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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEBAJA CALIFORNIA SUR
`REA INTERDISCIPLINARIA DE CIENCIAS DEL MAR
Departamento de Biología Marina
ACTIVIDAD ENZIM`TICA ANTIOXIDANTE EN
TEJIDOS DE FOCA ANILLADA Phoea hispiday DE CERDO COMÚN Sus serofa
TESIS
QUE PARA OBTENER EL T˝TULO DE
BIÓLOGO MARINO
PRESENT A
JosØ Pablo VÆzquez Medina
La Paz Baja California Sur MØxico Septiembre de 2004
OTEC
l rl 1 c
vJI
UNIVERSIDAD AUTÓNOMADE
BAJA CALIFORNIA SURApartado Postal 19 B
Codigo Postal 23080
La Paz B C S
Tds 1238800 el 14100
Fax 123 88 19
INTERDISCIPLINARlADE CIENCL S DEL MAR
fkpartarnento de Biología Marina
Fecha O 3 Otj
M EN C EMELIO BARJAU GONZALÉZJEFE DEL DEPARTAMENTO DE BIOLOG˝A MARINA
PRESENTE
Los abajo fIrmantes comunicamos a Usted que habiendo revisado el Trabajo de Tesis querealizó el pasante JcJi ctlr o JŒ qLt ï ZÖ ˆ
Con el Titulo l Þc hJ9dcdb ŒiVv 6YCCt ˜ 4Jì í ScìoV cL
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Otorgamos nuestro voto aprobatorio y consideramos que dicho TrabaJdefensa a fin de obtener el título de Biólogo Marino
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PRESIDENTE
SECRETARIO
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Nombre Completo
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Nombre Completo
DIRECTOR
cc p Coordinador del Area Interdisciplinaria de Ciencias del 1ar
cc p Director del Servicios E5Clares
cc p Interesado
Dedicado con todo mi cariæo a mis papÆs y a mis hermanos el regalo
mÆs grande que me dio la vida
Agradecimientos
Agradezco al CONACyT y al CIBNOR por financiar esta investigación y por
otorgarme una beca para realizar este trabajo
Gracias al Dr Robert Elsner de la Universidad de Alaska Fairbanks al North
Slope Borough Department of Wildlife Management y a los cazadores de subsistencia
Inupiat de Barrow AK E U A por su ayuda para obtener las muestras de foca
anillada que fueron colectadas bajo los tØrminos del permiso otorgado por US Nacional
Mame Fisheries Service al Dr Robert Elsner UAF y traídas a MØxico b o los
lineamientos del permiso de importación otorgado por el Instituto Nacional de Ecología
a la Dra Tania Zenteno Savín TambiØn se agradece al Dr JosØ María Acosta Farías y
al personal del rastro municipal de La Paz B C S MØxico por su ayuda en la
obtención de las muestras de cerdo
Quiero darle las gracias ami comitØ revisor Dra Tania Zenteno Savín gracias
por tu confianza tu tiempo tu apoyo incondicional tus consejos tus enseæazas tu
amistad y por permitirme ser parte de tu grupo de trab o Dr Jorge UrbÆn Ramírez M
en C Sergio Flores Ramírez y M en C Renato Peæa Martínez gracias por sus
comentarios y por sus enseæanzas en el salón de clase M en C Paloma Alejandra
Valdivia JimØnez gracias por contestar todas mis dudas gracias por tus consejos y sobre
todo gracias por ser mi amiga
Gracias al grupo de estrØs oxidativo del CIBNOR Tania Zenteno Juan
Larrinaga Jorge del Angel Juan Carlos PØrez Estrellita Clayton Paloma Valdivia
Mauricio Ahuejote Mariana Morales Katina Ramírez Norma Olguín Orlando Lugo
Nadia Cantœ Pedro Reyes Beto López María Eugenia Morales Marisol Medina y
Perla Escobar por sus comentarios y su compaæía en el laboratorio Gracias tambiØn a
los laboratorios de Bioquímica fisiológica y de Edafología del CIBNOR
Gracias a todos mis valientes compaæeros que me aguantaron durante ocho
largos semestres gracias tambiØn a los que hicieron el intento
Gracias a mis amigos por apoyarme incondicionalmente Dieguito gracias por
recordarme que a veces una cervecita es mÆs que necesaria Poli gracias por tantas
anØcdotas que tengo para contarle a mis nietos GØraldine gracias por tu cariæo Pablo
Tetey Adolfo Joel Mariana Oliver Bubu Natalia Marina IvÆn Coco Lucías
gracias por su eterna compaæía León gracias por enseæarme que se puede ser feliz
todos los días de la vida te vamos a extraæar amigo Meli y JosØ gracias por sus
consejos y por los buenos ratos Orso gracias por tener las puertas de tu casa abiertas
aœn despuØs del horario de oficina Liza muchas gracias por tu paciencia por
preocuparte por mi por cuidarme y por ayudarme siempre
Por œltimo quiero darle las gracias a mi familia por todo el apoyo que me dieron
para estudiar lo que me gusta y para hacer este trabajo PapÆs gracias por todo su amor
Oli gracias por ser el mejor ejemplo JosØ Antonio gracias por darme la energía
necesaria para seguir adelante
Contenido
Lista de Figuras 111
Lista deTablas
N
GlosarioV
Lista deAbreviaturas
VI
ResumenVIII
Abstract IX
Introducción 1
Antecedentes 9
Justificación 11
Hipótesis11
Objetivo General12
Objetivos Particulares 12
Material y MØtodos13
Obtención de muestras 13
AnÆlisisbioquímicos
13
Preparación de las muestras 14
Superóxido dismutasa14
Catalasa14
Glutatión Stransferasa
15
Determinación de proteínas 15
AnÆlisis estadísticos 16
Resultados17
Comparaciones entre tejidos de cada especie 17
Foca anillada 17
I
Cerdocomœn
19
Comparaciones por tejido entre especies 21
Corazón21
Riæón 23
Hígado25
Pulmón27
Mœsculo29
Discusión31
Comparaciones entre tejidos de cadaespecie
31
Foca anillada 31
Cerdocomœn
33
Comparaciones por tejido entre especies 35
Corazón 35
Riæón 38
Hígado 39
Pulmón41
Mœsculo 43
Conclusiones 45
Perspectivas47
Literatura citada 48
Anexos 57
11
Lista de Figuras
Figura 1 Producción de espeCIes reactivas de oxígeno durante la reducción
monovalente del oxígeno molecular 4
Figura 2 Eventos bioquímicos durante la isquemia y la reperfusión 5
Figura 3 Sistemas de producción y eliminación de las especies reactivas de oxígeno 6
Figura 4 Acción catalítica de la enzima superóxido dismutasa7
Figura 5 Descomposición del peróxido de hidrógeno en agua por acción de la enzima
catalasa 7
Figura 6 Acción catalítica de la enzima glutatón S transferasa 8
Figura 7 Actividad de las enzimas superóxido dismutasa catalasa y glutatión S
transferasa en tejidos de focaanillada
18
Figura 8 Actividad de las enzimas superóxido dismutasa catalasa y glutatión S
transferasa en tejidos de cerdo comœn 20
Figura 9 Actividad de las enzimas superóxido dismutasa catalasa y glutatión S
transferasa en corazón de foca anilIada v de cerdocomœn
22
Figura 10 Actividad de las enzimas superóxido dismutasa catalasa y glutatión S
transferasa en riæón de foca anillada y de cerdocomœn
24
Figura 11 Actividad de las enzimas superóxido dismutasa catalasa y glutatión S
transferasa en hígado de foca anillada y de cerdo comœn 26
Figura 12 Actividad de las enzimas superóxido dismutasa catalasa y glutatión S
transferasa en pulmón de foca anillada y de cerdocomœn
28
Figura 13 Actividad de las enzimas superóxido dismutasa catalasa y glutatión S
transferasa en mœsculo de foca anillada y de cerdo comœn 30
III
Lista de Tablas
Tabla 1 Actividad de las enzimas antioxidantes en tejidos de foca anillada 17
Tabla II Actividad de las enzimas antioxidantes en tejidos de cerdocomœn
19
Tabla III Datos de colecta de tejidos de foca anillada 57
Tabla IV Datos de colecta de tejidos de cerdo comœn 58
IV
Glosario
Acidosis acumulación de iones HT
Actividad enzimÆtica velocidad con la que una enzima transforma su sustrato en un
producto
Antioxidantes molØculas que contrarrestan alos oxidantes
Apnea suspensión de la ventilación pulmonar
Asfixia conjunción de hipoxia hipercapnia y acidosis
Bradicardia disminución del ritmo cardiaco
Daæo oxidativo trastorno celular ocasionado por especies reactivas de oxígeno
Dismutación reacción en la cual el producto es obtenido por reducción uoxidación del
mismo Ætomo o molØcula
Especies reactivas de oxígeno molØculas de existencia independiente con uno o mÆs
electrones desapareados en su œltimo nivel de energía
EstrØs oxidativo condición fisiopatológica originada cuando la tasa en la producción de
especies reactivas de oxígeno es mÆs alta que la tasa de descomposición de las mismas
Hipercapnia incremento en la concentración de dióxido de carbono
Hipoxia disminución en la concentración de oxígeno
Isquemia suspensión del flujo de sangre oxigenada
Peroxidación lipídica incorporación de oxígeno a lípidos insaturados
Reoxigenación reestablecimiento de las concentraciones de oxígeno
Lista de Abreviaturas
AOX Capacidad antioxidante total
ASB Albœmina sØrica bovina
ATP Adenosín trifosfato
CAT Catalasa
CDNB 1 cloro 24 dinitrobenceno
C02 Dióxido de carbono
Cu Zn SOD Superóxido dismutasa dependiente de cobre y zinc
dH20 Agua destilada
A Cambio en la absorbancia por minuto
Ec SOD Superóxido dismutasa extracelular
EROs Especies reactivas de oxígeno
e Electrón
Fe SOD Superóxido dismutasa dependiente de hierro
GPx Glutatión peroxidasa
GR Glutatión reductasa
GSH Glutatión reducido
GSSG Glutatión oxidado
GST Glutatión S transferasa
G6PDH Glucosa 6 fosfato deshidrogenasa
HGPRT Hipoxantina guanina fosforibosil transferasa
HIF Factor inducible por hipoxia
HSP Proteínas de choque tØrmico
