Curso: Enzimologa prctica

Curso:Enzimologa USOS Y APLICACIONESFacultad de Ciencias Qumicas UJED

Dra. Erika Flores Loyola

Enzimas Son protenas de alto peso molecular que tienen la capacidad de facilitar y acelerar las reacciones qumicas que tienen lugar en los tejidos vivos.No reaccionan qumicamente con las sustancias sobre las que actanNo alteran el equilibrio de la reaccinSolamente aumentan la velocidad con que estas se producenConceptos generalesSustrato: sustancias sobre las que actan las enzimas.Regiones o sitios importantes:Sitio de reconocimiento: reconoce y liga al sustrato Sitio cataltico: cataliza la reaccin toda vez que el sustrato se ha unido. En ocasiones, el sitio cataltico es parte del de reconocimiento, estas dos regiones en conjunto reciben el nombre de centro activo.

Mecanismo de accinDos sustratos

cofactor Componente no proteico, termoestable y de bajo peso molecular, necesario para la accin de una enzima. Cofactor + estructura proteica (apoenzima) = holoenzima. Ejemplos: Iones metlicos (Fe2+, Cu2+, K+, Mn2+, Mg2+, etc) y molculas orgnicas coenzimas.

Un sustrato

FUNCIN DEL COFACTORCentro cataltico primarioGrupo puente para reunir el sustrato y la enzima, formando un complejo de coordinacinAgente estabilizante de la conformacin de la protena enzimtica en su forma catalticamente activaLas enzimas que precisan de iones metlicos se conocen como metaloenzimasCoenzimasSon cofactores orgnicos no proteicos, termoestables, que unidos a una apoenzima constituyen una holoenzimaUna apoenzima es la parte proteica de una enzima, generalmente es inactiva y al unirse a un cofactor constituye una holoenzima.

Sitios alostricos

Estructura proteca

Organizacin estructural de las enzimas

Fuentes de obtencin de enzimasEnzimas vegetales: disponibles en forma de polvo sin una purificacin muy elevada ejemplos: papanas y bromelanas disponibles en estado purificado.

Enzimas animales incluyen lipasas pancreticas y proteasas,pepsinas, estereasas pregstricas y rennets. Son producidas ultrapuras y en forma de extractos para uso industrial

Enzimas microbianas

fuente usual de enzimas para uso industrial La mayora de las enzimas microbianas se producen a partir de aproximadamente 25 organismos, incluyendo una docena de hongos, Slo aproximadamente el 2% de los microorganismos existentes en el mundo han sido estudiado como fuente de enzimas.

Ventajas del uso de enzimas microbianasSon ms tiles que los derivados de las plantas o animales por la gran variedad de actividades catalticas de que disponenPueden obtenerse en cantidades abundantes,baratas, de forma regular y de calidad uniforme. generalmente ms estables que sus homlogos animales y vegetales,proceso de produccin es ms fcil y seguro. La manipulacin gentica y ambiental puede incrementar el rendimiento o la actividad enzimtica de las clulas microbianasCLASES DE ENZIMASENZIMAS INDUCIBLES. Se sintetizan en cantidad baja hasta q se encuentra presente un sustrato disponibe

ENZIMAS CONSTITUTIVAS. Se encuentran implicadas en aspectos centrales del metabolismo. Son producidas de manera continuaENZIMAS MICROBIANASProduccin, extraccin y purificacin de enzimas

IntroduccinEnzimas puras: alta pureza, accin ms especfica en su funcin cataltica. Actividad predecible y controlable. Posibilidad de emplear mayores concentraciones de sustratoExtractos crudos: Baratos, no requieren de condiciones de almacenamiento especiales, se usan en grandes cantidades; baja pureza.

Enzimas comerciales

Enzimas usadas a mediana escala Razonablemente purasCarasEj. Glucosa oxidasa y colesterol oxidasa

Enzimas especializadas

Caractersticas de las enzimas industrialesEXTRACCIN ENZIMTICA de fuentes microbianas

Enzimas extracelulares: separacin por centrifugado.Aplicacin: extraccin de enzimas a partir de bacterias gram-positivas.Bacterias gram-negativas, solo liberan parcialmente la enzima al medio. La enzima se localiza en la parte externa de la celula pero no es liberada. Ejemplo: kluyveromices marxianus.Enzimas intracelularesTcnicas ms comunes de disrupcin celular.

Disrupcin mecnica (presin celular, molido con abrasivos).Sonicacin.Congelacin-descongelacin.Choque osmtico o de TemperaturaDigestin enzimtica con lisozimas

Despus de la disrupcin

Eliminacin de clulas libres y desechos celulares por filtracin o centrifugacin.

Eliminacin de los cidos nuclicos contaminantes

Purificacin del extracto enzimtico Cromatografa de intercambio inico

Ultrafiltracinsmosis inversa

Precipitacin de enzimas con disolventes orgnicos, PEG, dextrano, ac. Poliacrlico o sulfato de amonio.

