[57].
Expresion, purificacion y caracterizacion de la enzima tipo silvestre y mutantes K42A y
E192A
Tomando en cuenta los datos planteados se expreso y purifico a las enzimas mutantes K42A y
E192A, ambas descritas previamente [28, 29]. Las enzimas se obtuvieron con alta pureza, como se
evidencio por SDS-PAGE (Figura 9). Es usual medir la actividad de FBPasa iniciando la reaccion
por la adicion de la enzima, por lo que una primera aproximacion fue evaluar el efecto de comenzar
las reacciones con enzima o con sustrato, con o sin EDTA 0,1 mM o citrato 1 mM, particularmente
en las enzimas mutantes. En todos los casos, la adicion de EDTA provoco una activacion maxima,
evidenciandose una activacion comparable con la adicion de citrato 1 mM. A su vez, al comparar
los ensayos sin quelante, respecto a aquellos a los que se le agrego EDTA o citrato, la activacion fue
mayor al comenzar la reaccion con sustrato, tanto para la enzima silvestre como para ambas mutan-
tes. Para la enzima tipo silvestre el comenzar la reaccion con enzima o con sustrato mostro ligeras
diferencias: el comenzar la reaccion con sustrato en presencia de EDTA o citrato permitio obtener
los valores de actividad catalıtica mas altos, mientra que en ausencia de ligandos la reaccion inicia-
da con sustrato mostro menor actividad. En el caso de las enzimas mutantes, siempre mostraron una
actividad especıfica mas alta al comenzar la reaccion con enzima. Considerando el posible efecto
de la incubacion de la enzima a 30ºC por 5 minutos en la menor actividad al comenzar la reaccion
con sustrato, y teniendo en cuenta que ambas mutaciones afectan un puente hidrogeno de la interfaz
C1-C4, se evaluo la inactivacion de la enzima por incubacion de la proteına a distintas temperaturas.
Ambas mutantes son claramente mas inestables que la enzima tipo silvestre, lo que puede explicar
5. Discusion 66
en parte la disminucion de actividad al comenzar los ensayos con sustrato. El resultado concuerda
con temperaturas de inactivacion reportadas para otras mutantes del residuo K42 [44].
La caracterizacion cinetica permitio comparar los parametros cineticos con aquellos reportados
previamente (Tabla VII). Ambas enzimas mutantes mostraron kcat menores a la correspondiente
de la enzima tipo silvestre: la mutante K42A evidencio una disminucion de aproximadamente un
septimo, mientras que la mutante E192A mostro un valor al menos 3 veces menor. En contraparte,
Lu et al. observo una disminucion a la mitad de la mutante K42A y de un cuarto para la enzima
E192A. Las Km fueron muy similares para la enzima tipo silvestre y la mutante K42A, y un poco
menor para la mutante E192A, a pesar de la similitud en la forma de todas las curvas obtenidas,
y que en todos los casos se obtuvo el maximo de actividad alrededor de 30 µM de sustrato (ver
Figura 12); a su vez fueron en todos los casos mayores a los valores reportados previamente. Estas
diferencias se pueden ver incrementadas debido a la diferencia en el metodo de regresion utilizado
entre el actual estudio y el reportado por Lu et al.. Los valores para la constante inhibitoria por
exceso de sustrato (Kss) fueron entre 40 y 60 µM, evidenciando ligeras y poco significativas dife-
rencias entre las enzimas; este parametro no habıa sido reportado con anterioridad. La respuesta a
Mg2� fue similar en todos los casos, obteniendo valores de Ka cercanos a 1 y coeficientes de Hill
cercanos a 2.
Uno de los parametros de interes en la enzimas mutantes es la inhibicion por AMP, la cual en
ambos casos se habıa descrito con caracterısticas bifasicas y con una perdida de cooperatividad,
ademas de una perdida de sensibilidad a la inhibicion en el caso de la enzima K42A [28, 29]. El
caracter bifasifco denota la presencia de sitios de alta y baja afinidad por AMP. Los resultados de
inhibicion por AMP obtenidos en esta tesis presentan una alta dispersion, al ser realizados sin la
adicion de EDTA. Se conoce que la enzima tipo silvestre presenta por lo general un coeficiente de
Hill cercano a 2 [5]. En nuestro caso se observo falta de cooperatividad para la enzima tipo silvestre
5. Discusion 67
Tabla VII: Valores reportados previamente para las enzimas tipo silvestre y mutantes K42A y E192Apor Lu et al., 1996 y 1997
FBPasa kcat (s�1) Km (µM) KaMg2� (mM) nMg2� KiAMP (µM) Ref.
wt 21�1 1,4�0,3 0,34 1,8�0,5 2,8 [28, 29]
K42A 10,8�0,5 3,3�0,7 0,64 NR 18;11000� [29]
E192A 15�4 3,3�1,8 0,95 1,4�0,1 1,6�0,1; 17000�17000� [28]
� Corresponde a la segunda constante inhibitoria.NR: Valor no reportado.
