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COMPARACIÓN DE LA ACTIVIDAD CITOTOXICA DE
LINFOCITOS T EN CELULAS TUMORALES CON
DIFERENTE EXPRESIÓN HLA-I
LIDI VANNESSA MEJIA GUARNIZO
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSE DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN
PROYECTO CURRICULAR LICENCIATURA EN BIOLOGIA
BOGOTA D.C.
2018
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COMPARACIÓN DE LA ACTIVIDAD CITOTOXICA
DE LINFOCITOS T EN CELULAS TUMORALES CON
DIFERENTE EXPRESIÓN HLA-I
LIDI VANNESSA MEJIA GUARNIZO
Propuesta trabajo de grado Investigación-Innovación para optar al título de Licenciada en
Biología
Director
CARMEN HELENA MORENO
Codirector
JOSEFA ANTONIA RODRIGUEZ
FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN
PROYECTO CURRICULAR LICENCIATURA EN BIOLOGIA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSE DE CALDAS
GRUPO DE INVESTIGACIÓN EN BIOLOGÍA DEL CÁNCER
INSTITUTO NACIONAL DE CANCEROLOGÍA
BOGOTA D.C.
2018
3
Agradecimientos
Quiero agradecer a mi familia por guiar mis pasos hacia adelante y apoyarme en todo lo que
siempre he necesitado en mi vida, por acompañarme en este proceso, que aunque largo y con
tropiezos, fue satisfactorio para mi crecimiento profesional como persona, considerando esto un
punto de partida para lograr muchas cosas.
A mi profe, Josefa Antonia Rodríguez por abrirme las puertas, brindarme la oportunidad de
realizar el presente trabajo de investigación y guiarme en todo el proceso con sus conocimientos
y consejos que me ayudaron bastante. A Andrea del grupo de patología y citometría de flujo del
Instituto Nacional de Cancerología por su amabilidad en la lectura de los gráficos, al profesor
Alexander García de la Universidad Distrital por su apoyo en los tropiezos que se presentaron, a
la profesora Carmen Helena Moreno por su amabilidad y brindarme la oportunidad de realizar el
vínculo con la universidad, a Jessica por sus enseñanzas de las técnicas en el laboratorio, a Juan
Camilo Urbano por su apoyo continuo y cariño, y a todos aquellos que han brindado su
colaboración en este proceso.
A la Universidad Distrital Francisco José de Caldas por formarme como profesional, al
Instituto Nacional de Cancerología y al grupo de investigación Biología del Cáncer por abrirme
las puertas y permitirme realizar el presente proyecto brindando todos los recursos para ello.
4
A mi familia, y las personas importantes en mi vida que han estado siempre para mí en todos los
momentos, los cuales día a día han estado desinteresadamente impulsando mis metas, que se
desvelaron conmigo, se estresaron conmigo, y se preocupaban por mí.
Familia, esto es para ustedes.
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RESUMEN
El cáncer es una enfermedad muy heterogénea cuya incidencia y mortalidad ha ido
incrementando durante la última década. Sin embargo, a pesar de que el sistema inmune está
capacitado para reconocer y destruir las células malignas, los tumores continúan creciendo e
invadiendo debido en parte, a que la presión inmune hace que se generen variantes tumorales
capaces de escapar al control de la respuesta inmune. Una de las estrategias más comúnmente
utilizadas por los tumores para escapar a la inmunidad, es la desregulación de la expresión de
moléculas del complejo mayor de Histocompatibilidad de clase I (en humanos HLA), la molécula
encargada de presentar los antígenos endógenos a los linfocitos T citotóxicos (CTL). Los
antígenos asociados a tumor (TAA), al ser endógenos, se presentan en estas moléculas para ser
reconocidos por los CTL, mediante su receptor de célula T (TCR). En consecuencia, el CTL se
activa para generar una respuesta inmune citotóxica capaz de destruir a la célula tumoral.
En la actualidad, la inmunoterapia es una de las estrategias terapéuticas más prometedoras para el
tratamiento del cáncer, ya que su acción no está dirigida a la destrucción de las células tumorales
sino al fortalecimiento del sistema inmune para que sea este, quien destruya a las células
tumorales. Los avances en el conocimiento de la inmunología tumoral han permitido el desarrollo
de diferentes tipos de inmunoterapias, muchas de las cuales se basan en la activación de los
linfocitos T, tales como la transferencia de células T adoptivas o de células dendríticas
estimuladas in vitro y re-inyectadas al paciente, o en el bloqueo de los puntos de chequeo de la
respuesta inmune como estrategia para estimular una respuesta T específica, o para evitar la
inactivación de los linfocitos T activados.
6
Desafortunadamente, durante el desarrollo del tumor, múltiples mecanismos de evasión de la
respuesta inmune son utilizados por las células tumorales para escapar al control inmune, siendo
el más frecuente la expresión alterada de HLA-I en la superficie de las células tumorales. Muchos
eventos moleculares pueden desencadenar defectos en la expresión de HLA-I, incluyendo los
defectos en la maquinaria de procesamiento y presentación antigénica (reversibles), que pueden
corregirse mediante la administración de interferón, o defectos estructurales (irreversibles) los
genes que codifican para la β2-microglobulina (β2m) o la cadena pesada de HLA, defectos que
solo pueden ser corregidos mediante la terapia génica. En este trabajo se evaluó la actividad
citotóxica de los linfocitos T CD8+ contra las líneas celulares tumorales SiHa y MDA-MB-231,
de cáncer de cuello uterino VPH-16+ y cáncer de mama respectivamente. Mediante un ensayo de
citotoxicidad utilizando lisado tumoral autólogo (de las propias líneas celulares), se evaluó la
actividad citotóxica antígeno-especifica de linfocitos T alogenicos que expresan HLA-A*02:01 y
HLA-B*44:02. Para evaluar la actividad citotóxica, se tuvo en cuenta el fenotipo HLA de las
líneas celulares que se utilizaron para el ensayo de citotoxicidad. La línea celular SiHa es
homocigota y no expresa HLA-A*02:01 ni HLA-B*44:02, mientras que la línea celular MDA-
MB-231, expresa HLA-A*02:01. La actividad citotóxica se determinará por la expresión de
citoquinas (INF y TNF); proteínas de la apoptosis temprana CD107a (LAMP-1), CD107b
(LAMP2) y proteínas citotóxicas como perforina y granzima.
Palabras clave: Cáncer, Inmunoterapia, HLA-I, ensayos de citotoxicidad, Linfocitos T
citotóxicos.
7
CONTENIDO
AGRADECIMIENTOS .............................................................................................................................................. 3
RESUMEN .............................................................................................................................................................. 5
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................................................ 9
LISTA DE TABLAS .............................................................................................................................................. 9
LISTA DE ABREVIATURAS ............................................................................................................................... 9
INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................................ 11
1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ....................................................................................................... 15
1.1 DESCRIPCIÓN DEL PROBLEMA ....................................................................................................................... 15
1.2 PREGUNTA PROBLEMA: ................................................................................................................................. 17
1.3 JUSTIFICACIÓN .............................................................................................................................................. 17
1.4 OBJETIVOS .................................................................................................................................................... 19
2. MARCO TEÓRICO ......................................................................................................................................... 19
2.1 ¿QUÉ ES EL CÁNCER? .................................................................................................................................... 19
2.2 SISTEMA INMUNE Y CÁNCER ......................................................................................................................... 21
2.2.1 Células implicadas en la respuesta inmune contra tumores ................................................................ 22
2.3 EDICIÓN INMUNE: ......................................................................................................................................... 24
2.4 MECANISMOS DE EVASIÓN TUMORAL ........................................................................................................... 27
2.5 COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD (MHC) ................................................................................ 28
2.5.1 Estructura de las Moléculas de HLA ................................................................................................... 30
2.6 HLA Y CANCER......................................................................................................................................... 33
2.7 RESPUESTA INMUNE ANTITUMORAL ............................................................................................................. 35
2.8 RECONOCIMIENTO DE LA CÉLULA BLANCO MEDIADO POR EL TCR ............................................................... 36
3. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................................... 37
3.1 LÍNEA CELULAR TUMORAL SIHA: ................................................................................................................. 38
3.2 LÍNEA CELULAR TUMORAL MDA ................................................................................................................. 38
3.3 CULTIVOS DE LÍNEAS CELULARES ................................................................................................................. 39
3.4 CITOQUINAS ................................................................................................................................................. 39
3.5 PREPARACIÓN DEL LISADO TUMORAL ........................................................................................................... 39
3.6 DETERMINACIÓN DE LA INMUNOGENICIDAD DE LAS CÉLULAS TUMORALES. ................................................. 40
3.6.1 Tipificación de HLA-A ......................................................................................................................... 40
3.6.2 Preparación de células T ..................................................................................................................... 41
3.6.3 Siembra y separación de los PBMC..................................................................................................... 42
3.6.4 Obtención de células dendríticas (CD) a partir de monocitos de sangre periférica. .......................... 44
3.6.5 Generación de linfocitos TCD8 antigeno-especificos .......................................................................... 44
3.6.6 Evaluación de la citotoxicidad ............................................................................................................. 45
4. RESULTADOS ............................................................................................................................................ 46
4.1 DETERMINACIÓN DE LA INMUNOGENICIDAD DE LAS CÉLULAS TUMORALES .................................................. 46
4.1.1 Determinación del alelo de histocompatibilidad HLA*02:01 .............................................................. 46
4.1.2 Separación de PBMC: ......................................................................................................................... 47
8
4.1.3 Generación de células dendríticas a partir de monocitos de sangre periférica de donadores HLA-
A*02:01 .............................................................................................................................................................. 51
4.1.4.Generación de linfocitos TCD8 antigeno-especificos .......................................................................... 58
EVALUACIÓN DE LA CITOTOXICIDAD DE LOS LINFOCITOS TCD8+ ESPECÍFICOS DE TUMOR
DE CÉLULAS SIHA Y MDA. .................................................................................................................................. 59
DISCUSION .......................................................................................................................................................... 60
CONCLUSIONES ................................................................................................................................................ 68
BIBLIOGRAFIA .................................................................................................................................................. 69
9
Lista de figuras
Figura 1. Características del cáncer .............................................................................................. 20
Figura 2: Inmunoedición del cáncer. .......................................................................................... 27
Figura 3: Esquema de los locus del MHC humano.………………………………….………….31
Figura 4. Estructura del HLA de clase II. ..................................................................................... 32
Figura 6. Ensamblaje de la molécula de HLA .............................................................................. 33
Figura 7. Pureza de la población CD14 ........................................................................................ 45
Figura 8. Linfocitos obtenidos de la fracción negativa por miltenyi…………………………….48
Figura 9. Linfocitos obtenidos de las células no adherentes por el método tradicional………....49
Figura 10. Evolución de la morfología de los monocitos a células dendríticas maduras………..51
Figura 11. Poblaciones celulares de linaje monocitico………………………………………….53
Figura 12.Dot plots obtenidos por citometria de flujo…………………………………………..55
Figura 13. Evaluación microscópica del co-cultivo células dendríticas y linfocitos…..………..58
Figura 14. Evaluación de la citotoxicidad para las líneas celulares tumorales.............................60
Lista de Tablas
Tabla 1. Mecanismos para prevenir la respuesta inmune antitumoral…………………….27
Tabla 2. Tipos de HLA-A de los donadores y las líneas celulares…………………….……….……..47
Tabla 3. Expresión de marcadores de superficie……………………………….……………54
Lista de Abreviaturas
Abreviatura Término
10
CTL: Linfocitos T citotóxicos. “Cytotoxic T lymphocytes”.
APC: Célula presentadora de antígeno. “Antigen presenting cell”.
HLA: Antígeno leucocitario humano. “Human leucocyte antigen”
IHC: Inmunohistoquímica. “Immunohistochemistry”
mAb: Anticuerpo monoclonal. “Monoclonal Antibody”
NK: Células Natural killer.
TAAs: Antígeno asociado a tumor. “Tumor associated antigens”
TAP: Transportador asociado al procesamiento antigénico. “Transporter associated
with Antigen Processing”
LOH: Pérdida de Heterocigosis. “Loss of heterocigosis”
PCR: Reacción en cadena de la polimerasa. “Polymerase Chain Reaction”
MHC: Complejo Mayor de Histocompatibilidad. “Major Histocompatibility Complex
DNA: Ácido desoxirribonucleico. “Deoxyribonucleic acid”
RNA: Ácido ribonucleico. .Ribonucleic Acid
DC: Célula dendrítica “Dendritic Cell”
DCm: Célula dendrítica madura
DCi: Célula dendrítica inmadura
LPS: Lipopolisacárido
TNF Factor de necrosis tumoral alfa
PBMC: Células mononucleares de sangre periférica “Peripheral Blood Mononuclear
Cells”
CTL: linfocito T citotóxico “Cytotoxic T cell”
TCR: Receptor de células T “T Cell Receptor”
MØ: Macrófagos
ADCC: Citotoxicidad celular mediada por anticuerpos: “Antibody Dependent Cell-
Mediated Cytotoxicity”
GM-CSF: Factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos
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INTRODUCCIÓN
El cáncer es un grupo de enfermedades malignas en las que se observa un crecimiento
descontrolado de células anormales en el cuerpo. De acuerdo con la organización mundial de la
salud, el cáncer se considera un problema de salud pública cuya incidencia y mortalidad ha
incrementado en los últimos años (Piñeros & Murillo, 2004). Las modalidades convencionales para
el tratamiento del cáncer como la quimioterapia y radioterapia han avanzado en los últimos años y
se han desarrollado nuevas alternativas terapéuticas. Sin embargo, la mortalidad por cáncer sigue
siendo alta, por lo que se requiere el desarrollo de nuevas intervenciones terapéuticas como la
terapia génica y la inmunoterapia, o una combinación de ambas.
