CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS

ESCUELA DE MEDICINA CÁTEDRA DE INMUNOLOGÍA

PRÁCTICA DE LABORATORIO No.11 INMUNOHEMÓLISIS: VALORACIÓN DE LA INTEGRIDAD DE VÍA CLÁSICA DEL COMPLEMENTO

.INTRODUCCIÓN:

El sistema del complemento, fue identificado hace muchos años como un principio termo-lábil que “complementaba” a

los anticuerpos en la función de destruir patógenos (de ahí se origina su nombre). Ahora se conoce que esta no es su

única función y que no depende siempre de anticuerpos para actuar.

El sistema del complemento juega un rol importante en la defensa del huésped ante microorganismos y en los procesos

inflamatorios. Está compuesto por más de 30 pequeñas proteínas de superficie celular y plasmáticas, principalmente

sintetizadas en el hígado y que se encuentran normalmente como precursores inactivos (zimógenos o pro-proteínas)

que, ante la presencia de ciertos estímulos, por ejemplo agentes patógenos, se activan secuencialmente en forma de

una cascada enzimática similar a aquellas de la vía de la coagulación, fibrinólisis, entre otras.

Las proteínas del complemento en el plasma se hallan en cantidades mayores a 3g por litro y corresponden al 15% de

la fracción globulínica. Los componentes C3 y C4 son los más abundantes con concentraciones máximas de C3 de

1200ug/mL y de C4 de 500ug/mL. Los niveles de las proteínas del complemento pueden disminuir debido a un

incrementado consumo y más raramente a deficiencias hereditarias. Niveles disminuidos pueden observarse en

infecciones recurrentes principalmente por bacterias, enfermedades autoinmunes como Lupus Eritematoso sistémico y

vasculitis, malnutrición, septicemia, angioedema hereditario o adquirido. Las proteínas del complemento pueden estar

incrementadas juntamente con las proteínas de la fase aguda durante inflamación aguda o crónica de la inflamación. Si

las condiciones que alteraron los niveles del complemento desaparecen las proteínas se normalizarán.

Las alteraciones cuantitativas o funcionales del complemento pueden ser determinadas en el laboratorio por diferentes

técnicas como ELISA, nefelometría, o la valoración de la capacidad hemolítica.

II. OBJETIVOS:

Determinar la integridad funcional de la vía clásica del sistema del complemento mediante la técnica de inmunohemólisis o capacidad hemolítica 50 (CH50).

Comprender las funciones, y vías de activación del sistema del complemento.

III. MARCO TEÓRICO:

El sistema del complemento es uno de los principales mecanismos efectores de la inmunidad humoral y también y es un

importante mecanismo efector de la inmunidad innata. Las funciones efectoras del sistema del complemento en las dos

inmunidades, se pueden resumir como se muestra en la Tabla 1.

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Tabla 1: FUNCIONES DEL COMPLEMENTO

ACTIVIDAD FACTORES DEL COMPLEMENTO INVOLUCRADOS

Defensa del huésped contra infecciones.

Opsonización C3b, C4b, C3dg, iC3b, receptores CR3, CR4, CR1

Quimiotaxis y activación de leucocitos

Anafilotoxinas (C5a, C3a y C4a); receptores de anafilotoxinas en leucocitos

Lisis bacteriana y celular Complejo de ataque de membrana (C5b-C9)

Integración entre la inmunidad innata y adaptativa

Memoria inmunológica C3d, receptores CR2 células B y célula folicular dendrítica.

Incremento en la respuesta por anticuerpos

Unión de C3b y C4b a los complejos inmunes y a los antígenos foliculares

Eliminación de desechos

Limpieza de inmunocomplejos C1q, fragmentos de C3 y C4 ligados covalentemente. Remoción de células apoptósicas

Traducido y modificado de: MACKAY I., ROSEN, F., WALPORT, M., et al. (2001) Advances in Immunology: Complement. The New England

Journal of Medicine, Vol 344, 14, 1.