5. Discusion 68
y la mutante E192A, mientras que la mutante K42A mostro un valor cercano a 2. No se tiene claro
el porque esta diferencia en la cooperatividad, pero hay que considerar que los ensayo fueron rea-
lizados sin quelante, lo que puede afectar los valores aquı informados. La perdida de inhibicion de
la enzima K42A resulto evidente, ademas de su caracter bifasico. El valor de la segunda constante
inhibitoria mostro una diferencia de un orden de magnitud respecto al valor reportado previamente,
pero aun ası fue en el rango de concentraciones milimolares. Para la enzima mutante E192A la
constante inhibitoria concuerda con lo informado anteriormente; aunque se vieron indicios de un
caracter bifasico, esto no fue evaluado debido a las bajas actividades obtenidas en las condiciones
utilizadas en este estudio. Es importante hacer notar que la actividad de la enzima en la segunda
fase no supera el 10 % segun lo descrito [28]. De hecho es interesante hacer notar el valor de la
constante inhibitoria reportado para la segunda fase, el cual evidencia un error estandar muy alto.
Tomando en cuenta los resultados obtenidos se considero que, excluyendo los parametros de inhi-
bicion por AMP, la kcat y la Km en el caso de la enzima E192A, las enzimas mutantes mostraron
caracterısticas similares a la enzima tipo silvestre.
Activacion de la enzima por citrato; ensayos de dialisis al equilibrio y el aumento de la union
en las enzimas mutantes
En vista de la activacion por citrato observada en los ensayos anteriores, se realizaron curvas
de activacion agregando citrato hasta concentraciones de 1 mM, comenzando las reacciones con
enzima o con sustrato (Figura 15). En concordancia con los resultados anteriores (Figura 10), al
comenzar la reaccion con sustrato se observo una activacion mayor comparado al ensayo realizado
comenzando la reaccion con enzima. Aun cuando el mayor cambio ocurre entre 0 y 100 µM, no se
pudo determinar con certeza una constante de activacion, debido a la alta dispersion de los datos.
Esto se debe probablemente a la presencia de especies mixtas de cationes divalentes y enzima, y
5. Discusion 69
a la menor capacidad respecto a EDTA de citrato de remover Zn2�. Al realizar el mismo analisis
con la enzima tipo silvestre agregando EDTA hasta concentraciones de 100 µM y comenzando con
sustrato, se observo una constante de activacion de aproximadamente 1 µM.
La posible union de citrato a la enzima silvestre y mutantes fue evaluada por dialisis al equili-
brio, de forma similar a lo mostrado previamente en la literatura para fosfofructoquinasa [37]; bajo
las condiciones probadas los ensayos no mostraron union detectable para la enzima tipo silvestre,
pero si al realizar los ensayos con las enzimas mutantes sin ligando, y de forma estadısticamente
significativa para la mutante E192A. Esto en cierta forma concuerda con lo esperado; la remocion
de una carga negativa del putativo sitio de union permitirıa disminuir la repulsion de citrato por la
cavidad, aumentando ası la union. La aparente union a la enzima K42A, aunque no significativa
segun la prueba t de Student, podrıa dar indicios de un factor esterico en la union a la interfaz,
ademas del factor determinado por carga ya descrito. Los resultados obtenidos no permitieron es-
tablecer constantes de disociacion para el ligando, dada las pequenas diferencias de radiactividad
detectadas entre las camaras.
En el laboratorio se habıan realizado anteriormente ensayos de fluorescencia para evaluar la
posible union de citrato a la enzima. Para esto se habıan realizado mutaciones de residuos fenilala-
nina a triptofano, considerando que la enzima silvestre no tiene este ultimo aminoacido, donde la
mutante F16W mostro ser sensible y reflejar cambios en la intensidad de fluorescencia a distintas
concentraciones de citrato (Figura 21). A partir de este ensayo se estimo una constante de disocia-
cion de 2,2�0,5 mM. La enzima utilizada fue purificada utilizando un sistema de purificacion de
Sefarosa-Nickel, al poseer una cola de polihistidina His-Tag; el ensayo fue realizado utilizando la
enzima sin haber cortado el peptido His-Tag, ademas de el medio tener 0.1 mM EDTA. Serıa intere-
sante realizar el ensayo en ausencia de EDTA y del mencionado peptido y observar si se obtiene un
efecto distinto, considerando que se puede estar enmascarando un efecto al ser ambos quelantes.