La terapia génica es un tratamiento novedoso que consiste en la introducción de genes
funcionales en células somáticas, con el fin de corregir un defecto genético o ejercer un efecto
terapéutico. Los sistemas virales basados en adenovirus se convirtieron en la herramienta ideal
para mejorar este tipo de terapias debido a sus características que lo hacen un vector eficiente
para la transferencia génica contra el cáncer: transfieren y expresan el gen terapéutico en células
quiescentes o en división, son de fácil manipulación y propagación in vitro, no se integran en el
genoma celular y tienen ciclo de vida lítico, lo que garantiza un efecto antitumoral de corta
duración que protege las células sanas de la exposición prolongada a productos tóxicos
(Rodriguez, Martínez, Cruz, & Combita, 2014)
Las razones por las cuales los tratamientos de inmunoterapia no han tenido la respuesta
clínica esperada son múltiples y tienen que ver por una parte, con el fracaso del control inmune, y
por otra parte con el desarrollo de mecanismos de evasión tumoral que evitan el reconocimiento y
posterior destrucción de las células tumorales por parte del sistema inmune. La inmunidad
12
antitumoral esta mediada por el reconocimiento del complejo HLA/péptido en las células
tumorales por parte del TCR de un linfocito T citotóxico (CTL) especifico. Este reconocimiento
desencadena la eliminación de células infectadas o transformadas y es el principal mecanismo
antitumoral de la inmunidad adaptativa.
Las moléculas de HLA-I se expresan en todas las células nucleadas y presentan antígenos
endógenos a los CTL, los cuales determinarán su estatus de propios o no propios (Mareel &
Leroy, 2003). Estas moléculas son glicoproteínas transmembranales y se forman por el
ensamblaje de tres componentes principales: una cadena polimórfica pesada, una cadena
monomórfica de menor peso molecular conocida como 2m y un péptido resultado de la
degradación de proteínas endógenas de la célula (Seliger, Cabrera, Garrido , & Ferrone, 2002).
En[JARG1] el hombre hay tres loci en el cromosoma 6p21.3 que codifican las cadenas polimórficas
del sistema HLA de clase I (HLA-A, HLA-B y HLA-C), y la 2m es codificada por un gen en el
cromosoma 15q21. El polimorfismo del sistema HLA es fundamental para la unión y
presentación de péptidos antigénicos (Seliger, Cabrera, Garrido , & Ferrone, 2002).
Las células tumorales durante su transformación presentan péptidos alterados en sus moléculas
de HLA-I convirtiéndose en el objetivo de los CTL. Sin embargo, aunque el sistema inmune está
capacitado para reconocer y eliminar las células transformadas, el tumor es capaz de crecer e
invadir un organismo (Mareel,2003). Existe evidencia de que el crecimiento tumoral no se debe
a un defecto en la respuesta inmune sino al desarrollo de estrategias por parte del tumor que
permite su escape del reconocimiento inmune (Mareel;, 2003).
Las células tumorales con alteraciones en la expresión de HLA escapan al reconocimiento por
parte de los linfocitos T previniendo la activación del sistema inmune y limitando la eficacia de
las inmunoterapias basadas en la activación de los linfocitos T, tales como terapias con péptidos o
13
la transferencia adoptiva de células dendríticas o linfocitos T. Estas alteraciones en las células
tumorales pueden deberse a defectos irreversibles en la expresión de la β2-microglobulina o de la
cadena pesada de HLA, que incluyen la perdida de heterocigosis (LOH) y la presencia de
mutaciones en los genes que codifican la cadena pesada de HLA o la β2-microglobulina (Seliger,
Cabrera, Garrido , & Ferrone, 2002). Adicionalmente, la presencia de defectos en la maquinaria
del procesamiento y presentación antigénica se manifiesta en una disminución o pérdida de
expresión de estas moléculas en la superficie celular (Seliger, Cabrera, Garrido , & Ferrone,
2002). Estos mecanismos, conducen al desarrollo de fenotipos tumorales con expresión alterada
de HLA-I que van desde la pérdida total de la expresión hasta la pérdida de un haplotipo
completo, de un locus o de un alelo (Seliger, Cabrera, Garrido , & Ferrone, 2002).
Estudios recientes han demostrado que a pesar de la presencia de gran cantidad de linfocitos T,
y del incremento en la expresión de citoquinas Th1 en el sitio del tumor, en ocasiones no se
presenta actividad citotóxica por parte de los linfocitos TCD8+ (Hicklin & Ferrone, 2002). Esta
falta de actividad antitumoral puede explicarse por la presencia de defectos en la expresión de
HLA-I, que afectan el reconocimiento de los antígenos tumorales por parte de los linfocitos T
CD8+. Estas alteraciones constituyen una estrategia de evasión inmune por parte de las células
tumorales que puede impactar de manera negativa la respuesta clínica a las inmunoterapias
basadas en la activación de linfocitos T CD8+, fundamentales en la respuesta inmune anti-
tumoral (Wu, 2009).
La activación de los linfocitos T requiere de dos señales; La primera señal deriva de la
interacción entre el TCR del linfocito y una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad
(MHC) que presenta un péptido unido en la superficie de la célula tumoral. Esta interacción
activa la señalización intracelular para la liberación de citoquinas que participan en la maduración
14
y proliferación celular. La segunda señal denominada co-estimuladora es dada por la interacción
entre moléculas co-estimuladoras como CD80/CD86 en la superficie de las células presentadoras
de antígenos (APC) con su receptor (CD28) en la superficie del linfocito T. Una vez que un
linfocito T con receptor específico para un complejo MHC en particular ha sido activado,
prolifera en un proceso denominado expansión clonal (Acebes,2015) y secretan citoquinas de tipo
Th1 (INFϒ IL-2 y TNFβ), o Th2 como IL-4, IL-5, IL-10 o IL-13 (Alfaro, et. al, 2013).
Por lo anteriormente expuesto, la eficiencia de las inmunoterapias basadas en la activación de
linfocitos T contra el cáncer, está determinada por el reconocimiento de los TAA presentados en
moléculas de HLA-I, lo que resalta la importancia de la caracterización in vitro de ña respuesta
que se genera cuando las DC pulsadas con antígenos tumorales específicos de cada línea celular
tumoral causan en la activación de los linfocitos T para desencadenar la respuesta inmune.
El presente estudio hace parte del proyecto “Restablecimiento de la expresión de moléculas de
HLA-I en células tumorales y su aplicación en el tratamiento del cáncer” que se está
desarrollando en el Grupo de Investigación en Biología del Cáncer del Instituto Nacional de
Cancerología. Para restablecer la expresión de HLA se construyeron dos adenovirus
recombinantes en los que se clonaron los genes que codifican los alelos HLA-A*02:01 y HLA-
B*44:02 (AdEasy/CMV/HLA-A* 02:01 y AdEasy/CMV/HLA-B*44:02 respectivamente). Con
estos virus recombinantes se infectó la línea celular de cáncer de cuello uterino SiHa y se logró
expresar correctamente la proteína en la superficie celular. El proyecto inicial buscaba comparar
la actividad citotóxica de los linfocitos T sobre la línea celular SiHa con y sin la expresión de este
alelo HLA, mediante un ensayo de citotoxicidad utilizando linfocitos alogenicos que expresaran
los antígenos clonados (HLA-A*02:01 y HLA-B*44:02), con el fin de determinar si el
restablecimiento de la expresión de estas moléculas en la superficie celular restablecía la
15
inmunogenicidad del tumor. Sin embargo, debido al daño de un ultra congelador, el stock
primario de adenovirus recombinantes se dañó, por lo cual se hizo una modificación al protocolo
inicial de trabajo, buscando una línea celular que expresara el alelo HLA- A*02:01 y usarla como
línea de control para la expresión del alelo de HLA-A clonado en vez de la línea celular SiHa
transfectada. De las líneas disponibles, únicamente la MDA-MB-231 expresa el alelo HLA-
A*02:01 pero es homocigota para este alelo.
En este trabajo se desarrolló una metodología para evaluar y comparar la actividad de los
linfocitos T citotóxicos in vitro, frente a dos líneas celulares que presentan el péptido especifico
en diferentes alelos del locus HLA-A: una en el alelo A*02:01 y otra en el A*24:02, al TCR de
los linfocitos HLA-A*02:01(+) con el fin de determinar si la actividad citotóxica de los linfocitos
T CD8 (+) es mayor contra las células que presentan en HLA-A*02:01. Esta metodología se
empleará para evaluar el restablecimiento de la expresión de HLA en líneas celulares tumorales
transfectadas con los adenovirus recombinantes Ad-CMV/HLA-A*02:01 y Ad-CMV/HLA-
B*44:02. A futuro se espera realizar estudios in vivo y posteriormente se propondrá la inyección
intratumoral de adenovirus con el HLA autólogo cuya expresión esté alterada en el tumor, como
terapia adyuvante para la inmunoterapia basada en la activación de linfocitos T.
1. Planteamiento del problema
1.1 Descripción del problema
El cáncer es un problema de salud pública en Colombia, cuya incidencia y mortalidad ha
incrementado durante los últimos años. Actualmente se están llevando a cabo estudios clínicos de
varios tratamientos basados en terapia génica que han podido desarrollarse gracias al avance en el
conocimiento de las interacciones que ocurren entre células neoplásicas y las del sistema inmune.
16
A pesar de los avances en los tratamientos convencionales basados en terapia hormonal, quimio y
radioterapia, no se ha mejorado el pronóstico de los pacientes con cáncer mujeres. (Piñeros
Petersen Marion; Murillo Moreno Raúl Hernando, 2004).
Diferentes métodos de inmunoterapia contra el cáncer se basan en la administración de
péptidos que deben ser presentados en una molécula de HLA-I a los CTL, por lo cual, tanto la
regulación negativa como la pérdida de expresión de estas moléculas en la superficie celular
pueden anular su efecto clínico, lo cual soporta la importancia de verificar la expresión de HLA
en el tumor, antes de iniciar la inmunoterapia y restablecer su expresión normal en las células
tumorales si se encuentran alteraciones que impidan la adecuada presentación de los antígenos
tumorales, y de esta manera, restituir la inmunogenicidad del tumor.
Dado que la terapia génica es una metodología prometedora que puede utilizarse para el
restablecimiento de la expresión normal de estas moléculas en las células tumorales mediante el
uso de vectores adenovirales, y teniendo en cuenta que los productos del proyecto son los
adenovirus recombinantes AdEasy/CMV/HLA-A* 02:01 y AdEasy/CMV/HLA-B*44:02, que
inducen la expresión de estos alelos HLA en las células SiHa, en este estudio vamos a
estandarizar una metodología para determinar mediante ensayos de citotoxicidad, si la expresión
de este antígeno mejora la inmunogenicidad de estas células en comparación con las que no lo
expresan. En el futuro, el uso de adenovirus recombinantes expresando diferentes alelos HLA
pueden ser útiles como terapia neo adyuvante a la inmunoterapia basada en activación de
linfocitos T para incrementar la respuesta clínica a terapias como aquellas dirigidas contra los
puntos de chequeo de la respuesta inmune, cuya expresión depende de la activación de los
linfocitos T.
17
1.2 Pregunta problema:
¿Una metodología basada en ensayos de citotoxicidad es útil para determinar si existen
diferencias en la actividad citotóxica de los linfocitos T CD8 (+) frente a líneas celulares que
presentan sus péptidos tumorales en diferentes alelos del locus HLA-A?
1.3 Justificación
El cáncer es en la actualidad un problema de salud pública, considerándose como una de las
tres causas más frecuentes de muerte en el mundo, con un estimado de 12,7 millones de casos
afectando a ambos sexos por igual. Este número se espera que aumente a 21 millones en 2030
(Vinay, et.al, 2015). En Colombia el cáncer es la tercera causa de muerte después de las
enfermedades cardiovasculares y la violencia. A pesar de los avances en las terapias que se usan
para controlar su progresión, no se ha logrado una mejora significativa en los pacientes, por lo
que se hace necesario desarrollar nuevas estrategias terapéuticas para esta enfermedad.
El principal obstáculo para el tratamiento del cáncer radica en la complejidad de los
mecanismos moleculares que se activan durante la respuesta inmune y los mecanismos de
evasión que desarrolla la célula tumoral para escapar a la detección por parte del sistema inmune
(Seliger, Cabrera, Garrido , & Ferrone, 2002).
Este escape puede atribuirse en parte a defectos en la expresión de HLA-I (HLA-A, B y C), a
alteraciones en la maquinaria del procesamiento antigénico, a la ausencia de señales co-
estimuladoras y a la expresión de señales inmunosupresoras por las células tumorales. Cualquiera
de estos obstáculos puede resultar en la resistencia de la célula tumoral a la destrucción por parte
del sistema inmune (Seliger, Cabrera, Garrido , & Ferrone, 2002).
18
Numerosos reportes demuestran que, durante el proceso de selección inmune, las células con
expresión normal de HLA-I son eliminadas por el sistema inmune mientras que las que presentan
alteraciones en su expresión escapan al reconocimiento inmune, por lo cual numerosas estrategias
inmuno-terapéuticas no han tenido éxito en la clínica (Aptsiauri, Cabrera et al., 2007). En
consecuencia, el restablecimiento de la expresión de HLA-I mediante transferencia génica en
células tumorales negativas para la expresión de estas moléculas puede ser una estrategia
interesante para optimizar los tratamientos inmuno-terapéuticos contra el cáncer (Hacker, 2006).