HX Hipoxantina
H20 Agua
VI
H202 Peróxido de hidrógeno
H Protón
IMP Inosínmonofosfato
M Molar
mM Milimolar
MDA Malondialdehído
Mn SOD Superóxido dismutasa dependiente de manganeso
NBT Nitroazul de tetrazolio
NADPH Dinucleótido de nicotinamida y adenina fosforilado reducido
NADP Dinucleótido de nicotinamida y adenina fosfatado
OH Radical oxhidrilo
02 Oxígeno molecular
Oi Radical superóxido
PUFAs Acidos grasos poliinsaturados
SH Sulfuidrilo
SOD Superóxido dismutasa
U mg proteína Unidades por miligramo de proteína
XDH Xantina deshidrogenasa
XO Xantina oxidasa
vn
Resumen
En los fócidos la disminución del ritmo cardíaco y la distribución preferencial
del flujo de sangre oxigenada hacia el corazón y el cerebro mediante una
vasoconstricción perifØrica traen como consecuencia isquemia selectiva en los tejidos
mÆs tolerantes ahipoxia Con la primera respiración despuØs del buceo se reestablece el
flujo de sangre oxigenada hacia todos los tejidos y se eleva sustancialmente la potencial
producción de especies reactivas de oxígeno EROs Se cree que para contrarrestar los
efectos daæinos de las EROs y tolerar ciclos repetitivos de isquemialreperfusión
derivados del buceo los tejidos de foca anillada Phoca hispida tienen actividades
elevadas de las principales enzimas antioxidantes Se midió la actividad de las enzimas
superóxido dismutasa SOD catalasa CAT y glutatión S transferasa GST usando
espectrofotometría en extractos de corazón riæón hígado pulmón y mœsculo de foca
anillada y de cerdo comœn Sus seroja que fueron usados como control Se
encontraron diferencias significativas p O 05 en la actividad de las tres enzimas entre
ambas especies En el corazón de foca la actividad de SOD p O OI y de GST p O 05
fue mÆs elevada que en el corazón de cerdo En el tejido hepÆtico la actividad de CAT
fue mÆs alta en la foca p O OI y la de GST p O 05 en el cerdo La actividad de SOD
fue mÆs elevada en el pulmón de foca que en el de cerdo p O 05 mientras que la
actividad de CA T fue mÆs alta en el pulmón de cerdo p O 05En el tejido muscular la
actividad de CAT fue mÆs alta en el cerdo p O 05 Estos resultados sugieren que en el
corazón de foca anillada la actividad de SOD y de GST es un mecanismo de defensa
eficiente contra las EROs que en el tejido hepÆtico de foca CAT participa de manera
importante en la remoción de los hidroperóxidos y que SOD protege al pulmón de foca
del daæo oxidativo
VIII
Abstract
In phocid seals heart rate reduction and preferential distribution of the
oxygenated blood flow to the heart and the brain by a widespread vasoconstriction
produce as a consequence selective ischemia in the most hypoxia tolerant tissues The
first breath after the dive restores the oxygenated blood flow to all tissues and raises the
potential for the production ofreactive oxygen species ROS It is thought that in order
to counteract the damaging effects of ROS and to tolerate repetitive cycles of
ischemia reperfision associated to diving ringed seal Phoca hispida tissues have
elevated activities of the main antioxidant enzymes Enzymatic activity of superoxide
dismutase SOD catalase CAT and glutathione S transferase GST using
spectrophotometric assays in heart kidney liver lung and muscle extracts of ringed
seal and domestic pig Su s serofa used for comparision was measured Significant
differences p O 05 in the enzyme activities between both species were found In seal
heart SOD p O OI and GST p O 05 activities vere higher than in pig heart In
hepatic tissue CAT actiYity was higher in seal p O 05 than in pig and GST activity
was higher in pig p O 05 than in seal SOD activity was higher in seal p O 05 than in
pig lung CAT activity was higher in pig lung p O 05 In muscle CAT activity was
higher in pig than in seal These results suggest that in ringed seal heart SOD and GST
activities are an efficient protective mechanism to counteract ROS effects Furthermore
in seal hepatic tissue CAT participates importantly in the remove of hydroperoxides
and seallung is protected from oxidative damage by SOD activity
IX
Introducción
La foca anillada Phoca hispida pertenece a la subfamilia Phocinae que incluye
a todas las focas que viven en el hemisferio norte excepto las focas monje y el elefante
marino del norte Riedman1990 Los miembros de las subfamilias Phocinae y
Monachinae componen a la familia Phocidae que agrupa todas las focas y conforma a
la superfamilia Phocoidea del suborden Pinnipedia Øste incluye tambiØn a lobos
marinos lobos finos y morsas clasificados en la superfamilia Otaroidea dentro del
Orden Carnívora Riedman 1990 Reynolds III et al 1999
Se reconocen cinco subespecies de foca anillada 1 P hispida hispida Schreber
1975 que vive en las costas Ærticas de Rusia Europa CanadÆ y Alaska 2 P hispida
ockhotensis PalIas 1811 que se distribuye en el mar de Ockhostk en la costa norte de
Japón 3 P hispida botnica Gmelin 1758 distribuida en los golfos de Finlandia y de
Bothnia 4 P hispida ladogensis Nordquist 1899 y P hispida saimensis Nordquist
1899 que iven en los lagos Ladoga y Samara respectivamente King 1983 Riedman
1990
P hispida es la foca mÆs pequeæa y mÆs abundante de todo el Ærtico su
población se compone de aproximadamente 75 millones de individuos King 1983
Riedman 1990 Reeves et al 2002 Al nacer la foca anillada mide alrededor de 65 cm
y pesa entre 4 y 4 5 kg de adulto mide de 1 1 a 1 5 m y pesa entre 50 y 70 kg Harris
1991 Las hembras son de tamaæo ligeramente menor al de los machos la coloración
de los adultos es de tonos grises parecidos a los de la foca comœn P vitultna pero con
marcas irregulares en forma de anillos en la espalda King 1983 Reeves et al 2002
La foca anillada no forma grupos durante el invierno pasa largos períodos de
tiempo en el mar por debajo del hielo En verano la mayoría reposa sobre el hielo
Kingsley 1990 Los cachorros nacen entre Marzo y Abril en madrigueras que las
1
madres cavan en el hielo son de color blanco y se alimentan de leche materna durante
casi cinco semanas King 1983 Reeves et al 2002 en este período son vulnerables a
la depredación principalmente del oso polar y de la zorra del Ærtico por lo que la tasa
de supervivencia de las focas jóvenes es muy baja las crías que sobreviven pasan gran
parte de su tiempo en el agua aprendiendo a bucear Riedman 1990
La temporada de apareamiento coincide con el periodo de lactancia entre Abril
y Mayo Las hembras alcanzan la madurez sexual a los cinco aæos y los machos a los
siete La cópula se lleva a cabo en el mar El período de gestación dura alrededor de
ocho meses Frost y Lowry 1981 King 1983 Atkinson 1997
La alimentación de P hispida varía dependiendo de la temporada y de la
distribución geogrÆfica Riedman 1990 Se han identificado 72 especies de presas en
los contenidos estomacales de foca anillada King 1983 destacando el bacalao azafrÆn
Eleginus gracilis el del Ærtico Boreogadus saida y varias especies de crustÆceos
como el anfipodo Parathemisto sp Frost y Lowry 1981 King 1983
Para conseguir su alimento P hispida tiene la capacidad de bucear por períodos
de hasta 25 minutos Elsner et al 1998 en los que experimenta asfixia progresiva es
decir la conjunción de a la disminución en la concentración de oxígeno hipoxia b
el incremento en la concentración de di óxido de carbono COz hipercapnia y c la
acumulación de iones hidrógeno acidosis Elsner y Gooden 1983 Debido a esta
situación las focas que bucean tienen que resolver el problema de hacerlo con
concentraciones limitadas de oxígeno y evitando exceder los límites del metabolismo
aerobio para no intoxicarse con concentraciones altas de lactato y dióxido de carbono
Kooyman y Ponganis 1998 aunque en ocasiones extremas las focas buceadoras son
capaces de utilizar el metabolismo anaerobio Elsner 1999 Davies y Kanatous 1999
2
Las adaptaciones fisiológicas mås importantes que han desarrollado los fócidos
para maximizar el uso de las reservas de oxígeno en la sangre y en los tejidos durante un
buceo incluyen concentraciones altas de hemoglobina y mioglobina así como
contenidos mitocondriales y volœmenes sanguíneos elevados Kooyman y Ponganis
1998 Kanatous et al 1999 Elsner 1999 Kanatous et al 2002Ademås existen
mecanismos del sistema cardiorespiratorio que se conocen en conjunto como respuesta
al buceo y consisten en suspender la ventilación pulmonar apnea disminuir el ritmo
cardíaco bradicardia y dirigir el flujo sanguíneo principalmente hacia el cerebro y el
corazón mediante una vasoconstricción perifØrica Kooyman y Ponganis 1998 Elsner
1999 Esto œltimo trae como consecuencia directa isquernia suspensión del flujo
sanguíneo selectiva en los tejidos mÆs tolerantes a hipoxia Gooden y Elsner 1985
DespuØs de un buceo con la primera respiración se eliminan los metabolitos
acumulados y se reestablece el flujo de sangre y de oxígeno hacia todos los tejidos lo