5. Discusion 70
[Citrato] mM
10
0*(
F-F
0)/
F0
0 5 10
-8
-6
-4
-2
0
Figura 21: Efecto de la concentracion de citrato sobre la intensidad de fluorescencia de la mutante derinon de cerdo F16W. Se grafica el porcentaje de disminucion de la intensidad de fluorescencia alir incrementando la concentracion de citrato. El medio corresponde a un buffer Tris-HCl 20 mMpH 7,5 EDTA 0,1 mM. El ajuste corresponde a una regresion utilizando la ecuacion de Hill. Losresultados corresponden a datos no publicados de Marcos Maureira, Joel Asenjo y Juan CarlosSlebe.
5. Discusion 71
Considerando la alta Kd estimada por fluorescencia, se puede explicar el resultado obtenido por
dialisis al equilibrio con el enzima tipo silvestre. Es posible que de realizar el mismo ensayo con
citrato marcado con una radiactividad especıfica mayor y mayores concentraciones de proteına, la
union seria observable.
En conjunto los datos permiten inferir que probablemente existe union de citrato a la enzima
silvestre, pero que la constante de afinidad es tan baja que no puede ser determinada utilizando
el metodo por dialisis al equilibrio planteado en este estudio. Adicionalmente ambas mutaciones
provocan un aumento en la union del ligando con la enzima, lo que podrıa implicar no solo un efecto
de repulsion por carga de la enzima silvestre, si no tambien un componente esterico en el putativo
sitio. Ademas, al realizar los ensayos en presencia de Fru-1,6-P2 30 µM, de Mg2� 5 mM, o de
ambos, se hizo imperceptible la diferencia de radiactividad entre la camara con proteına y la camara
con dializado. Uno de los motivos que pueden explicar este efecto al agregar el cation divalente,
es la formacion del complejo citrato-Mg2�, lo que podrıa modificar su capacidad de union. El caso
del sustrato es mas complejo; se ha observado que el sustrato modifica las interacciones entre las
subunidades del tetramero [2], lo que podrıa permitir especular respecto a una modificacion del
sitio de union de citrato, y por tanto la disminucion de la union observada.
Aunque se observa union del ligando y activacion de la enzima al aumentar la concentracion
de este, no es posible establecer fehacientemente el vınculo entre el proceso de union y el aumento
en la actividad. La constante de afinidad observada por fluorescencia no se correlaciona con la
activacion evaluada en este estudio; adicionalmente no se ve una activacion importante de la enzima
por citrato en una mezcla de reaccion con 10 µM EDTA (datos no mostrados). No obstante la union
detectada por dialisis al equilibrio en ambas mutantes se correlaciona con un aparente incremento
en el porcentaje de activacion por citrato, comparado con la enzima silvestre. Mas aun, existe
una aparente inconsistencia en la activacion observada por citrato y EDTA, si es que la perdida
5. Discusion 72
de inhibicion por zinc (II) fuese el unico responsable de la activacion observada. El logaritmo de
la constante de formacion para el complejo EDTA-Zn2� es de 16.58 [58], mientras que para el
complejo (citrato)2-Zn2� es de solo 5.9 [22]. Esto implica que EDTA es 1010,68 veces mas afın por
Zn2� de lo que lo es citrato. Aun ası con concentraciones cercanas a 100 µM de citrato se activa a
la enzima de forma comparable al utilizar entre 1 y 10 µM de EDTA (Figuras 10, 15 y 16), pero la
activacion por EDTA siempre es ligeramente superior.
Si el fenomeno de activacion fuese por mera quelacion, uno esperarıa que al aumentar la con-
centracion de citrato se llegase a obtener una activacion equivalente a aquella obtenida por EDTA.
Esto no ocurre, dado que al incrementar la concentracion de ambos quelantes por sobre 1 mM,
se observa una disminucion de la actividad, la cual es mucho mayor en el caso de EDTA. Esto
se puede relacionar con la capacidad para quelar magnesio (II), cation esencial para la actividad
enzimatica; EDTA tiene un logaritmo de constante de formacion de complejo de 8,6 [42], mientras
que el complejo (citrato)2-Mg2� de 4,89 [10]. Al comparar las constantes de formacion de EDTA y
citrato por Zn2� y Mg2� se observa una mayor especificidad de EDTA por Zn2� en comparacion a
citrato por este metal. Esto sugiere que citrato podrıa quelar Mg2� en conjunto a Zn2�, observando-
se una activacion aparente menor debido a la conjunta quelacion del metal catalıtico. Hay que
considerar que el sistema de equilibrios puede ser mucho mas complejo que lo planteado anterior-
mente. Es difıcil realizar calculos basados en las constantes de disociacion de los complejos sin
saber las concentraciones de zinc presentes en todas las soluciones involucradas en los ensayos de
actividad enzimatica, mas aun cuando se evaluo que incluso tampones tratados con agarosa-acido
iminodiacetico (o Chelex-100) tienen concentraciones de Zn2� alrededor de 20 nM [18].
