Preparación de muestras, extracción y análisis de ácidos nucleicos.

Comportamiento de las moléculas en el agua

Moléculas hidrofóbicas• Moléculas en las que predominan los enlaces no polares, generalmente son insolubles en agua. Las moléculas de agua no son atraídas por estas moléculas y tienden a aislarlas. • Los hidrocarburos que contienen muchos enlaces C-H, son especialmente hidrófobos

Comportamiento de las moléculas en el agua

Moléculas Hidrofílicas

Las moléculas que poseen carga – o + (iones) se disuelven con facilidad en el agua (azucares, DNA, RNA y proteínas). Las sustancias polares se disuelven porque sus moléculas forma enlaces de hidrógeno con las moléculas de agua que la rodean

Fuentes de ADN

Purificación DNA Genómico

Bacterias

Cells. Mamíferos

Cells. Vegetales

Hongos Virus

Etapas:!1. -Rompimiento Celular!2. -Eliminación de Contaminantes!3. -Concentración

Extracción de DNA Genómico

Células Eucariotas Células Procariotas

1.- Rompimiento Celular: (Tris-HCl pH 8.0, EDTA 1mM, Sacarosa o Glucosa)

Incubación con Detergente (SDS)

Congelamiento en N2 Líquido (-196° C)

Mecánico Uso de Enzimas (Vegetales, Hongos, Bacterias)

2.- Eliminación de Contaminantes:

Proteínas (proteinasa K + SDS)

Fenol Saturado pH 8.0 ó neutro

Centrifugación

Fenol:Cloroformo

RNA (Ribonucleasa A)

Fenol

2.- Concentración:

Etanol Absoluto

Gel Electroforesis

3.-

Etapas:!1. -Rompimiento Celular!2. -Eliminación de Contaminantes!3. -Concentración

Extracción de DNA Plasmidial

PLASMIDIOS:

Método Lisis Alcalina (mini-prep)

Sol. 1 Glucosa / Tris HCl pH 8.0 / Glucosa

Sol. 2 NaOH / SDS

Sol. 3 Acetato de Potasio

Precipitación: Isopropanol

o

Extracción de DNA Plasmidial

RNA: - Principal problema es la degradación

- DEPC (Diethylepyrocarbonate)

- Buffers sin Alcali

- Cuidado con RNAsa !!!

Precipitación:

- Etanol 95% O.N.

- Fenol/cloroformo

- Trizol

- Aislamiento mRNA

RNA: - Principal problema es la degradación

- DEPC (Diethylepyrocarbonate)

- Buffers sin Alcali

- Cuidado con RNAsa !!!

Precipitación:

- Etanol 95% O.N.

- Fenol/cloroformo

- Trizol

- Aislamiento mRNA

RNA: - Principal problema es la degradación

- DEPC (Diethylepyrocarbonate)

- Buffers sin Alcali

- Cuidado con RNAsa !!!

Precipitación:

- Etanol 95% O.N.

- Fenol/cloroformo

- Trizol

- Aislamiento mRNA

RNA: - Principal problema es la degradación

- DEPC (Diethylepyrocarbonate)

- Buffers sin Alcali

- Cuidado con RNAsa !!!

Precipitación:

- Etanol 95% O.N.

- Fenol/cloroformo

- Trizol

- Aislamiento mRNA

Métodos de extracción:

-Isopropanol

Extracción de RNA

Trizol:

- Solución monofásica del fenol e isotiocianato de guanidina.

- Mantiene integridad de RNA mientras rompe a las células

- Disuelve otros componentes celulares

- RNA permanece en fase acuosa despues de agregar Cloroformo

- Precipitar con Isopropanol

Extracción de RNA utilizando Trizol

- Cuantificación:

-Absorbancia 260nm 40 x O.D.260 = [ ] RNA µg/mL

50 x O.D.260 = [ ] DNA mg/mL

Relación de pureza:

260/280 RNA 1.8 ± 0.15

DNA 2.0 ± 0.15

-Geles

Una vez extraídos los ácidos nucleicos es necesario cuantificarlos

Cuantificación de ácidos nucleicos por espectofotometría

Secuenciación del DNA

Enzimas de restricciónNucleasas de restricción: cortan los enlaces fosfodiester de los ácidos nucleicos

(EXONUCLEASAS O ENDONUCLEASAS)

1. Tipo I y Tipo III: a. Tienen actividad de restricción (cortan) y modificación (metilan). b. Cortan a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento, las Tipo I cortan lejos de la

secuencia de reconocimiento, ya sea río arriba o río abajo. Las Tipo III cortan de 5-8 bases antes o después de la secuencia que reconocen.

c. Necesitan ATP para moverse a través de la molécula de DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio del corte.

2. Tipo II:

a. Sólo tienen actividad de restricción. b. Cortan de manera consistente y predecible dentro de la secuencia que reconocen. c. Sólo requieren Mg++ como cofactor. d. No necesitan ATP.

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN * Se aislaron de bacterias (donde su función es destruir DNA no propio).

* Reconocen secuencias PALINDRÓMICAS específicas de DNA (de 4, 6 u 8 pb) y cortan en lugares concretos.

Romos Cohesivos

* Generan extremos ROMOS o COHESIVOS.

Aplicaciones de las enzimas de restricción: !