que se conoce como reperfusión y reoxigenación respectivamente Elsner 1999
El fenómeno de isquemia reperfusión rutinario para focas buceadoras ha sido
identificado como uno de los problemas de estudio fundamentales para la ciencia
mØdica Las enfermedades asociadas a isquemialreperfusión por ejemplo infartos y
embolias entre otras estÆn consideradas como algunas de las causas principales de
muerte en las sociedades occidentales ya que la isquerniareperfusión induce la
producción de especies reactivas de oxígeno EROs y puede desencadenar estrØs
oxidatiyo El estrØs oxidativo es una condición fisiopatológica originada cuando la tasa
de producción de EROs excede a la tasa de descomposición de las mismas Halliwell y
Guteridge 2001
Las EROs son molØculas de existencia independiente con uno o mÆs electrones
desapareados en su œltimo nivel de energía Se forman en todas las cØlulas aerobias
3
durante la reducción monovalente del oxígeno Fig 1 que ocurre de manera natural en
la cadena de transporte de electrones Halliwell y Guteridge 200 1
O þ
e 2Ir e ttrþ H
e HÞ OH H O þ H O
e
Figura l Producción de especies reactivas de oxígeno durante la reducción
monovalente del oxígeno molecular Fridovich 1998
La pnmera reducción del oxígeno molecular produce al radical superóxido
02 anión que puede difundirse ampliamente por las cØlulas y que es precursor del
peróxido de hidrógeno H202 que a su vez da lugar al radical oxhidrilo OH
considerado como el mÆs daæino para los sistemas biológicos ya que puede reaccionar
con carbohidratos lípidos proteínas y Æcidos nucleicos Hennes Lima et al 200 1
Halliwell y Guteridge 200 1
Existen eventos bioquímicos en los tejidos isquØmicos que promueven la
producción de EROs durante la reoxigenación Fig 2 como son a el aumento en las
tasas de degradación del glucógeno y glucólisis lo que induce la producción de lactato
y la acidosis b la disminución de los niveles de adenosín trifo5fâto ATP provocando
la acumulación de hipmantina HX que es el sustrato de la enzima xantina oxidasa
XO que produce ü y c la dismpción de la homeostasis iónica que eleva ˛os nìveîes
de calcio activa lipasas proteasas calciodependientes que convierten a la enzima
xantina deshidrogenasa XDH en XO Hermes Lima et ai 998 IlaîîìweIl y
Guteridge 200 I
Durante la reoxigenación la XO producida por los eventos bioquímicos durante
la isquemia cata 1 iza la unión de oxígeno molecular con IIX generada tambiØn durante
la isquemia dando lugar a la producción de Æcido Úrico y 0 que a su vez puede
4
promover la síntesis de H202 o combinarse con Øl y originar radicales OR en presencia
de cobre o hierro Fig 2 Hennes Lima etal
1998 Halliwell y Guteridge 201
Isquemia Xantina deshidorgenasa
ATP ADP AMPadenoslna Proteasas calcio
dependientes
Inos111a
llipoxantina Xantina oxidasa
ReperfusiÓn
O2 xantilla luato H202
BFigura 2 Eventos bioquímicos durante la isquemia y la reperfusión Modificado de
Halliwell y Guteridge 200 1
La producción de EROs derivada de los ciclos continuos de
isquemialreperfusión es contrarrestada por mecanismos fisiológicos de defensa que
pueden organizarse en tres grandes grupos 1 la inhibición de mecanismos generadores
5
de EROs 2 los sistemas reparadores de dafto y 3 la actividad de las enzimas
antioxidantes y otras molØculas antioxidantes no enzimÆticas Zenteno Savín 2002
Los antioxidantes enzimÆticos son el primer mecanismo de defensa contra las EROs en
los tejidos isquØmicos ya que estÆn involucrados directamente en las reacciones en
cadena que las producen Fig 3 Hermes Lima et al 2001 Halliwell y Gutteridge
2001 Hermes Lima y Zenteno Savín 2002
IbïOoxíd rinlI l 11 11 011 HI
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J llfin oxídnri o
Figura 3 Sistemas de producción y eliminación de las especies reactivas de oxígeno O2oxígeno molecular Oi radical superóxido H202 peróxido de hidrógeno OH
radical oxhidrilo H20 agua SOO superóxido dismutasa CAT catalasa GPX
glutatión peroxidasa GST glutatión S transferasa GSSG glutatión oxidado GSH
glutatión reducido G6POH glucosa 6 fosfato deshidrogenasa NADPHdinucleótido de nicotinamida y adenina fosforilado reducido NADP dinucleótido de
nicotidamida y adenina fosfatado Modificado de Hermes Lima et al 200 1
La superóxido dismutasa EC 115 1 1 SOO es una metaloenzima que se
presenta en tres isoformas mitocondrial citosólica y bacteriana Hermes Lima et al
2001 La forma mitocondrial Mn SOD utiliza manganeso como cofactor la forma
citosólica CuZn SOO utiliza cobre y zinc y la forma bacteriana Fe SOD hierro
Ahmad et al 1995 Fridovich 1998 Se ha identificado tambiØn una forma
6
extracelular EC SOD que utiliza cobre y zinc como cofactores Haliwell y Guteridge
2001
La SOD es el primer mecanismo de defensa contra las EROs su función es
catalizar la dismutación del Û2 en H2Û2 y oxígeno molecular Fig 4 McCord y
Fridovich 1969 Pippenger et al 1998
20 2ft son H202 02
Figura 4 Acción catalítica de la enzima superóxido dismutasa SOD McCord yFridovich 1969
La catalasa EC 1 11 1 6 CAT es una proteína con un grupo fØrrico unido a su
sitio activo que se encuentra en el citosol y en los peroxisomas y cuya función principal
es la de regular los niveles de H202 Fig 5 para evitar la producción de OH cuando el
H2Û2 se combina con hierro cobre reacción de Fenton o Û2 reacción de Haber
Weiss Halliwell y Gutteridge 2001 No existe ninguna enzima que regule los niveles
de OH por lo que la catalasa desempeæa un papel fundamental en el metabolismo
oxidativo Fig 3 Pippenger etal
1998
11 1 01 1e T H20 02
Figura 5 Descomposición del peróxido de hidrógeno H20Z en agua por acción de la
enzima catalasa CAT Aebi 1984
La CAT tambiØn actœa en reacciones peroxidativas en las que estÆn involucrados
sustratos que donan hidrógeno como metano etanol y fenoles Aeb 1984 Pippenger
etal 1998
7
La glutatión S transferasa BC 2 5 118 GST es una enzima que cataliza los
procesos de detoxificación al conjugar xenobióticos con glutatión reducido GSH Fig
6 Jakoby 1985 Esta enzima es muy importante en el metabolismo oxidativo debido a
que la toxicidad de muchos xenobióticos estÆ mediada por la foonación de EROs
Martínez Cayuela 1998
GSH xenobióticoGST
þ GSH xenobiótico conjugado
Figura 6 Acción catalítica de la enzima glutatón S transferasa GST Habing y Jakoby1981
Específicamente GST cataliza el ataque nucelofilico del Ætomo de azufre del
glutatión reducido en un segundo sustrato La GST se localiza en el citoplasma en el
nœcleo y en la superficie celular Existen cinco clases de GST f1 11 e y o que se
expresan selectivamente dependiendo del tipo de detoxificación que el tejido requiera
Tsuchida 2000 TambiØn se ha reportado que GST tiene actividad acarreadora de
muchos compuestos al actuar como ligandina Habing y Jakoby 1981
8
Antecedentes
Se sabe que los tejidos de foca toleran exposición a isquemia y reoxigenación
Elsner et al 1995 compararon la respuesta de riæones aislados de foca y de perro a
condiciones de isquemia experimental y observaron que la capacidad de recuperación es
mucho mayor en los riæones de foca que en los de perro Concluyeron que existe un
incremento sustancial en la concentración de HX un generador de radicales libres
cuando los tejidos renal y cardíaco de foca son sometidos a isquemia Sin embargo
existen pocos estudios del sistema de defensa antioxidante en mamíferos marinos
Elsner et al 1998 midieron la actividad de SOD y la producción de HX en
corazón y riæón de foca anillada y de cerdo comœn Sus seroja sometidos a isquemia
experimental encontrando mayor actividad enzimÆtica en el corazón de foca y en el
riæón de cerdo y mayor producción de HX en los extractos tisulares de cerdo Zenteno
Savín y Elsner 1998 encontraron mayor producción de O en el riæón que en el
corazón de foca anillada y niveles de peroxidación lipídica mucho mÆs bajos de lo que
se esperaba a partir de esos niveles de Oi por lo que sugieren que la producción de O2
es insuficiente para provocar un daæo en los tejidos de foca o bien que Østos tienen una
capacidad antioxidante elevada que les permite contrarrestar los efectos de las EROs
En el 2000 Zenteno Savín y Elsner encontraron que la producción de Oi es
mÆs alta en el mœsculo que en el riæón y en el riæón que en el corazón de foca anillada
que los niveles de peroxidación lipídica son mÆs altos en el mœsculo que en el rmón y
en el corazón de foca anillada y que la capacidad antioxidante total AOX no difiere
significativamente entre los tejidos estudiados Los autores proponen que el mecanismo
de defensa contra las EROs estÆ relacionado con el grado de perfusión que es diferente
para cada tejido durante un buceo Zenteno Savín y Elsner 2000
9
Zenteno Savín et al 2002 compararon la producción de 02 los niveles de
peroxidación lipídica y la AOX entre tejidos de foca anillada y de cerdo comœn y