Hay tres vías principales de activación del complemento: la vía clásica, que se activa por principalmente por ciertos

tipos de anticuerpos unidos a su antígeno respectivo; la vía alternativa, que se activa espontáneamente en la fase fluida

o se activa sobre las superficies de las células microbianas sin necesitar a los anticuerpos como mediadores; y la vía de

la lectina, que se activa por MBL y ficolinas plasmáticas que se unen a manosa y monosacáridos modificados (N-acetil

glucosamina) sobre las superficies de los microorganismos, respectivamente (Abbas & Lichtman: 2008, pp.330). Una

vez iniciada la activación las tres vías convergen en una vía común. El sistema del complemento además cuenta con

mecanismos regulatorios para lograr que, por una parte, la activación se dé adecuadamente en la superficie de

patógenos y, por otra, que el depósito de proteínas del complemento y el consiguiente daño, sea mínimo en células del

huésped. Si este delicado balance se altera, el sistema de complemento puede causar daño tisular como se ha

demostrado en varias entidades clínicas.

VÍA CLÁSICA.

Intervienen en esta vía las proteínas C1 compuesta de C1q, (C1s)2, (C1r)2, y los componentes C2, C4 y C3. La

activación del complejo C1 se da al unir 1 o más de las 6 cabezas globulares de la molécula de C1q, a cualquiera de los

siguientes ligandos: a) componentes de pared de células apoptóticas, ciertos virus, bacterias gram negativas y

positivas, b) proteína C reactiva unida a ligando y c) complejos inmunes (antígeno-anticuerpo). Ésta última unión es el

estímulo más común y de mayor importancia ya que constituye un nexo entre la inmunidad innata y la adaptativa.

Una vez que C1q se ha unido al ligando se activa C1r y luego este activa a C1s que es la fracción enzimática activa del

complejo C1 (C1s) que fragmenta primero a C4 en C4a y C4b y, luego, a C2 en C2a y C2b. Los fragmentos C4b y

C2a se quedan unidos y forman la convertasa de C3, cuya parte activa es C2a, enzima que va a fragmentar muchas

moléculas de C3 en C3b y C3a, en el paso de amplificación de la vía clásica.

VÍA ALTERNATIVA

En esta vía la hidrólisis espontánea de C3 es el iniciador. Esta proteína es abundante en el plasma y resulta

continuamente modificada – en un proceso llamado “tickover” - para generar C3(H2O), ésta une al factor B para que el

factor D lo fragmente en Ba y Bb, este último se queda unido a C3(H2O), y forma la convertasa de C3 (C3(H2O)Bb)

de fase fluida (no unida a superficie celular).

Aunque esta convertasa se produce en baja cantidad puede fragmentar muchas moléculas de C3 en C3b y C3a. De las

de C3b formadas, una parte se inactiva por hidrólisis, las demás moléculas se unen covalentemente a través de su

grupo tioester activo a las superficies de células propias o de bacterias, dónde puede ligar al factor B y con ayuda del

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factor D formar la convertasa de la vía alternativa (C3bBb) la cual al estar unida a la superficie celular es más estable.

Esta convertasa rompe C3 en C3a y C3b. En la membrana de nuestras células existen varias proteínas que evitan la

formación de esta convertasa, no así en la superficie de los microorganismos.

VÍA DE LA LECTINA

(MBL – mannose binding lectin y Ficolina)

Se inicia cuando la lectina ligadora de manosa (MBL) proteína sérica de origen hepático, se une a residuos de los

polisacáridos de pared bacteriana, o cuando ficolinas se unen a monosacáridos modificados. Ambas moléculas

activan un complejo enzimático compuesto por las serin-proteasas (MASP1,MASP2), que dividen a C4 y C2 de forma

similar a la vía clásica, formando similar convertasa de C3 que dividirá C3.

VÍA COMÚN

C3b es clave en la acción del sistema del complemento, se une a las distintas convertasas de C3 (C4bC2a – Vía

clásica y de lectina; y C3bBb en la vía alterna) para formar la convertasa de C5. Esta fragmenta a C5 en C5a y C5b. Y

aquí inicia la fase citolítica ya que C5b se une a la membrana bacteriana, liga a C6, este a su vez a C7, C8 y un

complejo de 10 a 16 moléculas de C9. Se forma así un polímero – el complejo de ataque de membrana o MAC - que

perfora la membrana celular y ocasiona el estallido o lisis celular. (La célula ya no es capaz de mantener su

concentración hiperosmolar por disrupción en la continuidad de su membrana).