En conjunto los argumentos planteados permiten suponer que la union de citrato en la interfaz
produce efectos adicionales a la activacion de la enzima por remocion de Zn2�. Esta no serıa la
primera vez que se observan inconsistencias en la respuesta de la enzima a citrato que darıan cabida
5. Discusion 73
a la especulacion de efectos adicionales a la quelacion de metales inhibidores; en 1990 Adams et al.
mostraron como una mezcla de histidina y citrato son capaces de activar mas a FBPasa que EDTA,
a pesar que ninguno de estos quelantes es capaz de competir por Zn2� con EDTA [1]. Ademas, en
1976, Tejwani et al. mostraron que a pH 9 el unico quelante capaz de activar a la enzima es citrato
[48]. Es importante hacer notar que a este pH la enzima no serıa inhibida por Zn2�, ya que este
precipitarıa al formarse Zn(OH)2, forma muy poco soluble de este metal [47].
Revision del posible rol fisiologico de Zn2� en la actividad de FBPasa
Se ha planteado con anterioridad que FBPasa puede funcionar como una metaloproteina de
Zn2� in-vivo [47]. Solo recientemente se ha logrado estimar con mas exactitud que la concentracion
libre de Zn2� en el citosol se encuentra en el rango picomolar, aun cuando la concentracion total
se encuentra en el rango micromolar [8, 32]; esto implica que la concentracion de Zn2� libre se
encuentra en el rango de concentraciones en el que el metal actua como un efector negativo para la
enzima y no como el metal catalıtico (@1 µM Zn2�).
En la ultima decada se la ha dado relevancia a las implicancias del Zn2� en posibles procesos
regulatorios a nivel celular, a sus mecanismos de transporte y a su interaccion con diversas proteınas
[9, 32]. De hecho se plantea que fluctuaciones en las concentraciones de Zn2� podrıan regular a
metaloenzimas dependientes de zinc, pero lo que es aun mas interesante, activar a enzimas que son
fuertemente inhibidas por este metal (Figura 22) [32]. Dentro de estos estudios se habla de Zn2�
estatico, el cual se une con un valor de logaritmo de constante de formacion (log Kf ) superior a 10,
fraccion movil de Zn2� con log Kf @10 y de Zn2� libre; citrato, como se menciono anteriormente,
formarıa complejos con Zn2� de la fraccion movil. Tomando en cuenta que las concentraciones
de citrato son oscilatorias, no es irracional pensar que este metabolito podrıa estar controlando por
medio de estos cambios de concentracion la fraccion libre de Zn2�, en conjunto con fluctuaciones de
5. Discusion 74
Figura 22: Activacion e inhibicion de enzimas por zinc (II). En la parte superior se muestra como apoenzi-mas son activadas por la union de zinc (II). Ademas, en la parte inferior se muestra como enzimasque son inhibidas por zinc (II) podrıan ser activadas al disminuir la concentracion libre del cation.Figura tomada del artıculo publicado por Maret, 2013 [32].
5. Discusion 75
otros metabolitos con capacidad quelante como histidina. Sin embargo hay que tener presente que
las constantes inhibitorias descritas para FBPasa son altas, en comparacion con las concentraciones
estimadas de Zn2� libre, presentando una Ki entre 100 y 300 nM [32, 33, 41, 48]. A pesar de esto,
el rol de la inhibicion por Zn2� no necesariamente implica la inhibicion total de la enzima, si no
que puede estar regulando su actividad por medio de la formacion de especies mixtas de enzima-
cationes divalentes.
Se han realizado observaciones interesantes en las dinamicas de union de Zn2� a las proteinas.
En β-lactamasas, el sustrato dimsinuye de forma importante la constante de disociacion de Zn2�
[56]. Ademas, al agregar EDTA a peptidos con capacidad de unir el metal, aumenta en 6 ordenes de
magnitud la velocidad de disociacion de Zn2�, al formar complejos ternarios EDTA-Zn2�-peptido,
permitiendo el rapido intercambio del metal entre especies con capacidad de unirlo (mecanismo
denominado ”quelacion catalıtica”) [17, 34]. Se puede especular que el primer fenomeno es el
responsable de los efectos observados al comenzar las reacciones con enzima o con sustrato en el
presente estudio (Figuras 10 y 15), es decir, que cuando la reaccion es comenzada con enzima, esta
no tiene tiempo suficiente de intercambiar todo el metal con EDTA o citrato antes de interaccionar
con el sustrato, generando especies de enzima con mezclas de metales (Zn2� y Mg2� y por lo
tanto una actividad reducida. En comparacion, al comenzar la reaccion enzimatica con sustrato, la
enzima es incubada por 5 minutos en la mezcla de reaccion, dando un tiempo mas extenso para
remover las trazas presentes. De ser cierto este efecto, podrıa tener implicancias en la capacidad
de la enzima de responder a cambios en las concentraciones de metales, dependiendo si el sitio
catalıtico se encuentra con el sustrato o no. La formacion de complejos ternarios, por otra parte,
pueden dar cabida a distintas velocidades de remocion del metal, dependiendo de la capacidad de
generar el complejo por el quelante mas que de las constantes de equilibrio. Respecto a esto, se han
descrito este tipo de estructuras en cristales, mostrando complejos citrato-Zn2�-proteına [14].