Se han desarrollado numerosas metodologías de terapia génica para restablecer la expresión de
HLA en células tumorales, (Hui, 1984), (Imboden, 2001), (Baba, 2007), (Lou, 2005); (Tao,
2008), y recientemente se recuperó la expresión de HLA en células tumorales humanas mediante
la transferencia del gen de la β2m utilizando vectores adenovirales (del Campo, 2009), sin
embargo, la transferencia del gen de la β2m no permite restablecer la expresión de HLA en los
casos en que la pérdida se debe a la presencia de alteraciones irreversibles en el gen de la cadena
pesada.
La importancia de este trabajo radica en el hecho de que a futuro este proyecto puede conducir
al desarrollo de nuevas estrategias para el tratamiento del cáncer que incluyan la transferencia
génica para corregir las alteraciones genéticas en la cadena pesada de HLA-I que contribuyen al
escape de la inmuno-vigilancia en células tumorales y de esta manera optimizar los protocolos de
inmunoterapia para el cáncer. Adicionalmente, abrir el campo de investigación en inmuno-
genética y terapia génica para el tratamiento del cáncer puede conducir al desarrollo de múltiples
alternativas terapéuticas o de diagnóstico que además pueden aplicarse al tratamiento de otras
enfermedades relacionadas con las alteraciones en la expresión de estas moléculas.
19
1.4 Objetivos
1.4.1 General.
Evaluar el efecto citotóxico de linfocitos T HLA-A*02:01 sobre líneas celulares tumorales
positivas y negativas para la expresión de este antígeno.
1.4.2 Específicos.
Cultivar las líneas celulares tumorales SiHa y MDA para verificar su expresión de HLA-
A*02:01 por citometría de flujo.
Realizar ensayos de citotoxicidad para verificar la actividad de los linfocitos T sobre las
líneas celulares MDA (positiva para HLA-A*02:01) y SiHa (negativa para HLA-
A*02:01).
Correlacionar los resultados obtenidos en las dos líneas celulares tumorales con diferente
expresión de HLA-A* 02:01.
2. Marco teórico
2.1 ¿Qué es el cáncer?
El cáncer es un grupo de enfermedades que se caracterizan por presentar un crecimiento
descontrolado de algunas células en el organismo (Acebes, 2015), debido a una acumulación de
mutaciones que modelan la célula con características que les permiten escapar de los mecanismos
de control del ciclo celular y la senescencia para sobrevivir y diseminarse.
Hannahan y Weinberg en su publicación “the Hallmarks of cancer” describen en detalle
características que adquieren las células tumorales para favorecer su crecimiento y diseminación
metastásica (Figura 1) :
20
(i) mantenimiento de la proliferación, (ii), evasión de los supresores del crecimiento, (iii),
inmortalidad replicativa, (iv); resistencia a la muerte celular, (v); inducción de la angiogénesis,
(vi), capacidad de invasión y metástasis, (vii) capacidad de reprogramar el metabolismo
energético, (viii), y evasión de la destrucción inmune. (Hanahan, 2011).
Figura 1. Características del cáncer. A. Los originales sellos distintivos del cáncer, modelo propuesto por
Hanahan y Weinberg (The hallmarks of cáncer, 2000) que define las seis propiedades que adquiere y caracterizan a
un tumor maligno. B. En su revisión de 2011, Hanahan y Weinberg incorporan otros dos nuevos "sellos distintivos"
del cáncer (Hanahan, 2011[JARG2]).
Para que una célula normal cambie su fenotipo y se convierta en una célula neoplásica, deben
ocurrir varias mutaciones a través del tiempo. El cáncer comienza en una célula alterada que
normalmente es eliminada por el sistema inmune para evitar su proliferación, sin embargo, esta
célula alterada puede escapar al control del sistema inmune (Instituto Nacional del Cancer, 2006),
y continuar proliferando de tal manera que en cada estadio del desarrollo tumoral nuevas
minorías con inmunogenicidad reducida quedan seleccionadas, convirtiéndose en la estirpe
dominante (Massague, 2009), lo que trae como consecuencia el desarrollo del tumor.
21
El desarrollo del cáncer ocurre en tres etapas conocidas como: Iniciación, promoción y
progresión. La etapa de iniciación se da a nivel genómico, como consecuencia de la exposición a
carcinógenos físicos, químicos o microbiológicos, que inducen una serie de mutaciones que
alteran el ciclo celular o la senescencia. La etapa de promoción se caracteriza por la participación
de receptores de membrana y factores de crecimiento, algunas hormonas y citoquinas pro
inflamatorias que transmiten el mensaje proliferativo para inducir el crecimiento tumoral y
durante la etapa de progresión, las células tumorales adquieren la capacidad de invadir los tejidos
vecinos o a distancia. (Martin & Domingo, 2011).
Para diseminarse, las células tumorales desarrollan mecanismos para separarse de su tejido de
origen, en un proceso conocido como transición epitelio-mesenquimal que les confiere a las
células tumorales la capacidad de degradar la matriz extracelular y migrar a sitios distantes
(Massague, 2009). Sin embargo, para sobrevivir, las metástasis deben ser capaces de inducir la
angiogénesis, que es la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de vénulas post-capilares
preexistentes, lo que facilita porte de oxígeno y nutrientes para las células malignas (Gorrin,
2003).
2.2 Sistema Inmune y cáncer
El papel que desempeña el sistema inmune en el control de tumores fue propuesto inicialmente
por Thomas y Burnet en 1957, con la teoría de la Vigilancia inmunológica. Esta teoría postula,
que dentro de un organismo siempre se están produciendo células malignas, que son identificadas
y eliminadas por el sistema inmune antes de que se conviertan en cáncer (Acebes, 2015). Sin
embargo, a pesar de la inmuno-vigilancia las células transformadas presentan mecanismos de
evasión a la respuesta inmune, que les permite crecer eficientemente. La escasa inmunogenicidad
de los antígenos tumorales, la velocidad del crecimiento tumoral que supera la velocidad de la
22
respuesta inmune, la pérdida total o parcial de los antígenos HLA- I, la activación de una
respuesta inflamatoria crónica local que impide el reclutamiento de las células efectoras contra el
tumor, y la secreción de factores inmunosupresores son algunos de los mecanismos que permiten
el escape del tumor al control de la respuesta inmune (Rodríguez& Zaragosa, 1995).
El proceso de vigilancia inmune se ha evidenciado gracias a los reportes de numerosos
estudios que indican una mayor incidencia de tumores en el período neonatal y en edades
avanzadas, en animales timectomizados y en humanos inmunodeprimidos, cuando el sistema
inmune funciona con menos efectividad (Rodríguez& Zaragosa, 1995). Adicionalmente, la larga
historia natural de la enfermedad y las curaciones espontáneas ocasionales de los carcinomas in
situ, demuestran que efectivamente, existen mecanismos de defensa inmune capaces de controlar
el desarrollo tumoral (Batista, 2003).
2.2.1 Células implicadas en la respuesta inmune contra tumores
En la respuesta inmune antitumoral intervienen células de la inmunidad innata y adaptativa,
que actúan en conjunto para lograr la destrucción de las células tumorales. Los principales
efectores de la inmunidad antitumoral son los linfocitos T y las células NK, sin embargo, la
participación de las APC es fundamental para la inducción de una respuesta inmune adaptativa
eficiente contra los tumores.
Las células NK son las principales efectoras de la inmunidad innata contra las células
infectadas por virus y las células tumorales. Son capaces de destruir muchos tipos de células, pero
en particular aquellas que pierden la expresión de HLA-I, un mecanismo comúnmente utilizado
por los virus y las células tumorales para escapar al reconocimiento por parte de los linfocitos T.
Las células NK no expresan receptores específicos de antígeno, sino que su activación depende
del balance entre señales activadoras e inhibidoras y la principal señal inhibidora está dada por el
23
reconocimiento de las moléculas de HLA-I, por lo cual, la pérdida de expresión de estas
moléculas en la superficie de las células tumorales las convierte en objetivo de las células NK. Su
capacidad para matar células tumorales es potenciada por citoquinas como interferones e
interleuquinas (IFN, IL-2, IL12) (Abbas, Lichtman, & Pillai, 2015). (Lorenzo, 2014).
Los linfocitos T CD8+ por su parte, son el principal componente de la inmunidad adaptativa
para la destrucción de las células tumorales. Son fundamentales para la vigilancia inmune contra
el cáncer porque reconocen y destruyen directamente a las células tumorales debido a que estas
expresan péptidos derivados de proteínas endógenas y dado que el cáncer es una enfermedad del
DNA, en la célula tumoral se generan péptidos también alterados que son presentados en HLA-I,
Los linfocitos T CD4+ ayudadores (LTh) polarizan la respuesta hacia una respuesta celular (Th1)
o humoral (Th2). Los linfocitos Th1 secretan citoquinas como IL-2, e IFN γ, que estimulan la
inmunidad mediada por células. (Abbas, Lichtman, & Pillai, 2015).
Como se mencionó anteriormente, las APC profesionales son fundamentales para la
generación de respuestas inmunes adaptativas. Estas células, además de ser capaces de fagocitar,
procesar y presentar antígenos de células tumorales en HLA-II a los linfocitos T CD4+, están
implicadas en la producción de citoquinas como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF) con
fuerte actividad citotóxica, factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-
CSF) e Interleuquina 1(IL-1) (Batista, 2003).y expresan receptores para la fracción constante de
las inmunoglobulinas (Fc) (Kindt, Goldsby, & Osborne, 2007).
Para que se desarrolle una respuesta inmune efectiva contra los tumores, deben participar
diferentes poblaciones celulares del sistema inmune adaptativo (linfocitos T y B (LT y LB)), e
innato (células Natural Killer (NK), macrófagos (MØ) y células dendríticas (CD)) y moléculas
solubles como citoquinas, quimioquinas y factores de crecimiento. Sin embargo, esta respuesta
24
efectiva del sistema inmune ejerce una presión selectiva que tiene como consecuencia la inmuno-
edición, un proceso por el cual las células tumorales que no son destruidas por la inmunidad,
pueden evolucionar modificando sus antígenos y generando variantes tumorales con la capacidad
de evitar el reconocimiento inmune y la destrucción. De hecho, el sistema inmune es
aprovechado por los tumores para promover su propio crecimiento (Tham & Abastado, 2011). La
edición inmune explica por qué algunos tumores permanecen inactivos durante años y por qué
crecen a pesar de que el huésped tenga un sistema inmune completamente funcional (Vinay, y
otros, 2015).
2.3 Edición inmune:
Esta teoría explica la interacción entre el sistema inmune y el tumor dividiéndolas en tres
fases: Eliminación, equilibrio y escape (Dunn, Old, & Schreiber, 2004). (Figura. 2)
Durante la fase de eliminación los TAA desencadenan una respuesta inmune que conduce a la
destrucción de células neoplásicas, previniendo el desarrollo de cáncer (Tham & Abastado,
2011). Esta etapa corresponde a la idea clásica de inmuno-vigilancia presentada por Burnet y
Thomas en la que la inmunidad innata y adaptativa trabajan de forma concertada para erradicar
los tumores en desarrollo. (Acebes, 2015). Como consecuencia del crecimiento tumoral, se va
generando el microambiente tumoral en el que las células tumorales conviven con células del
estroma y secretan moléculas pro-inflamatorias como señal de peligro para reclutar células del
sistema inmune innato, capaces de identificar las células tumorales mediante interacciones
receptor-ligando. Esta interacción induce la producción de INF- y otras citoquinas que
participan en la eliminación de las células tumorales (Acebes, 2015). En esta fase las células NK
juegan un papel importante en la destrucción del tumor, generando una gran cantidad de TAAs
que son fagocitados y procesados por las APC para presentarlos en su superficie en moléculas de
25
HLA-II. Las CD inmaduras, estimuladas por las condiciones inflamatorias y habiendo fagocitado
apoptosomas producto de la muerte de las células tumorales por citotoxicidad celular mediada
por anticuerpos (ADCC), migran a los ganglios regionales para presentar los TAA fagocitados en
forma de péptidos cargados en moléculas de HLA-II a los linfocitos T CD4+ vírgenes. Una vez
que el linfocito T CD4+ reconoce el antígeno y recibe las señales co-estimuladoras, induce la
expresión del receptor para la IL2 y comienza a secretar la IL-2 para, de manera autocrina, para
regular su expansión clonal y posteriormente se diferencian hacia el fenotipo Th1 capaces de
activar una respuesta inmune celular contra las células tumorales, mediada por linfocitos T CD8+
(Acebes, 2015).
En la fase de equilibrio el sistema inmune es capaz de reconocer y destruir a las células
tumorales que presentan sus antígenos de manera adecuada. Sin embargo, la inestabilidad
genética y la presión inmune pueden generar células con inmunogenicidad reducida capaces de
evadir el control inmune para sobrevivir en un huésped inmunocompetente (Dunn, Old, &
Schreiber, 2004), y continuar dividiéndose y acumulando mutaciones en respuesta a la
inflamación crónica. Se mantiene un equilibrio entre el control inmune y desarrollo tumoral que
genera una fase de latencia del tumor, la más larga de las tres porque implica la erradicación
continua de células tumorales y la aparición continua de variantes resistentes por selección
inmune (Vinay, y otros, 2015). Es decir que el sistema inmune, durante esta fase protege al
huésped contra la formación de tumores, pero también modela la inmunogenicidad del tumor
mediante el establecimiento de una respuesta inflamatoria crónica, la cual genera un
microambiente inmunosupresor que favorece el desarrollo y diseminación del cáncer (Chow,
Moller, & Smyth, 2012).