Los fragmentos restantes C5a, C3a y C4a son, en orden descendente de mayor potencia, anafilotoxinas y cumplen en

distinto grado funciones como: quimiotaxis y activación de leucocitos y mastocitos.

Las tres vias de activación del complemento: Clásica, Lectina ligadora de manosa, Alternativa. NEJM. Advances in Inmunology. Complement, Second of twoparts.

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DIAGNÓSTICO DE ALTERACIONES DEL SISTEMA DEL COMPLEMENTO

Para evaluar el sistema del complemento se realizan pruebas cualitativas y cuantitativas. Su utilidad está en la

inmunología clínica, ya que permiten detectar deficiencias en factores del complemento (por baja síntesis o síntesis

defectuosas), además de anomalías funcionales en las vías de activación y regulación.

El análisis del sistema del complemento se realiza en el marco de varias entidades clínicas, entre ellas: Lupus

eritematoso sistémico, artritis autoinmune, angioedema, síndromes de vasculitis, nefritis, infecciones recurrentes.

Recientemente incluso se ha implicado al análisis del complemento en desórdenes neurodegenerativos como el

Alzheimer, esclerosis múltiple, Guillain-Barré.

Las pruebas cuantitativas, usualmente analizan las concentraciones de componentes específicos del complemento e

incluyen ensayos inmunoquímicos. Las pruebas cualitativas o ensayos funcionales miden la actividad total del

complemento (lisis) en las distintas vías de activación. Las pruebas que producen hemólisis dan una perspectiva de la

función de la cascada enzimática completa del complemento. Una de ellas es la capacidad hemolítica 50 (CH50) del

complemento.

También se han desarrollado otros métodos que utilizan los ensayos de inmunoabsorbancia asociados a enzimas

(ELISA) para detectar el depósito de C1q, C1s, C4, C3, factor B, proteína de unión a C4b, properdina y todos los

componentes terminales del complemento en la superficie plástica de un micro pocillo después de la activación sérica.

VI. FUNDAMENTO DE LA PRÁCTICA INMUNOHEMOLISIS (CH50) POR LA VIA CLASICA

La técnica CH50 o capacidad hemolítica del complemento mide la habilidad del suero del paciente para lisar (destruir)

50% de una suspensión de eritrocitos cubiertos con anticuerpos, es decir valora la integridad de activación del

complemento, en este caso por la vía clásica.

A pesar de que se han descrito muchas variantes el protocolo del ensayo por inmunohemólisis conserva su base

conceptual: realizar diluciones de la muestra a ser analizada, propiciar una reacción antígeno-anticuerpo y medir la

respuesta. Se denomina CH50 cuando se busca producir la lisis del 50% de eritrocitos y CH100 cuando se lisa el 100%,

en esta práctica nos basaremos en este principio. Para evaluar la vía alternativa se bloquea las reacciones enzimáticas

al añadir EDTA para quelar el calcio.

La hemólisis inducida por la activación del complemento sobre antígenos de un grupo sanguíneo que han sido

reconocidos por anticuerpos correspondientes (Ej, antígeno A con anticuerpo anti A), se presentará proporcionalmente

a la concentración de componentes del complemento. El método CH50 utiliza distintas diluciones para determinar la

cantidad de complemento necesaria para producir la lisis del 50% de eritrocitos. Este tipo de lisis, mediada por el

complemento se denomina inmunohemólisis y refleja la integridad funcional de los 9 componentes del sistema de la vía

clásica. Si en estos existiera un déficit, la cadena enzimática no se activaría correctamente y habría ausencia de

inmunohemólisis.

El CH50 en esta práctica se realizará activando la Vía Clásica del complemento. El concepto es muy parecido a lo que

ocurre en una enfermedad hemolítica de tipo transfusional, en donde eritrocitos de un grupo sanguíneo son puestos en

contacto con suero de distinto grupo sanguíneo (que contiene anticuerpos), para formar de esta manera

inmunocomplejos. Se coloca luego suero humano que contiene las proteínas del complemento (protegido del calor,

recordar que el complemento es termolábil) y se observa la activación de la vía clásica y hemólisis subsecuente. La

magnitud de la inmunohemólisis se puede determinar a simple vista o medirse por espectofotometría, expresándose

como porcentaje de hemólisis. Hemólisis menores de 50% indican deficiencia del complemento, pero no permite

determinar qué componente es el que está deficitario.