5. Discusion 76
Perspectivas
La evaluacion de los efectos de los quelantes sobre las actividades enzimaticas de metaloenzi-
mas muestra ser mas compleja de lo esperado inicialmente. Serıa interesante evaluar, tomando en
cuenta la informacion y tecnicas actualmente disponibles, los reales efectos de Zn2� sobre FBPasa,
ademas de poder dilucidar la controversia del efecto de citrato en la actividad catalıtica de la enzi-
ma. En 2002, Wommer et al. mostraron en una serie de experimentos como es posible evaluar las
constantes de disociacion y los efectos en las catalisis de β-lactamasas utilizando quelantes, sondas
absorciometricas, un modelo del equilibrio y evaluaciones de las concentraciones de Zn2� en las
soluciones utilizadas [56]. Expermientos de este tipo probablemente permitirıan esclarecer si existe
algun efecto de citrato sobre FBPasa adicional a la quelacion de metales, lo que incluye variaciones
en las velocidades de disociacion de los metales a la enzima.
Nuevos ensayos con la enzima mutante F16W bajo condiciones mas adecuadas tal vez den
resultados mas auspiciosos que los generados por dialisis al equilibrio, al aumentar la capacidad
de deteccion. Es mas, dobles mutantes de la enzima F16W y E192A o K42A permitirıan reevaluar
lo observado en el presente reporte, ademas de poder determinar las constantes de disociacion,
indeterminables bajo el metodo aquı utilizado.
Conclusiones
El efecto en la actividad catalıtica de los quelantes como EDTA, citrato e histidina en FBPasa
han sido estudiados con anterioridad. Aun ası, este parece ser el primer informe que da cuenta de
una interaccion de citrato con una FBPasa hepatica. Las mutaciones de los residuos E192 y K42
a alanina parecen aumentar la union del ligando, lo que podrıa dar cuenta que el sitio de union es
equivalente al observado en E. coli, y aunque la union parece ser fuertemente influenciada por las
cargas de los residuos en la cavidad, podrıa darse un componente esterico no despreciable. La su-
5. Discusion 77
posicion hecha por Hines et al. es congruente con lo observado en esta tesis [21]; se observo union
por dialisis al equilibrio en las enzimas mutantes de los residuos E192 y K42, aun cuando no se
evidencio un incremento en la activacion por citrato en presencia de EDTA, comparado con el efec-
to observado en la enzima de E. coli. La discrepancia entre la activacion y la union de citrato por
la enzima, ademas de las diferencias de activacion entre EDTA y citrato, hace pensar que existen
dos posibilidades: 1) la activacion observada por citrato es a consecuencia de la quelacion de Zn2�,
y la aparente discrepancia entre EDTA y citrato se explica por equilibrios y dinamicas complejas
no evaluadas o 2)citrato es capaz de generar un cambio en la estructura de la enzima, debido a su
union con esta. Se propone reevaluar la union de citrato a la enzima con el sistema de mutantes
mencionadas anteriormente, ademas de evaluar los efectos de Zn2� sobre la actividad catalıtica de
la enzima y sus posibles consecuencias a nivel celular, donde es posible que citrato, junto con otros
quelantes fisiologicos, jueguen un rol. Esto permitirıa discriminar si el efecto de citrato se debe
exclusivamente a la quelacion de este metal o si la union esta involucrada en la activacion, abriendo
posibilidades a mecanismos de regulacion no contemplados con anterioridad.
6 Bibliografıa[1] Adams, A., Redden, C., & Menahem, S. (1990). Characterization of human fructose-1,6-
bisphosphatase in control and deficient tissues. J Inherit Metab Dis, 13(6), 829–48.
[2] Asenjo, J. L. (2008). Asimetrıa en la fructosa 1,6-bisfosfatasa; analisis del mecanismo deinhibicion por fructosa 2,6-bisfosfato y por altas concentraciones de fructosa 1,6-bisfosfato,mediante el uso de enzimas hıbridas con subunidades sensibles y desensibilizadas al efector.Tesis doctoral, p. 141, Facultad de Ciencias, Universidad Austral de Chile.