26
Por último, durante el escape las variantes tumorales seleccionadas en la etapa de equilibrio
por su baja inmunogenicidad y su capacidad para evadir al sistema inmune se desarrollan en un
entorno inmunológicamente activo y se manifiestan clínicamente (Acebes, 2015). Esta fase
ocurre por cambios en las células tumorales o en el microambiente tumoral (Chow, Moller, &
Smyth, 2012), pero también puede ser consecuencia de alteraciones en la presentación de los
antígenos tumorales, debidas a daños en la maquinaria de procesamiento y presentación
antigénica, lo que facilita la evasión del reconocimiento por parte del sistema inmune adaptativo
(Dunn, Old, & Schreiber, 2004). (Acebes, 2015). Por otra parte, el microambiente tumoral,
caracterizado por la presencia de poblaciones celulares tales como las células del estroma o las
células inmunes además de las células tumorales es modificado por la producción conjunta de
factores de crecimiento, moléculas inmunosupresoras y citoquinas pro-inflamatorias (factor de
crecimiento del endotelio vascular (VEGF), el factor de crecimiento transformante beta (TGF-β
Interleuquina (IL)-10, prostaglandina E2 (PGE2), fosfatidilserinas solubles, Fas soluble o la
indolamina 2,3-dioxigenasa), para establecer un ambiente inmunosupresor que promueva la
formación de metástasis al aumentar la permeabilidad vascular e inducir la transición epitelio-
mesenquimal (EMT) que favorece la invasión y colonización de nuevos tejidos (Tham &
Abastado, 2011). Sumado a esto, los tumores reclutan células T reguladoras (Treg) y células
supresoras derivadas de mieloides (MDSC), capaces de inhibir la respuesta antitumoral del
huésped (Chow, Moller, & Smyth, 2012).
27
Figura 2.Inmunoedición del cáncer (Lorenzo, 2014). Mecanismo de supresión tumoral que está constituido por
tres fases consecutivas. En la fase de eliminación interviene la inmunidad innata y adaptativa para destruir las células
tumorales iniciales. Si no se logra eliminar el tumor, continua con la fase de equilibrio, dando lugar a variantes
capaces de evadir el sistema inmune, y finalmente se entra en la fase de escape en la que las variantes inmunogénicas
proliferan dando lugar a un tumor visible clínicamente.
2.4 Mecanismos de evasión tumoral
Los tumores malignos tienen mecanismos que les permiten resistir a la respuesta inmunitaria
del huésped y progresar a fases más avanzadas. Los principales mecanismos de escape tumoral se
resumen en la tabla 1.
28
Tabla 1. Mecanismos para prevenir la respuesta inmune antitumoral.
Mecanismo Descripción
Baja
inmunogenicidad
1. Pérdida o regulación negativa de la expresión de antígenos asociados al
tumor en las células tumorales.
2. Pérdida o regulación negativa de la expresión de HLA para evitar el
reconocimiento por parte de los linfocitos T citotóxicos.
3. Pérdida o regulación negativa de la expresión de moléculas co-
estimuladoras en el tumor o en las APCs (DCs, MØ, LB), indispensables
para la interacción eficiente con los linfocitos T.
4. Defectos en la maquinaria del procesamiento antigénico (TAP, LMP2,
LMP7).
5. Cambios inducidos por el tumor en moléculas transductoras de señales en
los linfocitos T
6. Pérdida o regulación negativa de la expresión de moléculas de adhesión en
linfocitos.
Tolerancia
1. Neutralización de la respuesta inmune a través de la inducción de anergia o
debido a la eliminación clonal de los linfocitos T específicos.
Modulación
antigénica
1. Pérdida de antígenos por internalización inducida por anticuerpos o
variación antigénica.
Inmunosupresión
inducida por el
tumor
1. Activación de células reguladoras del sistema inmune que secretan
citoquinas inhibidoras.
2. Utilización de factores estimulantes, que favorecen el crecimiento tumoral,
producidos luego de la activación del sistema inmune (TGF-b).
3. Secreción de factores inmunosupresores por los tumores (prostaglandina E2
e IL-10).
Ignorancia
1. Secreción de factores por las células tumorales que crean una barrera física
para el sistema inmune.
2. Pérdida de antígenos tumorales en los órganos linfoides
3. Crecimiento en sitios con privilegio inmune (no vigilados por el sistema
inmune).
4. Pérdida de moléculas de adhesión (inhibe la infiltración de linfocitos).
Resistencia a la
apoptosis
1. Sobreexpresión de moléculas anti apoptosis.
Rápida
proliferación
celular
1. Logra superar la capacidad de respuesta del sistema inmune,
estableciéndose una masa tumoral.
Tomado de: (Rodriguez, 2007)
29
2.5 Complejo mayor de Histocompatibilidad (MHC)
Los genes que codifican HLA son los más polimórficos del genoma con más de 5000 alelos
con diferente secuencia de aminoácidos y con más de 250 especificidades serológicas para cada
locus de HLA (Abbas, Lichtman, & Pillai, 2015). Las regiones más polimórficas de la molécula
se localizan en la región de unión al péptido, determinando la especificidad de la unión y el
reconocimiento del antígeno por las células T.
Los genes de HLA se expresan de forma codominante, es decir que cada individuo expresa
todos los alelos de estos genes que ha heredado del padre y de la madre; maximizando el número
de moléculas de HLA disponibles para que se unan péptidos para ser presentados a las células T
(Abbas, Lichtman, & Pillai, 2015). Existen dos tipos de genes HLA polimórficos, HLA de clase I
(HLA-I) y HLA de clase II (HLA-II), que codifican dos tipos de moléculas con estructuras
distintas, pero homologas: HLA-I presenta péptidos endógenos que son reconocidos por los
linfocitos T CD8+ y HLA-II presenta péptidos exógenos que son reconocidos por los linfocitos T
CD4+ (Abbas, Lichtman, & Pillai, 2015). Además de los genes HLA-I y HLA-II, existe otra
región génica conocida como HLA-III que codifica para varias proteínas de las cuales
algunas participan en la respuesta inmune como los componentes del sistema de
complemento y algunas moléculas relacionadas con la inflamación, pero estructuralmente
son diferentes a las de clase I y II. (Kindt, Goldsby, & Osborne, 2007). (Fig.3)
30
Figura 3. Esquema de los locus del MHC humano. Esquema de la región génica que codifica los genes del
MHC humano. (Tomado de Celular and Molecular Immunology. Abbas, A., Lichtman, A., & Pillai, S., 2015)
2.5.1 Estructura de las Moléculas de HLA
Las moléculas de HLA pertenecen a la super-familia de las inmunoglobulinas, y están
implicadas en procesos de reconocimiento antigénico. Presentan una hendidura polimórfica en la
región extracelular para la unión del péptido antigénico, esta hendidura se forma por el
plegamiento de la molécula y está compuesta por hélices alfa pareadas que descansan sobre una
superficie de 8 cintas beta. Dentro y alrededor del sitio de unión al péptido se encuentran los
aminoácidos polimórficos de la molécula a los que se une el péptido antigénico para ser
presentados al TCR que reconoce el péptido junto con las hélices alfa de la molécula de HLA.
Esta variabilidad de aminoácidos en el sitio de unión al péptido permite acomodar diferentes
péptidos según su secuencia de aminoácidos, lo que genera la especificidad del reconocimiento
antigénico por parte de los linfocitos T. (Abbas, Lichtman, & Pillai, 2015). Como se mencionó
anteriormente, las moléculas de HLA-I y II tienen estructuras diferentes pero homólogas. La
molécula de clase II está formada por dos cadenas pesadas α y β unidas mediante interacciones
no covalentes. Son glicoproteínas de membrana que poseen cada una, una región citoplasmática,
una transmembrana, y una extracelular con dos dominios externos. Los dominios α1 y β1 forman
el sitio de unión al péptido, donde pueden acomodar péptidos de entre 10 y 30 aminoácidos, y los
31
dominios a2 y b2 más cercanos a la membrana plegados en dominios inmunoglobulina (figura 3).
Estas cadenas pesadas están codificadas por genes polimórficos localizados en 6p21.3 (Kindt,
Goldsby, & Osborne, 2007) (Abbas, Lichtman, & Pillai, 2015). Este complejo es expresado por
las APC (CD, MØ y LB), en células endoteliales y en el epitelio del timo y presenta péptidos
exógenos que son reconocidos por el TCR de los linfocitos T CD4 (+).
A. B.
Figura 4. Estructura del HLA de clase II. Tanto las moléculas de clase I como las de clase II pertenecen a la
súper-familia de las inmunoglobulinas. Cada cadena pesada contiene dos dominios, la cadena alfa, α1 y α2, y la
cadena beta, β1 yβ2. Los dominios α1 y β1 forman la hendidura de unión al péptido y los dominios α2 y β2 son los
que se encuentran más cerca a la membrana, plegados en dominios de inmunoglobulinas. (Tomado de Celular and
Molecular Immunology. Abbas, A., Lichtman, A., & Pillai, S., 2015)
Por su parte, las moléculas de clase I son glicoproteínas de membrana, al igual que las de clase
II, pero a diferencia de estas, están compuestas por una cadena pesada una cadena liviana , la
β2 microglobulina (β2m), y un péptido antigénico. La cadena pesada contiene una región
citoplasmática una transmembrana, y una extracelular con tres dominios 1, 2 y 3. Los
dominios 1 y 2 forman el sitio de unión al péptido donde pueden acomodar péptidos de entre 8
y 10 amino ácidos, y el dominio 3, más cercano a la membrana, está plegado en dominio
inmunoglobulina. La cadena pesada , codificada en 6p21.3, está unida de manera no covalente
32
con una cadena liviana , la β2 microglobulina (β2m), codificada en 15q21 (Figura. 5) (Kindt,
Goldsby, & Osborne, 2007). Este complejo se expresa en todas las células nucleadas y presenta
péptidos endógenos. Para que se expresen las moléculas de clase I maduras, cargadas de péptido
en la superficie celular se requiere la coordinación de tres procesos: la degradación de proteínas
endógenas a péptidos en el proteosoma, la translocación de estos péptidos a través de la
membrana del retículo endoplásmico; el ensamblaje del complejo trimolecular y su transporte a la
superficie celular (Figura 6)
A. B.
Figura 5[JARG3]. Estructura de HLA-I. . Estructura de HLA-I. Izquierda muestra el ensamblaje completo de la
molécula y a la derecha se observa la vista superior de la hendidura de unión de péptidos. En esta molécula el sitio de
unión al péptido está entre los dominios α1 y α2 de la cadena pesada y el dominio de inmunoglobulina se va a
encontrar en la subunidad α3 y en la β2m. A este dominio se une el CD8+. Los péptidos que se presentan en la
hendidura son producto de la degradación de proteínas por el proteosoma que genera péptidos pequeños para unirse a
HLA, ser presentados y reconocidos por los linfocitos TCD8+ (Abbas, Lichtman, & Pillai, 2015) (Tomado de
Celular and Molecular Immunology. Abbas, A., Lichtman, A., & Pillai, S., 2015)
Además de esta vía clásica para la presentación de antígenos endógenos en HLA-I, existe una
vía por la cual se procesan antígenos exógenos para ser presentados en HLA-I (Reimann y
Kaufmann, 1997). Esta vía, que parece estar restringida a las APC, se denomina la vía de
presentación cruzada o cross priming. APCs profesionales como las CD, internalizan antígenos
33
exógenos por endocitosis, los procesan y salen de la via endosomica hacia el citosol, donde
pueden ingresar a la vía clásica de presentación de HLA- I (Wilson y Villadangos, 2005).
2.6 HLA Y CANCER
La degradación de proteínas endógenas en péptidos se inicia cuando una proteína propia es
marcada por la ubiquitina, para su degradación en el proteosoma, donde son reducidas a péptidos
de 7 a 9 aminoácidos cuya translocación desde el citosol, a través de la membrana del retículo
endoplásmico al lumen, es llevada a cabo por las proteínas transportadoras de antígeno (TAP-I y
TAP-II), el ensamblaje del complejo trimolecular (HLA-I/2m/péptido) se lleva a cabo en el
retículo endoplásmico con ayuda de las chaperonas calnexina, calreticulina y tapasina, y el
transporte de la molécula a la superficie celular para presentar los antígenos al TCR de un CTL
(Fig. 6), se hace a través del aparato de Golgi. Si la célula está infectada por algún parásito
intracelular o si está sufriendo un proceso de transformación maligna, presenta péptidos alterados
en sus moléculas de HLA-I a los linfocitos T CD8 (+) (Abbas, Lichtman, & Pillai, 2015). El
reconocimiento del péptido alterado en la molécula de HLA induce la activación del linfocito T
que se polariza y destruye la célula blanco. Es decir, que la célula tumoral es inmunogénica
cuando expresa sus antígenos HLA-I presentando TAA y por ello utiliza la desregulación de la
expresión de HLA para escapar a la respuesta inmune.
A pesar de lo anteriormente expuesto, el cáncer ocurre y se disemina, en parte debido al
desarrollo de estrategias de evasión por parte del tumor, que le permiten escapar al reconocimiento
inmune. (Mareel, 2003). Como se mencionó anteriormente, el mecanismo de evasión más
comúnmente utilizado por las células tumorales es la desregulación en la expresión de HLA en la
superficie celular, por lo cual, frecuentemente ocurren alteraciones en la expresión esta molécula
en las células malignas.