VII. MATERIALES:

Extracción sanguínea INMUNOHEMOLISIS

3 jeringuillas de 10 ml 3 tubos de 10 ml sin anticoagulante Buffer fosfato salino (PBS)

Torundas de algodón con alcohol 1 tubo de 10ml con anticoagulante Sistema de enfriamiento (hielo)

Torniquete Micropipetas de 20µl, 100µl y 1000 µl Centrífuga, Baño maría

VIII. PROCEDIMIENTO

1. Extraer 10 ml de sangre tipo 0 de dos individuos, sin tomar en cuenta el factor Rh, y colocar en 2 tubos sin

anticoagulante.

2. Extraer 10 ml de sangre de un individuo de grupo sanguíneo A o B. Colocar 7ml en un tubo con anticoagulante

3. Centrifugar todas las muestras a 3000 r.p.m. (revoluciones por minuto) durante 10 minutos

4. Extraer el suero de los tubos con sangre O y someterlo al proceso de descomplementación: calentar el suero

55°C por 15 – 20 minutos. Descartar el paquete globular.

NOTA: esta temperatura desnaturaliza las proteínas del complemento pero no los anticuerpos.

5. Separar el plasma de los tubos con sangre del grupo A ó B y guardarlo en refrigeración para proteger las

proteínas del complemento de su condición termolábil y guardar los eritrocitos.

6. Realizar el lavado de los eritrocitos con PBS:

a. Añadir 5 cc. de PBS al paquete eritrocitario y centrifugar a 1500 r.p.m. por 10 minutos .

b. Retirar el sobrenadante y repetir el paso por 2 veces más.

7. Una vez lavados los eritrocitos realizar una dilución al 2% de eritrocitos para dispensar 1000µl en cada uno de

los 5 tubos del ensayo.

Cálculo: Preparar 6000 µL de solución de eritrocitos al 2% (siempre se prepara un poco más de lo necesario)

___________________________________________________________________

2µl 100µL

X 6000µL

X= 6000 µL x 2 µL

100 µL

X= 120 µL

SOLUCIÓN DE ERITROCITOS AL 2% Tomar 120µl de eritrocitos lavados + 5880 µl de Na Cl al 0.9% como disolvente. ___________________________________________________________________

8. Colocar 1000µl de solución de eritrocitos al 2% en cada uno de los 5 tubos y rotularlos.

9. Añadir 500µl de suero O descomplementado desde el tubo N°1 hasta el N°4.

En el tubo número 5 se coloca 3ml de agua destilada en lugar de suero O.

10. Los tubos se llevan a Baño María a 37°C por 20 minutos (temperatura fisiológica)

11. A la preparación incubada agregar el suero A ó B que contiene las proteínas del complemento de acuerdo al

siguiente esquema:

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REACTIVO/TUBO

CONTROL (-)

TITULACIONES (complemento)

CONTROL

1:02 1:01 2:01 (+)

1 2 3 4 5

Eritrocitos 2% (grupo A o B) en NaCl 0.9%

1000µl 1000µl 1000µl 1000µl 1000µl

ANTIGENOS

Suero O

500µl 500µl 500µl 500µl - ANTICUERPOS SIN COMPLEMENTO

Suero A - 250 µl 500 µl 1000µl -

COMPLEMENTO

Agua Destilada - - - - 3000 µl

12. Incubar los tubos por 20 minutos más.

13. Luego de la incubación, centrifugar todos los tubos a 1500 r.p.m. con el fin de sedimentar los restos de

eritrocitos y los eritrocitos no hemolisados.

14. Observar la coloración del sobrenadante de cada tubo.

15. Recoger el sobrenadante con una pipeta y en un espectrofotómetro medir la densidad óptica del sobrenadante

de todos los tubos, construyendo una curva de porcentaje de hemólisis utilizando la siguiente fórmula:

DOs: Densidad óptica del sobrenadante de los tubos N°2 A N°4

DOb: Densidad óptica del control negativo (tubo N° 1 )

DOo: Densidad óptica del control positivo (tubo N° 5)

De acuerdo con esta curva, la concentración de complemento necesario para producir 50% de hemólisis (con

el control positivo como el 100%) constituye el CH50.