[3] Benkovic, P. A., Caperelli, C. A., de Maine, M., & Benkovic, S. J. (1978). Binding and kineticdata for rabbit liver fructose-1,6-bisphosphatase with Zn2+ as cofactor. Proc Natl Acad SciUSA, 75(5), 2185–9.
[4] Benkovic, S. J., & DeMaine, M. M. (1982). Mechanism of action of fructose 1,6-bisphosphatase. Adv Enzymol RAMB, 53(May 1980), 45–82.
[5] Carcamo, J. G., Yanez, a. J., Ludwig, H. C., Leon, O., Pinto, R. O., Reyes, a. M., & Slebe, J. C.(2000). The C1-C2 interface residue lysine 50 of pig kidney fructose-1, 6-bisphosphatase hasa crucial role in the cooperative signal transmission of the AMP inhibition. Eur J Biochem,267(8), 2242–51.
[6] Chang, M. W., Ayeni, C., Breuer, S., & Torbett, B. E. (2010). Virtual screening for HIVprotease inhibitors: a comparison of AutoDock 4 and Vina. PLoS One, 5(8), e11955.
[7] Choe, J. Y., Poland, B. W., Fromm, H. J., & Honzatko, R. B. (1998). Role of a dyna-mic loop in cation activation and allosteric regulation of recombinant porcine fructose-1,6-bisphosphatase. Biochemistry-US, 37(33), 11441–50.
[8] Colvin, R. A., Holmes, W. R., Fontaine, C. P., & Maret, W. (2010). Cytosolic zinc bufferingand muffling: their role in intracellular zinc homeostasis. Metallomics, 2(5), 306–17.
[9] Costello, L. C., Fenselau, C. C., & Franklin, R. B. (2011). Evidence for operation of thedirect zinc ligand exchange mechanism for trafficking, transport, and reactivity of zinc inmammalian cells. J Inorg Biochem, 105(5), 589–99.
[10] Covington, A., & Danish, E. (2009). Measurement of Magnesium Stability Constants ofBiologically Relevant Ligands by Simultaneous Use of pH and Ion Selective Electrodes. JSolution Chem, 38(11), 1449–1462.
78
6. Bibliografıa 79
[11] Coyle, P., Tichelman, E., Pauw, R., Philcox, J., & Rofe, A. (2003). Zinc inhibition of hepaticfructose metabolism in rats. Biol Trace Elem Res, 92(1), 41–54.
[12] Cross, J. B., Thompson, D. C., Rai, B. K., Baber, J. C., Fan, K. Y., Hu, Y., & Humblet,C. (2009). Comparison of several molecular docking programs: pose prediction and virtualscreening accuracy. J Chem Inf Model, 49(6), 1455–74.
[13] Demaine, M. M., & Benkovic, S. J. (1980). Selective modification of rabbit liver fructosebisphosphatase. Arch Biochem Biophys, 205(2), 308–14.
[14] Fernandez, D., Boix, E., Pallares, I., Aviles, F. X., & Vendrell, J. (2011). Structural and Fun-ctional Analysis of the Complex between Citrate and the Zinc Peptidase Carboxypeptidase A.Enzyme research, 2011, 128676.
[15] Fu, J. Y., & Kemp, R. G. (1973). Activation of muscle fructose 1,6-diphosphatase by creatinephosphate and citrate. J Biol Chem, 248(3), 1124–1125.
[16] Gomori, G. (1943). Hexosediphosphatase. J Biol Chem, 148, 139–149.
[17] Heinz, U., Kiefer, M., Tholey, A., & Adolph, H.-W. (2005). On the competition for availablezinc. J Biol Chem, 280(5), 3197–207.
[18] Hernandez Valladares, M., Felici, a., Weber, G., Adolph, H. W., Zeppezauer, M., Rossolini,G. M., Amicosante, G., Frere, J. M., & Galleni, M. (1997). Zn(II) dependence of the Aero-monas hydrophila AE036 metallo-beta-lactamase activity and stability. Biochemistry, 36(38),11534–41.
[19] Hines, J. K., Chen, X., Nix, J. C., Fromm, H. J., & Honzatko, R. B. (2007). Structuresof mammalian and bacterial fructose-1,6-bisphosphatase reveal the basis for synergism inAMP/fructose 2,6-bisphosphate inhibition. J Biol Chem, 282(49), 36121–36131.
[20] Hines, J. K., Fromm, H. J., & Honzatko, R. B. (2006). Novel allosteric activation site inEscherichia coli fructose-1,6-bisphosphatase. J Biol Chem, 281(27), 18386–18393.