encontraron que la elevada AOX en tejidos de foca anillada minimiza notablemente el
daæo oxidativo pese a la alta producción de Ch y proponen a las focas que bucean como
un modelo para entender las adaptaciones que permiten tolerar ciclos repetitivos de
isquemialreperfusión asociados al buceo
Wilhelm Filho et al 2002 encontraron mayor actividad de SOD CAT GST y
niveles de glutatión mÆs altos en la sangre de un grupo de especies de mamíferos
buceadores que en la de un grupo de especies de mamíferos terrestres y concluyeron
que en general los mamíferos que bucean presentan un incremento en las defensas
antioxidantes en comparación con los mamíferos no buceado res sin embargo a la fecha
no se cuenta con un estudio detallado de las defensas antioxidantes en tejidos de
mamíferos marinos que por su condición de buceadores estÆn expuestos a ciclos
recurrentes de isquemialreperfusión
10
JustificaC˛ón
La primera respiración despuØs de un buceo reestablece el flujo de sangre
oxigenada hacia los tejidos isquØmicos eliminando el CO2 y otros metabolitos
acumulados Kooman y Ponganis 1998 Elsner 1999 al tiempo que incrementa
notablemente la producción de 02 Zenteno Savín y Elsner 1998 Sin embargo este
incremento no se ve reflejado en un aumento del daæo celular en los tejidos de foca
anillada debido a su elevada capacidad antioxidante Zenteno Savín et al 2002 El
estudio de la actividad de las principales enzimas antioxidantes en tejidos de foca
anillada ayudarÆ a entender cómo estos organismos son capaces de tolerar ciclos
repetitivo s de isquemialreperfusión derivados del buceo sin presentar daæo oxidativo
aparente
Hipótesis
En los fócidos la reoxigenación de los tejidos isquØmicos debida a la
vasocronstricción perifØrica asociada a periodos de apnea intermitente promueve la
producción de EROs y aumenta la posibilidad de daæo oxidativo En consecuencia es
factible que una elevada actividad de las principales enzimas antioxidantes permita a los
tejidos de foca anillada contrarrestar los efectos daæinos de las EROs y tolerar ciclos
repetitivo s de isquemialreperfusión derivados del buceo
11
Objetivo General
Parra corroborar la hipótesis propuesta se plantea como objetivo general
comparar la actividad de las principales enzimas antioxidantes entre tejidos de foca
anillada y tejidos de un mamífero terrestre el cerdo comœn
Objetivos particulares
Medir la actividad de superóxido dismutasa en corazón riæón hígado pulmón y
mœsculo de foca anilladay de cerdo comœn
Medir la actividad de catalasa en corazón riæón hígado pulmón y mœsculo de
foca anillada y de cerdo comœn
Medir la actividad de glutatión S transferasa en corazón riæón hígado pulmón
y mœsculo de foca anillada y de cerdo comœn
Comparar la actividad de superóxido dismutasa catalasa y glutatión S
transferasa entre los tejidos de cada especie
Comparar la actividad de superóxido dismutasa catalasa y glutatión S
transferasa entre ambas especies
12
Material y MØtodos
Obtención de muestras
Se obtuvieron muestras frescas de corazón riæón hígado pulmón y mœsculo de
foca anillada y de cerdo comœn Las muestras de foca n 11 fueron colectadas con la
colaboración del Departamento de Vida Silvestre del Estado de Alaska y de los
cazadores de subsistencia Inupiat cerca de Barrow en la costa norte de Alaska E UA
Los organismos fueron sacrificados mediante disparo en la cabeza Antes de la colecta
de muestras cada individuo fue pesado se determinó el gØnero y se realizó una
disección ventral para obtener aproximadamente 5 g de cada tejido Las muestras fueron
congeladas inmediatamente por inmersión en nitrógeno líquido para transporte y
posterior anÆlisis Las muestras de cerdo n 1 O se colectaron a partir de animales
reciØn sacrificados en el rastro municipal de La Paz B C S MØxico Se registró el
peso y el gØnero de cada individuo Las muestras obtenidas aproximadamente 5 g de
cada tejido fueron congeladas inmediatamente mediante inmersión en nitrógeno
líquido Todas las muestras fueron transportadas al Centro de Investigaciones
Biológicas del Noroeste S C CIBNOR y almacenadas a 80 oC hasta su anÆlisis
AnÆlisis bioquímicos
Se midió la activad enzimÆtica de SOD CAT y GST así como la cantidad de
proteínas solubles en extractos tisulares de corazón riæón hígado pulmón y mœsculo de
ambas especies Los reactivos que se utilizaron para los anÆlisis bioquímicos se
obtuvieron de Sigma Aldrich Chemical Co San Luis MO E UA y de Bio Rad
Laboratories Hercules CA EUA
13
Preparación de las muestras
Previo a las determinaciones enzirnÆticas 100 mg de cada muestra se
homogenizaron en solución amortiguadora de fosfatos 50 mM pH 7 5 EDTA 1 mM
PMSF 1 mM y se centrifugaron a 3 500 rpm durante 10 minutos a 4 o C se desechó el
precipitado y se guardó el sobrenadante para los anÆlisis Hermes Lirna y Storey 1995
Supelóxido dismutasa EC 115 11
Se midió la actividad de la SOD utilizando el sistema xantinaxantina oxidasa
como generador constante de Oi que reduce al nitroazul de tetrazolio NBT y forma
un producto azul llamado formazÆn cuyo cambio puede ser detectado a560 nm cuando
SOD inhibe la reducción del NBT Suzuki 2000 Cada muestra fue diluida 110 con
solución amortiguadora de fosfatos 50 mM p H 7 5 EDTA 1 mM En una celda de
plÆstico se colocaron y se mezclaron la solución de trabajo solución amortiguadora
sodio carbonato 50 rnM xantina 0 1 rnM NBT 0 025 rnM EDTA 0 1 mM xantina
oxidasa 1 U mL sulfato de amonio 2 M Y muestra o blanco solución amortiguadora
de fostafos 50 mM pH 7j EDT A 1 rnM Se regIstró el cambio en la absorbancia a
560 ron cada 30 segundos durante 5 minutos en un espectrofotómetro Jenway 6305
U Ìs Jem ay Ud Londres R U calibrado con agua destilada dH20 El porcentaje
ae IliubJCJon se calculo a pamr del cambJO en la absorbanCla por minuto a 560 ron
AA I el el re r e1 el r d I j n l r t ri1 560 La aCU UaGL ˙Ftesu el u nUaUe LeL U m2 e F O elna
Catalasa EC 11116
Se determmo la actIVIdad de caaiasa mIdIendo el decremento en la
concemraClOn de H O a 24U nm AebL 1 Ìz 4 Se colocaron se mezclaron en una
celda de cuarzo la solucJOn de trabaJo I soluclOn arnornguadora de tostatos 100 rnM
14
H202 10 rnM Y la muestra se registró la absorbancia a 240 nrn cada 15 segundos
durante 3 5 minutos en un espectrofotómetro Jenway 6305 uv vis Jenway Ltd
Londres R U calibrado con dH20 La actividad se calculó con base en el cambio de la
absorbancia por minuto a 240 nm M240 y se expresó en unidades de CAT mg de
proteínarl
Glutatión S tansferasa EC 25 118
La actividad de GST fue medida monitoreando la formación del complejo
tioeter CDNB como producto de la reacción de glutatión reducido GSH con l cloro
2A dinitrobenceno CDNB Habing y Jakoby i98 i Se colocaron y se mezclaron en
una ceJaa ue cuaflo SOlUClon de trabajo So uclOn amontguadora de tostatos 100 rnM
u H inl L iD 1 1 nlivi L LJ 4t i rnil la rnuestra e retllSlfO Ł carno o en ia
n rDanC a n 11H1tnO a p 1 nn1 cada se2unaos Gurante t n1H1UlOS en un
Œ DŁcrrOfOlOmerro JŁ1 a ul tII S JŁn al LIl1 LOiK res f L caHoraao con
MJ e CtHnO un DJanco SUSIHU enCO a n1ueSlr3 Dar sojuc on de trabato Se caicuió ía
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15
0 08 0 04 0 02 0 01 Y 0 005 mg mLr1 En una microplaca se agregó a cada pozo
dH20 colorante Coomassie@ y la curva estÆndar o la muestra Se preparó un blanco con
dH20 y colorante Coomassie@ DespuØs de 15 minutos se leyó la absorbancia a 620 nm
en un lector de microplaca Multiskan MS 352 Labsystems Helsinki Finlandia La
cantidad de proteínas solubles se calculó apartir de la ecuación de la recta ajustada a la
curva estÆndar y se expresó en mg de proteína
AnÆlisis estadísticos
A los datos obtenidos se les aplicó una prueba de normalidad Kolmogorov
Smimoff una prueba de homocedasticidad Levene y una prueba de correlación
media variancia Para determinar las diferencias entre los tejidos de cada especie se
realizó un anÆlisis de variancia por rangos de Kruskall Wallis seguido de una U de
Mann Withney Para determinar diferencias significativas por tejido entre las dos
especies se utilizó la U de Mann Withney Zar 1999 Se consideró a 0 05 como nivel
de significancia estadística y a O 1 como tendencia no significativa Los anÆlisis
estadísticos se desarrollaron utilizando los paquetes SYSTA T9 ver 9 0 SPSS me
Chicago IL E UA y STATISTICA@ ver 6 0 STATSOFT San Diego CA EuA
para computadora personal
16
Resultados
Comparaciones entre tejidos de cada especie
Foca anillada
La actividad de las enzimas antioxidantes en los tejidos de foca anillada se
presenta en la Tabla I y la Figura 7 Los resultados de grupo de edad gØnero y peso se
muestran en la Tabla IlI La actividad de SOD en el mœsculo fue significativamente mÆs
baja p O 05 que en los demÆs tejidos Fig 7A La actividad de CAT fue
significativamente pO 05 mayor en el hígado y en el riæón y significativamente
p O 05 menor en el mœsculo que en el pulmón y el corazón la actividad de CAT en