1. Hacer mapa de restricción de un fragmento DNA. 2. Fragmentar DNA genómico para separación de

electroforesis y “Southern Blot”. 3. Generación de fragmentos para ser usados como sondas

marcadas en “Southern”y “Northern” blotting. 4. Generación de fragmentos para ser subclonados en los

vectores apropiados, creación de DNA recombinante.

Mapa de restricción

B15 8

AA1 5.5 1.5

A

105

Electroforesis

Sondas

Una sonda es un objeto de manipulación remota cuya misión es llegar a un objetivo prefijado y realizar algún tipo de acción o mandar información.

¿Qué  es  una  sonda  en  biología  molecular?                  Una   sonda  es  un   fragmento  monocatenario  de  DNA  o  RNA  marcado   con   una   molécula   reportera,   y   que   se   emplea   para   el  reconocimiento   específico   de   una   molécula   determinada   de   ácido  nucléico  diana  de  cadena  sencilla,  en  un  proceso  de  hibridación.  !        Existen  tres  Dpos  de  sonda  de  ácidos  nucleicos:  !-­‐  Fragmentos  de  DNA  -­‐  Fragmentos  de  RNA  -­‐  OligonucleóDdos  sintéDcos  u  oligosondas.  

Sondas de Acidos Nucleicos!

El uso de las sondas se basa en el descubrimiento (década del 60)!!!

es posible hibridar ácidos nucleicos en función de la complementariedad de sus secuencias de nucleótidos !

La doble cadena del ADN ha sido abierta

(desnaturalizada)

la sonda se va uniendo por reconocimiento de las bases complementarias.

Sondas “Calientes”

* Isotopos Radioactivos tanto de emisión alfa como beta: tritio, fósforo-32, azufre-35 o iodo-125

Autorradiografía

ADN

Isotopo radioactivo

Sondas “Frías”

Actualmente existen diversas alternativas no radiactivas para marcar las sondas,

1) enzimas (peroxidasa o fosfatasa que llevan a cabo una reacción detectable )

2) marcadores de afinidad (biotina o digoxigenina, que se van a unir posteriormente a otra molécula)

3) moléculas Quimioluminiscentes Y Fluorescentes (que producen luz y puede excitar una película fotográfica).

Tipos de Hibridación

Hibridación en Fase Líquida

EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay)

Si hay más sitios de unión...

Especificidad de la interacción

Competidor

Supershift

Hibridación en Soporte Sólido

DNA arrays: es una superficie sólida a la cual se unen una serie de fragmentos de ADN. Las superficies empleadas para fijar el ADN son muy variables y pueden ser vidrio, plástico e incluso chips de silicio. Los arreglos de ADN son utilizadas para averiguar la expresión de genes, monitorizandose los niveles de miles de ellos de forma simultanea.

Microarreglos

!!

Esta modalidad permite localizar en forma muy precisa, a nivel de la célula o de sus componentes, las secuencias específicas complementarias

de la sonda empleada

Hibridación in situ

Las sondas son puestas directamente en contacto con preparados citológicos o histológicos

Virus Papiloma Humano Tipo II

In Situ Hibridization

In Situ Hibridization in zebrafish

FISH  (Fluorescent  in  situ  hybridizaDon  )Es   una   técnica   citogenéDca   que   puede   ser   uDlizada   para   detectar   y   localizar   la  presencia   o   ausencia   de   una   secuencia   específica   de   DNA   en   un   cromosoma.   Se  uDliza  sondas  fluorescentes  que  se  unen  sólo  a  aquellas  partes  del  cromosoma  con  el   que   muestran   un   alto   grado   de   similitud   de   secuencia.   La   microscopía   de  fluorescencia   se   puede   uDlizar   para   averiguar   donde   la   sonda   fluorescente   se   ha  unido   al   cromosoma.   FISH   se   uDliza   a   menudo   para   encontrar   caracterísDcas  específicas   en   el   ADN.   Estas   caracterísDcas   se   pueden   usar   en   el   asesoramiento  genéDco,  la  medicina  y  la  idenDficación  de  especies.

Southerns  y    Northerns:    Técnicas  de  Búsqueda  Molecular.

1)DNA-­‐DNA.  Un  ADN  sonda  de  DNA  de  cadena  sencilla  (ssDNA)  puede  formar  un   híbrido   de   cadena   doble   al   aparearse   con   un   DNA   objeDvo   de   cadena  simple,   esto  ocurre   si   la   secuencia  de   la   sonda  es  el   complementaria   y  de  orientación  inversa  a  la  secuencia  diana.  

!  2)  DNA-­‐RNA.  Una  sonda  de  DNA  de  cadena  sencilla  (ssDNA)  puede  formar  un  

híbrido   de   cadena   doble   al   aparearse   con   un   RNA   objeDvo   de   cadena  simple   (el   RNA   usualmente   es   de   cadena   simple),   esto   ocurre   si   la  secuencia  de   la   sonda  es  el   complementaria  y  de  orientación   inversa  a   la  secuencia  diana.  

!•-­‐  Electroforesis  en  gel  •-­‐  Transferencia  a  un  soporte  sólido  •-­‐  Bloqueo  •-­‐  Preparar  la  sonda  •-­‐  Hibridación  •-­‐  Lavados  •-­‐  Detección del híbrido de sonda-objetivo

Etapas  de  un  Southern  y    Northern

Southern  Blot   DNA  se  corta  con  enzimas  de  restricción-­‐  sonda  con  DNA  marcado

Northern Blot (RNA)

!!Northern  Blot  RNA-­‐  sonda  con  DNA  o  RNA  marcado

RNA Sonda