[21] Hines, J. K., Fromm, H. J., & Honzatko, R. B. (2007). Structures of activated fructose-1,6-bisphosphatase from Escherichia coli. Coordinate regulation of bacterial metabolism and theconservation of the R-state. J Biol Chem, 282(16), 11696–704.
[22] Ishizaki, T., Ohtomo, T., Sakamoto, Y., & Fuwa, A. (2004). Effect of pH on the Electrodepo-sition of ZnTe Film from a Citric Acid Solution. Mater Trans, 45(2), 277–280.
[23] Ke, H. M., Zhang, Y. P., & Lipscomb, W. N. (1990). Crystal structure of fructose-1,6-bisphosphatase complexed with fructose 6-phosphate, AMP, and magnesium. Proc Natl AcadSci USA, 87(14), 5243–7.
6. Bibliografıa 80
[24] Kommedal, O., Karlsen, B., & Saebø, O. (2008). Analysis of mixed sequencing chromato-grams and its application in direct 16S rRNA gene sequencing of polymicrobial samples. JClin Microbiol, 46(11), 3766–71.
[25] Krebs, B. H. A., & Woodford, M. (1965). Fructose 1 , 6-Diphosphatase in Striated Muscle.Biochem J, pp. 436–445.
[26] Laemmli, U. K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head ofbacteriophage T4. Nature, 227(5259), 680–5.
[27] Laskowski, R. a., & Swindells, M. B. (2011). LigPlot+: multiple ligand-protein interactiondiagrams for drug discovery. J Chem Inf Model, 51(10), 2778–86.
[28] Lu, G., Giroux, E. L., & Kantrowitz, E. R. (1997). Importance of the dimer-dimer inter-face for allosteric signal transduction and AMP cooperativity of pig kidney fructose-1,6-bisphosphatase. Site-specific mutagenesis studies of Glu-192 and Asp-187 residues on the190’s loop. J Biol Chem, 272(8), 5076–81.
[29] Lu, G., Stec, B., Giroux, E. L., & Kantrowitz, E. R. (1996). Evidence for an active T-statepig kidney fructose 1,6-bisphosphatase: interface residue Lys-42 is important for allostericinhibition and AMP cooperativity. Protein Sci, 5(11), 2333–42.
[30] MacDonald, M. J., Fahien, L. a., Buss, J. D., Hasan, N. M., Fallon, M. J., & Kendrick, M. a.(2003). Citrate oscillates in liver and pancreatic beta cell mitochondria and in INS-1 insuli-noma cells. J Biol Chem, 278(51), 51894–900.
[31] Marcus, F., & Hubert, E. (1968). Functional consequences of modification of kidney fructose1,6-diphosphatase by pyridoxal 5’-phosphate. J Biol Chem, 243(18), 4923–6.
[32] Maret, W. (2013). Inhibitory zinc sites in enzymes. Biometals, 26(2), 197–204.
[33] Maret, W., Jacob, C., Vallee, B. L., & Fischer, E. H. (1999). Inhibitory sites in enzymes: zincremoval and reactivation by thionein. Proc Natl Acad Sci USA, 96(5), 1936–40.
[34] Maret, W., & Li, Y. (2009). Coordination dynamics of zinc in proteins. Chem Rev, 109(10),4682–707.
[35] Nelson, David L., Lehninger, Albert L., Cox, M. M. (2008). Lehninger principles of bioche-mistry. New York: W.H. Freeman.
[36] Nimmo, H. G., & Tipton, K. F. (1975). The purification of fructose 1,6-diphosphatase fromox liver and its activation by ethylenediaminetetra-acetate. Biochem J, 145(2), 323–34.
6. Bibliografıa 81
[37] Ogawa, Y., & Atkinson, D. E. (1985). Interactions between citrate and nucleoside triphosp-hates in binding to phosphofructokinase. Biochemistry, 24(4), 954–8.
[38] Pedrosa, F. (1977). Binding of Zn2+ to rat liver fructose-1, 6-bisphosphatase and its effect onthe catalytic properties. Proc Natl Acad Sci USA, 74(7), 2742–2745.
[39] Peters, S. J., & Spriet, L. L. (1995). Skeletal muscle phosphofructokinase activity examinedunder physiological conditions in vitro. J Appl Physiol, 78(5), 1853–1858.
[40] Pettersen, E. F., Goddard, T. D., Huang, C. C., Couch, G. S., Greenblatt, D. M., Meng, E. C.,& Ferrin, T. E. (2004). UCSF Chimera–a visualization system for exploratory research andanalysis. J Comput Chem, 25(13), 1605–1612.
[41] Pontremoli, S., Melloni, E., Salamino, F., Sparatore, B., & Horecker, B. L. (1978). Interactionsof Zn2+ and Mg2+ with rabbit liver fructose 1,6 bisphosphatase. Arch Biochem Biophys,188(1), 90–7.