tejidos de foca anillada se observó en el siguiente orden Hígado Riæón Corazón
Pulmón Mœsculo Fig 78 La actividad de GST registró diferencias significativas
PO 05 en el corazón y el riæón con respecto al hígado al pulmón y al mœsculo la
actividad de GST en tejidos de foca anillada se observó como Hígado Corazón Riæón
Pulmón Mœsculo Fig 7C
Tabla 1 Actividad U mg de proteína de las enzimas antioxidanteen tejidos de foca
anillada Los datos se presentan como media i error estÆndar tn i j letras diferentesdenotan diferencias significativas p O 05
Tejido SuperÚxidlÌ dismurasa Catalasa Glutatión S transferasa
RiæÓn 55 2X i 10 114
17ì ij56 16i58 LOìv
1340 t3 76
8245 23i 960 ï8a 7 18i 1St
CorazÓn ïï 2ì t 25 71
Hígado 7172 i 36 7
Pulmón 78 65 t 2039
19196 85i 452731 35 1 l í 5 92a
1614 59t 289490c
3 54t1511
1 5 3 9fl ˙t 2 i ˛ 95 O ì4d
17
18
Cerdo comœn
La actividad de las enzimas antioxidantes en los tejidos de cerdo comœn se
presenta en la Tabla 11 y la Figura 8 Los resultados de grupo de edad gØnero y peso se
muestran en la Tabla IV La actividad de son registró diferencias significativas
pO 05 y fue mÆs elevada en el riæón que en el pulmón y el mœsculo Fig 8A La
actividad de eAT fue signitïcativamente distinta p O 05 entre el riæón el corazón y el
hlgado entre el pu˛mon y e˛ mÚscu˛o y entre higado rÌiìón pulmon j mÚsculo y se
observo en d siguiente en jjigado Rinón CorazÓn PuJmón MÚscuJo Fig 8B La
4n f c i c c i T o L J il t UtlU U l U H l lt i t l t 1 ld UY J l1 1 t e o1UU que el U
UC lJ f f f
l lI HI 1 1I111l illl illllrlIlrr
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n i i ir Vjl t1tlFllll r l 1111111 1111 rn J
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1hh ti ifhtl tl ímti prnteína òe laen7imas antioxidantes en tejidos de cerdo
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Corazón Riæón Hígado Puhnón Mœsculo
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14000l
12000Oo
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c 4000U
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Corazón Riæón Hígado Pulmón Mœsculo
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º 40
30oJ 20
10d
o
Corazón Riæón Hígado Puhnón Mœsculo
Figura 8 Actividad U mg de proteína de las enzimas A superóxido dismutasa SOD
B catalasa CAT y C glutatión S transferasa GST en tejidos de cerdo comœn Losdatos se presentan como medial estÆndar n 10 letras diferentes denotan diferencias
significativas p 0 05
20
Comparaciones por tejido entre especies
Corazón
La actividad de SOD presentó una tendencia no significativa p O l aser mÆs
elevada en el corazón de foca que en el de cerdo Fig 9A La actividad de CAT fue
significativamente mÆs elevada en el corazón de cerdo que en el de la foca p O 05
Fig 9B La actividad de GST fue significativamente mÆs alta en corazón de foca
p O 05 Fig 9C
r 6359521
120 A
100
E 80c
O601
r8 40 100
J20
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Foca Cerdo
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7000Q
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10e
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6eJ 4
2
o
Foca Cerdo
Figura 9 Actividad U mg de proteína de las enzimas A superóxido dismutasa SOD
B catalasa eAT y C glutatión S transferasa GST en corazón de foca anillada n
11 Y de cerdo comœn n 1 O Los resultados se presentan como media lerror
estÆndar pO 05 pO l
22
Riæón
No se encontraron diferencias significativas en la actividad de las tres enzimas
SOD CAT GST entre el riæón de foca anìllada y el riæón de cerdo comœn Fig 10
23
70 1A
60tIlIl
50o
olo
po 40
Ol
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J10
O
Foca Cerdo
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Foca Cerdo
10
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1
OFoca Cerdo
Figura 10 Actividad U mg de proteína de las enzimas A superóxido dismutasaSOD B catalasa CAT y C glutatión S transferasa GST en riæón de foca anilladan ll y de cerdo comœn n 10 Los datos se presentan como mediaferror estÆndar
24
Hígado
La actividad de son no fue significativamente diferente entre el hígado de foca
anillada y el de cerdo comœn Fig llA La actividad de CAT presentó una tendencia
no significativa a ser mÆs elevada en el hígado de la foca que en el cerdo p O l
Fig llB La actividad de GST en el hígado fue significativamente mayor en el cerdo
que en la foca p O 05 Fig llC
25
120 1
A
ł100
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B80o
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OFoca Cerdo
90 1
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OJ 2O
10
OCerdoFoca
Figura 11 Actividad U mg de proteína de las enzimas A superóxido dismutasaSOD B catalasa CAT y C glutatión S transferasa OST en hígado de foca aniladan 11 y de cerdo comœn n IO Los resultados se presentan como medial error
estÆndar p 0 05 pO I
26
Pulmón
La actividad de son fue significativamente mayor en el pulmón de foca que en
el de cerdo p O 05 Fig I2A La actividad de CAT fue significativamente mayor en
el pulmón de cerdo que en el de foca p O 05 Fig I2B La actividad de GST en el
pulmón no presentó diferencias significativas entre ambas especies Fig I2C
27
120 lA
100t
Q
80o
OQ
el60Oll
Eel
40OCI1
20
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Foca Cerdo
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OFoca Cerdo
Figura 12 Actividad U mg de proteína de las enzimas A superóxido dismutasaSOD B catalasa CAT y C glutatión S transferasa GST en pulmón de foca
anillada n ll y de cerdo comœn n 10 Los datos se presentan como mediarerror
estÆndar p 0 05 pO I
28
Mœsculo
La actividad de las enzimas SOD y GST no fue significativamente distinta entre
el mœsculo de foca y el de cerdo Figs BA y Be La actividad de CAT fue
significativamente mÆs elevada en el mœsculo de cerdo que en el de foca p O 05 Fig
13B
29
25 lA
ro 20t1o1
o 15QO00
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5
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Π0 6frf1O 004
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OFoca Cerdo
Figura 13 Actividad U mg de proteína de las enzimas A superóxido dismutasaSOD B catalasa CAT y C glutatión S transferasa GSn en mœsculo de foca
anillada n 11 y de cerdo comœn n 10 Los datos se presentan como medialerror
estÆndar pO 05
30
Discusión
Comparaciones entre tejidos de cada especie
Foca anillada
Los niveles de actividad de superóxido dismutasa en tejidos de foca anillada
fueron significativamente mÆs bajos en el mœsculo que en los demÆs tejidos estudiados
Zenteno Savín et al 2002 reportaron mayor producción de Oi mayores niveles de
peroxidación lipídica y menor capacidad antioxidante total en el tejido muscular que en
los tejidos renal y cardíaco de esta especie Las adaptaciones fisiológicas y bioquímicas
del tejido muscular de los fócidos para aprovechar al mÆximo las reservas de oxígeno
durante el buceo incluyen altos contenidos de mitocondrias de mioglobina y de Æcidos
graso s poliinsaturados PUFAs lo que permite mantener el metabolismo aerobio aœn
en condiciones de isquemia Kanatous et al 1999 Kanatous et al 2002 Y al mismo
tiempo aumenta la susceptibilidad a producir O2 derivado de los procesos respiratorios
durante ciclos repetitivos de isquemialreperfusión Longo et al 1996 Zwicker et al
1998 Lo anterior sugiere que el tejido muscular es mÆs propenso agenerar Oi por la
cantidad de mitocondrias y mÆs propenso al daæo oxidativo en las membranas
celulares por la cantidad de PUF As que contiene La función de SOD es dismutar al
Oi en H202 McCord y Fridovich 1969 a partir del cual se puede generar OH una
ERO altamente reactiva capaz de oxidar lípidos proteínas y Æcidos nucleicos Halliwell
y Gutteridge 2001 El Oi por si mismo es incapaz de abstraer un hidrógeno de un
PUFA iniciando las reacciones de lipoperoxidación Halliwell y Gutheridge 2001 por
lo que resulta congruente que una estrategia para evitar el daæo oxidativo en tejidos con
altos contenidos de PUF As como el tejido muscular de los fócidos sea mantener bajos
los niveles de actividad de la SOD
31
La actividad de la enzima catalasa fue significativamente mÆs elevada en el
hígado y en el riæón Resultados similares han sido reportados en otras especies de
vertebrados como la tortuga de agua dulce Trachemis scripta Willmore y Storey
1997 peces antÆrticos Chapsocephalus gunnari C aceratus Pseudochaenichthys
georgianus Dissostichus eleginoides Notothemia rossi Ansaldo et al 2000 el pez
dorado Carassius auratus Lushchak et al 2001 Y la tortuga prieta Chelonia mydas
agassizii Valdivia JimØnez 2003 Estos resultados pueden explicase debido a que
despuØs del cerebro el hígado es el órgano con la tasa metabólica mÆs elevada y entre
sus funciones principales se encuentra la detoxificación ademÆs de ser un depósito