34
Figura 6. Ensamblaje de la molécula de HLA. Proceso de ensamblaje de la molecula HLA, que inicia con la
degradación de proteínas en el proteosoma hasta conventirse en péptidos de 7 a 9 aminoacidos, luego se trasloca
desde el citosol al lumen del retículo endoplasmatico, el ensmblje es llevado a cabo por las proteínas transportadoras
de antígeno (TAP-I y TAP-II), el ensamblaje del complejo trimolecular (HLA- l
retículo endoplásmico con ayuda de las chaperonas calnexina, calreticulina y tapasina, y el transporte de la molécula
a la superficie celular para presentar los antígenos al TCR de un CTL se hace a través del aparato de Golgi.
Cualquier defecto en el funcionamiento de los componentes de la maquinaria del
procesamiento y presentación antigénica puede afectar la expresión de HLA-I en la superficie
celular y por lo tanto, la capacidad de los linfocitos T para reconocer a la célula tumoral
(Cromme & et.al., 1994) (Seliger & et al., 1996) (Seliger B. C., 2002).
Además de los defectos en los componentes de la maquinaria del procesamiento antigénico,
existen numerosos mecanismos moleculares que alteran la expresión de HLA en los tumores tales
como los defectos en la expresión de la β2-microglobulina, las alteraciones en los mecanismos
reguladores de la expresión de HLA-I, las mutaciones en la cadena pesada de HLA-I, y la pérdida
de heterocigosis (LOH) en la región 6p21.3 que contiene los genes que codifican para HLA-I
(Cabrera, 2003). Estos mecanismos conducen al desarrollo de fenotipos tumorales alterados para
la expresión de HLA-I (Aptsiauri N. C.-L., 2013) que pueden conducir a la evasión inmune por
parte del tumor.
35
Por otra parte, es importante mencionar que en el tumor existen otros mecanismos de evasión
tumoral. Algunos, relacionados de manera directa con la expresión alterada de HLA como la
desregulación de HLA-II, o la expresión aberrante de HLA-I no-clásicas; otros, que de manera
indirecta pueden inhibir la expresión de HLA (-A, -B, -C) y sobre regular la expresión de HLA-
G como la secreción de IL-10 (Rodriguez, y otros, 2011) (Urosevic & Dummer,R., 2003) y otros
no relacionados con HLA como la inducción de tolerancia, modulación antigénica,
inmunosupresión inducida por el tumor, ignorancia inmune, resistencia a la apoptosis y el
incremento en la tasa de proliferación celular. Estas alteraciones en conjunto pueden conducir al
escape tumoral. Los principales mecanismos de escape tumoral se resumen en la tabla 1.
2.7 Respuesta inmune antitumoral
La respuesta inmune anti-tumoral más importante está dada por la respuesta celular.
Aunque existen ejemplos de antígenos de superficie reconocidos por anticuerpos, estos tienen
más importancia en la detección y tipificación de los tumores que en el aspecto terapéutico
(Zinkernagel & Doherty, 1974). Es claro que la respuesta del sistema inmune hacia los antígenos
tumorales sigue esencialmente las mismas reglas que aplican para todos los antígenos.
Normalmente, las células dendríticas (APC) infiltrantes de tumor toman los antígenos asociados a
tumor (AAT), los procesan y los expresan en asociación con moléculas de HLA-II. Una vez que
migran a los nódulos linfáticos cercanos al tumor, estas células dendríticas cargadas con
antígenos tumorales presentan los antígenos a los linfocitos T CD4 (+) que proliferan y favorecen
una respuesta inmune celular mediada por linfocitos T CD8 (+) específicas de tumor (Armstrong,
Pulaski, & Ostrand-Rosenberg, 1998) . La destrucción de las células tumorales por los linfocitos
TCD8 (+) es específica puesto que únicamente destruye las dianas que expresan el mismo
antígeno asociado a HLA- I que indujo su activación y proliferación y no destruyen células no
36
tumorales adyacentes que expresen sus antígenos propios. Recientemente se ha demostrado que
las células dendríticas que migran a los nódulos linfáticos pueden interactuar directamente con
células T CD8 (+) y presentar antígenos tumorales en HLA-I en un proceso conocido como
“crosspriming” o presentación cruzada (Heath & Carbone, 1999).
Posterior al reconocimiento del antígeno por los linfocitos T CD4 (+) y CD (8)+ específicos de
tumor y a su co-estimulación, estas células entran en un proceso de expansión clonal y
diferenciación en células efectoras y células de memoria. Las efectoras son capaces de cooperar
para la destrucción de las células tumorales.
2.8 Reconocimiento de la célula blanco mediado por el TCR
En humanos, todas las células nucleadas expresan hasta seis moléculas de clase I diferentes, y
contienen tres loci (HLA-A, -B y -C). Las moléculas HLA pueden presentar una gran variedad de
péptidos. Se estima que puede haber hasta 250,000 moléculas de cada HLA-I en la superficie de
una célula (Parham y Ohta, 1996). El péptido antigénico presentado en HLA-I es un evento
crucial de la respuesta inmune celular, el TCR reconoce el complejo MHC-péptido con sus
dominios variables (Garboczi et al., 1996) y aunque la afinidad de la interacción entre el TCR y
el péptido/MHC es de menor intensidad que la de las interacciones entre antígeno-anticuerpo,
estas interacciones débiles son suficientes para iniciar la transducción de señales en los CTL.
Adicionalmente, las moléculas de HLA no solo sirven para presentar antígenos al TCR, también
actúan como ligandos no antigénicos específicos para los correceptores del TCR (clase I- CD8 y
clase II- CD4).
En los CTL, el CD8 tiene dos funciones como receptor: reconoce el ligando e inicia la
transducción de la señal. Sin embargo, CD4 y CD8, no son los únicos correceptores importantes
para la activación de CTL CD8 +.
37
Un único TCR puede reconocer varios ligandos péptido/MHC: Los ligandos agonistas son los
complejos péptido/MHC que inducen la transducción de señal de TCR completa, lo que resulta
en cambios de la expresión génica; los ligandos antagonistas inhiben la respuesta inducida por el
agonista, y algunos ligandos inhiben múltiples respuestas celulares (proliferación y producción de
citoquinas) a la vez que inducen cambios en la expresión génica y la respuesta funcional de las
células T. Más aún, inducen respuestas desencadenadas por ligandos agonistas, por lo que se
denominan agonistas parciales, esta señalización agonista parcial puede conducir a respuestas
celulares cualitativamente diferentes a las inducidas por la señalización agonista. Por ejemplo: los
linfocitos T vírgenes proliferan y se diferencian en respuesta a un agonista, o sobreviven sin
proliferar o diferenciarse en respuesta a un agonista parcial, y el TCR es único por ser un receptor
que interpreta diferencias sutiles en la estructura del ligando para determinar cuál de las
diferentes respuestas celulares es la que se requiere.
Una vez que el receptor del antígeno de los CTL reconoce al péptido en el HLA-I de la célula
tumoral, se genera la sinapsis inmunológica entre las dos células que genera señales para activar
al CTL, lo que conduce a la muerte de la célula blanco en un lapso de 2 a 6 horas. El principal
mecanismo de destrucción del CTL es la liberación de proteínas citotóxicas (granzima A, B, y C
y perforina), almacenadas dentro de gránulos citoplasmáticos, hacia la célula diana, lo que induce
su muerte celular por apoptosis. (Abbas, Lichtman, & Pillai, 2015).
3. Materiales y Métodos
La metodología empleada para la verificación de la respuesta citotóxica por parte de los
linfocitos T CD8+ específicos de tumor, se desarrolló siguiendo el ensayo de citotoxicidad
propuesto por Olguin, (2012), con algunas modificaciones. Inicialmente se obtuvieron células
dendríticas maduras para la captación, procesamiento y presentación de antígenos tumorales
38
provenientes de lisados tumorales de las líneas celulares SiHA y MDA-MB-231, a los Linfocitos
de sangre periférica (CD4+ y CD8+) alogénicos, con el fin de analizar su actividad citotóxica en
respuesta a la presentación antigénica en diferentes alelos de la molécula HLA-A.
3.1 Línea celular tumoral SiHa:
La línea celular SiHa es una línea celular de carcinoma escamo celular de cérvix, que se
estableció a partir de fragmentos de una muestra de tejido primario obtenida después de la cirugía
de una paciente japonesa de 55 años. Esta línea celular tiene integradas 1 a 2 copias de HPV-16
por célula y es Homocigota. Su fenotipo HLA es: HLA-A*24:02/24:06/24:07 – HLA-
A*24:02/24:06/24:07; HLA-B*40:02/40:09/40:27 – HLA-B*40:02/40:09/40:27 y HLA-
C*03:04/03:05/03:06 – HLA-C*03:04/03:05/03:06
3.2 Línea celular tumoral MDA
La línea celular MDA-MB-231 es una línea celular epitelial de cáncer de mama humano que
se estableció a partir de un derrame pleural de una mujer caucásica de 51 años con un
adenocarcinoma mamario metastásico. El fenotipo de esta línea celular es triple negativo, ya que
no expresa receptor de estrógeno (ER), de progesterona (PR), ni el factor de crecimiento
epidérmico humano (HER2) es altamente agresivo, invasivo y pobremente diferenciado
(European collection of authenticated cells cultures, 2017). Esta línea celular es heterocigota para
los locus B y C pero homocigota para el locus A y su fenotipo HLA es: HLA-
A*02:01/02:07/02:09 – HLA-A*02:01/02:07/02:09; HLA-B*40:02–HLA-B*41:01 y HLA-
C*17:01/17:03–HLA-C*02:02.
39
3.3 Cultivos de líneas celulares
Las líneas celulares SiHa y MDA-MB-231, fueron obtenidas de la ATCC (American Type
Culture Collection) y se encontraban conservadas con medio de congelación (90% de suero fetal
bovino + 10% de Dimetil sulfoxido), y almacenadas en tanques de nitrógeno líquido, en el
laboratorio de Biología del Cáncer del Instituto Nacional de Cancerología.
Las células fueron descongeladas rápidamente y re-suspendidas en medio DMEM
suplementado con suero fetal bovino al 10% y 1% de antibióticos (Penicilina, Estreptomicina y
Anfotericina B). Las suspensión celular se centrifuga a 1500rpm por 7 minutos, se descarta el
sobrenadante y el precipitado celular se re suspende en 4ml del mismo medio (DMEM
suplementado) y se siembra en cajas de 25cm2. Las cajas se incuban a 37°C con 5% de CO2 y
humedad al 90%. A las 24h se realiza cambio de medio de cultivo con el fin de eliminar detritos
y células muertas. Para el mantenimiento, se realiza cambio de medio cada 5 días o según la
confluencia celular.
3.4 Citoquinas
Las citoquinas utilizadas fueron: GM-CSF, IL-4 e IL-2 (R&D system), y como súper-
antígeno, el lipopolisacárido (LPS). Todos los reactivos venían listos para usarse, y se prepararon
de acuerdo con las instrucciones del proveedor, a las concentraciones necesarias para realizar la
estimulación de los cultivos. Se almacenaron a -20°C.
3.5 Preparación del lisado tumoral
Cuando las líneas celulares tumorales SiHa y MDA-MB-231 que estaban en cultivo alcanzan
un 80% de confluencia, se tripsinizaron para despegarlas de la caja, se colectaron en un tubo
falcon, se lavaron con 10ml de medio DMEM sin suplementar y se centrifugaron a 1500rpm por
40
5 minutos para eliminar completamente la tripsina. El pellet celular se re-suspendió en 1ml de
medio DMEM sin suplementar y se sometieron a 5 ciclos de congelamiento en nitrógeno líquido
y descongelamiento a en baño serológico a 37°C por inmersión. El sobrenadante se separó por
centrifugación y se almacenó a -80°C hasta su uso para la estimulación de las células dendríticas
inmaduras.
3.6 Determinación de la inmunogenicidad de las células tumorales.
Con el fin de comprobar si las células tumorales que expresan HLA-A*02:01 son más
fácilmente reconocidas y destruidas por linfocitos T CD8+ alogénicos que expresan este HLA-
A*02:01 que las que no lo expresan, se evaluó la actividad citotóxica de los linfocitos en dos
líneas celulares, una positiva para el alelo HLA-A*02:01 (MDA-MB-231) y la otra negativa para
la expresión de este alelo (SiHa), mediante la medición de citoquinas por citometría de flujo.
3.6.1 Tipificación de HLA-A
Tanto las muestras de los donadores sanos como las líneas celulares disponibles en el
laboratorio fueron tipificadas para HLA-I en el Laboratorio Medico Echavarria. Para realizar la
tipificación de los donadores sanos, se extrajo ADN a partir células mononucleares de sangre
periférica (PBMCs), aisladas por un gradiente de densidad. El ADN se extrajo con fenol-
cloroformo-alcohol isoamílico, se precipitó con isopropanol, se lavó con etanol al 70% y se re-
suspendió en buffer TE. La tipificación de alelos Clase I (A, B, C) se llevó a cabo mediante
métodos moleculares de amplificación de DNA seguido de hibridación con sondas de secuencia
específica (PCR-SSO). Las cuales reconocen polimorfismos en el segundo y tercer exón en las
moléculas de Clase I. (Sistema Gen-Probe Trasplant Diagnostic-Lifecodes, Inc Stanford CT) y
analizados en el sistema LUMINEX 200.
41
3.6.2 Preparación de células T
Se obtuvieron muestras de aproximadamente 25ml de sangre periférica de un donante sano
que expresaba el alelo HLA-A*02:01 por punción venosa, para obtener cerca de 3,8 x105 células
mononucleares de sangre periférica (PBMC). La sangre extraída por punción venosa se
centrifugó a 1500rpm por 7 minutos con el fin de obtener el buffy coat (capa de leucocitos).