Otras tcnicas especializadasFiltracin en gel

Cromatografa de afinidad

Adsorcin y desorcin por resinas de intercambio inico en centrfugas tipo cesta.

EXTRACCIN DE ENZIMAS DE TEJIDOS ANIMALESPROCESOS DE EXTRACCIN DE ENZIMAS INTRACELULARES DE MICROORGANIMOS EUCARIONTES.HOMOGENEIZACIN DEL TEJIDO EN UNA SOLUCIN TAMPONADA.CENTRIFUGACIN DIFERENCIALRECUPERACIN DE LOS GRANULOS

EXTRACCIN DE ENZIMAS DE TEJIDOS VEGETALESINCONVENIENTES: PAREDES CELULARES MUY FUERTES

CONTIENEN COMPUESTOS FENLICOS QUE SON OXIDADOS ENZIMTICAMENTE (POLIFENOLOXIDASAS) Y QUE GENERAN PRODUCTOS QUE INACTIVAN A LAS ENZIMAS.

En general las enzimas son comercializadas en forma de: concentrados lquidos que contienen conservadoresPolvo diluido con lactosaINACTIVACIN DE ENZIMASProblema: prdida de producto por inactivacin.

Solucin: control de pH, T y formacin de espuma + reduccin de la actividad de las proteasas mediante adicin de inhibidores

Algunos medios de inhibicin: proteasas calcio dependientesadicin de EDTA. Proteasas alcalinasmanteniendo el pH 6.5-7.0. Serino-proteasasadicin de fluoruro de fenil-metil sulfonilo.Contenedores y equipo auxiliarRecipientes de vidrio. Ideal para trabajar con enzimas a pequea escala. Resiste la corrosin. A gran escala presentan baja resistencia.

Recipientes metlicosHierro dulce, aleaciones de Cu y Al no se emplean por problemas de corrosin. Los ms recomendados: acero inoxidable de nquel.Problemas relacionados con la lixiviacin de los iones son eliminados x adicin de EDTA.Ventajas: facilidad de refrigeracin y mantenimiento de T bajas. Fuertes, duraderos, fciles de esterilizar, funcionan bajo P, atmsfera controlada

Recipientes de plstico:

Material: PPUso en procesos en que se emplean materiales corrosivos como (NH4)2SO4 o cuando el medio es susceptible a la presencia de iones metlicos.Desventajas: pueden liberarse plastificantes contaminantes. No pueden esterilizarse por calor. Poco control de pH y T.Disrupcin de bacteriasResuspensin

Pasta de bacterias

Resuspensin (agua o buffer)

Disrupcin por agitadores manuales o mecnicos.

Extraccin y purificacin de enzimasProtenas extracelulares Protenas intracelulares: ligadas o libres. (Requieren de disrupcin celular)Mtodos de disrupcin: sonicacin, congelacin-descongelacin, molienda del material slido, etc.Extraccin por mtodos qumicosAlcalis. pH alcalino entre 11-12.5Aplicacin: plantas, hongos y bacterias.Consideraciones importantes: estabilidad de la enzima a pH alcalino.Ventajas: inactivacin de proteasas y reduccin de contaminacin por pirgenos, adems de ser rpido.Lizozima y EDTALisozima: enzima producida a partir de clara de huevo que cataliza la hidrlisis de los enlaces b-1-4 glicosdicos de los mucopptidos de las paredes celulares de bacterias.Bacterias gram-positivas altamente susceptibles.Gacterias gram-negativas necesitan EDTA que rompa la estabilidad de la pared celular.Se emplea a escala media debido al costo de la lisozima..Ventajas: mtodo suave empleado en enzimas sensibles a altas T.DetergentesSon compuestos inicos o no inicos que en condiciones adecuadas de pH, T y fza inica se combinan con lipoprotenas formando micelas Solubilizan los componentes lipoproticos de las membranas biolgicas.Los detergentes inicos son ms reactivos que los no inicos y pueden producir la desnaturalizacin, precipitacin y la hidrlisis de los enlaces peptdicos de las protenas.No son ideales para la extraccin de enzimas.

Shock por enfriamientoReduccin rpida de T hasta 0 C bajo condiciones adecuadas de pH.Las bacterias gram-positivas son las ms sensibles a este efecto.Produce prdida de viabilidad y libera al medio aminocidos, ATP y una sustancia que absorbe a 260 nm.Limitaciones: efecto muy pequeo o nulo sobre suspensiones con densidad >108/mL. Las bacterias son ms susceptibles en la fase exponencial. Inviable para aplicaciones a gran escala.Shock osmticoLavado de las bacterias con solucin tamponada de sacarosa al 20%

Centrifugacin para eliminar el agua.