importante de hierro Schmidt Nielsen 2001 El hierro y el cobre se combinan con
H202 y generan radicales OH mediante la reacción de Fenton al no existir una enzima
que metabolice OH en los organismos la actividad de la catalasa juega un papel
trascendental para controlar los niveles de OH Pippenger et al 1998
Por otra parte tanto el hígado como el riæón son fuertemente vasoconstriæidos
durante el buceo Elsner 1999 el riæón ha sido identificado como uno de los tejidos
mÆs tolerantes a isquemia y con mejores respuestas a la reoxigenación debido a las b as
concentraciones de HX y a los altos niveles de glucógeno que contiene lo cual le
permite hacer uso del metabolismo anaerobio cuando las concentraciones de oxígeno
son b as Halasz et al 1974 Elsner et al 1995 Elsner et al 1998 A pesar de que el
flujo de sangre oxigenada se ve drÆsticamente interrumpido hacia el riæón durante el
buceo no existe daæo oxidativo aparente medido como peroxidación de lípidos en este
órgano Zenteno Savín et al 2002 lo que puede deberse a la elevada actividad de la
enzima catalasa que permite la remoción eficiente de hidroperóxidos en este tejido
La actividad de GST fue significativamente mÆs elevada en el hígado que en los
demÆs tejidos lo que concuerda con resultados de estudios realizados en otras especies
32
de vertebrados como la serpiente liga Thamnophis sirtalis Hermes Lima y Storey
1993 la rana leopardo Rana pipiens Hermes Lima y Storey 1996 y la tortuga prieta
c mydas agassizii Valdivia JimØnez 2003 Se ha reportado que GST se encuentra
en grandes cantidades en el hígado Jakoby 1985 Tsuchida y Sato 1992 debido a que
participa activamente en los procesos de detoxificación propios del órgano al catalizar
las reacciones que eliminan compuestos sin valor nutricional o xenobióticos cuando son
conjugados con el grupo SH del GSH produciendo compuestos menos tóxicos que
pueden ser secretados hacia la bilis o la sangre para facilitar su salida del organismo
Habing y Jakoby 1981 Jakoby 1985 Schmidt Nielsen 2001
En general las diferencias en la actividad de cada una de las enzimas entre los
distintos órganos de la foca anillada podrían estar relacionadas con las funciones
específicas el alcance aeróbico y la capacidad oxidativa de cada tejido relacionada al
grado de perfusión que mantienen durante el buceo Elsner 1999 ademÆs las focas
disminuyen su temperatura cuando bucean Andrews et al 1995 Se ha reportado que a
bajas temperaturas el daæo oxidativo derivado de los ciclos de isquemia reperfusión se
atenœa Belzer y Southard 1988 Heijnen et al 2001 por lo que Østa tambiØn puede
ser considerada como unaestrategia de protección contra las EROs
Cerdo comœn
La actividad de SOD en tejidos de cerdo comœn fue mÆs elevada en el riæón
seguida del corazón y del hígado Elsner et al 1998 encontraron concentraciones altas
de HX y elevada actividad de la SOD en el riæón de cerdo comœn reportando incluso
niveles mÆs altos de las dos variables en el tejido renal de cerdo que en el de foca
anillada Zenteno Savín et al 2002 encantaron mayor producción endógena de radical
superóxido en riæón y en corazón que en mœsculo de cerdo comœn 10 que puede estar
relacionado con las concentraciones altas de HX sustrato de la enzima XO que produce
33
al Oi Es probable que las actividades altas de son en este tejido se deban a la
abundancia en el sustrato condición en la que la actividad enzimÆtica se ve en aumento
y puede alcanzar su velocidad mÆxima Lehninger 1978
La actividad de CAT fue mÆs alta en el hígado que en los demÆs tejidos de
cerdo debido probablemente a que el hígado tiene depósitos importantes de hierro
Scmidt Nielsen 2001 que al combinarse con H202 genera OH Halliwell y
Gutteridge 2001 por lo que la acción de CAT es de primordial importancia en este
tejido La actividad de CAT en el riæón fue mÆs alta que en el corazón y el mœsculo lo
cual puede estar relacionado directamente con la actividad de SOD encontrada en este
tejido que hace que la tasa conversión del 02 en H202 sea alta y por lo tanto que
aumente la actividad de CAT DespuØs del riæón el corazón fue el que presentó la
actividad de CAT mÆs elevada este patrón es similar al reportado por Zenteno Savín et
al 2002 en cuanto a la tasa de producción endógena de O2 La actividad enzimÆtica
de CAT no presentó diferencias significativas entre el corazón y el mœsculo de cerdo y
fue mÆs baja que en el riæón y en el hígado lo que concuerda con los resultados de
Zenteno Savín et al 2002 quienes reportaron similar capacidad antioxidante total en
corazón y mœsculo y menor a la del riæón así como niveles de peroxidación lipídica
elevados en el corazón de cerdo Lo anterior puede deberse a que de acuerdo con los
niveles de CAT y de producción endógena de Oi este anión se estØ combinando con
H202 generando radicales OH que pueden daæar las membranas celulares Halliwell y
Gutteridge 2001
La actividad de GST en los tejidos de cerdo comœn sigue el patrón reportado
para otras especies de vertebrados Hermes Lima y Storey 1993 Hermes Lima y
Storey 1996 Valdivia JimØnez 2003 destacando el hígado seguido del riæón debido
probablemente a sus funciones detoxificadoras Sin embargo llama la atención que los
34
niveles en el hígado sean diez veces mayores a los del riæón quizÆ la acumulación de
contaminantes en este tejido sea excesiva y resulte en la elevada actividad de GST Se
ha reportado que existe una alta acumulación de cobre zinc manganeso y hierro en
zonas con alto contenido de materia orgÆnica procedente de las descargas humanas en
la Bahía de La paz MØndez et al 1998 10 que puede traer como consecuencia la
acumulación de estos iones en los tejidos de cerdo que proceden de las zonas aledaæas a
la Bahía
Comparaciones por tejido entre especies
Corazón
La actividad de la SOD presentó una tendencia no significativa a ser mÆs alta en
el corazón de foca que en el de cerdo lo que concuerda con los resultados de Elsner et
al 1998
Durante el buceo el corazón de los fócidos recibe flujo intermitente de sangre
oxigenada Esto permite minimizar el consumo de oxígeno sin suspender la actividad
del tejido cardíaco y al mismo tiempo lo hace dependiente de mecanismos de defensa
efecti vos contra las EROs Kjekshus et al 1982 Elsner et al 1985 Elsner et al
1998 como pueden ser elevar la actividad de las enzimas antioxidantes SOD y GST
En otras especies de mamíferos se ha visto que el preacondicionamiento
experimental del tejido cardíaco reducciones intermitentes en el flujo sanguíneo
exponiendo al tejido a periodos cortos de isquemialreperfusión activa mecanismos
fisiológicos de defensa como las proteínas de choque tØrmico HSP o la MnSOD y
minimiza el daæo causado por isquemialreperfusión Murry et al 1986 Nao et al
1990 eohen et al 1990 Flack et al 1999 Halliwell y Gutteridge 2001 En los
fócidos Øste parece ser un mecanismo natural de defensa derivado directamente de la
35
respuesta al buceo Elsner et al 1998 Zenteno Savín et al 2001Otro mecanismo
involucrado en el preacondicionamiento es que los periodos cortos de isquemia activen
el receptor de adenosina Al y por lo tanto que se acelere la síntesis de adenosina en
grandes cantidades Liu et al 2004 condición que vendría a contrarrestar la depresión
de la respiración mitocondrial causada por las EROs en el corazón durante períodos de
isquemia prolongados lo que trae como consecuencia una reducción de la capacidad de
los miocitos para generar ATP McCarthy y Shah 2003
Los niveles de actividad de CAT y el contenido de sustancias reactivas al Æcido
tiobarbirtœrico reportado por Zenteno Savín et al 2002 pueden indicar que existe una
acumulación de residuos procedentes de la peroxidación lipídica como
malondialdehído MDA e hydroxynonenal que pueden estar siendo removidos por la
enzima GST Prohaska 1980 Halliwell y Guteridge 2001 cuyos niveles de actividad
fueron mÆs altos en el corazón de foca que en el de cerdo
La elevada actividad de CATen el corazón de cerdo puede deberse a la
acumulación de catecolaminas que se liberan debido al manejo de los organismos previo
al sacrificio Fraser et al 1975 y que provocan la producción de EROs Sigal et al
1982 Häggendal et al 1987 Sing 1992 Otra posible explicación es que en el
corazón de foca el mecanismo de defensa sea mÆs complejo por estar expuesto aciclos
recurrentes de isquemiareperfusión y requiera de otra enzima antioxidante que
remueva los hidroperóxidos la glutatión peroxidasa GPx La CAT y la GPx colaboran
para remover el peróxido de hidrógeno GPx actœa cuando las concentraciones de H202
se mantienen constantes y CAT cuando aumentan El mœsculo esquelØtico generalmente
contiene niveles mÆs altos de GPx que de CAT Halliwell y Gutteridge 2001A
diferencia de la CAT que se ubica en el citosol y en los peroxisomas GPx se encuentra
en el cito sol y en la matriz mitocondrial donde tambiØn hay GSH NADPH y las
36