El el buffy coat se extrajo en un tubo de 15ml y se adicionó PBS 1x hasta completar un
volumen de 6 ml. Simultáneamente, en otro tubo de 15ml, se adicionaron 3ml ficoll-hystopaque
para formar el gradiente de densidad. El buffy coat diluido en PBS se adicionó lentamente con el
tubo inclinado para que no se rompiera el gradiente, y rápidamente de centrifugó a 2000 rpm, por
20 minutos, a 20°C y en desaceleración cero.
Una vez que transcurridos los 20 minutos, se observaron en los tubos 4 capas: una superior
que corresponde al plasma, la siguiente, que se observa como una nube de color blanco
correspondiente a los PBMCs, la siguiente correspondiente al reactivo Ficoll-Hypaque, y en el
fondo del tubo los eritrocitos. La capa de PBMC se retiró con mucho cuidado utilizando una
pipeta Pasteur procurando no tomar ficoll en el proceso y posteriormente se realizaron 2 lavados
con PBS 1X y se centrifugaron a 1500rpm por 10 minutos para eliminar el ficoll que es muy
tóxico para las células.
42
3.6.3 Siembra y separación de los PBMC
Los PBMCs obtenidos mediante separación por gradientes de densidad contienen dos
poblaciones celulares (linfocitos y monocitos) que deben separarse para realizar los ensayos de
citotoxicidad. Las células se re-suspendieron en DMEM suplementado con 10% de SFB. Se
realizó recuento celular en cámara de neubauer y 1x106 células por pozo fueron sembradas en
los ocho pozos centrales de placas de 24 pozos. En los pozos externos se sirvieron 300l de PBS
estéril para evitar la desecación de las placas y la contaminación. Las células fueron incubadas
por 2 horas a 37°C y 5% de CO2 y tras el tiempo de incubación se retiraron las que quedaron sin
adherirse a la placa de cultivo, se comprobó su naturaleza y pureza mediante citometría de flujo
usando los anticuerpos CD4 Per CP, CD8 PE, CD3 FITC (Pharmigen a Becton Dickinson). Se
transfirieron a una nueva placa de cultivo con medio fresco y se estimularon con 10ng/ml de IL-
2. Se incubaron a 37°C y 5% de CO2 hasta su uso. Cada tercer día se cambió el medio y se
adicionó nuevamente el estímulo con la IL-2.
3.6.4 Método de separación magnética MACS
Otro método utilizado para separar PBMCs en monocitos y linfocitos es mediante el uso de
perlas magnéticas que se encuentran unidas a anticuerpos específicos. La separación se lleva a
cabo haciendo pasar una muestra previamente incubada con micro esferas paramagnéticas
adheridas a la superficie celular mediante un anticuerpo específico, a través de una columna que
contiene una matriz de esferas ferromagnéticas recubiertas de un material inerte que no daña las
células. Cuando se coloca la columna sobre un imán, las esferas crean un campo magnético de
gran intensidad que atrae fuertemente las micro esferas MACS y las células unidas a ellas,
mientras que las células que no se unen fluyen libremente a través de la columna.
43
Los PBMC obtenidos luego de la separación realizada con Ficoll-Histopaque se centrifugaron
a 300xg por 10 minutos, 107 células se re suspendieron en 80l de buffer específico para MACS
y 20ul de anticuerpo específico para monocitos (CD14 microbeads- Rochem Biocare Colombia
SAS- Miltenyi Biotec) posteriormente la suspensión celular se incubó por 25 minutos. Las
células se lavaron con 1 a 2ml de buffer específico y se centrifugaron a 300xg por 10 minutos. El
pellet se re suspendió en 500ul de buffer y se procedió a la separación magnética para separar por
selección positiva los monocitos y por selección negativa los linfocitos. Para la separación
magnética se utilizaron columnas LS que permiten separar una mayor cantidad de células.
Inicialmente se colocó la columna en el campo magnético y se realizó un lavado a la columna con
3ml de buffer, se adicionó la suspensión celular marcada con CD14 microbeads y se lavó 3 veces
la columna con 3 ml de buffer, el eluído se colectó en un falcon (Fracción negativa-linfocitos) y
una vez concluidos los lavados, se adicionaron 5 ml de buffer dentro de la columna, se retiró del
campo magnético e inmediatamente se presionó la columna con el embolo semejando una
jeringa. El flujo se colectó en otro falcon y las células que se obtuvieron fueron aquellas que se
encontraban adheridas a la columna y marcadas magnéticamente (fracción positiva-monocitos).
Las células obtenidas fueron sembradas en placas de 12 pozos y se les aplicaron los estímulos
en las mismas condiciones como se explicó anteriormente para los linfocitos y los monocitos. Se
realizó un análisis fenotípico mediante citometría de flujo para comprobar la pureza de los
monocitos separados por MACS y estimulados con GM-CSF e IL-4 para diferenciarlos a CDi.
Los anticuerpos utilizados para monocitos fueron CD14 FITC, CD45 PE, HLA-DR PE, CD83
PECy5. Para los linfocitos obtenidos también se realizó citometría de flujo para verificar su
naturaleza y pureza usando los anticuerpos CD4 Per CP, CD8 PE, CD25 APC, CD3 FITC.
44
3.6.5 Obtención de células dendríticas (CD) a partir de monocitos de sangre periférica.
Las células obtenidas luego de la incubación de 2 horas, la fracción adherente (corresponde
principalmente a monocitos y macrófagos) que quedó en la placa de cultivo de 12 pozos fueron
colectadas e incubadas a 37°C y 5% de CO2 por un periodo de 48h con medio DMEM
suplementado con 10% de SFB, en donde las primeras 24h se les da estímulos con 1000U/ml de
GM-CSF y 500U/ml de IL-4 de la compañía GenProducts . Transcurridas las siguientes 24h se
adiciona el lisado tumoral de SIHA y MDA-MB-231 para lograr su captación por las células
dendríticas inmaduras en una concentración de 10ug/ml (corresponde a 10ul de lisado), tiempo
tras el cual se adicionó el lipopolisacarido (LPS) para finalizar la estimulación, y se incubaron
por 24h mas. Las células generadas después de recibir estos estímulos fueron células dendríticas
maduras que presentaban de manera específica el antígeno de interés para el estudio que se
utilizaron para la generación de linfocitos TCD8 (+) específicos de antígeno.
Se realizó un análisis fenotípico para comprobar la pureza de las células dendríticas separadas
y bajo los estímulos de GM-CSF e IL-4. Se realizó citometría de flujo de las células bajo ningún
estímulo y posteriormente con los estímulos para verificar la naturaleza y maduración de las
células. Los anticuerpos utilizados fueron CD14 FITC, CD45 PE, HLA-DR PE, CD83 PECy5.
3.6.6 Generación de linfocitos TCD8 antigeno-especificos
Los linfocitos de sangre periférica previamente separados y bajo los estímulos de IL-2 fueron
co- cultivados en medio DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino en conjunto con
las células dendríticas pulsadas con el lisado tumoral de SIHA y MDA-MB-231 en una relación
efector: estimulador de 10:2 durante 7 días, durante este tiempo los cultivos se mantuvieron bajo
los estímulos de IL-2 y cada tercer día se reemplazaba la mitad del medio y se daban los
45
estímulos con IL-2. Luego de los 7 días de incubación, se da un re-estimulo con 1x105 células
dendríticas frescas pulsadas con el antígeno por un lapso de 24h. Los linfocitos activados fueron
sometidos a una separación magnética MACS de acuerdo a las instrucciones del fabricante,
donde se incubaron con el anticuerpo CD3 mycrobeads específico para linfocitos T. Los
linfocitos T marcados con el anticuerpo de perlas magnéticas se unirán al magneto y serán
separados del resto de células, luego se toman estas células se mantienen bajo estímulos de IL-2 y
anticuerpo CD3 para su proliferación hasta el momento de la evaluación de la citotoxicidad en
contra de las líneas celulares MDA-MB-231 y SIHA según corresponda. La pureza de la
separación magnética se realiza mediante citometría de flujo utilizando anticuerpos (CD3- Cy
Chrome, CD4-FITC, CD8-PE).
3.6.7 Evaluación de la citotoxicidad
Las líneas celulares MDA-MB-231 y SIHA fueron co-cultivadas con los linfocitos
estimulados anteriormente para antígeno especifico de MDA-MB-231 y SIHA en una relación
1:1 por 4 horas. Como control se utilizó un co-cultivo con linfocitos que no fueron estimulados
con ningún tipo de citoquina ni lisado tumoral. Luego de este tiempo se analizó la expresión de
INF y TNF en los linfocitos T CD4 (+) específicos de tumor y por otro lado, y se analizó la
actividad citotóxica de los linfocitos T CD8 (+) específicos mediante la medición de la expresión
de proteínas de expresión temprana de la apoptosis: CD107a (LAMP-1), CD107b (LAMP2) y
perforina.
46
4. RESULTADOS
4.1 Determinación de la inmunogenicidad de las células tumorales
4.1.1 Determinación del alelo de histocompatibilidad HLA*02:01
Para llevar a cabo los ensayos in vitro, las muestras de 5 donadores sanos y 5 líneas celulares
disponibles en el laboratorio fueron tipificadas para HLA-I en el Laboratorio Medico Echavarría.
De los 5 donadores sanos, 3 eran heterocigotos para la expresión del alelo HLA-A*02:01. La
línea celular SiHa no expresa el alelo HLA-A*02:01, y es homocigota para HLA-I y II y el alelo
del locus -A es HLA-A*24:02. En contraste, la línea celular MDA-MB-231 es homocigota para
HLA-A*02:01.
Tabla[JARG4] 2. Tipos de HLA-A de los donadores y las líneas celulares.
Donador Expresión de alelos HLA-
A
Tipificación HLA-A
MDA A*02 A*02 A*02:01 A*02:01
SiHa A*24 A*24 A*24:02 A*24:02
1 A*02 A*23 A*02:01 A*23:01
2 A*11 A* 24 A*11:03 A*24:02
3 A*02 A*24 A*02:01 A*24:02
4 A*24 A *68 A*24:14 A *68:02
5 A*02 A*24 A*02:01 A*24:02
Se eligieron las líneas celulares SiHa y MDA-MB-231 debido a su diferente expresión de HLA. La línea SiHa,
por ser negativa para la expresión de HLA-A*02:01, utilizada como línea de control para la infección con los
adenovirus recombinantes construidos en el laboratorio, Ad/CMV/HLA-A*02:01 y Ad/CMV/HLA-B*44:02, y la
línea MDA-MB-231 positiva para la expresión de HLA-A*02:01.
47
4.1.2 Separación de PBMC:
Para la obtención de las APCs se utilizaron dos métodos de separación: el convencional que
permite la adherencia de los monocitos al fondo del frasco de cultivo mediante una incubación
por 2 horas a 37°C con 5% de CO2, después de las cuales se retiran los linfocitos que quedan en
suspensión y la separación magnética, que separa los monocitos por selección positiva con el
anticuerpo anti-CD14 unido a las microbeads y los linfocitos por selección negativa. La pureza de
las poblaciones celulares separadas por ambos métodos se comprobó por citometría de flujo con
anticuerpos específicos de linfocitos T (CD3, CD4, CD8) y de monocitos (CD14). La citometría
de flujo nos permitió identificar las poblaciones celulares presentes en las fracciones obtenidas
por ambos métodos y nos permitió determinar la viabilidad por tamaño (FSC) y granularidad
(SSC). La población celular se desplaza hacia arriba y hacia la derecha dependiendo de los
parámetros analizados.
La separación de monocitos y linfocitos a partir de los PBMC por el método tradicional nos
permitió obtener una viabilidad celular mayor al 90%, sin embargo, la pureza de la fracción
positiva correspondiente a las células de linaje monocitico (CD14+) no fue significativa ya que
correspondió al 0,022% (fracción delimitada por la línea negra) y, por otra parte, se observó una
segunda población de células vivas fuera del cuadrado de delimitación que corresponde a los
linfocitos.
En la separación de monocitos (fracción positiva CD14+) y linfocitos (fracción negativa), por
medio de perlas magnéticas, obtuvimos PBMCs con una viabilidad mayor del 90% y con
porcentajes de pureza para CD14+ mayores al 50% (fracción delimitada por la línea negra). La
citometría separó dos poblaciones celulares: una positiva para CD14+ y otra negativa, que
correspondió a los linfocitos (fuera del cuadrado de delimitación). La separación magnética es
altamente selectiva para el tipo celular que se desee separar, por lo que la pureza de las células
48
CD14+ debería estar cerca al 90% y la fracción negativa (linfocitos) no debería evidenciarse en el
diagrama.
Las células de la fracción negativa separadas por miltenyi (figura 2), correspondieron a
linfocitos: 22.05% son CD8+ y 40.65% son CD4+, mientras que la población de monocitos
(CD14+) fue de solo un 0.12%, lo cual nos demostró que el método de la columna de perlas
magnéticas es eficiente para la separación de linfocitos puesto que las células eluídas (que son
negativas para el anticuerpo anti-CD14), corresponden totalmente a linfocitos.
Por otra parte, con el método de separación tradicional, las células en suspensión que se
retiraron de los frascos de cultivo después de las 2 horas de incubación tuvieron una viabilidad
del 77.8%, y de ellas, el 10,4% son CD14+ El 16.66% son linfocitos T CD8+ y un 32.96% son
linfocitos T CD4+. En adición a la baja viabilidad celular y a la mayor cantidad de detritos
celulares en comparación con las células obtenidas por miltenyi, se encontró una menor cantidad
de células CD8 y CD4 con respecto al método miltenyi. Por otro lado se evidencia la presencia de
células CD14+ indicando que la separación no es completamente exitosa y en el sobrenadante
aún hay presencia de monocitos.