Dispersin de la pasta de clulas en agua a 4C.Aplicaciones: extraccin de enzimas hidrolticas a partir de bacterias Gram(-). Bacterias que viven en aguas marinas.Se liberan de 4-7% de las protenas bacterianas totales.Extraccin por medios fsicosSonicacinSonidos con frecuencias por encima del nivel de percepcin del odo humano (6-2.4X10-4 cm).Produce cavitacin zonas de compresin y de rarefaccin y cavidades que colapsan rpidamente al pasar a la zona de compresinLa eficacia depende de: pH, T, fza inica y t de exposicin. Se emplea nicamente a pequea escala.Congelacin y descongelacinLa formacin de cristales de hielo intra y extracelulares daan la clula.Eficacia limitada. Solo se libera el 10% de las protenas solubles totales. Para protenas periplsmicas puede liberarse hasta en 60%.Desventajas: puede conducir a una prdida de la actividad celular por cambios en la estructura enzimtica

Cizalla slidaSe emplea un abrasivo (tierra de diatomeas o cristales de hielo) sobre el cual se aplica presin generando fuerzas de corte que rompen a las clulas.Mtodo excelente para obtener enzimas.

Trituracin o agitacin con abrasivosMolino de perlas de vidrioAplicaciones a gran escala.Puede romper hasta 5 Kg de pasta bacteriana/h.Cizalla lquidaLA suspensin se hace pasar a travs de aguja a presiones de hasta 20 000 psi (137 MPa) con un flujo de unos 10 mL/min.Rompe bacterias Gram(-) ms fcilmente que Gram (+).Particularmente las enzimas periplasmticas son liberadas ms fcilmente.Aislamiento y purificacinSeparacin de los cidos nuclicospH elevado, fza inica baja y nucleasas desnaturalizan a los cidos nuclicos.Precipitacin por formacin de complejos (BTAB, Sulfato de estreptomicina, polietilenoimina, polilisina, Catavlon, sulfato de prolamina, MnCl2)Tratamiento con nucleasas (ribonucleasa y desoxirribonucleasa pancretica bovina)Concentracin por precipitacinMtodo de salado de protenas: purifica y concentra algunas protenas especficas. Sal utilizada: sulfato de amonio.Caractersticas de la sal: barata, gran solubilidad, no afecta a la mayora de las enzimas.En soluciones concentradas de electrolitos la solubilidad de las protenas disminuye con en incremento de la concentracin de la sal.La solubilidad de la protena depende de: pH, T, tipo de electrolito.Disolventes orgnicosLa adicin de disolventes reduce la solubilidad de las protenas por reduccin de la constante dielctrica del medio. Mayor interaccin E-E que E-A.Es deseable trabajar a T bajas para evitar desnaturalizacin de la enzima.Disolventes ms usados: metanol, etanol, y 2-propanol. Otros: acetona y ter etlico.Polmeros de peso molecular elevado. Polmeros solubles en agua entre los que destacan PEGOtros mtodosConcentracin por ultrafiltracin Concentracin por liofilizacinCromatografa en gelCromatografa de intercambio inicoCromatografa de afinidadCromatografa de interaccin hidrofbicaHPLCElectroforsisConcentracin por ultrafiltracinSistema de concentracin y purificacin de protenas basado en diferencias de PM. smosis inversa (PM=250)Ultrafiltracin Ultrafiltracin (PM=500-300000) Filtracin de micropartculas

Tipos de membranas: ultrafiltro microporoso y de difusin.Ultrafiltro microporosoRgido Poros entre 500-5000Pueden bloquearse por molculas de tamao medio (disminucin de retencin)tiles para concentrar solutos de PM elevado( interaccinLa elucin se consigue alterando la fza inica del disolvente, el pH o modificando la cte. Dielctrica.

HPLC

Es una Cromatografa en que el flujo se aplica a presin (entre 1500 a 2200 psi). El tamao de partcula es entre 3 y 10 micras, La longitud de la columna es entre 5 y 25 cm. y requiere de equipo sofisticado. La reduccin del tiempo en que la sustancia se encuentra en el interior de la columna, limita el ensanchamiento por difusin de las bandas, aumentando por tanto la resolucin. El anlisis de la informacin obtenida permite estandarizar la cromatografa, identificar la naturaleza los picos eludos y cuantificar su contenido. Los picos se relacionan segn su "tiempo de retencin" con estndares, que permiten identificar los aminocidos o protenas presentes en la mezcla. La cantidad relativa de cada uno de ellos se determina calculando el rea bajo la curva del pico correspondiente.

ElectroforsisMtodo de separacin de protenas en disolucin cuando se les somete a un campo elctrico estacionario Cuando una mezcla de molculas ionizadas y con carga neta son colocadas en un campo elctrico, estas experimentan una fuerza de atraccin hacia el polo que posee carga opuesta.

Principios de enzimologaFuncin: catalizador

Dependencia de la velocidad de reaccin con la concentracin

Actividad CatalticaDependencia de la actividad con el pH