enzimas que regulan su ciclo en el organismo Halliwell y Gutteridge 2001GSH es
un tripØptido formado por residuos de glutamato cisteína y glicina que tiene la
capacidad de donar un electrón ligado a su grupo sulfhidrilo SH Lehninger 1978
funciona como cosustrato para GST y GPx y se produce apartir de GSSG por acción de
la enzima GR que lo reduce con un hidrógeno proveniente del NADPR Los niveles de
GSH estÆn controlados homeostÆticamente GSH es capaz de detener la formación de
EROs al reaccionar con iones de cobre y de remover oxidantes como el OH o el
peroxinitrito ademÆs de intervenir en el metabolismo del Æcido ascórbico Halliwell y
Guteridge 2001
La actividad de SOD encontrada en el corazón de foca y los resultados
reportados por Zenteno Savín et al 2002 que indican valores mÆs altos de Oi en el
corazón de foca que en el de cerdo permiten inferir que la tasa de conversión del Oi en
H202 es alta Sin embargo la actividad de eAT fue mÆs alta en el corazón de cerdo lo
cual hace suponer que probablemente GPx sea la enzima que en su mayoría estØ
removiendo los hidroperóxidos para lo que se necesitarían concentraciones elevadas de
sus sustratos GSH y H202 En el tejido cardiaco de foca los resultados encontrados en
este trabajo y los reportados por Elsner et al 1998 con respecto ala actividad de SOD
penniten suponer que las concentraciones de H202 son elevadas mientras que la
actividad de GST da pie a pensar que los niveles de GSH tambiØn son altos Lo anterior
estaría planteando la posibilidad de que el sistema glutatión en los fócidos sea una parte
importante del mecanismo de defensa contra las EROs y por lo tanto que la actividad
de las enzimas que lo regulan así como las concentraciones de GSSG GSH y NADPH
sean considerablemente mÆs elevadas que las de los mamíferos que no bucean o no
estÆn expuestos a cambios recurrentes en las concentraciones de h
37
Riæón
En la actividad de las tres enzimas SOD CAT y GST no se registraron
diferencias significativas entre el riæón de foca anillada y el riæón de cerdo comœn En
contraste Elsner et al 1998 encontraron mayor actividad de la SOD en el riæón de
cerdo que en el de foca Zenteno Savín et al 2002 encontraron mayor producción de
Oi en el riæón de foca que en el de cerdo lo que sin embargo no se refleja en niveles
mÆs altos de peroxidación lipídica debido a la mayor capacidad antioxidante total que
exhibe el riæón de foca con respecto al riæón de cerdo Teniendo en cuenta que la AOX
es mÆs alta en el riæón de foca Zenteno Savín et al 2002 y que en modelos
experimentales se ha demostrado que el tratamiento con vitaminas contrarresta el daæo
causado por isquemiareperfusión en el tejido renal Chade et al 2003 puede pensarse
que tal vez son antioxidantes no enzimÆticos los que contribuyen a contrarrestar la
producción y el efecto de EROs en el riæón de estos fócidos
El tejido renal es uno de los tejidos mÆs fuertemente vasoconstriæidos durante el
buceo Elsner et al 1966 el flujo de sangre oxigenada hacia Øl es totalmente
interrumpido debido a su amplia tolerancia a la hipoxia y a su capacidad para recobrar
sus funciones despuØs de la reperfusión Halaz et al 1974 Behrisch y Elsner 1980
Elsner 1987 Se ha reportado que a pesar de su capacidad para tolerar períodos
prolongados de isquemia el tejido renal de los fócidos no concentra cantidades
importantes de HX Elsner et al 1995 Elsner et al 1998 Reciclar HX para utilizarla
en la síntesis de ATP vía IMP y el reciclado de purinas específicamente por la enzima
hipoxantina guanina fosforibosil transferasa HGPRT requiere menos energía que
generar nuevo ATP limita el sustrato a la enzima XO encargada de generar al Oi y
abre la posibilidad de utilizar el metabolismo anaerobio Berisch y Elsner 1980 Elsner
etal 1998
3S
A pesar de que las concentraciones de HX en el tejido renal de foca anillada son
bajas Elsner et al 1998 la producción endógena de Di es mÆs alta que en el rmón de
cerdo comœn lo que no se ve reflejado en daæo por lipoperoxidación de membranas
Zenteno Savín et al 2002 Con estos antecedentes cabria esperar que la actividad de
SOD y CA T fueran elevadas en el riæón de foca QuizÆ la baja actividad de SOD evita
la síntesis de H202 y por lo tanto limita la formación de DH
Estudios recientes Buetler et al 2004 sugieren que la baja en la actividad de
SOD puede deberse a la importancia de conservar concentraciones altas de Oi anión
que ha sido identificado como una molØcula importante en la seæalización de procesos
celulares como el crecimiento la diferenciación e incluso la vasodilatación
Otra posibilidad es que los mecanismos de defensa en el tejido renal de foca
incluyan la participación elevada de otras enzimas como GPx GR y glucosa 6 fosfato
deshidrogenasa G6PDH para mantener el ciclo del glutatión y evitar el daæo
oxidativo tal como sucede en el riæón del pez dorado c auratus que vive en un
ambiente expuesto a cambios recurrentes en la concentración de oxígeno lo que deriva
en ciclos contínuos de isquemialreperfusión Lushchak et al 2001
Hígado
La actividad de SOD no presentó diferencias significativas entre el hígado de
foca y el higado de cerdo La actividad de CAT registró una tendencia a ser mÆs elevada
en el hígado de foca La actividad de GST fue significativamente mÆs alta en el higado
de cerdo El higado es uno de los tejidos que se ven mÆs fuertemente vasoconstriæidos
durante el buceo Elsner et al 1966 Su tasa metabólica es elevada Schmidt Nielsen
2001 por lo que se esperaría que la actividad de las enzimas antioxidantes fuera
significativamente mÆs alta en el hígado de foca que en el hígado de cerdo En el pez
39
dorado c aura tus Lushchak et al 2001 reportaron que durante la hipoxia disminuye
la concentración total de proteínas probablemente porque la concentración de iones Ca
aumenta lo que provoca que se activen proteasas calciodependientes y la enzima XO
potencial generador de Oi a partir de HX que se acumula cuando las concentraciones
de O2 disminuyen y se degrada el ATP Hallíwell y Guteridge 2001 Sin embargo no
se observaron mayores niveles de actividad de SOD en el hígado de foca que en el de
cerdo que puedan indicar que la tasa de producción endógena de Oi sea alta lo que
marca la posibilidad de que la HX estØ siendo reciclada por la enzima HGPRT
Halliwell y Guteridge 2001
El que la actividad de CAT presentara una tendencia a ser mÆs elevada en el
hígado de foca indica que existe un mecanismo de protección en este tejido que
remueve eficientemente los hidroperóxidos lo que al mismo tiempo regula los niveles
de OH y limita el daæo por lipoperoxidación Halliwell y Gutteridge 2001 El tejido
hepÆtico de cerdo en cambio no presentó una actividad de eAT tan elevada por lo que
puede entenderse que requiera de una alta actividad de GST que le permita remover los
productos derivados de la lipoperoxidación como el MDA así como posibles residuos
de contaminantes MØndez et al 1998
De acuerdo con los resultados obtenidos en este estudio y con lo reportado en
otras especies de vertebrados que estÆn expuestas a ciclos de isquemia reperfusión
derivados de sus estilos de vida Hermes Lima y Storey 1993 Willmore y Storey
1997 Grundy y Storey 1998 Lushchak et al 2001 puede inferirse que CAT
contribuye de manera importante al mecanismo de protección en el hígado de foca
anillada y que el sistema glutatión puede tambiØn estar jugando un papel fundamental
En el hígado del pez dorado por ejemplo las concentraciones de GSH son mÆs elevadas
que en el cerebro el mœsculo o el riæón la hipoxiareoxigenación no causa efecto en la
40
actividad de SOD GST o GPx pero sí eleva la actividad de CAT para controlar los
niveles de peroxidación lipídica y la generación de radicales OH tambiØn se observan
niveles altos de GSH GR y G6PDH despuØs de la reoxigenación Lushchak et al
2001En el hígado de la serpiente liga los niveles de GSH se incrementan y la
actividad de SOD no sufre cambios debido a la hipoxia Hermes Lima y Storey 1993
En el tejido hepÆtico de la tortuga de agua dulce Trachem vs scripta elegans la
actividad de SOD y de otras enzimas antioxidantes disminuye por efecto de la hipoxia
derivada del buceo pero la actividad de GR y los niveles de GSH aumentan Willmore
y Storey 1997 En el sapo del desierto Scaphioups couchi la actividad de SOD
disminuye mientras que la actividad de CAT y los niveles de GSSG y de GSH en el
hígado aumentan despuØs de la hibernación Grundy y Storey 1998
Pulmón
La actividad de SOD fue signifícativamente mÆs elevada en el pulmón de foca
que en el de cerdo La actividad de CAT fue significativamente mayor en el pulmón de
cerdo La actividad de la GST no presentó diferencias significativas entre ambas
especies Las paredes de los pulmones de los mamíferos marinos adiferencia de las de
los mamíferos terrestres son flexibles y estÆn reforzadas con cartílago lo anterior hace