IX. TEMAS DE CONSULTA:

Consulte el siguiente tema para que lo revise en el laboratorio junto con su ayudante: Cuadros clínicos

asociados a alteraciones en la actividad total del complemento y de sus reguladores.

IX. BIBLIOGRAFÍA

ABBAS, A., Cellular and Molecular Immunology, 5th edition, Elsevier/Saunders, 2008, 564p, ISBN: 1-4160-2389-5.

P326 – 330.

ARENDRUP, M., HANSEN, J., CLAUSEN, H., NIELSEN, C., MATHIESEN, L., Antibody to histo-blood group A antigen neutralizes HIV produced by lymphocytes from blood group A donors but not from blood group B or O donors, AIDS, 4 441–4.

7

BERGER, S., DAHA, M., Complement in glomerular injury, Semin Immunopathol, 2007, 29:375–384.

FAUCI, A., BRAUNWALD, E., KASPER, D., et al., Harrison’s principles of internal medicine, 17th edition,

McGrawHill, 2008, Vol. II, ISBN 978-0-07-147693-5 p- 2030- 2061

GABAY, C., Acute-phase proteins and other systemic response to inflammation, NEJM, 1999, 340-344-354

JANEWAY, C., TRAVERS, P., WALPORT, M., SHLOMCHIK, M., Immunobiology: the immune system in health and

disease. 6th edition, Garland Science, 2005, 823p, ISBN 0 8153 4101 6.

KIRSCHFINK, M., MOLLNES, T., Modern Complement Analysis, clinical and diagnostic laboratory immunology, 2003, Vol. 10, No. 6p. 982–989

MACKAY I., ROSEN, F., Review article: Complement first of two parts, The New England Journal of Medicine., N

Engl J Med, 2001, Vol 344, No. 14. P 1058 – 1066.

MACKAY I., ROSEN, F., Review article: Complement second of two parts, The New England Journal of Medicine.,

N Engl J Med, 2001, Vol 344, No. 15. P 1140 – 1144.

MEDZHITOV, R., JANEWAY, C., Advances in immunology: Innate immunity, NEJM, 2000, 343:338 – 44.

NEIL, S., MCKNIGHT, A., GUSTAFSSON, K., WEISS, R., 2005, HIV-1 incorporates ABO histo-blood group antigens that sensitize virions to complement-mediated inactivation, Blood, 105, 12: 4693–9.

SAVVAS, C., Therapeutic inhibition of the complement system, PRAECIS, pharmacological review, 1998, 50: 59-87.

SIMPSON, S., A Bacterial Anticomplement, Nat. Immunol, 2007, 10.1038/ni1450

SVETOMIR, N., Acquired C1 estearase inhibitor deficiency, Annals of Internal Medicine, 132, 2000, p144-55.

Crispin, J. Pathogenesis of human systemic lupus erythematosus: recent advances [Documento PDF]. Disponible

en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2823952/pdf/nihms-169854.pdfCrow, M. Developments in the

clinical understanding of lupus [Documento PDF]. Disponible en: http://arthritis-research.com/content/pdf/ar2762.pdf

Enberg, M. Infecciones en pacientes con Lupus Eritematoso Sistémico [Documento PDF]. Disponible en:

http://www.scielo.cl/pdf/rmc/v137n10/art14.pdf

Sánchez, S. Lupus eritematoso: enfermedad autoinmune sistémica y órgano específica. [Documento PDF].

Disponible en: http://www.medigraphic.com/pdfs/revbio/bio-2004/bio043e.pdf

Font, J. Lupus eritematoso sistémico [Documento PDF]. Disponible en:

http://www.jano.es/ficheros/sumarios/1/65/1491/57/1v65n1491a13052760pdf001.pdf

ELABORACIÓN

AYUDANTES DE CÁTEDRA DE INMUNOLOGÍAPaola SantacruzAna María Zambrano Bertha Loaiza S. Christian León Christian Rosero Gabriela Pesantez Nadia Montero Sebastián Paredes Vicente Huilca SUPERVISIÓN: Dr. Fernando Sempértegui Jefe de Cátedra.

Quito, Septiembre, 2011