Teniendo en cuenta lo anterior, el método que muestra un mejor porcentaje de pureza y de
identidad para monocitos (CD14+) y linfocitos es el método de separación magnética; siendo el
método elegido para los siguientes ensayos.
49
Pureza de la población de monocitos (CD14+)
A. Método Convencional
B. Separación magnética fracción positiva:
.
Figura 7. Pureza de la población CD14+ separadas por el método tradicional (A) y por separación con anticuerpos
monoclonales anti-CD14 acoplados a perlas magnéticas utilizando el sistema de MiniMaCs – Miltenyi (B). El Gate
de células seleccionado corresponde a las células viables identificadas por tamaño (FSC-A) y granularidad (SSC-A),
93.3% para el método tradicional y 96,9% para el método de separación por miltenyi. De las células viables se
selecciona el Gate positivo para el anticuerpo CD14+ marcado con el fluorocromo FITC. Para el método tradicional
la pureza de la población de CD14+ corresponde al 0.022% y para el método de separación magnética corresponde
al 82.3%.
Gate células
Gate anticuerpo CD14+ Gate células
50
Pureza de la población de linfocitos (CD4+ y CD8+) (Fracción negativa)
Figura 8[JARG5]. Linfocitos obtenidos de la fracción negativa por el método miltenyi. El Gate de células
viables corresponde al 91,3%, de las cuales las positivas para CD14+ corresponden al 0,12%. El Gate
correspondiente para linfocitos muestra un porcentaje de 22.05% para CD8 y un 40.65% para CD4.
Gate células Gate células Gate Anticuerpo CD14
Gates Anticuerpo CD4 – CD8
51
B. Linfocitos obtenidos de las células no adherentes correspondiente a la separación por
método tradicional.
Figura 9[JARG6]. Linfocitos obtenidos de las células no adherentes por el método tradicional. El Gate de
células viables corresponde al 77,8%, de las cuales las positivas para CD14+ corresponden al 10,4%. El Gate
correspondiente para linfocitos muestra un porcentaje de 16.66% para CD8 y un 32.96% para CD4.
4.1.3 Generación de células dendríticas a partir de monocitos de sangre periférica de
donadores HLA-A*02:01
Con el fin de obtener APCs para estimular la generación de linfocitos específicos de antígeno
de las líneas celulares SiHa y MDA-MB-231, los monocitos obtenidos por el método de
separación magnética fueron sometidos a un periodo de incubación de 48h en medio de cultivo
Gate células Gate células Gate Anticuerpo CD14
Gates Anticuerpo CD4 – CD8
52
DMEM suplementado con 10% de SFB y 1% de antibióticos a 37°C y una atmosfera de 5% de
CO2, las primeras 24h se mantuvieron con estímulos de GM-CSF e IL-4 y luego por 24h mas se
adicionó el lisado de cada línea tumoral y lipopolisacarido (LPS) como estímulo de maduración,
tiempo tras el cual los monocitos maduran a células dendríticas. La maduración se confirmó
mediante observación morfológica de las células durante el periodo de incubación y un análisis
fenotípico por citometría de flujo utilizando marcadores de superficie, expresados por las células
dendríticas maduras (CDm) pero no por los estadios inmaduros. Los marcadores de maduración
utilizados fueron: CD83 PerCp-Cy5, HLA-DR- PE, y, además, se analizó la expresión de un
marcador indicador de inmadurez en este linaje, el marcador CD14- FITC. Los marcadores de
superficie mostraron los resultados esperados, indicaron que los monocitos de sangre periférica
presentan una maduración a células dendríticas en un periodo de 48h con los estímulos
mencionados anteriormente, lo cual se evidencia morfológicamente (Figura 10) Además, la
expresión de CD14 (marcador de monocitos) disminuye a medida que las células adoptan
características de célula dendrítica inmadura (CDi) y célula dendrítica madura (CDm); HLA-DR
se expresa en un 99% de las células y se incrementa la expresión de CD83, lo que indica que los
monocitos se diferenciaron a CDi y posteriormente a CDm. La figura 11 muestra el efecto del
tratamiento de las CDi con los lisados tumorales obtenidos de las líneas celulares tumorales
MDA-MB-231 y SiHa en la expresión de los tres marcadores de superficie en las CD.
53
A B
C
Figura 10. Evolución de la morfología de los monocitos a células dendríticas maduras. A. monocitos sin
ningún tipo de estímulo. B. monocitos estimulados durante las primeras 24 horas con GM-CSF y IL-4. C. células
dendríticas maduras al finalizar las 48 horas de estimulación. morfológicamente
Se realizaron tres ensayos independientes para optimizar los resultados. Los cuales se
muestran los en los dot plots de uno de tres experimentos independientes.
A. Gate FSC-A vs FSC-H.
Gate FSC-A vs. FSC-H células sin estímulos Gate FSC-A vs. FSC-H células con estímulos
54
B. Gate población de Interés.
C. Monocitos con estímulos de citoquinas y lisado tumoral.
Gate CD14- CD sin estímulos
Gate Población de interés células sin estímulos Gate Población de interés células con estímulos
Gate CD14 CDm MDA Gate CD14 CDm SiHa
55
Figura 11. Poblaciones celulares de linaje monocitico. (a) Gate de células viables seleccionado para el análisis
posterior de cada uno de los anticuerpos (b) Gate de células de la población de interés (células de linaje monocitico)
con una viabilidad mayor al 70%. (C) células marcadas con los anticuerpos de superficie CD14+, HLA-DR+,
CD83+, donde se observa la expresión de estos marcadores en células sin estímulos de citoquinas, y células con
estimulo inicial de 24h con GM-CSF en una concentración de 1000U/ml e IL-4 en una concentración de 500U/ml y
con estimulo final de LPS en una concentración de 10ng/ml y lisado tumoral de MDA y SiHa, cada ensayo se realizó
por triplicado y se muestran los dot plots representativos de tres experimentos independientes.
Los dot plots permiten analizar la expresión de dos marcadores al mismo tiempo en el
disperso-grama de manera que se pueden evidenciar los cambios de marcadores para ambas
Gate HLA-DR
Gate CD83
CDm MDA CDm SiHa
Células sin estímulos CDm MDA CDm SiHa
Células sin estímulos
56
condiciones, en las células estimuladas y sin estimular. Se obtuvieron monocitos CD14+, HLA-
DR+ y CD83- y células dendríticas maduras que fueron CD14 - HLA-DR+ CD83+ (figura 11).
Además, la morfología celular evaluada por microscopía de luz permitió observar células grandes
y con prolongaciones de la membrana, características de células dendríticas (figura 10). En las
células sin estimular el dot plot muestra exactamente un CD14+ en mayor proporción con
respecto a los marcadores de CD83 y HLA-DR, y en las células estimuladas se observa la
fracción de CD14 negativa y un desplazamiento mayor a la derecha del HLA-DR con un aumento
del 96% y un CD83 positivo en un 13%.
Tabla 3. Expresión de marcadores de superficie.
Expresión de CD14+, HLA-DR, CD83 en monocitos sin estímulos y CDm en 72 h de cultivo.
71,4
1,08
18,7
66,2
96,9 99,9
4,0513,1
22,1
0
20
40
60
80
100
120
monocitos CDm con lisado de SiHa CDm con lisado de MDA
Expresión de marcadores de superficie
CD14+ HLA-DR CD83
57
A. Células sin estímulos B. células con estímulos de citoquinas
Figura 12. Dot plots obtenidos por citometria de flujo que muestran la expresión de CD14, HLA-DR, y CD83 en
células dendríticas sin estimulo (a) y con estimulo de citoquinas (b).
Gates HLA-DR – CD14
Gates HLA-DR – CD83
Gates CD14 – CD83
Gates HLA-DR – CD14
Gates HLA-DR – CD83
Gates CD14 – CD83
58
4.1.4.Generación de linfocitos TCD8 antigeno-especificos
Al comprobar la maduración de las células dendríticas a las 72 horas, se realizó el co-cultivo
con los linfocitos previamente separados y estimulados con IL-2 en conjunto con las células
dendríticas pulsadas con el lisado tumoral de SiHa y MDA-MB-231 durante 7 días.
Aproximadamente a los 4 días de cultivo se observó a las CDm rodeadas por los linfocitos y al
finalizar el co-cultivo se observó que las CDm tienen un cambio en su morfología, presentando
formación de velos, lo que corresponde a células dendríticas maduras muy eficaces y sugiere que
los linfocitos T están siendo activados.
Figura 13[JARG7]. Evaluación microscópica co-cultivo células dendríticas y linfocitos. Células dendríticas
maduras que en su periferia están rodeadas de linfocitos en lo cual se sugiere está ocurriendo el proceso de
presentación de antígeno (A), células dendríticas con velos formadas al sexto día de co-cultivo debido a que los
linfocitos T están siendo activados (B).
59
4.1.5 Evaluación de la citotoxicidad de los linfocitos TCD8+ específicos de tumor de
células SiHa y MDA.
Se realizaron co-cultivos entre los linfocitos TCD8+ previamente activados y las líneas
celulares en una relación 1:1, tras un periodo de incubación de 4 horas se midieron los niveles de
expresión de las proteínas tempranas de apoptosis CD107a (LAMP-1), CD107b (LAMP2) y
perforina mediante citometría de flujo. Sin embargo, en el análisis realizado por citometría de
flujo se expresaron las proteínas en los ensayos realizados únicamente con el lisado para línea
celular tumoral SiHa, para la línea celular tumoral MDA-MB-231 no se logró ningún resultado
positivo.
Figura 14. Evaluación de la citotoxicidad para las líneas celulares tumorales. El resultado del Dot plot
muestra un aumento de los anticuerpos Perforina, LAMP1 y LAMP2 en los linfocitos estimulados específicamente
para la línea celular tumoral SiHa.
Estimulado Sin estimular
60
5. DISCUSION
El cáncer es una de las principales causas de muerte a nivel mundial, por lo cual se han
realizado muchos estudios con el fin de comprender los mecanismos biológicos y moleculares
por los que se genera la progresión de los tumores en los seres humanos (Hanahan, 2011). Uno
de los principales mecanismos de escape de la vigilancia inmune utilizado por el tumor es la
expresión alterada de HLA-I, una molécula fundamental para la presentación de antígenos a los
linfocitos T citotóxicos.
Múltiples inmunoterapias basadas en la activación de células T han sido desarrolladas hasta la
fecha con el fin de incrementar la respuesta antitumoral específica del sistema inmune. Un
ejemplo de ellas es la transferencia adoptiva de células T autólogas modificadas In vitro para
potenciar su actividad antitumoral y reinyectarlas de nuevo en el paciente con el fin de lograr la
destrucción del tumor (Olguin, 2012).
En este trabajo se desarrolló una metodología para evaluar y comparar la actividad de los
linfocitos T citotóxicos in vitro, frente a dos líneas celulares que presentan el péptido especifico
en diferentes alelos del locus HLA-A: una en el alelo A*02:01 y otra en el A*24:02, al TCR de
los linfocitos HLA-A*02:01(+) con el fin de determinar si la actividad citotóxica de los linfocitos
T CD8 (+) es mayor contra las células que presentan en HLA-A*02:01. Esta metodología se
empleará para evaluar el restablecimiento de la expresión de HLA en líneas celulares tumorales
transfectadas con los adenovirus recombinantes Ad-CMV/HLA-A*02:01 y Ad-CMV/HLA-
B*44:02. A futuro se espera realizar estudios in vivo y posteriormente se propondrá la inyección
intra-tumoral de adenovirus con el HLA autólogo cuya expresión esté alterada en el tumor, como
terapia adyuvante para la inmunoterapia basada en la activación de linfocitos T
61
Inicialmente se tipificó la molécula de HLA-A tanto para las líneas celulares tumorales como
para los 6 donantes sanos, en busca del alelo especifico HLA-A*02:01 el cual es importante para
el estudio por ser uno de los más frecuentes en la población Colombiana de acuerdo a varios
estudios de frecuencias alélicas del sistema HLA-I (Ossa, Manrique, Quintanilla, & Peña, 2007)
(Arrunategui, Villegas, & Ocampo, 2013) La alta frecuencia de expresión de este alelo en la
población es ventajosa al diseñar una terapia personalizada para el cáncer, ya que construyendo
adenovirus recombinantes que expresen los alelos más frecuentes en la población, podríamos
contar con una reserva de adenovirus para cubrir la necesidad inmediata de esta terapia adyuvante
en la mayoría de los pacientes. Adicionalmente, se debe tener en cuenta, que en caso de que este
tipo de terapias pueda utilizarse para el tratamiento del cáncer, sería de vital importancia tipificar
los alelos de HLA en sangre periférica y en la superficie de las células tumorales para realizar un
diagnóstico acertado y elegir la mejor terapia adyuvante para cada paciente en particular o para
determinar que paciente puede beneficiarse de alguna de las inmunoterapias existentes en la
actualidad.
Según lo esperado, nuestros resultados de la tipificación de HLA-I corroboran la abundancia
de este alelo en nuestra población, puesto que de 5 pacientes sanos, 3 (60%), eran heterocigotos
para la expresión del alelo HLA-A*02:01 que, como se mencionó anteriormente, es el alelo más
frecuente del locus HLA-A. (Shengli, Miaomiao, Han, & Hong, 2013). Por otra parte, la línea
celular MDA-MB-231 resultó ser homocigota para el locus A, pero heterocigota para los locus B
y C, lo que sugiere que esta expresión homocigota puede deberse a LOH en 6p21.3
específicamente en el locus A. Esta línea celular no había sido caracterizada para la expresión de
HLA a pesar de haberse utilizado en múltiples estudios de inmunoterapia para el cáncer de mama
triple negativo. El resultado de la tipificación de la línea celular SiHa nos muestra un fenotipo
homocigoto para todos los locus HLA-I lo cual podría deberse a la pérdida de un haplotipo HLA-
62
completo y en el locus HLA-A expresa el alelo HLA-A*24:02. Este resultado está de acuerdo
con lo reportado en la literatura, ya que en varias publicaciones se menciona su estatus
homocigoto. (Siabatto, 2015) (Martínez & Navarro, 2003) (Ruiz, Rodriguez, & Combita, 2017),
Sin embargo, esta es la primera vez que se realiza la tipificación de HLA-I para definir su
aplicación en el desarrollo de trabajos experimentales en inmunoterapia génica.