posible que los pulmones se colapsen durante el buceo por la respuesta de
quimiorreceptores perifØricos y de barorreceptores arteriales a la bradicardia evitando
barotraumas al eliminar el intercambio gaseoso alveolar para prevenir la acumulación
de nitrógeno ademÆs de ayudar al descenso Kooyman y Ponganis 1998 Elsner 1999
Otra particularidad que presentan los fócidos es empezar a bucear con menos de la
mitad de su capacidad pulmonar total lo que hace que la contribución del oxígeno del
aire en los pulmones durante el buceo sea relativamente baja por lo que se cree que la
41
mioglobina y la hemoglobina tienen una capacidad amortiguadora para tolerar
metabolitos Æcidos producto del metabolismo anaerobio Elsner 1999 Todo lo anterior
trae como consecuencia que el pulmón se aísle y se exponga a isquemia aguda durante
el buceo lo que aunado a que este tejido es el primero en recibir la entrada de oxígeno
en la reperfusión Elsner 1999 provoca la producción excesiva de EROs que son
contrarrestadas por los elevados niveles de actividad de SOO
El que la actividad de CAT haya sido mÆs alta en el pulmón de cerdo que en el
de foca da pie a pensar que la protección contra la toxicidad derivada del H202 en el
tejido pulmonar requiere de otro tipo de antioxidantes Se ha reportado en pacientes
humanos que los antioxidantes vitamínicos provenientes de la dieta desempeæan un
papel de mantenimiento en la función de este tejido Shunemann et al 2002 y que
cuando el pulmón se ve sometido a isquemia porque no existe flujo a travØs de la arteria
pulmonar durante una cirugía cardiaca con circulación extracorpórea se produce una
alteración en la vasodilatación del endotelio dependiente del circuito vascular pulmonar
y por consecuencia aumentan la producción y el daæo generado por EROs situación
que se ve atenuada con un tratamiento que incluye una mezcla de antioxidantes Angdin
et al 2003 Otra posibilidad es que el sistema glutatión y la enzima GPx estØn
removiendo los hidroperóxidos generados cuando la tasa de conversión de Oi en H202
por son es elevada se sabe que al exponer al tejido pulmonar aislado a
concentraciones elevadas de 02 los niveles de GSSG y la actividad de la GPx
aumentan y ayudan al GSH al Æcido ascórbico y a la vitamina E a contrarrestar los
efectos tóxicos derivados de las EROs en este tejido Halliwell y Guteridge 2001 Lo
anterior se refuerza con los resultados reportados por Grundy y Sto rey 1998 en el sapo
del desieto Scaphiopus couchii donde la actividad de eAT no aumentó al despertar de
42
la hibernación situación anÆloga al buceo en tØrminos de hipoxiareoxigenación a
diferencia de la actividad total de GPx y de los niveles de GSH
Mœsculo
La actividad de las enzirnas son y GST no presentó diferencias significativas
entre el mœsculo de foca y el mœsculo de cerdo mientras que la actividad de CAT fue
mÆs alta en el mœsculo de cerdo El aislamiento del tejido muscular durante un buceo es
evidente y drÆstico debido a que el oxígeno que se almacena en Øl se agota mÆs rÆpido
que el que se almacena en la sangre Elsner et al 1966 Los ciclos de
isquemia reperfusión derivados de este fenómeno hacen que se inicie la reacción en
cadena de las EROs que al no ser contrarrestada por la actividad elevada de enzimas
como son y CAT se manifiesta en daæo por lipoperoxidación como el reportado por
Zenteno Savín et al 2002 en este tejido Se sabe que el mœsculo de los mamíferos
marinos es rico en mioglobina y su volumen mitocondrial es elevado 10 que le permite
mantener el metabolismo aerobio durante el buceo a pesar de estar aislado Kanatous et
al 1999 Davies y Kanatous 1999 Kanatous et al 2002TambiØn se sabe que tanto
el metabolismo mitocondrial como la oxidación de la mioglobina son generadores de
EROs por lo que se esperaría encontrar actividades elevadas de las enzimas
antioxidantes En el tejido muscular de la serpiente liga no existe cambio en la actividad
de CAT y GST a pesar de estar sometido ahipoxiareoxigenación pero sí es evidente la
acumulación de GSH que puede estimular la actividad de peroxidasas que remuevan
los productos de las reacciones iniciadas por las EROs Hermes Lima y Storey 1993
Es probable tambiØn que al momento de la reperfusión los grupos SH superficiales de
la hemoglobina contribuyan a remover EROs y sus productos de desecho Resichl
1986 Por lo anterior se plantea que el mecanismo de defensa en el tejido muscular de
43
la foca anillada que ademÆs es propenso al daæo oxidativo por la excesiva acumulación
de PUFAs Kanatous et al 1999 Kanatous et al 2002 incluye la baja la actividad de
SOD para mantener al O que es menos daæino que el H202 o el OH y que ademÆs
puede funcionar como molØcula de seæalización Buetler et al 2004 lo que traería
como consecuencia una baja en la tasa de conversión de O en H202 y por lo tanto una
baja en la actividad de CAT que probablemente estØ compensada con mecanismos
reparadores de daæo oxidativo
44
Conclusiones
La diferencia en la actividad de las enzimas SOD CAT y GST entre los distintos
órganos de foca anillada puede estar relacionada con las funciones específicas el
alcance aeróbico la capacidad oxidativa y el grado de perfusión que cada tejido
mantiene durante el buceo
La actividad de GST en el hígado y de CAT en el corazón el pulmón y el
musculo de cerdo comím es elevada probablemente por la alta acumulación de metales
pesados que ha sido registrada cerca de la zona de crianza estos organismos y por la
acumulación de catecolaminas que se liberan debido al manejo de los animales previo al
sacrificio
La actividad de las enzimas SOD y GST en el tejido cardíaco de foca anillada
aparentemente son un mecanismo de defensa eficiente contra la producción y efecto de
las EROs derivadas de ciclos continuos de isquemiareperfusión asociados al buceo
En el tejido renal de foca anillada la actividad de las enzimas antioxidantes
SOD GST y CAT al parecer no contribuye al mecanismo de protección contra las
EROs que en Øste órgano probablemente incluya el reciclamiento de HX vía la enzima
HGPRT o una participación eficiente del sistema glutatión
La actividad de la enzima CATen el hígado de foca anillada es al parecer un
mecanismo eficiente para remover hidroperóxidos y evitar el daæo causado por las
EROs
En el pulmón de foca anillada la enZIma SOD parece jugar un papel
trascendental como mecanismo de protección contra la producción de O2 derivada de
los ciclos continuos de isquemiareperfusión asociados al buceo La remoción de
hidroperóxidos quizÆ requiera de la participación de otras enzimas antioxidantes como
GPx o de antioxidantes no enzimÆticos
45
Mantener baja la actividad de SOD en el mœsculo de foca anillada es una
estrategia de defensa debido a la composición específica de este tejido Es probable que
este tejido requiera de concentraciones altas de antioxidantes reparadores de daæo
producido por EROs
46
Perspectivas
Para poder obtener un panorama mÆs amplio de cómo los tejidos de foca son
capaces de tolerar ciclos repetitivos de isquemiareperfusión derivados del buceo sin
presentar daæo oxidativo aparente es necesario seguir describiendo cómo actœan los
mecanismos de defensa contra las EROs para lo que se requiere medir la actividad de
otras enzimas antioxidantes como GPx y GR los niveles de GSSG GSH y NADPH la
actividad de G6PDH y en general hacer una revisión exhaustiva del sistema glutatión
ademÆs de medir las concentraciones de otros antioxidantes no enzimÆticos como la
vitamina E o el Æcido ascórbico y de otras enzimas como la HGPRT que puedan tener
inferencia directa en las reacciones oxidativas de las EROs
Otro punto importante es conocer como actœan las EROs en los procesos de
seæalización celular ademÆs de entender el papel que juegan molØculas como el factor
inducible por hipoxia HIF o las proteínas de choque tØnnico HSP en la regulación
genØtica de estos procesos bioquímicos
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56
Anexos
Tabla 11I Datos de colecta de tejidos de foca anillada cerca de Barrow en la costa Norte
de Alaska E U A
No de individuo Fecha de colecta
1 04 0702
2 04 07 023 04 07 024 0407 025 06 07 02
Oh 07 02
7 06 07 02
R 06 07 02
9 06 07 010 OR Oï 02n n2 n7 n
l l v V I v
Grupode Edad
Cría
Cría
AdultoAdulto
Adulto
Adulto
Adu to
Aduho
Adultodulrn
i i iii l UUllJ
GØnero
HembraMacho
HembraMacho
Hembra
Macho
1acho
Hemhra
Macho
1flCholacho
Peso kg
1134
11 34
O27 216
33 5664
14 02
26 762410 1912
34473640 R24
4 O
t Lq Lð
57
Tabla IV Datos de colecta de tejidos de cerdo comœn en el rastro municipal de La Paz
B C S MØxico
No de individuo Fecha de colecta Grupo de
Edad
GØnero Peso kg
8 08 03 A rhtltnj
1102 l8 0R 03 Adulto1 Cl e o e
lO V
4 1 x OR n A tiu t
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1 1 R n n 1utn1 n r n
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