[42] Rodrıguez-Sotres, R., & Munoz Clares, R. a. (1990). Kinetic evidence of the existence of aregulatory phosphoenolpyruvate binding site in maize leaf phosphoenolpyruvate carboxylase.Arch Biochem Biophys, 276(1), 180–90.
[43] Rosenberg, J. S., Tashima, Y., Horecker, B. L., & Pontremoli, S. (1973). Activation of rabbitkidney fructose diphosphatase by Mg-EDTA, Mn-EDTA and Co-EDTA complexes. Archivesof biochemistry and biophysics, 154(1), 283–91.
[44] Shyur, L. F., Aleshin, a. E., Honzatko, R. B., & Fromm, H. J. (1996). Biochemical proper-ties of mutant and wild-type fructose-1,6-bisphosphatases are consistent with the coupling ofintra- and intersubunit conformational changes in the T- and R-state transition. J Biol Chem,271(52), 33301–7.
[45] Siess, E. A., Brocks, D. G., Wieland, O. H., & Ash, C. (1978). Distribution of MetabolitesBetween the Cytosolic and Mitochondrial Compartments of Hepatocytes Isolated from FedRats fed rats , the subcellular distribution of malate ,. H-S Z Physiol Chem, pp. 785–798.
[46] Taketa, K., & Pogell, B. M. (1965). Allosteric Inhibition of Rat Liver Fructose 1,6-Diphosphatase By Adenosine 5’-Monophosphate. J Biol Chem, 240(2), 651–62.
[47] Tejwani, G. A. (1983). Regulation of fructose-bisphosphatase activity. Adv Enzymol RAMB,54, 121–94.
[48] Tejwani, G. A., Pedrosa, F. O., Pontremoli, S., & Horecker, B. L. (1976). Dual role of Zn2+as inhibitor and activator of fructose 1,6-bisphosphatase of rat liver. Proc Natl Acad Sci USA,73(8), 2692–5.
6. Bibliografıa 82
[49] Tejwani, G. A., Pedrosa, F. O., Pontremoli, S., & Horecker, B. L. (1976). The purification ofproperties of rat liver fructose 1,6-bisphosphatase. Archives of biochemistry and biophysics,177(1), 253–64.
[50] Tornheim, K., Andres, V., & Schultz, V. (1991). Modulation by citrate of glycolytic oscilla-tions in skeletal muscle extracts. J Biol Chem, 266(24), 15675–8.
[51] Trott, O., & Olson, A. J. (2010). AutoDock Vina: improving the speed and accuracy ofdocking with a new scoring function, efficient optimization, and multithreading. J ComputChem, 31(2), 455–461.
[52] Underwood, A. H., & Newsholme, E. a. (1965). Some Properties of Fructose 1,6-Diphosphatase of Rat Liver and Their Relation to the Control of Gluconeogenesis. BiochemJ, 95, 767–774.
[53] Van Tol, A., Black, W., & Horecker, B. L. (1972). Activation of rabbit muscle fructose dip-hosphatase by EDTA and the effect of divalent cations. Archives of Biochemistry and Biophy-sics, 151(2), 591–596.
[54] Watowich, S., & Arian, M. (2010). Docking At UTMB - DUD Results:http://docking.utmb.edu/dudresults/.URL http://docking.utmb.edu/dudresults/
[55] Webb, J. L. (1963). Enzyme and metabolic inhibitors., vol. 1. New York,: Academic Press,.
[56] Wommer, S., Rival, S., Heinz, U., Galleni, M., Frere, J.-M., Franceschini, N., Amicosante,G., Rasmussen, B., Bauer, R., & Adolph, H.-W. (2002). Substrate-activated zinc binding ofmetallo-beta -lactamases: physiological importance of mononuclear enzymes. J Biol Chem,277(27), 24142–7.
[57] Wu, S., Dornan, J., Kontopidis, G., Taylor, P., & Walkinshaw, M. D. (2001). The First DirectDetermination of a Ligand Binding Constant in Protein Crystals. Angew Chem Int Edit, 40(3),582–586.
[58] Xu, G., Zhang, J., & Song, G. (2003). Effect of complexation on the zeta potential of silicapowder. Powder Technol, 134(3), 218–222.
[59] Yanez, A. J., Nualart, F., Droppelmann, C., Bertinat, R., Brito, M., Concha, I. I., Slebe, J. C.,Yanez, A. J., & Concha II (2003). Broad expression of fructose-1,6-bisphosphatase andphosphoenolpyruvate carboxykinase provide evidence for gluconeogenesis in human tissuesother than liver and kidney. J Cell Physiol, 197(2), 189–97.