Posteriormente se estandarizó el protocolo para la separación y siembra de los monocitos
resultantes del gradiente de densidad Ficoll-Hystopaque utilizado para separar los PBMCs. Se
evaluó el método para la separación de monocitos por adherencia al plástico conocido como
método convencional, (Olguin, 2012) (Hernandez, 2015) (Ramos, 2015) (Granados & Delgado,
2008) (Cuevas, 2008), y el método de separación magnética Mini Macs (miltenyi) (Cuellar,
Cifuentes, & Gonzales, 2004). Los resultados muestran que los monocitos separados por el
método convencional tienen una adherencia más rápida a la placa (2 a 3 horas) después de las
cuales se pueden iniciar los estímulos para la realización del ensayo de citotoxicidad (Olguin,
2012) (Hernandez, 2015) (Ramos, 2015) (Granados & Delgado, 2008) (Cuevas, 2008), mientras
que las células separadas por miltenyi tardan más de 24 horas en adherirse a la placa y algunas
quedan suspendidas en el medio, lo que está de acuerdo con lo reportado por Cuellar y
colaboradores, quienes encontraron que su adherencia se completa al día 5 de cultivo en
presencia de los estímulos correspondientes y que al día 7 aquellas que se encuentran en
suspensión también corresponden a células dendríticas diferenciadas (Cuellar, Fonseca, & Gomez
, 2004). Por otra parte, se confirmó la pureza de los monocitos por cada método de separación
mediante citometría de flujo marcando las células con un anticuerpo contra CD14, un marcador
específico de monocitos.
63
El resultado obtenido por el método convencional de separación no corresponde con lo
reportado en trabajos del mismo tipo, ya que nosotros obtuvimos una cantidad muy pequeña de
monocitos (0,022%) en comparación con el 70% - 95% reportado en otros estudios. (Olguin,
2012). Este bajo porcentaje de células obtenidas por el método tradicional, puede deberse a que la
mayoría de los monocitos se encontraban fuertemente adheridos a la placa de cultivo y su
desprendimiento con la tripsina no fue muy efectivo, por lo que muchos de ellos quedaron
adheridos. Por otra parte, al medir CD14 en la población de células del sobrenadante, se observó
una cantidad de monocitos mucho mayor que la observada en las células desprendidas de las
placas de cultivo (10,4%). Este resultado sugiere que durante la separación muchos monocitos
que no se adhirieron a la placa fueron retirados del cultivo junto con los linfocitos.
El método de separación por miltenyi utilizando el anticuerpo CD14 fue más efectivo para
separar las células que el tradicional. Observamos una pureza del 82,3% de monocitos en la
fracción celular y valores por encima del 70% se consideran óptimos (Cuellar, Fonseca, &
Gomez , 2004). Este método de separación tiene la ventaja de que las células obtenidas
corresponden a las que se quieren separar, sin contaminación con otros tipos celulares, tal como
se evidencia en la figura 7, mientras que con el análisis de viabilidad y pureza que se realizó a
los linfocitos obtenidos del sobrenadante por el método tradicional, se observó una pureza del
77,8% de linfocitos T pero como se mencionó anteriormente (Figura 9), en esta población se
observó un 10,4% de células CD14+, lo que sugiere una separación no muy efectiva a diferencia
del método miltenyi con el cual, se obtuvo una pureza celular del 91,3% de linfocitos en la
fracción negativa, y no se observaron células CD14+ (Miltenyi Biotec, 2007). Con base en estos
resultados, se decidió utilizar el método de separación magnética Miltenyi Biotec en posteriores
ensayos.
64
Posteriormente, se realizó un protocolo para estandarizar la maduración de células dendríticas
a partir de monocitos de sangre periférica obtenidos en el paso anterior. Para diferenciar los
monocitos de sangre periférica a DCi y posteriormente a DCm, nos basamos en los protocolos
desarrollados por (Hernandez, 2015) (Olguin, 2012) y (Granados & Delgado, 2008). Nuestro
protocolo fue de 48 horas y se basó en la diferenciación de las células dendríticas en un periodo
de 72 horas.
El análisis de los resultados del protocolo de 48horas evidenció la diferenciación morfológica,
fenotípica y funcional de las DCs diferenciadas a partir de monocitos de sangre periférica
provenientes de donadores sanos positivos para HLA-A*02:01. Inicialmente las células
presentaban morfología monocitoide adheridas a la placa, y después de administrar las citoquinas
para su diferenciación (GM-CSF e IL-4) adquirieron características de células dendríticas
maduras, bien pegadas al fondo del frasco de cultivo con prolongaciones del citoplasma
(dendritas) (Begoña, Sureda, & Rebollo, 2012). Como se mencionó antes, las DCi, fueron
sometidas a un estímulo con los lisados tumorales y LPS para madurarlas in vitro. La maduración
fue confirmada mediante citometría de flujo utilizando anticuerpos anti-CD14, HLA-DR, y CD83
y se observó que tras la maduración se pierde la expresión de CD14 y se sobre expresa HLA-DR.
La viabilidad de las células dendríticas maduras fue del 90% con ambos extractos de lisado de las
líneas tumorales (MDA-MB-231 y SiHa) como se reporta en los trabajos de (Olguin, 2012)
(Granados & Delgado, 2008).
La maduración de las DCs se ve reflejada en un cambio en la expresión génica. Las células
inmaduras expresan moléculas necesarias para la fogocitosis y el procesamiento de los antígenos,
mientras que las maduras expresan moléculas para presentar los antígenos (HLA-DR) y
moléculas co-estimuladoras para activar a los linfocitos T.
65
Las moléculas HLA-DR son las de mayor capacidad de presentación antigénica dentro de este
grupo, y aun cuando el ARNm correspondiente está presente en estadios tempranos de la
diferenciación de CD (monocitos y CDi), la síntesis de la proteína y su localización en la
membrana celular ocurre con la maduración, por lo cual, en CDm se incrementa su expresión
(Carrillo, y otros, 2009), lo que explica que en monocitos sin estimular, se observe una baja
expresión de esta molécula (46,2%) (Carrillo, y otros, 2009).
La activación de las células T, además de la señal de activación generada por las moléculas de
HLA de clase II, requiere la participación de un conjunto de moléculas co-estimuladoras, que se
encuentran también presentes en la membrana de la célula presentadora. Una de ellas es CD83,
conocida como marcador de maduración de células dendríticas. A diferencia de lo reportado por
Olguín, Hernández y Ramos,
La expresión de CD83 difiere de los trabajos de (Olguin, 2012) (Hernandez, 2015) (Ramos,
2015) quienes, al igual que nosotros, realizaron el protocolo de maduración de CD en un periodo
de 48 horas y reportaron la expresión de CD83 en un 70 - 80%, en nuestro trabajo encontramos
CD83 en el 13% de las células dendríticas expuestas al lisado tumoral de la línea celular SiHa y
en el 22% de las células expuestas al lisado tumoral de la línea celular MDA-MB-231. Para
descartar que esta diferencia se debiera al corto tiempo utilizado para la maduración (48h), se
realizó un ensayo en un tiempo de 6 días siguiendo un protocolo utilizado por Cuellar y Carrillo,
(Cuellar, Cifuentes, & Gonzales, 2004) (Carrillo, y otros, 2009). Los resultados fueron similares
a los previamente obtenidos (baja expresión), por otro lado, en el protocolo realizado por
Granados (Granados & Delgado, 2008), que incluye la maduración de las células dendríticas en
72 horas, la expresión de CD83 fue del 60%, lo que se considera como una sobre-expresión en
CDm, lo que sugiere que a mayor tiempo de maduración se incrementa la expresión de moléculas
co-estimuladoras, sin embargo, en este trabajo no se detectaron esos niveles de expresión ni a las
66
48h ni a los 6 días de maduración. Por otro lado, la maduración de células dendríticas en corto
tiempo genera células con mayor viabilidad, ya que a mayor cantidad de días se presenta una
reducción en el número de células viables (Granados & Delgado, 2008).
En la figura 11. Se puede observar que su expresión no se detectó en monocitos, mientras que
en las DCm presento los niveles detectables mencionados anteriormente, la baja expresión que se
observa se puede correlacionar con los resultados obtenidos por Carrillo y colaboradores
(Carrillo, y otros, 2009), quienes examinaron la maduración de DC con diferentes extractos
proteicos provenientes de tumores frescos y líneas celulares tumorales de los mismos tipos de
tumor o encontraron que los extractos de las líneas celulares inducen una menor expresión de
CD83 en comparación con los extractos de tumor fresco, indicando que el tumor in vivo tiene una
inmunogenicidad diferente, capaz de modular la expresión de CD83 (Carrillo, y otros, 2009).
Esta diferente inmunogenicidad puede estar dada por la composición del microambiente
tumoral y en la composición misma del tumor, que es capaz de activar las moléculas co-
estimuladoras, en cambio, las líneas celulares no retienen muchas de las características del tumor
inicial, por lo cual es necesario tener en cuenta las características de los extractos tumorales para
identificar las moléculas con mayor capacidad moduladora (Carrillo, y otros, 2009). Los
resultados soportan la idea de que el bloqueo en la maduración de las APC, es uno de los
mecanismos usados por el tumor para evadir la respuesta inmune, como se ha descrito en varios
modelos de cáncer.
Otro factor que disminuye la expresión de CD83 es el uso de lipopolisacarido (LPS) como
estímulo de maduración, en su trabajo (Cuellar, Fonseca, & Gomez , 2004) observan el
efecto del LPS en cultivo frente a la expresión de marcadores de membrana de las células
dendríticas maduras encontrando que la expresión de CD83 disminuyó en el cultivo que contenía
67
LPS desde el día 0 y que fue madurado con LPS al día 5. Este efecto no se observó cuando se
utilizó PGE2 y TNFα como estímulo de maduración.
Continuando con el siguiente punto, una vez obtenidas las APCs se generaron linfocitos
antígeno-específicos contra las líneas celulares tumorales, para lo cual se realizaron co-cultivos
de DCm y linfocitos T estimulados con IL-2 durante 7 días, tras la activación de los linfocitos se
procedió evaluó la respuesta citotóxica de los linfocitos TCD8+ frente a las líneas celulares SiHa
y MDA-MB- 231 respectivamente. Aunque las células dendríticas fueron activadas con éxito y se
generó el co-cultivo con los linfocitos T CD8+, no se observó una actividad citotóxica por parte
de los mismos cuando se co-cultivaron con sus respetivas líneas celulares. Sin embargo, la
actividad citotóxica a las 24horas fue evaluada por microscopía óptica y se observó (en el co
cultivo con SiHa), un incremento en el número de linfocitos y células en apoptosis y para la línea
MDA-MB-231 en general las células se observaban muy similares al control, sin mostrar un
resultado positivo para apoptosis.
Aunque no son claras las razones, es posible que el problema en la activación antígeno
específica de los linfocitos se deba a la baja expresión de CD83. Por otra parte, para verificar la
activación de los linfocitos probablemente sea mejor medir la producción de IFNϒ realizando un
ensayo ELISA pero no por citometría de flujo, pues la producción de IFNϒ por los linfocitos es
resultado de su activación para inducir la expresión de moléculas que participan en el proceso de
presentación antigénica (Olguin, 2012).
68
CONCLUSIONES
Se cultivaron las líneas celulares tumorales SiHa y MDA-MB- 231 y se tipificó la expresión
de HLA en las líneas celulares y en los 5 participantes para encontrar el alelo HLA-A*02:01, que
fue escogido por su alta frecuencia en la población general, lo cual es una ventaja para diseñar
una terapia personalizada contra el cáncer porque si se construyen adenovirus recombinantes que
expresen los alelos más frecuentes en la población se podría contar con una reserva para cubrir la
necesidad inmediata de esta terapia neoadyuvante en la mayoría de los pacientes.
La maduración de las células dendríticas, a partir de monocitos de los donadores HLA-
A*02:01, se observó a las 48 horas de aplicado el estímulo con los antígenos de las líneas
celulares tumorales. Valdría la pena realizar el ensayo con extractos frescos de tumor, pero para
ello se requiere la tipificación de HLA en los mismos.
Es importante caracterizar los extractos de lisados tumorales, con el fin de determinar aquellos
que presentan una carga antigénica capaz de generar la activación de las APCs y se debe tener en
cuenta, que en caso de que este tipo de terapias pueda utilizarse para el tratamiento del cáncer,
sería de vital importancia tipificar los alelos de HLA en sangre periférica y en la superficie de las
células tumorales para realizar un diagnóstico acertado y elegir la mejor terapia adyuvante para
cada paciente en particular o para determinar que paciente puede beneficiarse de alguna de las
inmunoterapias existentes en la actualidad.
El cultivo primario del tumor, su caracterización molecular y el diseño de una metodología
adecuada para medir la citotoxicidad de linfocitos T autólogos contra el propio tumor, es una
potencial herramienta para determinar qué tipo de tratamiento puede ser más efectivo para un
determinado cáncer.
69
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